CN109939238A - 透明质酸修饰的载药复合纳米材料及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种透明质酸修饰的载药复合纳米材料及其制备方法，所述方法包括制备二氧化硅‑羟基磷灰石复合纳米材料、表面氨基化处理、载药以及透明质酸表面修饰的步骤。通过该方法制备的载药复合纳米材料能够在4h内快速渗透到肿瘤细胞，不仅能够提高抗癌药物的治疗效率，而且有效地区分了正常与肿瘤细胞，从而有效地降低了该纳米材料在血液循环过程中的被体内正常组织，血液内含物等的吸附，提高抗癌药物的释放效率和局部浓度，并降低抗癌药物的使用剂量和毒副作用等，在癌症治疗领域有着重要研究价值和应用前景。

Description

透明质酸修饰的载药复合纳米材料及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物纳米材料领域，具体涉及一种透明质酸修饰的二氧化硅-羟磷灰石载药纳米材料的制备、合成及应用。

背景技术

传统化疗主要是指通过化学药物(包括阿霉素、紫杉醇、顺铂、吉西他滨等)干扰体内细胞的分裂分化过程，快速杀死分裂活跃的细胞。这种治疗对正常和肿瘤细胞没有选择性，会产生很严重的毒副作用，并且长期使用会产生耐受性，因而，提高化疗药物在体内的分布情况，即降低在正常组织(包括血液、淋巴、器官等)的积聚，提高在肿瘤区域的积累量可以大大提高化疗效果、降低毒副作用。

靶向药物输送体系是通过将化疗药物负载于纳米药物载体中，然后在纳米材料表面修饰靶向肿瘤的物质(包括小分子、蛋白质、抗体、多肽、核苷酸等)，最终实现药物载体在体内不同的分布情况以及化疗药物在肿瘤区域的药物释放行为。目前，更多的是采用肿瘤细胞膜上特异或者高表达的蛋白或者小分子作为靶点，通过相对应的配体实现对肿瘤的识别，主要包括叶酸、铁传递蛋白、透明质酸和某些抗原抗体等。透明质酸(hyaluronic acid，HA)是一种高亲水性的酸性粘多糖，单体由D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成，分子量可从1kDa至几十MDa不等，是CD44蛋白的主要一种结合受体。因此，可以通过透明质酸的修饰从而介导纳米药物载体靶向输送到CD44过表达的肿瘤细胞区域，实现对CD44过表达肿瘤细胞的靶向药物输送。

寡多糖透明质酸是指分子量低于20kDa的透明质酸多糖，其单体个数不超过10个。不同分子量的透明质酸的生理功能不同，其中大分子量的透明质酸(>500kDa)在被细胞摄取前需要通过透明质酸酶进行降解成小分子透明质酸片段后才能被摄取代谢；而寡多糖透明质酸可以快速直接的被细胞摄取。通常，寡多糖透明质酸表现出相比于一般分子量(～1500kDa)更加优异的CD44靶向效果。但他们与载药体系的联合应用在肿瘤靶向治疗中的疗效并经过考证。

发明内容

本发明旨在提供一种透明质酸修饰的载药复合纳米材料及其制备方法。该所述材料可用于靶向表面CD44过表达的肿瘤细胞，从而实现载药纳米材料在肿瘤部位的积累及抗癌药物的缓慢释放。

所述材料的制备方法包括下述步骤，即所述的材料通过下述方法制备：

①制备含有介孔的二氧化硅-羟基磷灰石复合纳米材料；

②以硅烷偶联剂对所得二氧化硅-羟基磷灰石复合纳米材料进行表面氨基化处理，得到氨基化的复合纳米材料；

③药物与氨基化的复合纳米材料在溶液中混合，制备表面氨基化的载药复合纳米材料；

④以透明质酸对上述氨基化的载药复合纳米材料进行表面修饰。

CD44在大部分乳腺癌肿瘤中高度表达，本发明的方法制备的透明质酸修饰的载药复合纳米材料可通过透明质酸的靶向作用，增强载药纳米材料在CD44高表达肿瘤区域的积累量，进一步微酸性环境下缓慢酸解释放负载的药物，实现对CD44高表达肿瘤的靶向释放及化学药物治疗。

与现有技术相比，本发明的透明质酸修饰的载药复合纳米材料在以下几个方面具有突出的优势：(1)通过修饰不同分子量透明质酸后的靶向能力比较，发现寡多糖透明质酸修饰后的纳米材料具有更加优异的靶向能力，能够对CD44过表达的肿瘤细胞与低表达(其中大部分处于静息态)的正常细胞进行区分，从而大大增强了纳米材料在肿瘤区域的积累，降低了在非肿瘤区域的不必要的积累，实现了对肿瘤区域的选择性；(2)羟磷灰石(HAP)是脊椎动物骨骼和牙齿的主要无机组成成分，具有很好的生物相容性和生物降解性，通过将其与介孔二氧化硅进行结合制备复合纳米材料，使其同时具备羟磷灰石的高生物相容和传统介孔二氧化硅的高比表面积，大大提高了羟磷灰石的负载能力；(3)与传统的无机纳米材料(如介孔二氧化硅、四氧化三铁、氧化铝、二氧化钛等)相比，制备的二氧化硅-羟磷灰石载药纳米材料具有在酸性环境下的酸解，导致纳米结构“碎片”化过程，促进了负载药物的释放；(4)二氧化硅-羟磷灰石载药纳米材料具备两个串联式的触发“开关”：透明质酸小分子靶向CD44过表达细胞(或组织)，以及复合纳米材料的酸解释放药物。这串联式的触发机制进一步降低了载药纳米材料在血液循环过程中被正常组织、淋巴系统、血液细胞、血液内含物等吸附，提高了载药纳米材料中抗癌药物的释放效率、利用率和局部浓度，从而降低了抗癌药物的使用剂量和毒副作用，在肿瘤治疗领域有着重大的研究价值和应用前景。因此，本发明制备的透明质酸修饰的载药复合纳米材料对CD44高表达肿瘤细胞组织具有很好的主动靶向性能，能够降低传统化疗药物的毒副作用，提高抗肿瘤药物的药物利用。

附图说明

本发明附图12幅：

图1是本发明中所制备的纳米材料的透射电镜(TEM)图。其中：a：MSNs/HAP；b:DOX@MSNs/HAP；c:oHA-DOX@MSNs/HAP；d:HA-DOX@MSNs/HAP。

图2是本发明中所制备的纳米材料的动态光散射分析结果图(DLS)。a:MSNs/HAP；b:DOX@MSNs/HAP；c:oHA-DOX@MSNs/HAP；d:HA-DOX@MSNs/HAP。

图3是本发明中所制备的纳米材料的稳定性PDI指数检测结果图。

图4是本发明中所制备的纳米材料的XRD分析结果图，其中，第三、四行分别为二氧化硅和羟磷灰石的标准XRD卡片。

图5是本发明中所制备的纳米材料的红外光谱(FT-IR)图。

图6是本发明中所制备的纳米材料在逐级修饰中各个纳米材料的的Zeta电位测试，其中：1.MSNs/HAP；2.MSNs/HAP-NH₂；3.HA；4.DOX@MSNs/HAP；5.oHA-DOX@MSNs/HAP；6.HA-DOX@MSNs/HAP。

图7是本发明中所制备的纳米材料的氮气吸脱附实验结果及BET方程计算孔径图。其中，a为MSNs/HAP和DOX-MSNs/HAP两种纳米材料的氮气吸脱附曲线，b为相对应依据BET计算得到的孔径大小分布曲线。

图8是实施例3中的二氧化硅-羟磷灰石载药纳米材料DOX@MSNs/HAP的药物缓释曲线。

图9是实施例4中透明质酸修饰的二氧化硅-羟磷灰石载药纳米材料的细胞毒性实验。其中：a为HA-DOX@MSNs/HAP(HA：1.5MDa)，b为oHA-DOX@MSNs/HAP(oHA：776Da)。

图10是实施例5的透明质酸修饰的二氧化硅-羟磷灰石载药纳米材料的细胞摄取实验结果图。分别测定了HA-DOX@MSNs/HAP(HA：1.5MDa；a图)，oHA-DOX@MSNs/HAP(oHA：776Da；b图)的细胞摄取能力，时间为2小时。

图11是实施例5的透明质酸修饰的二氧化硅-羟磷灰石载药纳米材料的细胞摄取实验。分别测定了HA-DOX@MSNs/HAP(HA：1.5MDa；a图)，oHA-DOX@MSNs/HAP(oHA：776Da；b图)的细胞摄取能力，时间为4小时。

图12是实施例6的透明质酸修饰的二氧化硅-羟磷灰石载药纳米材料的流式细胞仪测定结果，采用的试剂盒为AV-PI凋亡试剂盒，测试时间为12h。

具体实施方式

本发明旨在提供对寡多糖透明质酸修饰的二氧化硅-羟磷灰石载药纳米材料的制备方法以及由该方法制备得到的产品。

所述的制备方法包括：首先制备含有介孔的二氧化硅-羟基磷灰石复合纳米材料(MSNs/HAP)，然后以硅烷偶联剂对所得二氧化硅-羟基磷灰石复合纳米材料进行表面氨基化处理，得到氨基化的复合纳米材料(MSNs/HAP-NH₂)，进一步使药物与氨基化的复合纳米材料在溶液中混合，制备表面氨基化的载药复合纳米材料(DOX@MSNs/HAP)，最后以透明质酸对上述氨基化的载药复合纳米材料进行表面修饰(HA-DOX@MSNs/HAP)。

如无特殊说明，本说明书中所使用的符号CD44均代表CD44抗原蛋白质。所述及的靶向均表示针对肿瘤细胞CD44的靶向。oHA代表寡多糖透明质酸，HA代表原生透明质酸(>500kDa)，DOX代表阿霉素，MSNs/HAP代表二氧化硅-羟磷灰石复合纳米材料，DOX@MSNs/HAP代表负载DOX的二氧化硅-羟磷灰石复合纳米材料。

具体实施方式中，所述方法中，二氧化硅-羟磷灰石载药纳米材料由水热法制备：水溶性钙盐、磷酸盐及硅源在乙醇-水体系中，于75～100℃条件下制备复合纳米材料，进一步将得到的纳米材料通过硅烷偶联剂进行表面氨基化，最后在乙醇-水体系中进行药物的负载。其中，所述的可溶性钙盐优选但不仅限于Ca(NO₃)₂·4H₂O；所述的可溶性磷酸盐优选但不限于(NH₄)₂HPO₄；所述的硅源优选但不限于硅烷四乙酯；硅烷偶联剂优选但不限于氨丙基三乙氧硅烷(APTES)。

进一步具体的描述中，所述的二氧化硅-羟基磷灰石复合纳米材料由硝酸钙、磷酸氢二铵、硅酸四乙酯、聚乙烯吡咯烷酮、十六烷基三甲基溴化铵、乙醇、和水制备而成。其中的磷酸氢二铵、硝酸钙、硅酸四乙酯为结构内核，聚乙烯吡咯烷酮、十六烷基三甲基溴化铵为结构分散剂，乙醇与水的混合溶液为溶剂。更加具体地，该反应中所述及的磷酸氢二铵、硝酸钙、硅酸四乙酯为结构内核，聚乙烯吡咯烷酮、十六烷基三甲基溴化铵为结构分散剂，乙醇与水的混合溶液为溶剂。所述的硝酸钙、磷酸氢二铵、硅酸四乙酯、聚乙烯吡咯烷酮和十六烷基三甲基溴化铵的摩尔比为1:0.5～1:2～5:0.005～0.015:0.05～0.3。优选摩尔比为1:0.75:3:0.01:0.15。

更为具体地，可以将本发明所述的二氧化硅-羟基磷灰石复合纳米材料的制备描述为包含下述步骤的技术方案：

①向pH为10.5±0.5的乙醇-水溶液中(v/v,1:3)缓慢加入十六烷基三甲基溴化铵，控制十六烷基三甲基溴化铵的质量浓度为5g/L，剧烈搅拌后在95±5℃下回流2～4小时；

②向①所得的混合溶液中加入硝酸钙，控制硝酸钙的质量浓度为8g/L，剧烈搅拌后，维持pH为10.5±0.5，在95±5℃下回流0.5～1小时；

③向②所得的混合溶液中极其缓慢的加入硅烷四乙酯和0.099g磷酸氢二铵，硅烷四乙酯与磷酸氢二铵的质量比为6:1，硅烷四乙酯的质量浓度为20g/L，剧烈搅拌后在95±5℃下回流12～24小时；

④将步骤③所得到的溶液通过高速离心，离心产物依次通过水、乙醇洗涤干燥后，在650℃下煅烧6～12小时，得到二氧化硅-羟磷灰石复合纳米材料。

经上述方法所制备的二氧化硅-羟基磷灰石复合纳米材料为球状颗粒，粒径50～80nm，比表面积不低于300m²/g。具有极强的药物负载能力，可以更加高效的递送药物。药物负载方式为先制备二氧化硅-羟磷灰石复合纳米材料，然后再进行药物负载，其负载条件温和，有利于保持药物本身特性。

另一具体的实施方式中，所述以硅烷偶联剂对二氧化硅-羟磷灰石复合纳米材料进行表面氨基化，是在室温条件下，将药物与氨基化的复合纳米材料在乙醇-水体系中搅拌反应12～36h。其步骤可以是：将质量比4:3的二氧化硅-羟磷灰石复合纳米材料、硅烷偶联剂APTES和含25％乙醇的去离子水搅拌，高速离心后，洗涤干燥沉淀物，得到表面氨基化的二氧化硅-羟磷灰石复合纳米材料。

再一具体的实施方式中，本发明所述的制备方法中所述及的药物为抗肿瘤药物，选自阿霉素、紫杉醇、顺铂、吉西他滨、氟尿嘧啶、盖诺、表阿霉素、环磷酰胺、长春新碱、博莱霉素和多帕菲。所述的药物优选阿霉素(DOX)或其衍生物。尤其优选阿霉素(DOX)、盐酸阿霉素(DOX·HCl)。

本发明的具体实施方式中，所述的透明质酸是寡多糖透明质酸。优选分子量不超过5KDa的寡多糖透明质酸。所述的透明质酸与氨基化的载药复合纳米材料通过共价键进行连接。连接的步骤可具体举例描述为：透明质酸通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCL)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)进行活化后，与氨基化的载药复合纳米材料在水中反应3-12h。

较为具体完整的具体实施方式中，本发明的透明质酸修饰的载药复合纳米材料的制备方法，包括如下步骤：

(1)可溶性钙盐磷酸盐及硅源在乙醇-水体系中，与75～95℃条件下反应制备用于负载药物的复合纳米材料；

(2)将质量比4:3的复合纳米材料、硅烷偶联剂APTES与含25％乙醇的去离子水中，预先通过超声进行分散后，以1000r/min搅拌0.5h，然后调节pH值至11，继续反应3h，离心得到氨基化的复合纳米材料；

(3)将50～200mg氨基化后的复合纳米材料分散在25％乙醇的去离子水中，加入10～100mg的药物进行负载，以1200r/min搅拌3h后，离心得到表面氨基化功能化的的复合载药纳米材料；

(4)将80mg的透明质酸分散在25～40℃的水中，以600r/min继续搅拌0.5h后，在冰浴的条件下，按顺序加入100mg EDCL，60mg NHS，以600r/min下搅拌稳定0.5h，恢复至室温后加入175mg的步骤(3)得到的复合纳米材料，然后在室温下反应24～36h，最后通过离心，洗涤得到目标纳米材料，即透明质酸修饰的载药复合纳米材料。

优选的技术方案中，本发明的透明质酸修饰的载药复合纳米材料的制备方法，包括如下步骤：

(1)向pH为10.5±0.5的25％乙醇的50mL去离子水溶液中，加入150mg的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，以600r/min继续搅拌稳定15min；然后，0.235g硝酸钙[Ca(NO₃)₂]加入到上述混合溶液中，在70℃下快速搅拌30min后；0.6g硅烷四乙酯和0.099g磷酸氢二铵极其缓慢的加入到得到的混合溶液中，经剧烈搅拌分散均匀后，在95±5℃下回流8～24小时。将上述得到的溶液通过高速离心，得到的离心物质分别通过水、乙醇洗涤干燥后，在650℃下煅烧6～12小时，得到二氧化硅-羟磷灰石复合纳米材料MSNs/HAP。

(2)将150mg氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)加入到25％乙醇的50mL去离子水溶液中，在室温下搅拌30min，然后加入200mg上述得到的复合纳米材料MSNs/HAP，并超声5min分散均匀纳米材料，室温下搅拌2h后，调节pH值至10.5±0.5，继续反应3～6h后离心分离，得到的纳米材料通过超纯水和无水乙醇充分洗涤3～5次后，真空干燥得到氨基化的复合纳米材料MSNs/HAP-NH₂。

(3)将200mg上述纳米材料MSNs/HAP-NH₂均匀分散在25％乙醇水溶液中，以600r/min搅拌30min后，逐滴加入100mg阿霉素(DOX)水溶液，继续在室温下搅拌12～36h，产物通过离心，洗涤后，真空干燥得到负载药物的复合纳米材料DOX-MSNs/HAP。

(4)将80mg(0.1mmol)的透明质酸(HA)的分散在25～35℃的水(50mL)中，以600r/min下搅拌0.5h使其均匀分散。在冰浴条件下，加入100mg(0.5mmol)EDCI的水溶液，以600r/min下搅拌0.5h后，再加入60mg(0.5mmol)NHS，以600r/min下搅拌0.5～1.5h，然后加入175mg DOX-MSNs/HAP纳米材料，在室温下反应12～36h。最后混合溶液通过离心、洗涤、干燥后，得到透明质酸修饰的载药复合纳米材料。(776Da寡多糖透明质酸：oHA-DOX@MSNs/HAP；1.5MDa透明质酸：HA-DOX@MSNs/HAP)

进一步，本发明提供上述制备方法得到的透明质酸修饰的载药复合纳米材料。并对所述材料结构、大小和形态等基本性能分别采用傅里叶红外光谱仪(FT-IR)、Zeta电位分析仪、透射电子显微镜(TEM)进行表征。其对抗癌药物负载能力的大小通过紫外分光光度计、荧光显微镜进行验证，并通过体外细胞实验、流式细胞术、蛋白质印迹法(WesternBlot)来检测该纳米材料的靶向治疗效果。此外，还通过细胞实验来评价这一可定向传输抗癌药物到肿瘤细胞的靶向体系，即采用非洲绿猴肾细胞(COS-7)、乳腺肿瘤细胞(4T1)、乳腺肿瘤细胞(MCF-7)、人肝肿瘤细胞(HepG2)来进行体外的细胞毒性实验，以测定表面修饰透明质酸的载药羟基磷灰石对不同细胞的细胞毒性。其中COS-7为正常细胞，其CD44表达量低且未被激活，4T1、MCF-7，HeLa以及HepG2为肿瘤细胞，将两组进行对比实验。

下述非限制性实施例用于对本发明做进一步的说明，但不应当理解为对本发明内容任何形式的限定。

实施例1.oHA-DOX@MSNs/HAP及HA-DOX@MSNs/HAP的制备

1.1二氧化硅-羟磷灰石复合纳米材料(MSNs/HAP)的合成

采用水热合成方法，向pH为10.5的25％乙醇的50mL去离子水溶液中，加入150mg的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，以600r/min继续搅拌15min；然后，0.235g硝酸钙[Ca(NO₃)₂]加入到上述混合溶液中，在70℃下快速搅拌30min后；0.6g硅烷四乙酯和0.099g磷酸氢二铵极其缓慢的加入到得到的混合溶液中，经剧烈搅拌分散均匀后，在95℃下回流12小时。将上述得到的溶液通过高速离心，得到的离心物质分别通过水、乙醇洗涤干燥后，在650℃下煅烧8小时，得到二氧化硅-羟磷灰石复合纳米材料MSNs/HAP。

1.2表面氨基化的复合纳米材料(MSNs/HAP-NH₂)的合成

采用硅烷偶联剂进行材料表面的氨基化修饰：将150mg氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)加入到25％(w/w)乙醇的50mL去离子水溶液中，在室温下搅拌30min，然后加入200mg上述得到的复合纳米材料MSNs/HAP，并超声5min分散均匀纳米材料，室温下搅拌2h后，调节pH值至10.5，继续反应4h后离心分离，得到的沉降物通过超纯水和无水乙醇充分洗涤3次后，真空干燥得到氨基化的复合纳米材料MSNs/HAP-NH₂。

1.3载药复合纳米材料(DOX-MSNs/HAP)的制备

将200mg上述MSNs/HAP-NH₂纳米材料均匀分散在50mL的25％(w/w)乙醇水溶液中，以600r/min搅拌30min后，逐滴加入分散有50mg阿霉素(DOX)的水溶液，继续在室温下搅拌24h，产物通过离心，洗涤后，真空干燥得到负载药物的复合纳米材料DOX-MSNs/HAP。

1.4透明质酸修饰的载药复合纳米材料的合成

将80mg(0.1mmol)的透明质酸(HA)的分散在30mL的30℃水中，以600r/min下搅拌0.5h使其均匀分散。在冰浴条件下，加入100mg(0.5mmol)EDCI的水溶液，以600r/min下搅拌0.5h后，再加入60mg(0.5mmol)NHS，以600r/min下搅拌1h，然后加入得到175mg DOX-MSNs/HAP纳米材料，在室温下反应24h。最后将得到混合溶液通过离心、洗涤、干燥后，得到透明质酸修饰的载药复合纳米材料。

776 Da寡多糖透明质酸：oHA-DOX@MSNs/HAP，

1.5 MDa透明质酸：HA-DOX@MSNs/HAP。

实施例2.纳米材料基本性能的测试

本实施例对各类纳米粒子纳米材料的基本性能进行了测试，参与测试的纳米粒子纳米材料均为实施例1中所制备得到，包括：

二氧化硅-羟磷灰石复合纳米材料：MSNs/HAP；

氨基化二氧化硅-羟磷灰石复合纳米材料：MSNs/HAP-NH₂；

载药复合纳米材料：DOX-MSNs/HAP

透明质酸修饰的载药复合纳米材料I：oHA-DOX@MSNs/HAP，776Da寡多糖透明质酸；

透明质酸修饰的载药复合纳米材料II：HA-DOX@MSNs/HAP，1.5MDa透明质酸。

2.1纳米材料大小和形态的测试

采用透射电子显微镜来观察确定实施例1所制备的各种纳米材料的形态及尺寸，测试结果如图1。可见，通过水热法的方法合成的MSNs/HAP、DOX-MSNs/HAP、oHA-DOX@MSNs/HAP、HA-DOX@MSNs/HAP纳米材料，其形态为球状，平均粒径分别是75nm、77nm、85nm、100nm，分散性好。

2.2透明质酸修饰的二氧化硅-羟磷灰石载药纳米材料动态光散射及稳定性的测试

采用动态光散射测定的方法来确定实施例1得到的各种纳米材料的水合粒径以及稳定性，测试结果见图2和图3。从MSNs/HAP、DOX-MSNs/HAP、oHA-DOX@MSNs/HAP、HA-DOX@MSNs/HAP纳米材料的动态光散射结果可以看出，其粒径大小随着修饰的进行，逐渐增大，从PDI指数来看，其纳米材料的分散性和稳定性在14天表现出优异的稳定性。

2.3透明质酸修饰的二氧化硅-羟磷灰石载药纳米材料的组成测定

采用X射线衍射(XRD)的方法来确定实施例1得到的纳米材料MSNs/HAP与DOX@MSNs/HAP的纳米组成，测试结果见图4。从XRD结果与二氧化硅、羟磷灰石标准卡片比对，可以验证由该制备方法得到的复合纳米材料中同时含有二氧化硅和羟磷灰石两者组分。

2.4高级傅里叶变换红外光谱测定

采用高级傅里叶变换红外光谱(FT-IR)的方法来确定实施例1得到的各种纳米材料的特征官能团。取5mg透明质酸修饰的二氧化硅-羟磷灰石载药纳米材料样品在玛瑙研钵中与干燥的溴化钾粉末(A.R.级)混合并研磨成细粉末，装入模具中，在压片机上压制成片后在6700FTIR(Thermo Fisher，USA)上测试。测试参数为：光谱范围7800-350cm^-1，分辨率0.09cm^-1，温度25℃。测试结果如图5所示，和MSNs/HAP的FTIR光谱图比较，DOX@MSNs/HAP和oHA-DOX@MSNs/HAP在1641cm^-1，1590cm^-1和1490cm^-1处的峰是羧基的伸缩振动和平面弯曲振动。此外，612cm^-1处的峰是HAP羰基的伸缩振动，1002cm^-1处的峰是HAP的PO₄ ^3-特征峰。说明药物和透明质酸很好的修饰到材料的表面。

2.5 Zeta电位的测定

采用Zeta电位分析仪(Nanozs90，UK)测定Zeta电位的方法确定实施例1得到的各种纳米材料的电位变化情况。测试参数为：温度25℃，测试数遍取平均值。测试结果如图6所示，由于二氧化硅-羟磷灰石复合纳米材料MSNs/HAP几乎是电中性的，故测其Zeta电位接近于零，将其氨基化后，其Zeta电位为正电性(MSNs/HAP-NH₂)，与阿霉素掺杂后(DOX-MSNs/HAP)，电位变化不大；透明质酸本身为负电性，在负载阿霉素的二氧化硅-羟磷灰石纳米材料表面修饰透明质酸后(oHA-DOX-MSNs/HAP和HA-DOX-MSNs/HAP)，电位发生变化，Zeta值由正电性转化为负电性，表明透明质酸分子已经成功的修饰在DOX-MSNs/HAP纳米颗粒表面。

2.6纳米比表面积测定及介孔分析

采用N₂吸脱附实验测定比表面积的方法确定实施例1得到的纳米材料MSNs/HAP和DOX@MSNs/HAP的比表面积大小及介孔粒径大小，其中得到的N₂吸脱附数据经BET模拟可以进行介孔分析并得出介孔大小理论值。测试结果如图7所示，未进行药物负载的MSNs/HAP的比表面积大约为500m²/g，负载后的DOX-MSNs/HAP的比表面积大大降低，低于30m²/g；通过BET方程模拟得到，MSNs/HAP主要分布了两种孔：2.75nm和14.26nm，而负载药物后的DOX-MSNs/HAP几乎没有检测到强的孔径信号峰。

实施例3.透明质酸修饰的二氧化硅-羟磷灰石载药纳米材料中药物释放测试

将制备得到的纳米材料DOX@MSNs/HAP分别分散在pH为5.5，6.0，6.5及7.4的不同乙醇水(2:8，v/v)溶液中，在600r/min下搅拌，测量纳米材料在酸性或者中性环境中不同时间下释放药物后混合溶液中所负载药物(本发明中药物为阿霉素)的吸收值，计算得到相对应的药物释放。如图8所示，药物释放随着时间不断增加，在12小时左右达到相对应的最大药物释放量；此外，在同一时间点比较药物释放量，发现随着pH的不断降低，其药物释放量不断增大，阿霉素的吸收值信号不断增强。肿瘤细胞的微环境pH值为6.4～6.8之间，本发明设计制备的纳米材料在pH＝6.5时，其药物的最大释放量达到了50％；在pH＝6.0时，最大释放量达到了78％以上。由此说明，合成的该复合纳米材料可以有效地进行药物缓慢释放，从而达到治疗肿瘤细胞的效果。

实施例4.透明质酸修饰的二氧化硅-羟磷灰石载药纳米材料细胞毒性测试

本实验选用噻唑蓝MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)分析法，以细胞的存活率来评估染料对细胞的毒性大小。分别将对数生长期的COS-7，4T1、MCF-7以及HepG2细胞以每毫升1×10⁵个细胞浓度接种于96孔板中，每孔加入10μL，于37℃、5％CO₂条件下培养24h，分别加入0.08、0.17、0.34、0.68、1.25、2.5、5、10、20mg DOX/L的药物载体oHA-DOX@MSNs/HAP或者HA-DOX@MSNs/HAP，相同条件下再培养24h后弃去原培养液，每孔加入MTT溶液(10μL，5mg/mL)孵育4h后，小心吸掉孔内上清液并加入200μL的DMSO，待甲瓒结晶完全溶解后，在酶标仪上测定570nm的吸光值OD，选择490nm作为参考波长，平行测定三次。细胞存活率＝(OD_实验组-OD_空白对照)/(OD_阳性对照-OD_空白对照)×100％，空白对照为不加药物载体组。细胞毒性是衡量纳米材料用于活细胞成像性能好坏的一项重要指标。测试结果如图9所示，从中可以看出，5mg/L oHA-DOX@MSNs/HAP纳米材料与COS-7、HepG2、4T1以及MCF-7细胞共培养24h之后，细胞存活率分别在107.6％、42.3％、40.9％、42.9％左右，表明该纳米材料对正常细胞具有较低的细胞毒性，对CD44过表达的肿瘤细胞具有高细胞毒性。具体的细胞毒性可以从下表1得出：

表1

注：其中IC₅₀为一定浓度的某种药物诱导肿瘤细胞凋亡50％，该浓度称为50％抑制浓度，即凋亡细胞与全部细胞数之比等于50％时所对应的浓度。

实施例5.透明质酸修饰的二氧化硅-羟磷灰石载药纳米材料体外吸收的细胞成像实验

实验过程中用到的细胞主要有非洲绿猴肾细胞(COS-7)、乳腺肿瘤细胞(4T1)、乳腺肿瘤细胞(MCF-7)、人肝肿瘤细胞(HepG2)。

细胞孵育：待贴壁生长的细胞长满瓶底，倒掉培养瓶中的培养液，并用PBS缓冲溶液洗两次。加入适量胰酶进行消化，然后加入新鲜的培养基吹掉贴壁细胞，弃去部分细胞悬液，再加入适量新鲜的培养基，放置在37℃，5％CO₂的细胞孵育箱中培养。细胞培养基为加入10％的胎牛血清和0.1％的硫酸庆大霉素的DMEM培养基。实验操作过程中，在细胞培养皿中以每毫升2×10⁵个细胞密度种上细胞，置于培养箱中培养，待用。

进行细胞成像时，将12μL母液(10mg/mL)加入到细胞培养皿中，在37℃及5％CO₂条件下培养30min后小心地用PBS溶液冲洗除去未进入细胞的染料，加入2mL新DMEM培养基后在Olympus FV1000-IX81激光共聚焦荧光显微镜下进行观察明场和荧光图像。测试结果如图10和图11所示，从中可以看出，纳米材料4h后，几乎没有进入CD44低表达或未被激活的细胞(COS-7)。在三种肿瘤细胞中，细胞孵育2h后，由图可见细胞对HA-DOX@MSNs/HAP的摄取很少，而oHA-DOX@MSNs/HAP已经有很明显的细胞摄取，其中DOX红色通道出现明显的红色荧光信号。4h后，oHA-DOX@MSNs/HAP经细胞摄取释放的DOX已经很快地进入了细胞核，实现了负载药物的释放，敏化了药物治疗效果。以上实验结果表明，纳米材料oHA-DOX@MSNs/HAP能够特异性识别CD44过表达的细胞，并且对肿瘤细胞有着极强的药物释放效率。

实施例6.透明质酸修饰的二氧化硅-羟磷灰石载药纳米材料的细胞凋亡测试

实验过程中用到的细胞主要有非洲绿猴肾细胞(COS-7)、乳腺肿瘤细胞(4T1)、人肝肿瘤细胞(HepG2)。

细胞孵育：待贴壁生长的细胞长满瓶底，倒掉培养瓶中的培养液，并用PBS缓冲溶液洗两次。加入适量胰酶进行消化，然后加入新鲜的培养基吹掉贴壁细胞，弃去部分细胞悬液，再加入适量新鲜的培养基，放置在37℃，5％CO₂的细胞孵育箱中培养。细胞培养基为加入10％的胎牛血清和0.1％的硫酸庆大霉素的DMEM培养基。操作过程中，在细胞培养皿中以每毫升2×10⁵个细胞密度种细胞，置于培养箱中培养，待用。

进行细胞凋亡测试时，将12μL母液(包括DOX水溶液、DOX-MSNs/HAP、oHA-DOX@MSNs/HAP、HA-DOX@MSNs/HAP；10mg DOX/mL)加入到细胞培养皿中，在37℃及5％CO₂条件下培养12h后小心地用PBS溶液冲洗除去未进入细胞的纳米材料，加入2mL胰酶进行消化，3min后将弃去胰酶，吹打下细胞，分散在PBS内，加入AV-PI凋亡测试试剂，在流式细胞仪上进行测试。测试结果如图12所示，DOX对细胞没有选择性，对正常细胞COS-7和肿瘤细胞4T1、MCF-7和HepG2均表现出很强的细胞毒性；DOX-MSNs/HAP由于没有靶标，表现出了对肿瘤的微酸性环境的纳米药物酸性释放性能，在肿瘤细胞中表现出了很明显的早期凋亡信号，在正常细胞中几乎没有毒性；HA-DOX@MSNs/HAP与DOX@MSNs/HAP相比，靶向能力增强了，但远不如oHA-DOX@MSNs/HAP的促凋亡作用，oHA-DOX@MSNs/HAP处理组中实现对肿瘤细胞更强的治疗作用，其早期凋亡和凋亡致死的比例为85.9％，高于38％(HA-DOX@MSNs/HAP组)。以上实验结果表明，寡多糖透明质酸修饰的二氧化硅-羟磷灰石载药纳米材料oHA-DOX@MSNs/HAP能够特异性识别肿瘤部位的CD44过表达的细胞，并且对肿瘤细胞有着极强的药物释放效率，能够很快的实现DOX在肿瘤细胞的积累，更快的进入细胞核中，证实纳米材料oHA-DOX@MSNs/HAP具有应用到治疗肿瘤的能力。

Claims (10)

1.透明质酸修饰的载药复合纳米材料的制备方法，包括下述步骤：

①制备含有介孔的二氧化硅-羟基磷灰石复合纳米材料；

②以硅烷偶联剂对所得二氧化硅-羟基磷灰石复合纳米材料进行表面氨基化处理，得到氨基化的复合纳米材料；

③药物与氨基化的复合纳米材料在溶液中混合，制备表面氨基化的载药复合纳米材料；

④以透明质酸对上述氨基化的载药复合纳米材料进行表面修饰。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的二氧化硅-羟基磷灰石复合纳米材料由硝酸钙、磷酸氢二铵、硅酸四乙酯、聚乙烯吡咯烷酮和十六烷基三甲基溴化铵制备而成。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的硝酸钙、磷酸氢二铵、硅酸四乙酯、聚乙烯吡咯烷酮和十六烷基三甲基溴化铵的摩尔比为1:0.5～1:2～5:0.005～0.015:0.05～0.3。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所制得的二氧化硅-羟基磷灰石复合纳米材料为球状颗粒，粒径50～80nm，比表面积不低于300m²/g。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的药物为抗肿瘤药物，选自阿霉素、紫杉醇、顺铂、吉西他滨、氟尿嘧啶、盖诺、表阿霉素、环磷酰胺、长春新碱、博莱霉素和多帕菲。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤③是在室温条件下，将药物与氨基化的复合纳米材料在乙醇-水体系中搅拌反应12～36h。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的透明质酸是寡多糖透明质酸。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述的透明质酸与氨基化的载药复合纳米材料通过共价键进行连接。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤④为：透明质酸通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺进行活化后，与氨基化的载药复合纳米材料在水中反应3-12h。

10.权利要求1～9中任一权利要求所述的方法制备的透明质酸修饰的载药复合纳米材料。