KR102523962B1 - 표면 아민화 메조다공성 실리카 나노입자, 이의 제조방법 및 용도 - Google Patents

표면 아민화 메조다공성 실리카 나노입자, 이의 제조방법 및 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR102523962B1
KR102523962B1 KR1020200120002A KR20200120002A KR102523962B1 KR 102523962 B1 KR102523962 B1 KR 102523962B1 KR 1020200120002 A KR1020200120002 A KR 1020200120002A KR 20200120002 A KR20200120002 A KR 20200120002A KR 102523962 B1 KR102523962 B1 KR 102523962B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cas9
silica nanoparticles
rnp
lps
mesoporous silica
Prior art date
Application number
KR1020200120002A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20220037265A (ko
Inventor
이효진
김성찬
정영도
Original Assignee
한국과학기술연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국과학기술연구원 filed Critical 한국과학기술연구원
Priority to KR1020200120002A priority Critical patent/KR102523962B1/ko
Priority to US17/384,913 priority patent/US20220087947A1/en
Publication of KR20220037265A publication Critical patent/KR20220037265A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102523962B1 publication Critical patent/KR102523962B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01B—NON-METALLIC ELEMENTS; COMPOUNDS THEREOF; METALLOIDS OR COMPOUNDS THEREOF NOT COVERED BY SUBCLASS C01C
    • C01B33/00—Silicon; Compounds thereof
    • C01B33/113—Silicon oxides; Hydrates thereof
    • C01B33/12—Silica; Hydrates thereof, e.g. lepidoic silicic acid
    • C01B33/18—Preparation of finely divided silica neither in sol nor in gel form; After-treatment thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5115—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6923—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being an inorganic particle, e.g. ceramic particles, silica particles, ferrite or synsorb
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01P—INDEXING SCHEME RELATING TO STRUCTURAL AND PHYSICAL ASPECTS OF SOLID INORGANIC COMPOUNDS
    • C01P2004/00—Particle morphology
    • C01P2004/30—Particle morphology extending in three dimensions
    • C01P2004/32—Spheres
    • C01P2004/34—Spheres hollow
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01P—INDEXING SCHEME RELATING TO STRUCTURAL AND PHYSICAL ASPECTS OF SOLID INORGANIC COMPOUNDS
    • C01P2004/00—Particle morphology
    • C01P2004/60—Particles characterised by their size
    • C01P2004/64—Nanometer sized, i.e. from 1-100 nanometer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/31—Combination therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Ceramic Engineering (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

표면 아민화 메조다공성 실리카 나노입자의 제조방법, 상기 제조방법에 의해 제조된 표면 아민화 메조다공성 실리카 나노입자, 상기 나노입자의 리보핵단백질 전달용 용도, 및 상기 나노입자에 리보핵단백질을 담지하는 방법을 제공한다.

Description

표면 아민화 메조다공성 실리카 나노입자, 이의 제조방법 및 용도{Surface aminated mesoporous silica nanoparticles, preparation method and use thereof}
표면 아민화 메조다공성 실리카 나노입자의 제조방법, 상기 제조방법에 의해 제조된 표면 아민화 메조다공성 실리카 나노입자, 상기 나노입자의 리보핵단백질 전달용 용도, 및 상기 나노입자에 리보핵단백질을 담지하는 방법에 관한 것이다.
이상증식에서의 유전자 융합은 보통 2종 이상의 독립적 인 유전자의 염색체 재배열을 통해 발생하여 조직 이상 및 종양 발생을 유도한다. 따라서, 암의 병리학적 메커니즘을 이해하고 질병을 치료하기 위해, 많은 연구에서 융합 유전자가 암 세포의 기능, 성장 및 분화를 어떻게 제어하는지 결정하는 데 중점을 두었다.
융합 유전자 중에서, FGFR3 (fibroblast growth factor receptor 3) 및 TACC3 (transforming acidic coiled-coil containing protein 3)로 구성된 유전자는 교모세포종, 폐선암종, 방광암 및 자궁경부암 환자와 같은 다양한 암 환자에서 확인되었으며, 종양 형성과 유의하게 관련되어있다. 융합 유전자 및 단백질의 발현은 이들의 종양-특이적 발현으로 인해 다른 단백질보다 더 높은 조직-특이성을 나타내므로, 엄청난 진단적 및 치료적 이점을 제공한다.
FGFR3-TACC3 (F-T) 융합 유전자는 FGFR3 및 TACC3의 유전자 발현 패턴을 보존하며, 정상 조직과 비교하여 종양에서 고도로 발현된다. 또한, MAPK (mitogen-activated protein kinase)/ERK (extracellular-regulated kinase) 및 PI3K (phosphatidylinositol 3-kinase) / Akt 신호를 포함하는 발암성 경로를 활성화하며, 이는 또한 FGFR3 및 TACC3 각각의 원래 역할에 고도로 연관성이 있다. F-T 융합 유전자의 기능은 FGFR3 및 TACC3 유전자의 기능과 매우 유사하지만, F-T 융합 유전자를 갖는 환자는 전통적인 FGFR 억제제 약물에 대해 제한된 민감성을 나타낸다. 따라서, 치료를 위해 다중유전자 (FGFR3 및 TACC3) 편집 및 새로운 억제제의 개발과 같은 새로운 대안적인 접근법이 요구된다. 그러나, 다중유전자 공학 전략은 신뢰할 수 있는 실질적인 플랫폼이 거의 없기 때문에 제한적이며, 현재, 그러한 전략과 관련된 유전자 요법은 바이러스, 플라스미드 및 siRNA의 사용과 같은 고전적인 치료 접근법에 대한 대안으로서 부족하다.
여기에서, 본 발명자들은 효율적인 다중유전자 엔지니어링을 위해 CRISPR/Cas9 기술을 적용하고 최적화했다. CRISPR/Cas9 기술을 사용한 유전자 편집 방법에는 몇 가지가 있다. 이들 중에서, Cas9/single-guide RNA (sgRNA) 리보핵단백질 (Cas9-RNP)은 Cas9 플라스미드 DNA/sgRNA 및 Cas9 mRNA/sgRNA 복합체와 비교하여 더 우수한 특이성 및 낮은 독성으로 인해 생체 내 적용에 대한 몇몇 이점을 갖는다. 또한, Cas9-RNP는 세포 전사 또는 번역 단계를 우회하여 신속하고 효율적인 유전자 편집을 가능하게 한다. Cas9-RNP의 장점은 명백하지만, 그 적용은 여전히 효소 분해로 인한 낮은 안정성, 강한 음전하로 인한 낮은 투과성, 큰 분자 크기 (> 160 kDa) 및 세포 내부에서 Cas9-RNP의 엔도솜 포획과 같은 몇 가지 한계에 여전히 직면하고 있다. 이들 인자는 전신 투여 후 특정 기관에서의 Cas9-RNP의 축적을 제한하고, 결국 생체 내에서 표적화된 유전자 편집의 효능을 감소시킨다. 따라서, 효율적인 세포 내 Cas9-RNP 전달을 위한 용이하고 편리한 전략이 필요하다.
표면 아민화 메조다공성 실리카 나노입자의 제조방법을 제공한다.
표면 아민화 메조다공성 실리카 나노입자에 RNP를 담지하는 방법을 제공한다.
표면 아민화 메조다공성 실리카 나노입자를 제공한다.
표면 아민화 메조다공성 실리카 나노입자 및 Cas9-RNP 결합체를 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 질병의 치료 방법을 제공한다.
일 양상은 표면 아민화 메조다공성 실리카 나노입자의 제조방법을 제공한다.
상기 제조방법은, (1) 양이온성 계면활성제를 염기성 용액에 용해시키는 단계;
(2) 상기 단계 (1)에서 제조된 용액에 실리카 전구체 용액을 첨가하고 교반하여 다공성 실리카 나노입자를 제조하는 단계;
(3) 상기 다공성 실리카 나노입자를 벤젠류 화합물 용액에 첨가하고 반응시켜 메조다공성 실리카 나노입자를 제조하는 단계; 및
(4) 상기 메조다공성 실리카 나노입자에 아민계 화합물 용액을 첨가하고 환류시켜 표면 아민화 메조다공성 실리카 나노입자를 제조하는 단계를 포함한다.
상기 단계 (1)은 양이온성 계면활성제를 염기성 용액에 용해시키는 단계이다.
상기 단계 (1)에서, 양이온성 계면활성제는 구조유도물질(Structure-directing agents, SDA)일 수 있다.
상기 단계 (1)에서, 양이온성 계면활성제는 나노입자의 구조유도물질로 사용될 수 있는 통상적인 양이온성 계면활성제라면 그 종류를 제한하지 않는다. 일 구체예에서, 상기 단계 (1)에서, 양이온성 계면활성제는 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드 (Cethyl trimethyl ammonium bromide, CTAB) 또는 세틸 트리메틸 암모늄 클로라이드 (Cethyl trimethyl ammonium chloride, CTAC)일 수 있다. 예를 들어, 상기 단계 (1)에서, 양이온성 계면활성제는 CTAB일 수 있다.
상기 단계 (1)에서, 염기성 용액은 pH 9 내지 13인 것일 수 있다. 상기 염기성 용액은 NaOH, KOH, NH4OH 또는 Tris를 포함하는 용액일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 단계 (2)는 상기 단계 (1)에서 제조된 용액에 실리카 전구체 용액을 첨가하고 교반하여 다공성 실리카 나노입자를 제조하는 단계이다. 상기 단계 (2)에 의해 제조된 다공성 실리카 나노입자는 단분산 다공성 실리카 나노입자일 수 있다. 상기 다공성 실리카 나노입자는 1 내지 5 nm의 평균 기공 크기, 예를 들어 약 3 nm의 평균 기공 크기를 갖는 것일 수 있다. 상기 다공성 실리카 나노입자는 40 내지 1000 nm, 40 내지 800 nm, 40 내지 500 nm, 40 내지 400 nm, 40 내지 300 nm, 100 내지 1000 nm, 100 내지 800 nm, 100 내지 500 nm, 100 내지 400 nm, 100 내지 300 nm, 150 내지 1000 nm, 150 내지 800 nm, 150 내지 500 nm, 150 내지 400 nm, 또는 150 내지 300 nm의 직경, 예를 들어 약 200 nm의 직경을 갖는 것일 수 있다.
상기 단계 (2)에서, 실리카 전구체는 테트라메틸 오르쏘실리케이트 (tetramethyl orthosilicate, TMOS), 테트라에틸 오르쏘실리케이트 (tetraethyl orthosilicate, TEOS), (3-글리시독시프로필)메틸디에톡시실란 ((3-glycidoxypropyl)methyldiethoxysilane, GPTMS), 3-메르캅토프로필 트리메톡시실란 (3-mercaptopropyl trimethoxysilane, MPS), γ-글리시딜옥시프로필 트리메톡시실란 (γ-glycidyloxypropyl trimethoxysilane, GOTMS), 또는 아미노페닐 트리메톡시실란 (aminophenyl trimethoxysilane, APTMOS)일 수 있다. 상기 실리카 전구체는 TMOS 또는 TEOS일 수 있다.
상기 실리카 전구체는 실온에서 액체 형태로 존재하는 것일 수 있다. 상기 실리카 전구체 용액은 실리카 전구체를 물, 알코올, 또는 이들의 혼합물에 용해시킨 것일 수 있다. 상기 알코올은 C1 내지 C10 알코올일 수 있다. 예를 들어, 상기 알코올은 에탄올 또는 메탄올일 수 있다.
상기 단계 (2)에서, 실리카 전구체 용액을 0.1mL/h 내지 10.0mL/h, 0.1mL/h 내지 5.0mL/h, 0.1mL/h 내지 1.0mL/h, 0.3mL/h 내지 10.0mL/h, 0.3mL/h 내지 5mL/h, 0.3mL/h 내지 1.0mL/h, 또는 0.3mL/h 내지 0.7mL/h의 유속으로 첨가하는 것일 수 있다. 예를 들어, TMOS 용액을 0.5mL/h의 유속으로 첨가할 수 있다. TMOS 용액의 첨가는 튜브 연결된 시린지 펌프를 사용하여 수행될 수 있으나, 일정한 유속으로 용액을 첨가할 수 있는 장치라면 그 종류를 제한하지 않고 사용할 수 있다. 유속이 과도하게 느리거나 빠른 경우, 나노입자 크기 및 기공 형성에 영향을 미칠 수 있다.
상기 단계 (2)에서, 교반은 1 내지 24시간, 1 내지 20시간, 1 내지 16시간, 1 내지 12시간, 1 내지 8시간, 2 내지 24시간, 2 내지 20시간, 2 내지 16시간, 2 내지 12시간, 2 내지 8시간, 4 내지 24시간, 4 내지 20시간, 4 내지 16시간, 4 내지 12시간, 또는 4 내지 8시간 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 단계 (2)에서 교반을 수행한 후에, 교반 없이 1 내지 24시간 동안 방치하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 단계 (2) 이후에, 다공성 실리카 나노입자를 원심분리하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 단계 (2) 이후에, 다공성 실리카 나노입자를 세척하는 단계를 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 단계는 원심분리된 다공성 실리카 나노입자를 세척하는 단계일 수 있다. 상기 세척은 당업자가 적절한 방법을 선택할 수 있으나, 예를 들어 알코올, 물, 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 세척은 에탄올 및 물을 사용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 단계 (3)은 상기 다공성 실리카 나노입자를 벤젠류 화합물 용액에 첨가하고 반응시켜 메조다공성 실리카 나노입자를 제조하는 단계이다. 상기 단계 (3)에 의해 제조된 메조다공성 실리카 나노입자는 15 내지 50 nm의 평균 기공 크기, 예를 들어 약 20 nm의 평균 기공 크기를 갖는 것일 수 있다. 일반적인 메조다공성 나노입자는 2 내지 50 nm의 평균 기공 크기를 갖는 것과 달리, 일 구체예에 따라 제조된 메조다공성 실리카 나노입자는 평균 기공 크기가 15 nm 이상, 바람직하게는 20 nm 이상이므로 매우 큰 기공 크기를 갖는다. 상기 다공성 실리카 나노입자는 40 내지 1000 nm, 40 내지 800 nm, 40 내지 500 nm, 40 내지 400 nm, 40 내지 300 nm, 100 내지 1000 nm, 100 내지 800 nm, 100 내지 500 nm, 100 내지 400 nm, 100 내지 300 nm, 150 내지 1000 nm, 150 내지 800 nm, 150 내지 500 nm, 150 내지 400 nm, 또는 150 내지 300 nm의 직경, 예를 들어 약 200 nm의 직경을 갖는 것일 수 있다.
상기 단계 (3)에서, 벤젠류 화합물은 벤젠, 트리메틸벤젠 (trimethylbenzene, TMB), 1,3,5-트리에틸벤젠 (1,3,5-triethylbenzene, TEB), TtBB (1,3,5-tri-tert-butylbenzene) 및 TiPB (1,3,5-Triisopropylbenzene)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 벤젠류 화합물은 TMB일 수 있다.
상기 단계 (3)에서, 상기 벤젠류 화합물 용액은 벤젠류 화합물, 알코올 및 증류수의 혼합물일 수 있다. 상기 벤젠류 화합물, 알코올 및 증류수의 부피비는 1~2:1~2:1~2일 수 있고, 예를 들어, 1:1:1일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 알코올은 예를 들어 에탄올일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 단계 (3)에서, 반응은 고온 조건에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 단계 (3)에서, 반응은 120 내지 200 ℃, 120 내지 180 ℃, 120 내지 160 ℃, 140 내지 200 ℃, 140 내지 180 ℃, 또는 140 내지 160 ℃에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 반응은 160 ℃에서 수행될 수 있다. 상기 반응 온도가 과도하게 낮거나 높은 경우, 나노입자의 기공확장이 잘 되지 않거나, 균일한 기공확장이 어려울 수 있다. 또한, 입자의 구조가 붕괴될 수 있다.
상기 단계 (3)에서, 반응은 24 내지 72 시간, 24 내지 60 시간, 24 내지 48 시간, 36 내지 72 시간, 36 내지 60 시간, 36 내지 48시간, 48 내지 72 시간, 또는 48 내지 60 시간 동안 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 반응은 48시간 동안 수행될 수 있다. 상기 반응 시간이 과도하게 짧거나 긴 경우, 나노입자의 기공확장이 잘 되지 않거나, 균일한 기공확장이 어려울 수 있다. 또한, 입자의 구조가 붕괴될 수 있다.
상기 단계 (3)에서, 반응은 임의의 반응용기에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 반응은 오토클레이브 또는 전기로(furnace)에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 단계 (3) 이후에, 메조다공성 실리카 나노입자를 세척하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 세척은 당업자가 적절한 방법을 선택할 수 있으나, 예를 들어 알코올, 물, 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 세척은 에탄올 및 물을 사용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 단계 (3) 이후에, 메조다공성 실리카 나노입자에 산성 용액을 첨가하고 환류시켜 양이온성 계면활성제를 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 산성 용액은 pH 1 내지 5인 것일 수 있다. 상기 산성 용액은 HCl을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 환류는 60 내지 180 ℃, 60 내지 150 ℃, 90 내지 180 ℃, 90 내지 150 ℃, 100 내지 180 ℃, 100 내지 150 ℃, 100 내지 140 ℃, 100 내지 130 ℃, 100 내지 120 ℃, 110 내지 180 ℃, 110 내지 150 ℃, 110 내지 140 ℃, 또는 110 내지 130 ℃에서 수행될 수 있다.
상기 단계 (4)는 상기 메조다공성 실리카 나노입자에 아민계 화합물 용액을 첨가하고 환류시켜 표면 아민화 메조다공성 실리카 나노입자를 제조하는 단계이다. 상기 단계 (4)에 의해 메조다공성 실리카 나노입자는 양으로 하전된 그룹으로 기능화될 수 있다. 따라서, 표면 아민화 메조다공성 실리카 나노입자는 정전 상호 작용을 통해 음전하를 갖는 물질을 담지할 수 있다.
상기 단계 (4)에서, 아민계 화합물은 실리카 나노입자를 양으로 하전된 그룹으로 기능화할 수 있는 것이라면 그 종류를 제한하지 않는다. 상기 아민계 화합물은 아민(-NH2)을 갖는 실란(silane) 화합물일 수 있다. 예를 들어, N(베타-아미노에틸)감마-아미노프로필메틸디메톡시실란 (N(beta-aminoethyl)gamma-aminopropylmethyldimethoxysilane, AEAPMDMS), N-[3-(트리메톡시실릴)프로필]에틸렌디아민, N1-(3-트리메톡시실릴프로필)디에틸렌트리아민, (3-아미노프로필)트리메톡시실란, N-[3-(트리메톡시실릴)프로필]아닐린, 트리메톡시[3-(메틸아미노)프로필]실란, 3-(2-아미노에틸아미노)프로필디메톡시메틸실란, TPPI (Trimethoxysilylpropyl modified polyethylenimine), p-아미노페닐트리메톡시실란, 1-아미노-2-(디메틸에톡시실릴)프로판으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.
상기 환류는 60 내지 180 ℃, 60 내지 150 ℃, 90 내지 180 ℃, 90 내지 150 ℃, 100 내지 180 ℃, 100 내지 150 ℃, 100 내지 140 ℃, 100 내지 130 ℃, 100 내지 120 ℃, 110 내지 180 ℃, 110 내지 150 ℃, 110 내지 140 ℃, 또는 110 내지 130 ℃에서 수행될 수 있다.
상기 단계 (4) 이후에, 표면 아민화 메조다공성 실리카 나노입자를 세척하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 세척은 당업자가 적절한 방법을 선택할 수 있으나, 예를 들어 알코올, 물, 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 세척은 에탄올 및 물을 사용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
다른 양상은 일 양상에 따른 제조방법에 의해 제조된 표면 아민화 메조다공성 실리카 나노입자 및 음전하를 갖는 물질을 혼합하는 단계를 포함하는, 표면 아민화 메조다공성 실리카 나노입자에 음전하를 갖는 물질을 담지하는 방법을 제공한다. 즉, 상기 방법은 표면 아민화 메조다공성 실리카 나노입자 및 음전하를 갖는 물질의 결합체를 제조하는 방법일 수 있다.
다른 양상은 일 양상에 따른 제조방법에 의해 제조된 표면 아민화 메조다공성 실리카 나노입자 및 리보핵단백질 (ribonucleoprotein, RNP)을 혼합하는 단계를 포함하는, 표면 아민화 메조다공성 실리카 나노입자에 RNP를 담지하는 방법을 제공한다. 즉, 상기 방법은 표면 아민화 메조다공성 실리카 나노입자 및 RNP의 결합체를 제조하는 방법일 수 있다.
상기 혼합은 온화한 온도에서 수행되는 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 혼합은 실온에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 실온은 당업계에서 통상적으로 사용되는 실온의 의미를 가지며, 예를 들어, 1 내지 35 ℃를 의미할 수 있다.
상기 혼합은 온화한 조건에서 수행되는 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 혼합은 임의의 용액 내에서 나노입자 및 음전하를 갖는 물질(예: RNP)를 10분 내지 3시간, 10분 내지 2시간, 10분 내지 1시간, 20분 내지 3시간, 20분 내지 2시간, 또는 20분 내지 1시간 동안 접촉시키는 것일 수 있다.
따라서, 상기 혼합은 실온에서 10분 내지 3시간 동안 수행되는 것일 수 있다.
상기 혼합에 따라 표면 아민화 메조다공성 실리카 나노입자와 음전하를 갖는 물질(예: RNP)의 정전 상호 작용에 의해 나노입자에 음전하를 갖는 물질이 담지될 수 있다.
일 양상에 따른 표면 아민화 메조다공성 실리카 나노입자에 음전하를 갖는 물질(예: RNP)를 담지하는 방법은 온화한 조건에서 수행되므로, 내부에 담지하는 물질이 Cas9과 같이 효소를 포함하는 경우 효소 활성이 유지될 수 있다.
다른 양상은 표면 아민화 메조다공성 실리카 나노입자를 제공한다.
상기 나노입자는 15 nm 이상 또는 20 nm 이상의 평균 기공 크기를 갖는 것일 수 있고, 15 내지 50 nm, 15 내지 40 nm, 15 내지 30 nm, 15 내지 25 nm, 20 내지 50 nm, 20 내지 40 nm, 20 내지 30nm, 20 내지 25 nm, 20 내지 23 nm, 20 내지 22 nm, 또는 20 내지 21 nm의 평균 기공 크기를 갖는 것일 수 있다. 따라서, 일 양상에 따른 나노입자는 2 내지 50 nm의 평균 기공 크기를 갖는 일반적인 메조다공성 입자 보다 더 큰 기공 크기를 갖는다.
상기 나노입자는 일 양상에 따른 제조방법에 의해 제조된 표면 아민화 메조다공성 실리카 나노입자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 표면 아민화 메조다공성 실리카 나노입자는 RNP 전달용인 것일 수 있다.
상기 RNP는 Cas 단백질-RNP일 수 있다. 상기 Cas 단백질은 Cas9, nCas9 (nickase Cas9), dCas9 (deactivated Cas9), Cas12, Cas13, Cpf1 또는 C2c2일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, Cas 단백질-RNP는 CRISPR/Cas9 single-guide RNA (sgRNA) 리보핵단백질, 즉, Cas9-RNP일 수 있다.
상기 나노입자는 150 nm 이상 또는 200 nm 이상의 직경을 갖는 것일 수 있고, 150 내지 500 nm, 150 내지 400 nm, 150 내지 300 nm, 150 내지 250 nm, 180 내지 500 nm, 180 내지 400 nm, 180 내지 300 nm, 180 내지 250 nm, 180 내지 220 nm, 200 내지 500 nm, 200 내지 400 nm, 200 내지 300 nm, 200 내지 250 nm, 또는 200 내지 220 nm의 직경을 갖는 것일 수 있다. 따라서, 일 양상에 따른 나노입자는 100 nm 이하의 직경을 갖는 일반적인 나노입자 보다 더 큰 직경을 갖는다.
상기 나노입자는 +20.0 내지 +30.0 mV의 제타 전위 (Zeta potential)를 갖는 것일 수 있고, +20.0 내지 +28.0 mV, +20.0 내지 +26.0 mV, +22.0 내지 +30.0 mV, +22.0 내지 +28.0 mV, +22.0 내지 +26.0 mV, +24.0 내지 +30.0 mV, +24.0 내지 +28.0 mV, +24.0 내지 +26.0 mV, 또는 +24.0 내지 +25.0 mV의 제타 전위를 갖는 것일 수 있다.
상기 나노입자는 상기와 같은 기공 크기, 직경 및 제타 전위 특성에 의해, 크기가 큰 음전하를 갖는 물질을 담지할 수 있다. 예를 들어, Cas9-RNP는 160 kDa의 큰 크기를 가지며 음전하를 갖는 물질인데, 일 양상에 따른 나노입자에 높은 용량으로 담지될 수 있다. 일 실시예에 따른 나노입자는 Cas9-RNP 로딩 용량이 pH 7.4에서 약 12.5%(w/w)인 것으로 확인되었으므로, 매우 우수한 로딩 용량을 갖는다.
상기 나노입자는 pH 7.0 내지 pH 8.0의 중성 pH 조건에서의 약물 방출 속도에 비해 pH 3.0 내지 pH 6.5, 예를 들어 pH 5.0 내지 pH 6.0의 산성 pH 조건에서 더 빠른 약물 방출 속도를 갖는 것일 수 있다. 일 실시예에 따른 나노입자는 12시간 동안 pH 7.4의 생리적 조건 하에서 5% 미만의 Cas9-RNP가 방출하는 반면, pH 6 및 pH 5에서 각각 30% 및 70%를 방출하였다. 이는 Cas9-RNP의 방출이 엔도솜 조건에 가까운 산성 환경에서 더 유리하다는 것을 나타낸다. 또한, 일 양상에 따른 나노입자의 서방 방출 특징은 생체 내 환경에서 장기간 높은 안전성으로 Cas9 단백질 활성을 유지할 수 있음을 나타낸다.
다른 양상은 일 양상에 따른 표면 아민화 메조다공성 실리카 나노입자 및 Cas9-RNP 결합체를 제공한다.
상기 결합체는 표면 아민화 메조다공성 실리카 나노입자에 Cas9-RNP가 담지된 것일 수 있다. 구체적으로, 표면 아민화 메조다공성 실리카 나노입자와 Cas9-RNP가 정전 상호 작용에 의해 결합된 것일 수 있다.
상기 Cas9-RNP는 1종 또는 2종 이상일 수 있다. Cas9-RNP가 2종 이상인 경우 Cas9-RNP에 포함되는 가이드 RNA의 종류가 서로 다른 것일 수 있다. 예를 들어, Cas9-RNP가 2종인 경우, 어느 하나는 임의의 특정 유전자를 표적으로 하는 가이드 RNA를 포함하고, 다른 하나는 그와 다른 유전자를 표적으로 하는 가이드 RNA를 포함할 수 있다.
다른 양상은 일 양상에 따른 표면 아민화 메조다공성 실리카 나노입자 및 Cas9-RNP 결합체를 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 질병의 치료 방법을 제공한다.
상기 표면 아민화 메조다공성 실리카 나노입자 및 Cas9-RNP 결합체에 대한 설명은 상술한 바와 같다.
상기 Cas9-RNP는 유전자 편집이 필요한 목적하는 유전자를 타겟으로 하는 가이드 RNA를 포함하는 것일 수 있다. 상기 가이드 RNA 서열은 특정 서열에 한정되지 않는다.
상기 "대상"은 질병의 치료가 필요한 개체를 의미한다. 상기 대상은 포유동물일 수 있고, 예를 들어 인간일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 "투여"는 목적 대상물을 대상에게 전달하는 행위를 의미한다. 투여량은 환자의 성별, 연령, 체중, 건강상태, 질병의 종류, 중증도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로, 치료 기간 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 상기 투여의 경로 및 방식은 특별히 제한되지 않으며, 목적하는 해당 부위에 상기 결합체가 도달할 수 있는 한 임의의 투여 경로 및 투여 방식에 따를 수 있다. 구체적으로 상기 결합체는 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 그 투여 경로의 비제한적인 예로는, 구강, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 또는 비측내 투여 등이 있다.
상기 "질병"은 유전자 편집에 의해 치료할 수 있는 질병이라면, 그 종류를 제한하지 않는다. 따라서, 상기 질병은 유전자 변이에 의해 발생하는 질병일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 질병은 융합유전자와 연관된 질병일 수 있다. 나노입자에 결합된 Cas9-RNP의 종류가 2종 이상인 경우, 융합유전자와 연관된 질병을 치료할 수 있다. 예를 들어, BCR-ABL 융합유전자는 만성골수백혈병에서 발견되는 융합유전자이며, FGFR3-TACC3 융합유전자는 자궁경부암에서 발견되는 융합유전자이다. 융합유전자는 원래 유전자와 유사한 특성을 갖지만, 융합유전자를 갖는 환자는 전통적인 억제제 약물에 대해 낮은 민감성을 나타내므로, 다중 유전자 공동 편집과 같은 새로운 대안이 필요하다. 일 양상에 따른 나노입자 및 Cas9-RNP 결합체는 Cas9-RNP 담지 능력 및 전달 능력이 뛰어나므로, 다중 유전자를 표적으로 하여 융합유전자와 연관된 질병을 치료할 수 있다.
상기 "치료"는 질병의 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
일 양상에 따른 제조방법에 의하면, 큰 기공 크기를 갖는 표면 아민화 메조다공성 실리카 나노입자를 제조할 수 있다.
다른 양상에 따른 표면 아민화 메조다공성 실리카 나노입자는 Cas9-RNP와 같은 크기가 큰 리보핵단백질을 담지할 수 있다.
따라서, 상기 표면 아민화 메조다공성 실리카 나노입자를 Cas9-RNP 전달체로 사용하여 유전자 편집에 의해 치료될 수 있는 다양한 질병의 치료에 활용할 수 있다.
도 1은 LPS-매개 CRISPR/Cas9 유전자 편집을 위한 작용 메커니즘 예시도이다.
도 2는 PS 및 LPS의 특성을 분석한 결과이다. (A) PS의 투과 전자 현미경 (transmission electron microscopy, TEM) 이미지. 스케일 바, 200 nm; (B) LPS의 투과 전자 현미경 이미지. 스케일 바, 200nm; (C) PS 및 LPS의 BET 표면적, 기공 부피, 평균 기공 크기, 제타 전위; (D) LPS에 로딩된 Cas9-RNP의 특성; (E) 시간에 따른 LPS의 Cas9-RNP 방출량.
도 3은 Cas9-RNP@LPS 및 Cas9-RNP를 각각 프로테아제와 함께 PBS에 분산시킨 후의 겔 이미지이다.
도 4는 PS 및 LPS의 농도에 따른 HeLa 세포의 생존력을 나타낸 그래프이다.
도 5는 (A) 처리 48 시간 후 세포질 또는 핵에서 Cas9 (적색) 및 LPS (녹색)에 상응하는 독립적인 형광 이미지. 이는 세포 내부의 LPS에 의한 Cas9-RNP의 전달 및 방출을 나타낸다. (B) Cas9-RNP@LPS로 48 시간 동안 처리된 HeLa 세포의 형광 이미지.
도 6은 Cas9-RNP의 세포 내 흡수를 나타낸 형광 이미지이다.
도 7은 GFP 발현의 정량화를 이용한 모델 유전자 편집 효능의 신속한 평가 원리를 나타낸 것이다.
도 8은 (A) Cas9-RNP/Lipo, Cas9-RNP@PS, Lipo, PS 및 LPS 단독으로 처리된 세포와 비교하여 Cas9-RNP@LPS로 처리된 세포에서 녹색 형광의 현저한 감소를 나타낸 결과. (+) 대조군은 일시적 유전자 녹다운을 위한 siRNA 처리 그룹이다; (B) 대조군과 비교하여 Cas9-RNP@LPS 처리된 세포에서 형광 신호와 상관된 세포 집단 히스토그램에서의 유의한 이동을 나타내는 유세포 분석 결과; (C) 비처리 대조군에 비해 Cas9-RNP@LPS (59.0%), Cas9-RNP@PS (20.7 %) 및 Cas9-RNP/Lipo (19.1 %)로 처리된 세포에서 평균 형광 강도의 백분율 감소를 나타내는 막대 그래프, **p<0.01.
도 9는 GFP 발현 및 세포 생존율의 정량화를 이용한 모델 유전자 편집 효능의 신속한 평가 결과를 나타낸 것이다. (A) 대조군에서의 형광; (B) 상이한 물질이 처리된 세포의 상대적인 세포 생존력.
도 10은 F-T 융합 유전자와 높은 유사성을 갖는 다중 유전자 표적화 실험 관련 도이다. (A) F-T 융합 유전자는 염색체 4에서 암호화된다; (B) FGFR3- 또는 TACC3- 표적화 Cas9-RNP로 처리 한 후 MTS 분석에 의해 상대 세포 증식을 분석한 결과; (C) 상대 카스파제 3/7 활성.
도 11은 Lipo-매개 Cas9-RNP 전달의 체계적인 최적화 실험 결과이다. (A) Lipo 단독으로 처리한 후의 상대적 세포 생존력; (B) 8XLipo는 Cas9-RNP@LPS에 비해 가장 높은 유전자 편집 효율을 허용하였다; (C) 효능 및 안전성을 고려하여, 4XLipo가 후속 연구에 적용되었다.
도 12는 in vitro 다중 유전자를 녹아웃시키는 효능을 평가한 결과이다. (a) RT-PCR 결과; (b) 웨스턴 블롯 결과, *p<0.05, **p<0.01; (c) FGFR3 및 TACC3의 녹아웃은 ERK 및 Akt 둘 다의 활성화를 억제함; (d, e) 차세대 시퀀싱에 의한 Cas9-RNP의 여러 잠재적 표적의 돌연변이 빈도 분석.
도 13은 (A) Cas9-RNP 또는 Cas9-RNP@LPS의 정맥 주사 후 실시간 전신 이미지; 및 (b) TEM 이미지이다.
도 14는 Cas9-RNP 또는 Cas9-RNP@LPS의 정맥 주사 후 실시간 전신 이미지이다. (A) 간, 폐, 비장, 신장, 심장, 종양에서의 형광 신호; (B) 간, 폐, 비장, 신장, 심장, 종양에서의 형광 신호; (C) 마우스 전신에서의 형광 신호.
도 15는 인간 암 이종 이식 마우스 모델에서 다중 유전자 (FGFR3 및 TACC3)에서의 게놈 편집에 의한 Cas9-RNP의 항종양 활성을 나타낸 도이다. **p<0.01, ***p<0.001.
도 16은 Cas9-RNP@LPS로 처리된 종양에서만 집중적인 아포토시스를 나타내는 헤마톡실린 및 에오신 염색을 나타낸 결과이다.
도 17은 Cas9-RNP@LPS 주사 후 주요 기관의 생존력을 나타낸 조직학적 이미지이다.
도 18은 F-T 융합 유전자 및 F-T 융합 유전자와 높은 유사성을 갖는 다중 유전자를 표적으로 한 비교 결과이다. (A) 웨스턴 블롯 결과; (B) 상대 세포 생존력; (C) 다중 유전자 표적화에 따른 돌연변이율.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료의 준비
세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드 (Cethyl trimethyl ammonium bromide, CTAB)는 Acros (New Jersey, USA)에서 구입하였다.
APTES (3-Aminopropyltriethoxysilane), TMOS (tetramethyl orthosilicate), 톨루엔, DMSO (dimethylsulfoxide), 메시틸렌 (trimethylbenzene, TMB)은 Sigma-Aldrich (St.Louis, MO, USA)로부터 구입하였다.
10xPBS (Phosphate buffered saline), DMEM (Dulbecco 's modified eagle 's medium), FBS (Fetal bovine serum) 및 P/S (penicillin and streptomycin, 100x)는 한국의 WELGENE에서 구입하였다.
CCK-8 분석 키트는 미국 Dojindo Molecular Technologies, Inc에서 구입하였다.
리포펙타민™ CRISPRMAX™ Cas9 형질감염 시약은 미국 ThermoFisher Scientific에서 구입하였다.
전체 RNA 분리를 위한 Trizol 및 Superscript II 역전사 효소는 Life Technology, USA에서 구입하였다.
프라이머 및 siRNA는 한국의 Bioneer에서 구입하였다.
Cas9 단백질 및 sgRNA는 한국의 ToolGen, Inc.에서 구입하였다.
비교예 및 실시예: Cas9-RNP 전달 플랫폼의 제조
비교예 1: 다공성 구조의 실리카 나노입자 (PS)의 제조
단분산 PS를 제조하기 위해, 염기성 용액 (1M NaOH)에 용해된 4g의 CTAB에 0.5mL/h에서 튜브 연결된 시린지 펌프를 사용하여 TMOS 용액을 첨가 한 후, 6시간 동안 교반 하고, 교반 없이 밤새 두었다. 합성된 생성물을 원심 분리하고 에탄올 및 물로 세척 하였다.
표면 개질을 위해, PS를 APTES 용액에 현탁시키고, 현탁액을 120 ℃에서 밤새 환류시키고, 에탄올 및 물로 세척하였다.
실시예 1: 큰 기공을 갖는 다공성 구조의 실리카 나노입자 (LPS)의 제조
20 nm 이상의 기공 크기를 갖는 다공성 구조의 실리카 나노입자를 제조하였다.
구체적으로, 염기성 용액 (1M NaOH)에 용해된 4g의 CTAB에 0.5mL/h에서 튜브 연결된 시린지 펌프를 사용하여 TMOS 용액을 첨가 한 후, 6시간 동안 교반 하고, 교반 없이 밤새 두었다. 합성된 생성물을 원심 분리하고 에탄올 및 물로 세척 하여 단분산 PS를 수득하였다.
LPS를 얻기 위해, 상기 수득된 PS를 TMB:EtOH:DW (1:1:1, v/v)의 혼합물에 용해시키고, 160 ℃에서 48 시간 동안 오토클레이브에서 반응시켰다. 생성된 분말을 에탄올 및 물로 세척하였다. CTAB를 제거하기 위해, 12M의 HCl을 에탄올 중 LPS에 첨가하고 120 ℃에서 밤새 환류시켰다.
표면 개질을 위해, LPS를 APTES 용액에 현탁시키고, 현탁액을 120 ℃에서 밤새 환류시키고, 에탄올 및 물로 세척하였다.
실험 방법
(1) PS 및 LPS의 특성 분석
PS 및 LPS의 기공 크기, 표면적 및 기공 부피를 질소 흡착 실험을 통해 분석하였다. 질소 흡착 등온선은 NOVA 표면적 분석기 (Nova 2200e, Quantachrome instrument, USA)를 사용하여 얻었다. 측정하기 전에, 샘플을 573K에서 12 시간 동안 탈기시켰다. 투과 전자 현미경 (TEM, JEM1010, JEOL, 일본)을 사용하여 형태학적 연구를 수행하였고, 제타 전위는 zetasizer NS90 (Malvern, UK)에 의해 측정되었다.
(2) 세포 배양
HeLa 세포주는 ATCC (American Tissue Culture Collection)으로부터 입수하였다. 세포를 10% 소태아 혈청 (FBS, S001-01, Welgene) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 (PS, LS202-02, Welgene)을 함유하는 DMEM (LM001-05, Welgene)에서 37 ℃에서 5% CO2의 조건으로 배양하였다. HeLa 세포를 0.05% 트립신 (LS015-01, Welgene)으로 세포 배양 플레이트로부터 단리 하였다. 10 μL의 세포 용액을 동일한 양의 트립토판 블루 (0.4%)로 염색하고, EVETM 세포 계수기 슬라이드 (EVS-050)에 펼치고 EVETM 자동 세포 계수기 (NanoEnTek)로 계수하였다.
(3) 세포 증식 분석
캐리어 시스템의 생체적합성을 검증하기 위해, Promega에서 구입한 CellTiter96 aqueous one solution cell proliferation assay (MTS, G5440)로 세포 증식 시험을 수행하였다. 세포 배양을 위해 96-웰 플레이트를 사용하였고, 세포를 각 웰당 10,000의 수로 시딩하였다. 세포를 PBS로 2 회 세척한 후, 동일한 양의 PBS에 증가하는 농도의 입자를 주입하였다. 그런 다음 제조업체의 지침에 따라 MTS 분석을 수행하였다. 37 ℃에서 30 분 동안 배양 한 후, Infinite F200 pro (TECAN, USA)로 형광 강도를 측정하였다.
(4) 유세포 분석
GFP 녹아웃 효율을 측정하기 위해, GFP-HeLa 세포 (3×104 세포/웰, 24-웰 플레이트)를 무혈청 배지 중의 복합체로 4 시간 동안 처리하였다. 이어서, 세포 배지를 혈청-함유 신선한 배지로 변경하고 44 시간 동안 인큐베이션 하였다. 1xPBS로 세척 한 후, 트립신-EDTA를 3 분 동안 처리 한 후 세포를 수집한 다음, 수집된 세포에 10% FBS를 첨가 하였다. 원심 분리 (1,200 rpm, 3 분) 후, 세포를 PBS로 세척하고 세포의 형광을 유세포 분석기, FACS Canto (Beckton Dickinson, USA)에 의해 측정하였다.
(5) 세포 이미징
LPS가 세포 내로 침투하고 리소좀을 형성하지 않고 LPS의 내부 내용물이 퍼져 있는지를 확인하기 위해, FITC-표지된 LPS 및 Cy5-표지된 Cas9 단백질을 제조한 다음, HeLa 세포 (2×104 세포/웰, 24-웰 플레이트)를 무혈청 배지 중의 복합체로 4 시간 동안 처리하였다. 세포 배지를 혈청-함유 신선한 배지로 변경하고 시간 의존적 모니터링을 위해 24 시간 및 48 시간 더 인큐베이션 하였다. 특정 시점에서, 세포를 4% 파라포름알데히드 (HP2031, biosesang, Korea)로 고정시키고, DAPI 염색 (H-1200, Vector Laboratories)하였다. 공 초점 현미경 (Zeiss)으로 형광 이미지를 모니터링하고 Image J 소프트웨어로 분석하였다.
(6) RT-PCR
TRIZOL 시약을 사용하여 각 샘플로부터 총 RNA를 분리 한 후, 사용설명서에 따라 Superscript™ 역전사효소를 사용하여 cDNA 합성을 수행하였다. 표적 유전자 증폭을 위해, 각각의 프라이머는 50% 미만의 GC 함량 및 표적 유전자의 2 개의 엑손 사이의 중첩을 고려하여 설계되었다. 1% 아가로스에서 겔 전기영동에 의해, PCR 산물을 분리하고 밴드를 모니터링 하였다.
(7) 웨스턴 블롯
샘플을 100x 프로테아제 억제제 칵테일을 함유하는 RIPA 완충액 (AKR-190, Koma)으로 용해시키고, 얼음에서 1 시간 동안 인큐베이션 하였다. 그 후, 샘플을 12,000 rpm 및 37 ℃에서 15 분 동안 원심분리하였다. 용액의 상부를 1.5 mL ep-튜브로 옮기고 -80 ℃에서 저장 하였다. 단백질 정량을 위해, PierceTM BCA 분석 키트 (# 23225, ThermoFisher Scientific)가 사용되었으며, 프로토콜은 제조업체의 지시에 따랐다. 동일한 양의 단백질을 각각 5x 로딩 완충제 (S2002, Biosesang)를 함유하는 물에 희석시키고 SDS-PAGE 겔 (Biorad)에 로딩하였다. Tris-Glycine SDS 완충액에서 80V에서 120 분 동안 전기 영동하여 단백질을 완전히 분리했다. SDS-PAGE 겔의 단백질을 교반 조건 하에 120 분 동안 50V, 4 ℃에서 10 % 메탄올과 함께 1x 트리스-글리신 네이티브 버퍼 (HT2028, Gendepot) 중 0.45 μm (# 1620145, biorad)의 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼다. 막을 3% BSA로 차단하여 비특이적 결합을 억제하고, 1 차 항체에 4 ℃에서 밤새 침지시켰다; GAPDH (ab9485, Abcam, 1 : 2500), TACC3 (sc-376883, Santa cruz, 1 : 1000) 및 FGFR3 (90313-T48, Sino, 1 : 1000). 토끼 (ab6721, Abcam, 1 : 5000) 및 마우스 (ab6789, abcam, 1 : 5000)와 반응성인 HRP (horse-Radish-Peroxidase)-접합된 항체를 2 차 항체로 사용하고 막을 1 시간 동안 인큐베이션 하였다. 검출제 EzWestLumi plus (WSE-7120L, ATTO Corporation)와의 반응 후, 단백질 밴드는 ImageQuant LAS 4000 mini에 의해 모니터링되었다.
(8) 게놈 DNA 시퀀싱
AccuPrep® Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer, Korea)를 이용하여 HeLa 세포로부터 게놈 DNA를 수집 하였다. 추출된 게놈 DNA를 서열 생성 라이브러리 생성을 위해 SUN-PCR 블렌드 (SUN GENETICS)를 사용하여 증폭시켰다. 라이브러리는 Mini-Seq 기기 (Illumina)를 사용하여 시퀀싱되었다. Mini-seq의 결과는 Cas-Analyzer 웹 도구 (http://www.rgenome.net/be-analyzer/)를 사용하여 분석되었다.
(9) 마우스 연구
모든 동물 실험은 한국과학기술연구원의 동물 관리위원회 (Institutional Animal Care and Use Committees, IACUC)에 따라 수행되었다. 실시간 생체 내 모니터링을 위해 Cy5-Cas9 및 Cy7-LPS를 제조하였다. 마우스의 오른쪽 옆구리에 HeLa 세포를 피하로 접종하고 무작위로 3 개의 그룹으로 나누었다. 2 주 인큐베이션 후, 각 그룹에 Cas9-RNP@LPS를 정맥 내 투여 하였다. 마우스로부터 명 시야 및 형광 이미지를 생체 내 형광 현미경을 사용하여 주기적으로 수득 하였다. 모든 획득 이미지는 형광 강도의 슈도-컬러링(pseudo-coloring)을 위해 작동되었다.
항종양 치료 효과를 조사하기 위해, 1 주일 번식 후 3 일마다 피하 주사로 Bala/c 누드 수컷 마우스에 1×106의 HeLa 암 세포를 이식함으로써 이종 이식 마우스 모델을 제조하였다. 항종양 효능은 15일 동안 유리 LPS, 유리 TACC3/Lipo, FGFR3/Lipo, TACC@LPS, FGFR3@LPS (6mg mL-1) 및 1x PBS의 주사 전/후 종양 부피의 변화를 측정함으로써 평가하였다 (n = 3). 종양 부피는 하기 공식을 사용하여 계산하였다: 종양 부피 = 길이 × (폭)2 × 1/2, 여기에서 길이 및 폭은 각각 종양의 가장 긴 직경 및 가장 짧은 직경 (mm)이다. 종양 부피는 초기 부피 (100 mm3)에 대해 계산되었다.
(10) 조직학적 분석
안락사된 마우스로부터 종양 조직을 추출하고, 고정을 위해 4 ℃에서 4% 파라포름알데히드 용액에서 인큐베이션 하였다. 조직을 파라핀 블록에 매립하고, 라이카 마이크로톰 (Leica Microtome)으로 5 μm 섹션으로 슬라이스 하였다. 조직 섹션을 조직학적으로 시각화하였다. 파라핀 섹션을 파라핀 제거를 위해 자일렌에 3 회 침지시키고, 일련의 감소하는 에틸 알코올로 수화시켰다. 헤마톡실린 및 에오신 염색을 위해, 섹션을 헤마톡실린 용액에 이어서 에오신 용액에 담갔다. 섹션을 장착 완충제 및 커버 슬립에 끼우고 광학 현미경 (Leica)으로 관찰하였다. 면역 형광 염색을 위해, 1 차 및 2 차 항체를 사용하여 표적 단백질을 특이적으로 모니터링 하였다. 먼저, 항원의 특이성 및 반응성을 증가시키기 위해, 탈 파라핀화 및 수화된 섹션을 메탄올 중 0.3 % H2O2로 30 분 동안 차단하고, 95 ℃에서 20 분 동안 시트레이트 완충제에 침지시켰다. 비특이적 결합을 방지하기 위해, 정적 조건에서 1 시간 동안 3% BSA로 절편을 차단하였다. 그 후, 섹션을 1 차 항체와 함께 4 ℃에서 밤새 인큐베이션 하였다; 항 -TACC3 (202326-T10, sino, 1 : 500), 항 -FGFR3 (90313-T48, sino, 1 : 500). 이차 항체 Alexa FluorTM 488 염소 항-토끼 IgG (H + L) (A-11008, Invitrogen, 1:5000)를 사용하고 1 시간 동안 처리하였다. 섹션은 DAPI (H-1200, Vector Laboratories)를 갖춘 Vectashield mounting medium으로 장착되었으며 LSM 700 공 초점 현미경 (Zeiss)을 사용하여 관찰되었다.
(11) 통계 및 데이터 분석
모든 통계적 분석은 unpaired t-test, GraphPad Prism 8 소프트웨어로 수행되었다. p<0.05는 유의한 것으로 간주되었다 (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 및 ****p<0.0001); n.s., 유의하지 않음). 모든 결과는 평균±표준 편차로 제공되었다.
(12) sgRNA의 디자인
CRISPR/Ca9 시스템의 sgRNA는 하기 표 1의 서열과 같이 설계하였다. 하기 실험에서는 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 6, 서열번호 9의 sgRNA를 사용하였다.
표적 유전자 sgRNA 서열 서열번호
GFP 5' CCAGGGCACGGGCAGCTTGCCGG 3' 1
5' GGCGAGGGCGATGCCACCTACGG 3' 2
FGFR3 5' ACGCGGCCAAGGGTAACCTGCGG 3' 3
5' GAAGGAGTAGTCCAGGCCCGGGG 3' 4
5' AGGTGTCGAAGGAGTAGTCCAGG 3' 5
TACC3 5' CGGAGTCTCCGCTTTGTGCTGGG 3' 6
5' AGACCCTAGAAGACCCTTGCAGG 3' 7
5' GCCGAGGAGGAATGCCGGCACGG 3' 8
F-T 5' TTCGAGCAGTACTCCCCGGGTGG 3' 9
실험 결과
도 1은 LPS-매개 CRISPR/Cas9 유전자 편집을 위한 작용 메커니즘 예시도이다.
본 발명자들은 높은 표면적 및 공동을 갖는 20 nm 이상의 큰 기공을 갖는 LPS를 합성하였다. 이어서 LPS는 정전 상호 작용을 통해 Cas9-RNP를 로딩 할 수 있는, 양으로 하전된 그룹으로 기능화되었다. LPS의 확장된 기공 및 높은 표면적은 충분한 내부 공간을 제공하여, 큰 단백질의 높은 로딩 용량을 가능하게 하고 단백질 분해 환경으로부터 Cas9-RNP를 보호한다.
중요하게는, Cas9-RNP@LPS 복합체의 합성 과정은 실온에서 온화한 혼합 및 반응과 같은 온화한 조건에서 달성되었으며, 이는 Cas9 단백질의 효소 활성을 유지하는데 기여한다. 존재하는 아민 작용기의 LPS 외부 표면 특성은 우수한 완충 용량에 기여할 뿐만 아니라, 세포 내 경로로부터의 탈출 확률을 향상시킬 수 있다. 또한, LPS의 내부 표면 기능성 및 Cas9-RNP의 음이온 특성은 pH 및 이온 강도의 변화에 의해 영향을 받을 수 있으므로, LPS 및 Cas9-RNP 간의 정전기 상호 작용 및 수소 결합 상호 작용의 감소를 통해 LPS로부터 Cas9-RNP의 방출을 가능하게 하였다. 따라서, 방출된 Cas9-RNP는 핵에 들어가서 부위-특이적 유전자 편집을 개시 할 수 있다. 또한, 생체 내 마우스 모델에서 종양 억제 및 돌연변이율의 NGS 분석을 모니터링함으로써 유전 공학의 효능을 평가하였다. 이하에서는 이를 확인한 구체적인 실험 과정을 나타내었다.
실험예 1: PS 및 LPS의 특성 분석
(1) PS 및 LPS의 특성
도 2는 PS 및 LPS의 특성을 분석한 결과이다. (A) PS의 투과 전자 현미경 (transmission electron microscopy, TEM) 이미지. 스케일 바, 200 nm; (B) LPS의 투과 전자 현미경 이미지. 스케일 바, 200nm; (C) PS 및 LPS의 BET 표면적, 기공 부피, 평균 기공 크기, 제타 전위; (D) LPS에 로딩된 Cas9-RNP의 특성; (E) 시간에 따른 LPS의 Cas9-RNP 방출량.
도 2A 및 2B에 나타낸 바와 같이, 투과 전자 현미경 (TEM) 이미지는 PS 및 LPS의 다공성 200 nm 크기의 입자 형태를 보여주었다.
도 2C에 나타낸 바와 같이, 질소 흡착 및 제타 전위 분석 결과에 따르면, 제조된 LPS가 확장된 기공 크기 (~ 21 nm)와 양의 표면 전하 (24.5 mV)를 가지는 것을 확인하였다. 이는 기공 내부에 Cas9-RNP의 로딩을 가능하게 할 것이다.
다음으로, 30분 동안 인산 완충 식염수 (PBS)에서 Cas9-RNP와 실시예 1에서 제조한 LPS를 간단히 혼합하여 Cas9-RNP가 로딩된 LPS (Cas9-RNP@LPS)를 수득하였다. LPS의 Cas9-RNP 로딩 용량은 비신코니닉산 (bicinchoninic acid, BCA) 분석을 사용하여 평가하였다.
도 2D에 나타낸 바와 같이, LPS의 Cas9-RNP 로딩 용량은 12.5% (w/w)이었다. 이전에 보고된 나노입자-기반 전달 시스템(Adv. Funct. Mater. 2017; 27(46): 1703036; J. Am. Chem. Soc. 2018; 140(1):143-136)들은 로딩 용량이 각각 6.3%, 1.2%인 것에 비해, 본 실시예에 따른 LPS는 로딩 용량이 더 크다.
다음으로, 본 발명자들은 24 시간 동안 모니터링하면서 흡수 분광법에 의해 다양한 pH 조건 하에서 LPS로부터 Cas9-RNP의 방출을 특성화 하였다.
도 2E에 나타낸 바와 같이, 12시간 동안 pH 7.4의 생리적 조건 하에서 5% 미만의 Cas9-RNP가 방출된 반면, pH 6 및 pH 5에서 각각 30% 및 70%가 방출되었다. 이는 Cas9-RNP의 방출은 엔도솜 조건에 가까운 산성 환경에서 더 유리하다는 것을 나타낸다. 또한, LPS의 이러한 서방 방출 현상은 생체 내 환경에서 장기간 높은 안정성으로 Cas9 단백질 활성을 유지하는데 유리하며, 다른 보고된 전달 시스템보다 우수하다.
(2) LPS 내부의 Cas9-RNP의 안정성 및 단백질 분해 환경에서의 LPS의 보호 효과 검증
생리학적 조건 하의 LPS 내부의 Cas9-RNP의 안정성 및 LPS의 보호 효과를 평가하기 위해, Cas9-RNP@LPS 및 Cas9-RNP를 각각 프로테아제와 함께 PBS에 분산시켰다.
도 3은 Cas9-RNP@LPS 및 Cas9-RNP를 각각 프로테아제와 함께 PBS에 분산시킨 후의 겔 이미지이다.
도 3에 나타낸 바와 같이, Cas9-RNP@LPS 처리군에서는 in vitro 절단 활성을 나타내었으나, Cas9-RNP 단독 처리군에서는 표적 DNA의 유의한 절단 밴드가 관찰되지 않았다. 이는 단백질 분해 환경에서 LPS에 의한 Cas9의 탁월한 보호 효과를 나타내며, 또한 방출된 Cas9 단백질이 여전히 활발하다는 것을 나타낸다.
(3) PS 및 LPS의 생체적합성 평가
다음으로, 본 발명자들은 PS와 LPS의 농도를 증가시키기 위해 HeLa를 사용하여 각 물질의 생체적합성을 테스트하였다.
도 4는 PS 및 LPS의 농도에 따른 HeLa 세포의 생존력을 나타낸 그래프이다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 모든 농도의 PS와 LPS에서 세포의 90% 이상이 생존 가능함을 확인했다. 이러한 Cas9-RNP@LPS의 우수한 생체적합성은 유전자 편집 플랫폼을 위한 LPS 플랫폼의 잠재력을 보장 할 수 있다.
실험예 2: Cas9-RNP의 세포 내 흡수 평가
Cas9-RNP@LPS의 세포 내 흡수를 평가하기 위해, Cas9-RNP@LPS 복합체의 형성 전에 Cas9 단백질을 Cy5로 표지하고 (Cy5-Cas9), LPS를 FAM으로 표지하였다 (FAM-LPS). HeLa 세포에 Cas9-RNP@LPS 복합체를 처리한 후, 형광현미경을 사용하여 세포를 시각화하였다.
도 5는 (A) 처리 48 시간 후 세포질 또는 핵에서 Cas9 (적색) 및 LPS (녹색)에 상응하는 독립적인 형광 이미지. 이는 세포 내부의 LPS에 의한 Cas9-RNP의 전달 및 방출을 나타낸다. (B) Cas9-RNP@LPS로 48 시간 동안 처리된 HeLa 세포의 형광 이미지.
도 6은 Cas9-RNP의 세포 내 흡수를 나타낸 형광 이미지이다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 처리 24 시간 후에 세포질 또는 핵 각각에서 Cas9 및 LPS에 상응하는 형광이 관찰되었다. 이는 세포 내부의 LPS로부터 Cas9-RNP의 성공적인 전달 및 방출을 나타낸다.
또한, 도 6에 나타낸 바와 같이, Cas9-RNP@LPS 복합체의 녹색 형광은 엔도솜과 병합된 색인 황색에서 분리되었으며, 적색 형광은 점차적으로 사라졌다. 이는 시간이 지남에 따라 세포질로 Cas9-RNP@LPS 복합체가 방출됨을 시사한다. 이 결과는 LPS가 표면 작용기의 완충 용량으로 인해 세포 내 경로를 벗어날 수 있는 능력을 나타냈다는 것을 의미한다.
실험예 3: Cas9-RNP의 in vitro 유전자 편집 효능 평가
살아있는 세포에서 LPS-매개 유전자 편집 효능을 평가하였다. 유전자 발현의 녹아웃을 정량적으로 측정하기 위해, 세포에서 돌연변이율을 신속하게 시각화 할 수 있는 모델 유전자로서 녹색 형광 단백질 (green fluorescence protein, GFP)을 우선적으로 선택하였다. GFP-발현 HeLa 세포를 무혈청 배지에서 24-웰 플레이트에 4 시간 동안 Cas9-RNP@LPS (1.25 μg의 Cas9)로 처리하고, 시험관 내 및 생체 외 적용에 적합한 조건을 충족시킨 후, 새로운 혈청 함유 배지로 교체 하였다. 통상적인 시약인 리포펙타민 (lipofectamine, Lipo)을 대조군으로 사용하였다. 형광 현미경 및 유세포 분석을 사용하여 세포의 형광 이미지를 관찰함으로써 상대 GFP 발현 수준을 추정하였다.
도 7은 GFP 발현의 정량화를 이용한 모델 유전자 편집 효능의 신속한 평가 원리를 나타낸 것이다.
도 8은 (A) Cas9-RNP/Lipo, Cas9-RNP@PS, Lipo, PS 및 LPS 단독으로 처리된 세포와 비교하여 Cas9-RNP@LPS로 처리된 세포에서 녹색 형광의 현저한 감소를 나타낸 결과. (+) 대조군은 일시적 유전자 녹다운을 위한 siRNA 처리 그룹이다; (B) 대조군과 비교하여 Cas9-RNP@LPS 처리된 세포에서 형광 신호와 상관된 세포 집단 히스토그램에서의 유의한 이동을 나타내는 유세포 분석 결과; (C) 비처리 대조군에 비해 Cas9-RNP@LPS (59.0%), Cas9-RNP@PS (20.7 %) 및 Cas9-RNP/Lipo (19.1 %)로 처리된 세포에서 평균 형광 강도의 백분율 감소를 나타내는 막대 그래프, **p<0.01.
도 9는 GFP 발현 및 세포 생존율의 정량화를 이용한 모델 유전자 편집 효능의 신속한 평가 결과를 나타낸 것이다. (A) 대조군에서의 형광; (B) 상이한 물질이 처리된 세포의 상대적인 세포 생존력.
도 8A 및 도 9A에 나타낸 바와 같이, Cas9-RNP/Lipo, Cas9-RNP@PS, Lipo, PS, LPS만 처리된 세포와 비교하여, Cas9-RNP@LPS로 처리된 세포에서 현저한 녹색 형광 감소가 관찰되었다.
도 8B에 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하여 Cas9-RNP@LPS 처리된 세포에서 형광 신호와 상관된 세포 집단 히스토그램에서의 상당한 이동을 관찰하였다.
도 8C에 나타낸 바와 같이, 평균 녹색 형광 강도도 Cas9-RNP@PS (20.7 %) 및 Cas9-RNP/Lipo (19.1)와 비교하여, 처리되지 않은 대조군에 비해 Cas9-RNP@LPS로 처리된 세포에서 유의하게 감소하여 59.0%까지 감소하였다.
도 9B에 나타낸 바와 같이, LPS-매개 Cas9-RNP 전달은 48 시간 동안 Cas9-RNP/Lipo (59.5%) 및 Lipo (81.3%) 단독과 비교하여, Lipo보다 더 높은 유전자 녹아웃 및 더 높은 세포 생존율 (99.5%)을 나타냈다. 이는 LPS는 독성이 낮은 효율적인 Cas9-RNP 전달 비히클임을 시사한다.
예비 결과에 기초하여, 본 발명자들은 F-T 융합 유전자와 높은 유사성을 갖는 다중 유전자, 즉 FGFR3 및 TACC3을 표적으로 하여 유전자 편집 효능을 조사하였다.
도 10은 F-T 융합 유전자와 높은 유사성을 갖는 다중 유전자 표적화 실험 관련 도이다. (A) F-T 융합 유전자는 염색체 4에서 암호화된다; (B) FGFR3- 또는 TACC3- 표적화 Cas9-RNP로 처리 한 후 MTS 분석에 의해 상대 세포 증식을 분석한 결과; (C) 상대 카스파제 3/7 활성.
도 11은 Lipo-매개 Cas9-RNP 전달의 체계적인 최적화 실험 결과이다. (A) Lipo 단독으로 처리한 후의 상대적 세포 생존력; (B) 8XLipo는 Cas9-RNP@LPS에 비해 가장 높은 유전자 편집 효율을 허용하였다; (C) 효능 및 안전성을 고려하여, 4XLipo가 후속 연구에 적용되었다.
도 12는 in vitro 다중 유전자를 녹아웃시키는 효능을 평가한 결과이다. (a) RT-PCR 결과; (b) 웨스턴 블롯 결과, *p<0.05, **p<0.01; (c) FGFR3 및 TACC3의 녹아웃은 ERK 및 Akt 둘 다의 활성화를 억제함; (d, e) 차세대 시퀀싱에 의한 Cas9-RNP의 여러 잠재적 표적의 돌연변이 빈도 분석.
도 10A에 나타낸 바와 같이, FAFR3 및 TACC3은 모두 염색체 4에 암호화되며 정상 세포의 다른 세포 위치에서 낮은 발현 수준을 보여준다. 그러나, 각 단백질이 유전자 융합에 의해 과발현 될 때, 세포 증식이 활성화되어 암으로 이어진다.
따라서, Cas9-RNP@LPS 복합체를 사용하여 다중 유전자를 절단함으로써, 증식 경로의 차단 및 아포토시스(apoptosis)를 유도하여 세포 사멸을 초래하는 치료 효과를 기대할 수 있다.
도 11에 나타낸 바와 같이, Cas9-RNP 전달 시스템의 정확한 비교를 위해, Lipo-매개 시험이 체계적으로 최적화되었고, 8XLipo가 가장 높은 유전자 편집 효율을 허용하지만 약간의 독성이 있었다. 따라서, 효능과 안전성을 모두 고려하여, 4XLipo를 후속 연구에 적용하였다.
FGFR3- 또는 TACC3-표적화 Cas9-RNP로 세포 처리 후 MTS 분석에 의해 상대 세포 증식을 분석하였다.
도 10B 및 10C에 나타낸 바와 같이, Lipo-매개 Cas9-RNP 복합체로 처리된 세포의 생존력은 FGFR3 및 TACC3 둘 다에 대해 80% 이상으로 유지되는 반면, Cas9-RNP@LPS 처리된 세포는 45% 생존력 미만으로 나타났다. LPS-매개된 RNP 처리된 그룹의 상대적 카스파제 (caspase) 3/7 활성은 Lipo-매개된 RNP 처리된 그룹의 것보다 5배 더 높았다.
효능은 HeLa 세포의 처리 48 시간 후에 각각 RT-PCR 및 웨스턴 블롯을 통해 mRNA 및 단백질 수준에서 추가로 평가되었다.
도 12A 및 12B에 나타낸 바와 같이, 예상한 바처럼 FGFR3 및 TACC3의 표적화는 유전자 발현에서 45% 및 40%까지 감소, 및 단백질 발현의 20% 미만의 감소를 초래한 반면, 비히클 단독 처리 또는 미처리 대조군은 유전자 편집을 초래하지 않았다.
F-T 융합 유전자가 MAPK/ERK 및 PI3K/Akt 신호와 같은 발암 경로의 활성화에 관여하기 때문에, 본 발명자들은 이러한 신호 전달 메커니즘에 대한 다중 유전자 편집의 영향을 조사했다.
도 12C에 나타낸 바와 같이, FGFR3 및 TACC3의 녹아웃은 ERK 및 Akt 둘 다의 활성화를 억제하였고, 이에 따라 인산화된 ERK (p-ERK) 및 인산화된 Akt (p-Akt)의 단백질 수준을 감소시켰다. 또한, 이것은 다중 유전자의 녹아웃이 ERK 및 Akt 신호 전달 경로의 억제를 통해 in vitro 및 in vivo에서 자궁경부암 성장을 억제 할 수 있음을 나타냈다.
다음으로, 본 발명자들은 NGS 분석에 의해 다중 유전자를 포함하는 Cas9-RNP의 잠재적 표적의 돌연변이 빈도를 분석하였다.
도 12D 및 12E에 나타낸 바와 같이, LPS-매개 Cas9-RNP 유전자 편집에 의해 FGFR 및 TACC3 유전자좌에서 돌연변이율이 48.9% 및 5.46% 이상임을 확인하였으며, 이는 Lipo-매개 편집에 비해 50 배 이상의 향상을 나타냈다. 그러나, LPS 단독, Lipo 단독 및 대조군에서는 유의한 돌연변이율 (0.1 % 미만)이 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 본 실시예에 따른 Cas9-RNP 전달 플랫폼의 높은 특이성뿐만 아니라 효율적인 다중 유전자 편집 기능을 종합적으로 보여준다.
실험예 4: Cas9-RNP@LPS-매개 유전자 요법의 in vivo 평가
(1) Cas9-RNP의 종양 특이적 세포 내 전달 확인
in vivo Cas9-RNP@LPS의 효능을 시험하기 위해, 본 발명자들은 먼저 HeLa 세포를 보유하는 이종 이식 마우스 모델에서 전신 투여에 따른 분포를 실험적으로 모니터링 하였다. Cas9-RNP@LPS 복합체의 형성 전에, Cas9 단백질 및 LPS를 각각 Cy5 (Cy5-Cas9) 및 Cy7 (Cy7-LPS)로 표지하였다. 100 ㎕의 멸균된 PBS 중의 HeLa 세포 (6×106 세포)의 현탁액을 Balb/c 수컷 누드 마우스 (5 주령)에 피하 주사하여 종양을 갖는 마우스를 제조하였다. 복합체의 정맥 주사 후 전신 영상화에 의해 각각의 형광을 모니터링한 다음, 마우스로부터 주요 기관을 절제하였다.
도 13은 (A) Cas9-RNP 또는 Cas9-RNP@LPS의 정맥 주사 후 실시간 전신 이미지; 및 (b) TEM 이미지이다.
도 14는 Cas9-RNP 또는 Cas9-RNP@LPS의 정맥 주사 후 실시간 전신 이미지이다. (A) 간, 폐, 비장, 신장, 심장, 종양에서의 형광 신호; (B) 간, 폐, 비장, 신장, 심장, 종양에서의 형광 신호; (C) 마우스 전신에서의 형광 신호.
도 13A 및 도 14에 나타낸 바와 같이, Cas9 단백질 및 LPS의 형광 신호는 종양에서 강하게 관찰되었지만, 간 및 폐에서는 약간 검출되었다. 더욱이, 유리 Cas9 처리된 종양에서 형광 신호는 Cas9 단백질의 분해 및 제거로 인해 사라졌다. 그러나, Cas9-RNP@LPS 처리된 종양에서의 형광 신호는 2 일 동안 유지되었다. 이 결과는 LPS가 Cas9-RNP의 지속 방출을 가능하게 하고 높은 안정성으로 Cas9 단백질 활성을 유지한다는 것을 나타낸다.
또한, 도 13B에 나타낸 바와 같이, TEM 이미지는 주변 핵 영역에서 Cas9-RNP@LPS 복합체의 세포 내 위치를 보여주었다.
종합적으로, 이들 결과는 Cas9-RNP@LPS에 의한 Cas9-RNP의 종양 특이적 세포 내 전달 활성이 오래 지속됨을 입증하였다. 따라서 Cas9-RNP@LPS는 의도하지 않은 부작용을 최소화 할뿐만 아니라 유전자 편집 효능을 최대화 할 수 있음을 보여준다.
(2) 다중 유전자의 게놈 편집에 의한 Cas9-RNP의 항종양 활성 평가
다음으로, 본 발명자들은 인간 암 이종 이식 마우스 모델에서 다중 유전자 (FGFR3 및 TACC3)의 게놈 편집에 의한 Cas9-RNP의 항종양 활성을 조사하였다. 각각의 종양은 부피가 100mm3까지 성장한 다음 정맥 내 주사에 의해 Cas9-RNP/Lipo, Cas9-RNP@LPS (6mg mL-1) 또는 PBS로 처리되었다. 각 그룹에서 종양 부피의 변화를 15 일 동안 모니터링 하였다.
도 15는 인간 암 이종 이식 마우스 모델에서 다중 유전자 (FGFR3 및 TACC3)에서의 게놈 편집에 의한 Cas9-RNP의 항종양 활성을 나타낸 도이다. **p<0.01, ***p<0.001.
도 15에 나타낸 바와 같이, FGFR3 (FGFR3@LPS) 및 TACC3 (TACC3@LPS)을 표적으로 하는 Cas9-RNP@LPS로 처리된 마우스에서 종양 성장이 유의하게 억제되었다. 그러나, Cas9-RNP/Lipo (FGFR3/Lipo 및 TACC3/Lipo)로 처리된 다른 그룹은 대조군과 비교하여 종양 부피에서 무시할만한 차이를 보여주었다.
다양한 군으로부터의 종양에서 통계적으로 유의한 차이에 기초하여, 종양 섹션의 헤마톡실린 및 에오신 염색은 처리 후 15 일에 수행되었다.
도 16은 Cas9-RNP@LPS로 처리된 종양에서만 집중적인 아포토시스를 나타내는 헤마톡실린 및 에오신 염색을 나타낸 결과이다.
도 17은 Cas9-RNP@LPS 주사 후 주요 기관의 생존력을 나타낸 조직학적 이미지이다.
도 16에 나타낸 바와 같이, 조직학적 이미지는 Cas9-RNP@LPS로 처리된 종양에서만 광범위한 아포토시스를 나타내었고, 이는 Cas9-RNP/Lipo, LPS 단독 및 1xPBS 처리된 그룹에서 관찰된 것과 상당히 대조적이었다.
또한, 도 17에 나타낸 바와 같이, Cas9-RNP@LPS 복합체로 처리된 마우스의 주요 기관으로부터의 조직학적 섹션에서 현저한 전신 독성이 관찰되지 않았다.
이들 결과는 LPS가 Cas9-RNP의 안전한 전달을 가능하게 하고 부위-특이적 유전자 변형을 촉진하면서 정상 조직에서 임의의 잠재적인 의도하지 않은 부작용을 완화시키는 것을 나타낸다.
Cas9-RNP@LPS에 의한 다중 유전자의 녹아웃을 정확하게 조사하기 위해, 각 마우스로부터 절제된 절편 조직을 면역 조직 화학을 사용하여 평가하였다.
도 16에 나타낸 바와 같이, 형광 이미지는 Cas9-RNP/Lipo, LPS 단독 및 1XPBS 단독으로 처리된 조직에 비해 Cas9-RNP@LPS 복합체로 처리된 단면 조직에서 FGFR3 (녹색) 및 TACC3 (적색) 둘 모두의 형광의 현저한 감소를 나타냈다. 이는 마우스 이종 이식편 모델에서 LPS-매개 유전자 편집을 통한 표적 유전자 발현의 성공적인 녹아웃을 시사한다.
종합적으로, 이들 결과는 Cas9-RNP@LPS가 효과적으로 세포 사멸을 유도하고 전신 독성 없이 생체 내 표적-특이적 게놈 편집에 의해 종양의 성장을 억제함을 입증 한다.
결론
본 발명자들은 암의 융합 유전자에 매우 관련이 있는 다중 유전자를 표적으로 하는 강력한 LPS 기반 Cas9-RNP 전달 플랫폼을 개발하였다. LPS는 Cas9-RNP의 높은 로딩 용량 및 내구성 있는 효소 활성뿐만 아니라 효율적인 세포 투과성, 엔도솜 탈출 및 LPS로부터 세포질로의 Cas9-RNP의 방출 효과를 나타냈다.
Cas9-RNP의 직접적인 세포질 전달을 위한 지질 기반의 고전적인 방법과 비교하여, 일 실시예에 따른 LPS-매개 Cas9-RNP 전달 시스템은 전사 및 번역 수준에서 NGS 분석 및 유전자 발현의 결과로부터 명백한 바와 같이 in vitro에서 다수의 표적 유전자에 대한 50% 이상의 유전자 편집 능력을 보여주었다. 또한, LPS 전달 시스템은 강력한 유전자 편집 결과 및 종양-특이적 축적뿐만 아니라 효소 활성 및 안정성을 유지하여 in vivo 효능 및 안전성을 나타냈다.
도 18은 F-T 융합 유전자 및 F-T 융합 유전자와 높은 유사성을 갖는 다중 유전자를 표적으로 한 비교 결과이다. (A) 웨스턴 블롯 결과; (B) 상대 세포 생존력; (C) 다중 유전자 표적화에 따른 돌연변이율.
도 18에 나타낸 바와 같이, 다중 유전자를 표적화하는 sgRNA의 양의 절반이 LPS에 의해 동시에 전달 되더라도, 융합 유전자는 높은 효율로 녹아웃되고, 상응하는 세포 사멸 효과 및 돌연변이 효율이 나타났다. 결국, LPS는 높은 특이성을 갖는 다중 유전자 엔지니어링을 가능하게 한다. 따라서 이는 융합 유전자의 잠재적 억제제를 수득하기 위해 다중 유전자를 공동 편집하는 새로운 대안적 접근법을 제안한다.
LPS는 캐비티 및 표면 기능성을 갖춘 다공성 구조로 인해 모듈화 및 다중물질의 제어 가능한 전달을 제공할 수 있으며, 이는 유연성이 덜한 기존의 방법에 비해 주요한 이점이다.
본 발명자들은 이 LPS 기반 Cas9-RNP 전달 플랫폼이 CRISPR/Cas9-매개 생체 내 게놈 편집을 위한 독특한 모듈식의 전달 시스템으로, 그리고 다른 치료 목적을 위한 상동성-지정 복구와 같은 다른 편집 시스템으로 유망할 것으로 예상한다.
SEQUENCE LISTING <110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> Surface aminated mesoporous silica nanoparticles, preparation method and use thereof <130> PN133294 <160> 9 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> GFP-targeting sgRNA <400> 1 ccagggcacg ggcagcttgc cgg 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> GFP-targeting sgRNA <400> 2 ggcgagggcg atgccaccta cgg 23 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> FGFR3-targeting sgRNA <400> 3 acgcggccaa gggtaacctg cgg 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> FGFR3-targeting sgRNA <400> 4 gaaggagtag tccaggcccg ggg 23 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> FGFR3-targeting sgRNA <400> 5 aggtgtcgaa ggagtagtcc agg 23 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TACC3-targeting sgRNA <400> 6 cggagtctcc gctttgtgct ggg 23 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TACC3-targeting sgRNA <400> 7 agaccctaga agacccttgc agg 23 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TACC3-targeting sgRNA <400> 8 gccgaggagg aatgccggca cgg 23 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> F-T-targeting sgRNA <400> 9 ttcgagcagt actccccggg tgg 23

Claims (20)

  1. (1) 양이온성 계면활성제를 염기성 용액에 용해시키는 단계;
    (2) 상기 단계 (1)에서 제조된 용액에 실리카 전구체 용액을 첨가하고 교반하여 다공성 실리카 나노입자를 제조하는 단계;
    (3) 상기 다공성 실리카 나노입자를 벤젠류 화합물 용액에 첨가하고 반응시켜 메조다공성 실리카 나노입자를 제조하는 단계; 및
    (4) 상기 메조다공성 실리카 나노입자에 아민계 화합물 용액을 첨가하고 환류시켜 표면 아민화 메조다공성 실리카 나노입자를 제조하는 단계를 포함하는,
    Cas 단백질-RNP 전달용 표면 아민화 메조다공성 실리카 나노입자의 제조방법으로서,
    상기 단계 (3)에서 반응은 120 내지 200 ℃에서 24 내지 72 시간 동안 수행되는 것인, 제조방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 단계 (1)에서, 양이온성 계면활성제는 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드 (Cethyl trimethyl ammonium bromide, CTAB) 또는 세틸 트리메틸 암모늄 클로라이드 (Cethyl trimethyl ammonium chloride, CTAC)인 것인, 표면 아민화 메조다공성 실리카 나노입자의 제조방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 단계 (2)에서, 실리카 전구체는 테트라메틸 오르쏘실리케이트 (tetramethyl orthosilicate, TMOS) 또는 테트라에틸 오르쏘실리케이트 (tetraethyl orthosilicate, TEOS)인 것인, 표면 아민화 메조다공성 실리카 나노입자의 제조방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 단계 (2)에서, 실리카 전구체 용액을 0.1mL/h 내지 10.0mL/h의 유속으로 첨가하는 것인, 표면 아민화 메조다공성 실리카 나노입자의 제조방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 단계 (2) 이후에, 다공성 실리카 나노입자를 세척하는 단계를 더 포함하는 것인, 표면 아민화 메조다공성 실리카 나노입자의 제조방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 단계 (3)에서, 벤젠류 화합물은 벤젠, 트리메틸벤젠 (trimethylbenzene, TMB), 1,3,5-트리에틸벤젠 (1,3,5-triethylbenzene, TEB), TtBB (1,3,5-tri-tert-butylbenzene) 및 TiPB (1,3,5-Triisopropylbenzene)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 표면 아민화 메조다공성 실리카 나노입자의 제조방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 벤젠류 화합물 용액은 벤젠류 화합물, 알코올 및 증류수의 혼합물인 것인, 표면 아민화 메조다공성 실리카 나노입자의 제조방법.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 벤젠류 화합물, 알코올 및 증류수의 부피비는 1~2:1~2:1~2인 것인, 표면 아민화 메조다공성 실리카 나노입자의 제조방법.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 단계 (3) 이후에, 메조다공성 실리카 나노입자에 산성 용액을 첨가하고 환류시켜 양이온성 계면활성제를 제거하는 단계를 더 포함하는 것인, 표면 아민화 메조다공성 실리카 나노입자의 제조방법.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 단계 (4)에서, 아민계 화합물은 3-아미노프로필트리에톡시실란 (3-Aminopropyltriethoxysilane, APTES), N(베타-아미노에틸)감마-아미노프로필메틸디메톡시실란 (N(beta-aminoethyl)gamma-aminopropylmethyldimethoxysilane, AEAPMDMS), N-[3-(트리메톡시실릴)프로필]에틸렌디아민, N1-(3-트리메톡시실릴프로필)디에틸렌트리아민, (3-아미노프로필)트리메톡시실란, N-[3-(트리메톡시실릴)프로필]아닐린, 트리메톡시[3-(메틸아미노)프로필]실란, 3-(2-아미노에틸아미노)프로필디메톡시메틸실란, TPPI (Trimethoxysilylpropyl modified polyethylenimine), p-아미노페닐트리메톡시실란, 1-아미노-2-(디메틸에톡시실릴)프로판으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 표면 아민화 메조다공성 실리카 나노입자의 제조방법.
  13. 청구항 1 내지 8 및 청구항 11 내지 12 중 어느 한 항에 따른 제조방법에 의해 제조된 표면 아민화 메조다공성 실리카 나노입자 및 리보핵단백질 (ribonucleoprotein, RNP)을 혼합하는 단계를 포함하는, 표면 아민화 메조다공성 실리카 나노입자에 RNP를 담지하는 방법.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 혼합은 실온에서 10분 내지 3시간 동안 수행되는 것인 방법.
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
KR1020200120002A 2020-09-17 2020-09-17 표면 아민화 메조다공성 실리카 나노입자, 이의 제조방법 및 용도 KR102523962B1 (ko)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200120002A KR102523962B1 (ko) 2020-09-17 2020-09-17 표면 아민화 메조다공성 실리카 나노입자, 이의 제조방법 및 용도
US17/384,913 US20220087947A1 (en) 2020-09-17 2021-07-26 Nanoparticle for delivering ribonucleoprotein and use thereof

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200120002A KR102523962B1 (ko) 2020-09-17 2020-09-17 표면 아민화 메조다공성 실리카 나노입자, 이의 제조방법 및 용도

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20220037265A KR20220037265A (ko) 2022-03-24
KR102523962B1 true KR102523962B1 (ko) 2023-04-21

Family

ID=80739391

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020200120002A KR102523962B1 (ko) 2020-09-17 2020-09-17 표면 아민화 메조다공성 실리카 나노입자, 이의 제조방법 및 용도

Country Status (2)

Country Link
US (1) US20220087947A1 (ko)
KR (1) KR102523962B1 (ko)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012509974A (ja) * 2008-11-26 2012-04-26 ユニバーシティ・カレッジ・コークーナショナル・ユニバーシティ・オブ・アイルランド，コーク シリカ微粒子を製造する方法
KR101497791B1 (ko) * 2013-01-29 2015-03-04 단국대학교 산학협력단 표면 아민화 메조다공성 생체활성유리 나노입자, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 생체분자 전달체 조성물
EP3898972A1 (en) * 2018-12-21 2021-10-27 Aarhus Universitet Crispr gene therapy of fusion gene related cancers

Also Published As

Publication number Publication date
KR20220037265A (ko) 2022-03-24
US20220087947A1 (en) 2022-03-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Amreddy et al. Chemo-biologic combinatorial drug delivery using folate receptor-targeted dendrimer nanoparticles for lung cancer treatment
Xiao et al. Combining p53 mRNA nanotherapy with immune checkpoint blockade reprograms the immune microenvironment for effective cancer therapy
Wang et al. Endosomolytic and tumor-penetrating mesoporous silica nanoparticles for siRNA/miRNA combination cancer therapy
Xie et al. Self-immolative nanoparticles for simultaneous delivery of microRNA and targeting of polyamine metabolism in combination cancer therapy
Cohen et al. Localized RNAi therapeutics of chemoresistant grade IV glioma using hyaluronan-grafted lipid-based nanoparticles
Yang et al. Functional exosome-mimic for delivery of siRNA to cancer: in vitro and in vivo evaluation
Dai Phung et al. Reprogramming the T cell response to cancer by simultaneous, nanoparticle-mediated PD-L1 inhibition and immunogenic cell death
Teo et al. Ovarian cancer immunotherapy using PD‐L1 siRNA targeted delivery from folic acid‐functionalized polyethylenimine: strategies to enhance T cell killing
Duo et al. CX-5461-loaded nucleolus-targeting nanoplatform for cancer therapy through induction of pro-death autophagy
Xiao et al. Nanoparticles with surface antibody against CD98 and carrying CD98 small interfering RNA reduce colitis in mice
Li et al. Reactive oxygen species (ROS)-responsive nanomedicine for RNAi-based cancer therapy
JP6527516B2 (ja) リポソーム粒子、前述のものを作製する方法及びその使用
Dai et al. Combined delivery of Let-7b MicroRNA and paclitaxel via biodegradable nanoassemblies for the treatment of KRAS mutant cancer
Joshi et al. Silencing STAT3 enhances sensitivity of cancer cells to doxorubicin and inhibits tumor progression
Shahidi et al. Multicomponent siRNA/miRNA-loaded modified mesoporous silica nanoparticles targeted bladder cancer for a highly effective combination therapy
Tang et al. A simple self-assembly nanomicelle based on brain tumor-targeting peptide-mediated siRNA delivery for glioma immunotherapy via intranasal administration
Sharma et al. Nanomaterials for autophagy-related miRNA-34a delivery in cancer treatment
Guo et al. Reversing the negative effect of adenosine A1 receptor-targeted immunometabolism modulation on melanoma by a co-delivery nanomedicine for self-activation of anti-PD-L1 DNAzyme
Hall et al. Peptide/lipid-associated nucleic acids (PLANAs) as a multicomponent siRNA delivery system
Allahyari et al. Simultaneous inhibition of CD73 and IL-6 molecules by siRNA-loaded nanoparticles prevents the growth and spread of cancer
Misra et al. Carotenoid nanovector for efficient therapeutic gene knockdown of transcription factor FOXC1 in liver cancer
Yang et al. Synchronous targeted delivery of TGF-β siRNA to stromal and tumor cells elicits robust antitumor immunity against triple-negative breast cancer by comprehensively remodeling the tumor microenvironment
Kamalzare et al. Development of a T cell-targeted siRNA delivery system against HIV-1 using modified superparamagnetic iron oxide nanoparticles: an in vitro study
Kumari et al. Oligochitosan modified albumin as plasmid DNA delivery vector: Endocytic trafficking, polyplex fate, in vivo compatibility
KR102523962B1 (ko) 표면 아민화 메조다공성 실리카 나노입자, 이의 제조방법 및 용도

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant