CN107200825B - 含ε-聚赖氨酸两亲性三嵌段抗菌肽的合成及其组装体的制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种含ε‑聚赖氨酸两亲性三嵌段抗菌肽的合成及其组装体的制备方法和应用。含ε‑聚赖氨酸两亲性三嵌段抗菌肽由环酯类单体、引发剂、催化剂、沉淀剂、二异氰酸酯、聚乙二醇和ε‑聚赖氨酸制备而成，本发明制备的含ε‑聚赖氨酸两亲性三嵌段抗菌肽具有广谱和优异的抗菌性能，是一种经济、低毒和稳定的生物材料，具有广泛的应用前景及价值；其原料便宜易得，成本低廉；另外，本发明的合成路线简单，条件可控。
Description
技术领域
本发明属于抗菌生物材料领域，具体涉及一种含ε-聚赖氨酸两亲性三嵌段抗菌肽的合成及其组装体的制备方法和应用。
背景技术
自青霉素问世以来，抗生素已成为20世纪人类最伟大的发明之一。然而，由于抗生素的杀菌机理为作用于微生物的遗传物质，使得微生物可通过基因突变、捕获外源耐药基因等方式，改变自身遗传物质，不再受抗生素影响；另一方面，因为医疗过度依赖抗生素、对畜禽广泛使用抗生素、医院控制感染不佳等原因，微生物耐药性逐年增强，导致耐药菌及超级耐药菌的出现和大范围传播，为现代医学治疗带来了巨大挑战。面临日益严重的情况，研究合成一种杀菌机理异于传统抗生素，难以产生耐药性的新型抗菌剂已变得迫在眉睫。
纳米给药系统是以纳米颗粒作为药物载体的一种药物输送形式。囊泡可将药物包封于其中，作为传导或输送药物的载体，具有调节释放药物速度，增加生物膜通透性，改变药物在体内的分布，提高药物生物利用度，降低药物对人体的副作用等优势。因此，聚合物纳米囊泡的制备及研究受到人们广泛关注。例如Barrefelt A等人将聚乳酸-ram-羟基乙酸(PLGA)组装成为纳米囊泡，通过乳化-蒸发法成功包载入了超顺磁氧化铁纳米粒子、锰掺杂硫化锌等无机显像剂以及抗癌药物甲磺酸丁二醇二酯。
癌症患者由于原发病变、手术及放化疗等因素使得机体免疫力下降，是医院感染的高危人群，并增加了癌症患者的死亡率，据统计，约60％的癌症患者死于感染。因此，近来具备抗菌性能的囊泡逐渐引起人们的兴趣。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，首要目的是提供一种含ε-聚赖氨酸两亲性三嵌段抗菌肽。
本发明的第二个目的在于提供一种含ε-聚赖氨酸两亲性三嵌段抗菌肽的合成。
本发明的第三个目的在于提供一种组装体的制备方法和应用。
为达到上述目的，本发明的解决方案是：
一种含ε-聚赖氨酸两亲性三嵌段抗菌肽，其结构式如下：
其中，X的取值范围为5-100中的整数，Y的取值范围为5-100中的整数，X和Y分别代表各嵌段的聚合度，I表示引发剂，A表示环酯类单体，R表示二异氰酸酯。
一种上述的含ε-聚赖氨酸两亲性三嵌段抗菌肽的制备方法，其包括如下步骤：
(1)、将0.100-10.000g引发剂、0.010g-0.600g催化剂、沉淀剂和1.000-30.000g环酯类单体在有机溶剂中反应，得到含环酯类单体的嵌段聚合物，其聚合度的取值范围为5-100中的整数，即：
(2)、将0.100-30.000g步骤(1)所得产物和0.001-20.000g二异氰酸酯在有机溶剂中反应，得到：
(3)、将1.000-30.000g步骤(2)所得产物、10-50μL催化剂和0.010-15.000g聚乙二醇在有机溶剂中反应，得到：
(4)、将1.000-30.000g步骤(3)所得产物和0.001-20.000g二异氰酸酯在有机溶剂中反应，得到：
(5)、将1.000-30.000g步骤(4)所得产物和0.010-20.000gε-聚赖氨酸在有机溶剂中反应，得到：
作为优选，步骤(1)中
的聚合包括如下步骤：
(a)、将环酯类单体在有机溶剂中处理，得到第一混合液：
(b)、将第一混合液通入氮气10-30min；
(c)、将引发剂、催化剂加入步骤(b)中，并在氮气保护下反应，得到第二混合液；
(d)、将第二混合液滴加至沉淀剂中，并取沉淀物作为粗产物；
(e)、将粗产物洗涤、透析、干燥即可。
作为优选，步骤(1)中，反应温度为70-110℃，反应时间为12-48h。
作为优选，步骤(2)中，反应温度为0-10℃，反应时间为2-4h。
作为优选，步骤(3)中，反应温度为20-40℃，反应时间为12-24h。
作为优选，步骤(4)中，反应温度为0-10℃，反应时间为2-4h。
作为优选，步骤(5)中，反应温度为20-40℃，反应时间为12-24h。
作为优选，环酯类单体选自己内酯、乙交酯和丙交酯中的一种。
作为优选，二异氰酸酯选自六亚甲基二异氰酸酯、五亚甲基二异氰酸酯、甲苯二异氰酸酯、二苯基甲烷二异氰酸酯、苯二亚甲基二异氰酸酯和萘二异氰酸酯中的一种。
作为优选，二异氰酸酯的摩尔量为含环酯类单体的嵌段聚合物或聚乙二醇摩尔量的2-5倍。
作为优选，有机溶剂选自甲苯、四氢呋喃、二氯甲烷或三氯甲烷中的一种以上。
作为优选，沉淀剂选自水、乙醇、正己烷、甲醇或丙酮中的一种以上。
作为优选，引发剂选自丙醇、丁醇、戊醇、己醇和苯甲醇中的一种。
作为优选，催化剂选自辛酸亚锡、4-二甲基吡啶或二丁基二月桂酸锡中的一种以上。
作为优选，引发剂与环酯类单体的摩尔比为：1:5-100。
作为优选，步骤(a)中，处理温度为130-150℃，处理时间为12-48h。
一种组装体，其由如上述的含ε-聚赖氨酸两亲性三嵌段抗菌肽自组装而成。
一种上述的组装体的制备方法，其包括如下步骤：
将含ε-聚赖氨酸两亲性三嵌段抗菌肽：
溶于有机溶剂与水的混合液中，得到悬浊液；在悬浊液里滴加去离子水，透析，得到组装体。
作为优选，有机溶剂选自四氢呋喃、二氧六环、N,N-二甲基甲酰胺和二甲基亚砜中的一种。
作为优选，滴加去离子水的时间为5-30min，透析时间为12-24h。
一种上述的组装体在药物的封装及运输、靶向释放、合成纳米粒子和化学微反应器等方面应用。
由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
第一、本发明制备的两亲性三嵌段抗菌肽具有良好的的抗菌性和优异的生物相容性。
第二、本发明的原料便宜易得，成本低廉；本发明的合成路线简单，条件可控。
第三、本发明制备的两亲性三嵌段抗菌肽是一种经济、低毒和稳定的生物材料，具有广泛的应用前景及价值。
附图说明
图1为本发明的组装体(PCL34-PEG45-PEL23)在大肠杆菌中的抗菌性，横坐标为时间(Time)，纵坐标为600nm时的OD值(即OD at 600nm)。
图2为本发明的组装体(PCL34-PEG45-PEL23)在金黄色葡萄球菌中的抗菌性，横坐标为时间(Time)，纵坐标为600nm时的OD值(即OD at 600nm)。
图3为本发明的组装体(PCL34-PEG45-PEL23)的细胞毒性图，横坐标为时间(Time)，纵坐标为细胞存活率(Relative Cell Viability)。
图4为本发明的组装体(PCL34-PEG45-PEL23)的DOX药物缓释图，横坐标为时间(Time)，纵坐标为累积DOX药物的缓释量(Cumulative DOX Release)。
具体实施方式
本发明提供了一种含ε-聚赖氨酸两亲性三嵌段抗菌肽的合成及其组装体的制备方法和应用。
<含ε-聚赖氨酸两亲性三嵌段抗菌肽>
一种含ε-聚赖氨酸两亲性三嵌段抗菌肽，其结构式如下：
其中，X的取值范围为5-100中的整数，Y的取值范围为5-100中的整数，X和Y分别代表各嵌段的聚合度，I表示引发剂，A表示环酯类单体，R表示二异氰酸酯。
<含ε-聚赖氨酸两亲性三嵌段抗菌肽的制备方法>
一种上述的含ε-聚赖氨酸两亲性三嵌段抗菌肽的制备方法，其包括如下步骤：
(1)、将0.001-10.000g引发剂、0.010g-0.600g催化剂、沉淀剂和1.000-30.000g环酯类单体在有机溶剂中反应，得到含环酯类单体的嵌段聚合物，其聚合度的取值范围为5-100中的整数，上述嵌段聚合物为可生物降解的疏水性高分子，即：
(2)、将1.000-30.000g步骤(1)所得产物和0.001-20.000g二异氰酸酯在有机溶剂中混合，得到：
(3)、将1.000-30.000g步骤(2)所得产物、10-50μL催化剂和0.010-15.000g聚乙二醇(PEG)在有机溶剂中反应，得到：
(4)、将1.000-30.0000g步骤(3)所得产物和0.001-20.000g二异氰酸酯在有机溶剂中反应，得到：
(5)、将1.000-30.000g步骤(4)所得产物和0.010-20.000gε-聚赖氨酸(EPL)在有机溶剂中反应，得到：
其中，步骤(1)中
的聚合包括如下步骤：
(a)、将环酯类单体在有机溶剂中共沸除水，得到第一混合液：
(b)、将第一混合液通入氮气10-30min至除尽氧气；
(c)、将引发剂、催化剂加入步骤(b)中，并在氮气保护下反应，得到第二混合液；
(d)、将第二混合液滴加至沉淀剂中，并取沉淀物作为粗产物；
(e)、将粗产物洗涤、透析、干燥即可。
实际上，在步骤(1)中，反应温度可以为70-110℃，优选为110℃；反应时间可以为12-48h，优选为48h。
在步骤(2)中，反应温度可以为0-10℃，优选为0℃；反应时间可以为2-4h，优选为4h。
在步骤(3)中，反应温度可以为20-40℃，优选为25℃；反应时间可以为12-24h，优选为24h。
在步骤(4)中，反应温度可以为0-10℃，优选为0℃；反应时间可以为2-4h，优选为4h。
在步骤(5)中，反应温度可以为20-40℃，优选为25℃；反应时间可以为12-24h，优选为24h。
其中，环酯类单体可以选自己内酯、乙交酯和丙交酯中的一种。
二异氰酸酯选自六亚甲基二异氰酸酯(HDI)、五亚甲基二异氰酸酯(PDI)、甲苯二异氰酸酯(TDI)、二苯基甲烷二异氰酸酯(MDI)、苯二亚甲基二异氰酸酯(XDI)和萘二异氰酸酯(NDI)一种。
二异氰酸酯的摩尔量为含环酯类单体的嵌段聚合物或聚乙二醇摩尔量的2-5倍，目的是为了防止二异氰酸酯两端的端基与同一聚合物发生反应。
有机溶剂可以选自甲苯、四氢呋喃、二氯甲烷或三氯甲烷中的一种以上。
沉淀剂可以选自水、乙醇、正己烷、甲醇或丙酮中的一种以上。
引发剂可以选自丙醇、丁醇、戊醇、己醇和苯甲醇中的一种。
催化剂可以选自辛酸亚锡、4-二甲基吡啶或二丁基二月桂酸锡中的一种以上。
引发剂与环酯类单体的摩尔比可以为：1:5-100。
步骤(a)中，处理温度可以为130-150℃，处理时间可以为12-48h。
<组装体>
一种组装体，其由如上述的含ε-聚赖氨酸两亲性三嵌段抗菌肽自组装而成。
自组装是指基本结构单元基于非共价键相互作用，如氢键、疏水作用、范德华力和π-π键堆积等，自发形成的稳定或亚稳定而具有一定规则几何结构的过程。
<组装体的制备方法>
一种上述的组装体的制备方法，其包括如下步骤：
将含ε-聚赖氨酸两亲性三嵌段抗菌肽：
溶于2.0-5.0mL有机溶剂与水的混合液中，得到悬浊液；在悬浊液里滴加5.0-10.0mL去离子水，透析，得到组装体。
其中，有机溶剂可以选自四氢呋喃、二氧六环、N,N-二甲基甲酰胺和二甲基亚砜中的一种。
滴加去离子水的时间可以为5-30min，优选为10min；透析时间可以为12-24h，优选为24h。
<组装体的应用>
一种上述的组装体在药物的封装及运输、靶向释放、合成纳米粒子和化学微反应器等方面应用。
实际上，ε-聚赖氨酸(EPL)是由一个赖氨酸的ε-氨基与另一赖氨酸的α-羟基缩聚而形成的多肽。其具有广谱抑菌能力，对革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌都有很强的抑制杀灭作用，同时对霉菌和酵母菌也有明显的抑制作用。其杀菌机理类似其他抗菌肽，通过静电吸附到细菌表面导致细胞膜的物理破坏，从而引起细胞的物质、能量和信息传递中断，使细菌很难对其产生耐药性。周春才等人将聚赖氨酸-ram-苯丙氨酸抗菌肽与聚己内酯(PCL)共聚，得到抗菌肽-b-聚己内酯二嵌段共聚物，并将其组装成囊泡，使其既具有药物缓释功能，可包载阿霉素(DOX)等抗癌药物，同时又具有优良的抗菌性。另外，EPL可食用，无毒副作用，具有生物降解性，并且生产成本很低，因此常用于食品添加剂。然而，由于EPL只能溶于水溶液中，无法与疏水链段共聚形成两亲性聚合物，因此也就无法进一步形成囊泡等纳米颗粒，也就无法起到相应的作用。
而本发明先将疏水性高分子链如聚己内酯(PCL)、聚乳酸(PLA)等与亲水性的聚二乙醇(PEG)共聚，形成两亲性共聚物，再将其与EPL进行共聚，则可成功得到含有EPL的两亲性共聚物，这种共聚物不仅具有良好的抗菌性、生物相容性以及生物可降解性，对人体无毒副作用，并且可以组装成为囊泡，应用于载药系统，在癌症治疗、药物缓释等方面都具有很大的应用前景。
以下结合附图所示实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1：
第一步：含ε-聚赖氨酸两亲性三嵌段抗菌肽的制备方法
本实施例的含ε-聚赖氨酸两亲性三嵌段抗菌肽的制备方法包括如下步骤：
(1)、将20.000g(175.439mmol)己内酯溶于100mL甲苯中，在140℃的油浴锅中共沸除水5h，接着在上述反应体系中通入氮气20min，然后将0.541g(5.013mmol)苯甲醇(作为引发剂)和0.800g辛酸亚锡(作为催化剂)加入上述反应体系中，在氮气保护下于110℃反应48h，得到第二混合液，将第二混合液在甲醇(作为沉淀剂)中沉淀，并取沉淀物作为粗产物，将粗产物洗涤，真空干燥，得到可生物降解的疏水性高分子聚己内酯(PCL34)；
(2)、将10.000g(2.506mmol)PCL34溶于50mL无水二氯甲烷中，加入2.060g(12.531mmol)六亚甲基二异氰酸酯(HDI)于0℃下搅拌反应4h。反应完成后在正己烷(作为沉淀剂)中反复沉淀洗涤三次，得到产物PCL34-NCO；
(3)、将5.000g(1.202mmol)PCL34-NCO与3.353g(1.202mmol)聚乙二醇(PEG45)溶于50mL无水二氯甲烷中，滴加10-20μL二丁基二月桂酸锡(作为催化剂)，在室温25℃下反应24h。反应完毕后，在真空环境下将二氯甲烷旋蒸掉，将粗产物溶于去离子水中，用透析袋(Mn＝3500)透析24h，期间每隔2h换一次水，最后在真空下冻干除掉去离子水，得到产物PCL34-PEG45；
(4)、将3.000g(0.425mmol)PCL34-PEG45溶于10mL无水二氯甲烷中，加入0.355g(2.125mmol)六亚甲基二异氰酸酯(HDI)，于0℃下搅拌反应4h。反应完成后在正己烷(作为沉淀剂)中反复沉淀洗涤三次，得到产物PCL34-PEG45-NCO；
(5)、将2.000g(0.277mmol)PCL34-PEG45-NCO溶于50mL四氢呋喃中，将0.930g(0.277mmol)聚-ε-赖氨酸(EPL23)溶于10mL水中，并将PCL34-PEG45-NCO的四氢呋喃溶液加入EPL23的水溶液中，在室温25℃下反应24h。反应完毕后，将粗产物溶于去离子水中，用透析袋(Mn＝3500)透析24h，期间每隔2h换一次水，最后在真空下冻干除掉去离子水，得到产物PCL34-PEG45-EPL23三嵌段抗菌肽。
其中，可生物降解的疏水性高分子PCL34结构式为：
PCL34-NCO的结构式为：
PCL34-PEG45的结构式为：
PCL34-PEG45-NCO
PCL34-PEG45-EPL23的结构式为：
实际上，在步骤(1)中，反应温度在70-110℃之内、反应时间在12-48h之内均是可以的。
在步骤(2)中，反应温度在0-10℃之内、反应时间在2-4h之内是可以的。
在步骤(3)中，反应温度在20-40℃之内、反应时间在12-24h之内是可以的。
在步骤(4)中，反应温度在0-10℃之内、反应时间在2-4h之内是可以的。
在步骤(5)中，反应温度在20-40℃之内、反应时间在12-24h之内都是可以的。
第二步：自组装形成共聚物囊泡组装体
本实施例的共聚物囊泡组装体的制备方法包括如下步骤：
将5.0mg(0.544mmol)PCL34-PEG45-PEL23溶于3mL四氢呋喃(THF)与水的混合溶液中(体积比为1:1)，再向其中逐滴缓慢加6.0mL去离子水，时间为10min，滴加完毕后过夜搅拌，搅拌完成后，用透析袋(Mn＝3500)透析24h，期间每隔2h换一次水，除去四氢呋喃，得到共聚物囊泡组装体。
其中，滴加去离子水的时间在5-30min之内、透析时间在12-24h之内均是可以的。
实施例2
第一步：含ε-聚赖氨酸两亲性三嵌段抗菌肽的制备方法
本实施例的含ε-聚赖氨酸两亲性三嵌段抗菌肽的制备方法包括如下步骤：
(1)、将20.000g(138.600mmol)丙交酯溶于100mL甲苯中，在140℃的油浴锅中共沸除水5h，接着在上述反应体系中通入氮气20min，然后将0.500g(4.620mmol)苯甲醇(作为引发剂)和1.656g 4-二甲基吡啶(作为催化剂)加入上述反应体系中，在氮气保护下于110℃反应48h，得到第二混合液，将第二混合液在甲醇(作为沉淀剂)中沉淀，并取沉淀物作为粗产物，将粗产物洗涤，真空干燥，得到可生物降解的疏水性高分子聚乳酸(PLA30)；
(2)、将10.000g(2.258mmol)PLA30溶于50mL无水二氯甲烷中，加入1.897g(11.292mmol)六亚甲基二异氰酸酯(HDI)于0℃下搅拌反应4h。反应完成后在正己烷(作为沉淀剂)中反复沉淀洗涤三次，得到产物PLA30-NCO；
(3)、将5.000g(1.088mmol)PLA30-NCO与3.035g(1.088mmol)聚乙二醇(PEG45)溶于50mL无水二氯甲烷中，滴加10-20μL滴二丁基二月桂酸锡(作为催化剂)，在室温25℃下反应24h。反应完毕后，在真空环境下将二氯甲烷旋蒸掉，将粗产物溶于去离子水中，用透析袋(Mn＝3500)透析24h，期间每隔2h换一次水，最后在真空下冻干除掉去离子水，得到产物PLA30-PEG45；
(4)、将3.000g(0.406mmol)PLA30-PEG45溶于10mL无水二氯甲烷中，加入0.341g(2.031mmol)六亚甲基二异氰酸酯(HDI)，于0℃下搅拌反应4h。反应完成后在正己烷(作为沉淀剂)中反复沉淀洗涤三次，得到产物PLA30-PEG45-NCO；
(5)、将2.000g(0.265mmol)PLA30-PEG45-NCO溶于50mL四氢呋喃中，将0.889g(0.265mmol)聚-ε-赖氨酸(EPL23)溶于10mL水中，并将PLA30-PEG45-NCO的四氢呋喃溶液加入EPL23的水溶液中，在室温25℃下反应24h。反应完毕后，将粗产物溶于去离子水中，用透析袋(Mn＝3500)透析24h，期间每隔2h换一次水，最后在真空下冻干除掉去离子水，得到产物PLA30-PEG45-EPL23三嵌段抗菌肽。
其中，可生物降解的疏水性高分子PLA30结构式为：
PLA30-NCO的结构式为：
PLA30-PEG45的结构式为：
PLA30-PEG45-NCO
PLA30-PEG45-EPL23的结构式为：
第二步：自组装形成共聚物囊泡组装体
本实施例的共聚物囊泡组装体的制备方法包括如下步骤：
将5.0mg(0.458mmol)PLA30-PEG45-PEL23溶于3mL四氢呋喃(THF)与水的混合溶液中(体积比为1:1)，再向其中逐滴缓慢加6.0mL去离子水，时间为10min，滴加完毕后过夜搅拌，搅拌完成后，用透析袋(Mn＝3500)透析24h，期间每隔2h换一次水，除去四氢呋喃，得到共聚物囊泡组装体。
<实验>
以上述实施例的两亲性三嵌段抗菌肽和组装体为产品进行如下实验。
<实验1>
本实验是为了验证两亲性三嵌段抗菌肽在革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)和革兰氏阴性菌(大肠杆菌)的抗菌性能。
最小抑菌浓度(MIC)是评估抗菌剂抗菌性能的重要参数。本实验分别使用革兰氏阴性菌(大肠杆菌)和革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)来测定两亲性三嵌段抗菌肽的抗菌性能。
实验步骤如下：
(1)在培养皿中加入10mL的LB骨肉汤；
(2)在96孔板第一行的每格均加入100μL的LB骨肉汤。接着在第一格中加入100μL浓度为5mg/mL的PCL34-PEG45-PEL23共聚物囊泡水溶液，充分混合，取100μL该混合液加入到96孔板第一行第二格中，混合均匀，然后再取100μL该混合液加入到该行第三格，以此类推；
(3)将10μL已活化好的细菌加入到步骤(1)中的10mL LB骨肉汤中，然后从中各取100μL加入步骤(2)中的每一个混合液的格子里。
加入100μL细菌液后(金黄色葡萄球菌或大肠杆菌)，96孔板的混合液中PCL34-PEG45-PEL23共聚物囊泡浓度分别为250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL、31μg/mL和16μg/mL，放入37℃恒温箱中恒温培养，每隔2小时用紫外分光光度计测定其在600nm处的光密度，其测试结果如图1和图2所示。
图1和图2反映了不同情况下细菌的生长率，OD值越大，说明细菌的生长率越大。由图1和图2可知，PCL34-PEG45-PEL23共聚物囊泡具有良好的抗菌性，并且在第12小时，PCL34-PEG45-PEL23共聚物囊泡浓度为31μg/mL时，两种细菌的生长趋于稳定，所以该抗菌剂对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的最低抑菌浓度MIC值均为31μg/mL。
<实验2>
本实验的目的在于研究PCL34-PEG45-PEL23共聚物囊泡组装体对L02细胞的毒性。
本实验通过CCK-8试剂盒来测定对于L02(正常人体肝细胞)的毒性。研究人员使用96孔铺板，每孔加入100μL细胞悬液(4000个)和培养基在37℃、5％的相对湿度的培养箱中一起培养24h，培养箱中充满CO2；然后在各个孔的细胞悬液中分别加入250μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL和2000μg/mL的两亲性三嵌段抗菌肽囊泡溶液再继续培养24h、48h及72h。使用未与抗菌肽溶液处理的细胞作为空白对照组。实验组和对照组培养完成之后，在每一个小孔内均加入CCK-8染色剂，在37℃下培养1h。研究人员通过酶标仪，使用双波长法测量实验组和对照组的样品在450nm和630nm处的吸光度。实验组和对照组的每个样品重复测量四次，根据正常肝细胞存活量与对照组肝细胞总量的比值计算得到细胞存活率，测试结果如图3所示，其中，横坐标表示时间(Time)，纵坐标表示细胞存活率(Relative CellViability)。
由图3可知，当PCL34-PEG45-PEL23共聚物囊泡组装体的浓度为250μg/mL时，细胞存活率为100％以上，即：该聚合物具有很好的生物相容性。因此，本发明制备的两亲性三嵌段PCL34-PEG45-PEL23共聚物囊泡组装体对细胞的毒性是很低的。
<实验3>
本实验的目的在于研究两亲性三嵌段抗菌肽PCL34-PEG45-PEL23共聚物囊泡组装体对抗癌药物DOX的缓释能力。
取PCL34-PEG45-PEL23共聚物(15.0mg)和抗癌药物盐酸阿霉素(3.50mg)溶解在5.0mLTHF/H2O(体积比为1：1)。然后将10.0mL的去离子水通过气密注射器在30分钟内滴加到上述溶液中，不断搅拌。使用旋转蒸发除去THF溶剂中的溶液。保持它们过夜连续搅拌后，置于装满1000mL去离子水的烧杯内透析4h，期间每半小时换一次水得到囊泡溶液，未包载进去的游离态药物可通过透析被移除(透析袋Mn＝8000-14000)。整个过程需要避光进行。
除去游离的药物后，将囊泡/DOX混合溶液精确分成3部分，每部分为3mL，并立即转移到新的透析袋中，密封袋口后投入装有50mL Tris buffer缓冲液(0.01M；pH为7.4)的避光烧杯中，以190转/分的速度搅拌，在37℃水浴下透析，分别于0.5h、1h、1.5h、2h、3h、4h、6h、8h、12h、24h和45h定时取出2mL混合溶液用荧光光谱(激发波长为461nm和591nm)来检测DOX浓度，测量之后将其放回至释放系统。
由图4可知，没有被PCL34-PEG45-PEL23共聚物囊泡包载的DOX药物在5小时时缓释率已达60％，并在6-7小时后，达到80％；而被包载的DOX药物在5小时时释放率为50％，并在之后的时间内基本维持在50％-60％。由此可知我们的PCL34-PEG45-PEL23共聚物囊泡具有一定的药物缓释功能。
上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种含ε-聚赖氨酸两亲性三嵌段抗菌肽，其特征在于：其结构式如下：
其中，X的取值范围为5-100中的整数，Y的取值范围为5-100中的整数，X和Y分别代表各嵌段的聚合度，I表示引发剂，A表示环酯类单体，R表示二异氰酸酯。
2.一种根据权利要求1所述的含ε-聚赖氨酸两亲性三嵌段抗菌肽的制备方法，其特征在于：其包括如下步骤：
(1)、将0.001-10.000g引发剂、0.010g-0.600g催化剂、沉淀剂和1.000-30.000g环酯类单体在有机溶剂中反应，得到含环酯类单体的嵌段聚合物，其聚合度的取值范围为5-100中的整数，即：
(2)、将1.000-30.000g步骤(1)所得产物和0.001-20.000g二异氰酸酯在有机溶剂中反应，得到：
(3)、将1.000-30.000g步骤(2)所得产物、10-50μL催化剂和0.010-15.000g聚乙二醇在有机溶剂中反应，得到：
(4)、将1.000-30.000g步骤(3)所得产物和0.001-20.000g二异氰酸酯在有机溶剂中反应，得到：
(5)、将1.000-30.000g步骤(4)所得产物和0.010-20.000gε-聚赖氨酸在有机溶剂中反应，得到：
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，
(a)、将环酯类单体在有机溶剂中处理，得到第一混合液：
(b)、将所述第一混合液通入氮气10-30min；
(c)、将引发剂、催化剂加入所述步骤(b)中，并在氮气保护下反应，得到第二混合液；
(d)、将所述第二混合液滴加至沉淀剂中，并取沉淀物作为粗产物；
(e)、将所述粗产物洗涤、透析、干燥即可。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，反应温度为70-110℃，反应时间为12-48h，和/或，
所述步骤(2)中，反应温度为0-10℃，反应时间为2-4h，和/或，
所述步骤(3)中，反应温度为20-40℃，反应时间为12-24h，和/或，
所述步骤(4)中，反应温度为0-10℃，反应时间为2-4h，和/或，
所述步骤(5)中，反应温度为20-40℃，反应时间为12-24h。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述环酯类单体选自己内酯、乙交酯和丙交酯中的一种；和/或，
所述二异氰酸酯选自六亚甲基二异氰酸酯、五亚甲基二异氰酸酯、甲苯二异氰酸酯、二苯基甲烷二异氰酸酯、苯二亚甲基二异氰酸酯和萘二异氰酸酯中的一种；和/或，
所述二异氰酸酯的摩尔量为含环酯类单体的嵌段聚合物或聚乙二醇摩尔量的2-5倍；和/或，
所述有机溶剂选自甲苯、四氢呋喃、二氯甲烷或三氯甲烷中的一种以上；和/或，
所述沉淀剂选自水、乙醇、正己烷、甲醇或丙酮中的一种以上；和/或，
所述引发剂选自丙醇、丁醇、戊醇、己醇和苯甲醇中的一种；和/或，
所述催化剂选自辛酸亚锡、4-二甲基吡啶或二丁基二月桂酸锡中的一种以上，和/或，
所述引发剂与所述环酯类单体的摩尔比为：1:5-100。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(a)中，处理温度为130-150℃，处理时间为12-48h。
7.一种组装体，其特征在于：由如权利要求1所述的含ε-聚赖氨酸两亲性三嵌段抗菌肽自组装而成。
8.一种如权利要求7所述的组装体的制备方法，其特征在于：其包括如下步骤：
将含ε-聚赖氨酸两亲性三嵌段抗菌肽：
溶于有机溶剂与水的混合液中，得到悬浊液；在所述悬浊液里滴加去离子水，透析，得到所述组装体。
9.根据权利要求8所述的组装体的制备方法，其特征在于：所述有机溶剂选自四氢呋喃、二氧六环、N,N-二甲基甲酰胺和二甲基亚砜中的一种；或者，
所述滴加去离子水的时间为5-30min，所述透析时间为12-24h。
10.一种如权利要求7所述的组装体在药物的封装及运输、靶向释放、合成纳米粒子和化学微反应器方面的应用。
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