CN114989265A - 一种具有高效广谱抗细菌、真菌功能的营养型支化结构聚多肽 - Google Patents

一种具有高效广谱抗细菌、真菌功能的营养型支化结构聚多肽 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种具有高效广谱抗细菌、真菌功能的营养型支化结构聚多肽。所述营养型支化结构聚多肽是分子量3000‑7000Da且多分散性指数小于1.2的含有L‑赖氨酸、D‑赖氨酸结构单元的聚合物多肽。该支化结构的多肽在低浓度下具有针对细菌、真菌和支原体的高效广谱抗菌效果，且不产生耐药性。同常见抗菌剂相比，本发明公开的聚多肽具有优异的生物相容性，无细胞毒性，经静脉注射对动物体无副作用，可满足体内静脉注射抗菌的需求。其降解产物为生物体必需的营养物质赖氨酸，无毒副作用。该支化结构的多肽无需生物发酵过程，全程由化学合成，物理、化学和生物性能稳定，可通过物理或者化学方式与其他材料结合，合成或者加工成多种形式的材料并保持高效的抗菌性能。

Description

一种具有高效广谱抗细菌、真菌功能的营养型支化结构聚 多肽
技术领域
本发明属于医用高分子材料领域，涉及一种具有高效广谱抗细菌、真菌功能的营养型支化结构聚多肽。
背景技术
微生物感染，尤其是细菌、真菌和支原体感染一直是阻碍人类生存的重要问题。在20世纪初，细菌流行病是全球性的重要死亡原因。相比之下，真菌及支原体感染几乎没有被考虑在内。随着公共卫生和生物医学技术的发展，青霉素及其他许多抗生素药物得到开发，许多细菌感染问题被有效解决甚至终结，但与此同时观察到真菌感染比例急剧上升，对全球人类健康仍是一个重要威胁。目前可用于对抗侵袭性真菌感染的药物数量非常有限，可针对三种不同真菌代谢途径并可在临床中治疗全身性真菌感染的药物分子仅有四类：氟嘧啶及衍生物、多烯类、唑类和棘白菌素。其他药物如吗啉和烯丙胺类分子，由于疗效差或全身给药时易出现严重的不良反应，目前仅用作局部用药。支原体的感染同样不可小视。支原体与细菌不同，没有细胞壁，所以作用于细菌细胞壁的抗生素对其无明显效果，目前常用红霉素和四环霉素进行治疗。
在长期使用上述抗细菌/真菌/支原体药物后，药物滥用导致了耐药微生物甚至多重耐药微生物的出现，即使不断有抗生素获得批准后投入使用，但相应的，耐药微生物也不断出现，例如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，导致现有抗细菌/真菌药物的广谱抗菌能力大幅下降。目前支原体对红霉素和四环霉素的耐药性最高可达90％。此外，常规抗菌分子还面临其他问题，如水溶性、过敏、用药过量和细胞毒性等。75％乙醇、次氯酸、碘伏等强抗菌剂仅能用于环境、医疗器械、生物体表的灭菌消毒，难以用于生物体内的感染。因此，得到一种低毒甚至无毒、高效广谱以及适用范围广的新型抗菌剂是人们一直追求的目标。
近年来，可用于生物体的抗菌剂主要分为无机抗菌剂、有机抗菌剂和天然抗菌剂。无机抗菌剂包括但不限于银、铜、锌、金及其化合物，多以离子或者纳米颗粒形式存在。这些抗菌剂主要通过破坏膜层、光热、光动力等方式抗菌，具有较强的抗菌效果，但其面临的主要问题是在体内难以降解或代谢，容易在体内富集并导致长期慢性毒性。据报道，无机纳米颗粒可与体内血液中的血清白蛋白发生非特异性吸附，也有报道称银纳米颗粒对细胞内基因产生损伤，尤其是分裂旺盛的细胞。有机抗菌剂包括人工合成的低分子和高分子有机抗菌材料，低分子类主要为季铵盐和酚醇酯类物质，高分子类主要为含有抗菌基团或结构的高分子，如阳离子聚合物、季铵盐聚合物，其优点在于种类多、结构可设计、适用范围广、可放大生产，但缺点是聚合物的碳碳链无法降解，以及降解后产物组分和结构复杂导致难以预测对生物体的毒性。天然抗菌剂主要包括植物来源精油、壳聚糖、儿茶酚等。有别于合成抗菌剂，天然抗菌剂是由人类从自然界中直接提取纯化得到，发现和使用历史悠久，生物相容性良好，但缺点是稳定性差、产量低、抗菌谱窄、抗菌效率低等。因而开发一种兼具上述优点的抗菌剂是目前抗菌物质研究中的一个难点和热点问题。
抗菌肽是又叫抗微生物肽、多肽抗生素，是指氨基酸数目小于100并且具广谱抗菌性的一类短肽。最早在20世纪80年代，瑞典科学家Boman从惜古比天蚕的蛹淋巴液内分离到第一种抗菌多肽，称之为天蚕素。此后，人类在几乎所有生物中共发现了上千种抗菌肽，是生物体抵抗外来病原体入侵的一道重要防线。
相较于传统抗菌药物分子，抗菌肽具有大量优点，因而被认为具有巨大的抗菌应用前景。首先，抗菌肽具有高效、广谱抗菌能力，杀灭对象包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、寄生虫和支原体等，且几乎无耐药性，少数具有杀灭病毒和肿瘤细胞的作用。其次，大多数抗菌肽在发挥抗菌作用的浓度范围内，对生物体内细胞无毒性或低毒性。第三，相较于免疫球蛋白等大分子生物抗菌制剂，其分子质量小，具有良好的水溶性，在生物体内具有更快的扩散速度，热稳定性更好。同时，其生物合成速度远大于免疫球蛋白。因此，抗菌肽亦被称为“天然的抗生素”，有望克服日益严重的抗生素耐药问题。
与传统抗生素相比，抗菌肽的作用机理不同。传统抗生素通过抑制或干扰微生物新陈代谢所必需的生命活动或者生物学功能，如阻挠细菌必需蛋白质的合成、细菌细胞壁的合成或者抑制细菌胞内酶的活性来达到杀菌目的，而细菌在突变其中一种相关基因，即可产生对付该种抗生素的能力并代代相传。抗菌肽则主要作用于细菌细胞膜，导致膜的通透性增大，从而杀灭细菌或其他种类的病原体。然而细菌难以通过上述方式，仅改变一种基因达到改变细菌细胞膜的结构的目的，因此，抗菌肽在杀灭病原微生物的同时可以认为其不产生耐药性。其次，抗菌肽对其作用对象具有选择性，只对细菌、真菌和支原体有抗菌作用，对正常的真核生物细胞不起作用。原因在于细菌/真菌/支原体和人类细胞的细胞膜结构不同，人类细胞膜中含有大量的胆固醇，而胆固醇的存在使膜结构更加稳定。此外高等动物存在高度发达的细胞骨架系统，也抵抗了抗菌肽的作用。目前，抗菌肽在农业、医药、食品和化妆品等领域已经有了一定的应用实践并取得了较好的效果。
在农业领域，抗菌肽出色的抗菌效果使其有望替代抗生素在饲料中的使用，避免了滥用抗生素导致的微生物耐药性，同时其可降解性避免了抗生素在动物体内的蓄积，降低对农产品质量和食用者健康的影响。在食品和化妆品领域，如从乳酸菌中分离的抗菌肽细菌素，可抑制食品和化妆品中的各种病原微生物的生长而作防腐剂。
然而，目前抗菌肽的大规模制备仍存在一定问题。由于抗菌肽的分子量低，所以直接从动植物组织中提取天然抗菌肽时，分离提纯存在一定的困难，故化学合成和基因工程发酵法成为获得抗菌肽的主要手段。但是化学合成抗菌肽需要保证其序列结构一致，因而大规模合成的成本高；基因工程发酵法是在微生物中直接表达抗菌肽基因，由于抗菌肽易被蛋白酶降解，而且表达产物可能对宿主(细菌)有害，从而影响了基因的高水平表达。如何提高生产效率、降低成本成为抗菌肽大规模应用亟需解决的问题。另一方面，与传统抗生素相比，一些抗菌肽的抗菌活性尚未达到理想强度，通过改造已有抗菌肽序列或设计新型氨基酸序列的抗菌肽是提高其活性的有效途径。
发明内容
本发明的目的是公开一种具有高效广谱抗细菌、真菌功能的营养型支化结构聚多肽。首先，该支化结构聚多肽完全由赖氨酸构成，无需考虑合成时控制氨基酸序列结构，易于制备、成本较低。其次，与其他化学合成的胍类、季铵盐类聚合物抗菌剂相比，该支化结构多肽具有良好的生物相容性，包括良好的细胞相容性、组织相容性以及血液相容性。其在低浓度下具有高效的抗菌性能，在0.001％的浓度时(10μg/mL)即可达到90％以上的抗菌率，且可用于体内，对正常组织、血液和细胞无毒性。相比医用酒精、过氧化氢、季铵盐类抗菌剂和其他种类的抗菌肽，该支化结构聚多肽拥有更广的抗菌适用场景，包括体外抗菌、体表皮肤创面抗菌以及体内注射抗菌。其降解产物为天然氨基酸之一的赖氨酸，因而在发挥抗菌功能后，降解为细胞或生物组织必需的氨基酸。该支化多肽可通过物理或者化学方式与其他材料结合，合成、加工成抗菌水凝胶、抗菌聚合物、抗菌金属器械、抗菌陶瓷、抗菌纳米微粒、抗菌微凝胶等形式，其作为生物医用抗菌材料具有广泛的适用场景和应用形式。
本发明提供的一种具有高效广谱抗细菌、真菌功能的营养型支化结构聚多肽，为含有L-赖氨酸、D-赖氨酸结构单元的聚合物多肽，可由L-赖氨酸、D-赖氨酸或者上述两种氨基酸或其盐酸盐作为原料聚合得到。
本发明中所述的聚多肽其数均分子量范围在3000-7000Da，多分散指数小于1.2；
本发明中所述的聚多肽，其在水溶液环境下，对细菌、真菌和支原体均具有优越的抗菌能力；
所涉及的细菌包括以金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌为例的革兰氏阳性菌及其耐药型变种菌株、以大肠杆菌和铜绿假单胞菌为例的革兰氏阴性菌及其耐药型变种菌株；
所涉及的真菌包括以酵母菌和白色念珠菌为例的酵母菌类真菌及其耐药变种菌株、以黑曲霉菌和黄曲霉菌等霉菌类真菌及其耐药变种菌株；
所涉及的支原体包括普通支原体以及耐药支原体变种。
所涉及的水溶液环境指所有以水为溶剂的环境，包括但不限于纯水、去离子水、磷酸盐缓冲溶液、生理盐水、细胞培养基、血液、组织液等；
在所涉及的抗菌应用中，所述聚多肽的浓度范围在10μg/mL～20mg/mL，以保障其抗菌效果及生物相容效果；在该浓度范围内，可以将多肽溶于细胞培养基中与细胞共培养；或者将多肽溶于生理盐水后注入动物体内；
本发明所涉及的聚多肽是一种营养型抗菌多肽，其在发挥抗菌作用后可被降解为生命体所必须的营养物质赖氨酸，参与生命体正常的生理活动；
本发明所涉及的聚多肽无需生物发酵，全程由化学合成、结构稳定、不易变性，此外所述聚多肽还可通过多种物理或化学方式与其他材料结合形成抗菌复合物；
进一步的，所述物理方式可以是物理包埋、静电吸附、非特异性吸附、共混挤出等方式；
进一步的，所述化学方式可以是：(1)与聚合物、金属和陶瓷本体材料进行化学接枝修饰；(2)在聚合物链之间充当交联剂，形成聚合物网络；(3)利用多肽的氨基，与其他小分子形成共价键等各种结合方式。
进一步的，所述复合物的形态可以为水凝胶、聚合物、金属、纳米微粒、微凝胶等。
本发明的有益效果是：
本发明公开了一种支化结构多肽及其在抗菌方面的应用，其在低浓度下具有高效的抗菌性能，在0.001％的浓度时(10μg/mL)对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母菌类真菌、霉菌类真菌、支原体，以及上述微生物相应的耐药性变种均有显著抗菌功能，其可以被开发为多种具有优异抗菌功能的产品。同时，其具有优异的生物相容性和体内血液相容性，降解产物是生物体必需氨基酸之一，对生物体无毒害作用，同时解决了传统抗菌剂具有耐药性、价格昂贵和生物相容性差的问题。此外，本发明公开的具有支化结构的抗菌肽还可以溶解在注射液中，通过静脉注射或肌肉注射方式注入机体，用于体内脓毒症或败血症等血液感染病的抗菌治疗。
附图说明
图1本发明的支化结构聚多肽对浓度为108CFU/mL的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌的抗菌效果(聚多肽浓度分别为250、500、750和1000μg/mL)
图2本发明的支化结构聚多肽对浓度为108CFU/mL的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌效果
图3本发明的支化结构聚多肽对浓度为109CFU/mL的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌效果
图4本发明的支化结构聚多肽培养成纤维细胞后的细胞活性结果
图5本发明的支化结构聚多肽按1mg/mL注射至大鼠体内24h后，大鼠血液中白细胞、中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞的细胞浓度
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体描述。所说实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据以上发明的内容做出一些非本质的改进和调整。在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
实施例1
一种具有高效广谱抗细菌和真菌功能的营养型支化结构聚多肽，其对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌的抗菌效果展示如下：
分别在浓度为108CFU/mL的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌中，按最终聚多肽浓度250μg/mL加入上述聚多肽，在37℃下共培养24h，其结果如图1所示，所得多肽对上述细菌和真菌的抗菌效果均为100％，本发明制得的多肽能有效杀灭细菌和真菌。
实施例2
一种具有高效广谱抗细菌和真菌功能的营养型支化结构聚多肽，其对耐药菌的抗菌效果展示如下：
在浓度分别为108和109CFU/mL的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的菌液中，按聚多肽浓度梯度加入上述聚多肽，在37℃下共培养24h，结果如图2和图3所示，该聚多肽在有效作用浓度范围内能有效杀灭耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。100μg/mL的聚多肽溶液的抗菌率可以达到100％(图2)和98％(图3)以上。相同条件下，相应浓度的季铵化抗菌剂在面对108CFU/mL浓度时，其抗菌效果远不如该支化结构多肽，而浓度为100μg/mL的青霉素G在两组抗菌实验中仅表现出低于10％的抗菌率。
实施例3
一种具有高效广谱抗细菌和真菌功能的营养型支化结构聚多肽，其安全性(细胞毒性)性能展示如下：
将本发明聚多肽按不同浓度加入到含有胎牛血清(体积浓度10％)的Dulbecco改良依格尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium,DMEM)中，将其用于培养成纤维细胞。按每孔1万个细胞将细胞种在96孔板上，将其与上述含有不同浓度聚多肽的培养基在37℃下进行培养，48h后用Cell Counting Kit-8法测定细胞活性。结果如图4，本发明公开的聚多肽在有效作用浓度范围内无细胞毒性。
实施例4
一种具有高效广谱抗细菌和真菌功能的营养型支化结构聚多肽，其安全性(是否产生急性全身炎症)性能展示如下：
将本发明聚多肽按1mg/mL浓度溶于生理盐水中，通过尾静脉按8mg/kg剂量注射进入大鼠体内。实验结果显示，大鼠在24h后仍然存活，直接观察未发现其有异常行为。血常规显示白细胞(WBC)、中性粒细胞(Neu)、单核细胞(Mon)和淋巴细胞(Lym)的细胞浓度均在正常范围内(图5)，未表现出炎症特征。这个结果好于当前多数可用于体内的阳离子抗菌剂和抗菌多肽，可用于脓毒症或败血症等全身血液感染疾病的抗菌治疗。
实施例5
一种具有高效广谱抗细菌和真菌功能的营养型支化结构聚多肽，其体内血液相容性性能展示如下：
将本发明聚多肽按1mg/mL浓度溶于生理盐水中，通过尾静脉按8mg/kg剂量注射进入大鼠体内。实验结果显示，大鼠在24h后仍存活，直接观察未发现其有异常行为。血常规显示红细胞(RBC)浓度、血红蛋白浓度(HGB)和血小板(PLT)浓度均在正常范围内(表1)，未表现出异常，证明其在高浓度下仍具有优异的血液相容性。
表1本发明的支化结构聚多肽按1mg/mL注射至大鼠体内24h后，大鼠血液中红细胞浓度、血红蛋白含量以及血小板浓度
Figure BDA0003669116760000071
实施例6
一种物理包埋聚多肽的抗菌非共价水凝胶的制备方法：
将本发明所涉及的聚多肽和琼脂糖按1mg/mL和30mg/mL浓度在90℃下溶解于100mL去离子水中，待完全溶解后将溶液倒入圆形培养皿，放入4℃冰箱中充分冷却后可形成含有聚多肽的抗菌琼脂糖凝胶。物理包埋聚多肽的非共价水凝胶对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌均有良好的抗菌效果。
实施例7
一种物理包埋聚多肽的抗菌共价水凝胶的制备方法：
将本发明所涉及的聚多肽、甲基丙烯酰化明胶、双端甲基丙烯酰化聚乙二醇按10mg/mL和10mg/mL浓度在90℃下溶解于100mL去离子水中，待完全溶解后将溶液倒入圆形培养皿，放入4℃冰箱中充分冷却后可形成含有聚多肽的抗菌共价水凝胶。物理包埋聚多肽的共价水凝胶对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌均有良好的抗菌效果。
实施例8
一种物理包埋聚多肽的抗菌聚氨酯静电纺丝膜的制备方法：
将本发明所涉及的聚多肽和聚氨酯按质量体积分数0.5％和10％溶于六氟异丙醇中，其中聚氨酯为聚(ε-己内酯)作为软段、六亚甲基二异氰酸酯作为硬段、乙二胺作为扩链剂合成的。将溶液加入注射器，置于静电纺丝机的注射泵上，挤出速度设定为1mL/h，接收器的滚轴速度为300rpm，正负极电压分别设为+15kV和-8kV，纺丝8h后可得到物理包埋聚多肽的聚氨酯静电纺丝膜。与金黄色葡萄球菌共培养24h后显示出良好的抗菌效果。
实施例9
一种共价交联的抗菌水凝胶的制备方法：
将甲基丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酸羟乙酯和过氧化苯甲酰按质量体积分数1％、5％和0.1％溶于二甲基亚砜，在50℃下热引发聚合、透析提纯、冻干后得到含有环氧基团的亲水聚合物。将该亲水聚合物和本发明所涉及的聚多肽按照10mg/mL和1mg/mL溶于纯水，常温下搅拌溶解后将溶液体系置于40℃下，24h后聚多肽的氨基和聚合物的环氧交联形成亲水聚合物网络，构建了抗菌水凝胶。
实施例10
一种物理包埋聚多肽的抗菌共价微凝胶的制备方法：
将聚多肽、甲基丙烯酰化明胶和苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂按1％、10％和0.05％溶解于纯水，将其通过超声分散在石蜡油中，通过紫外光引发聚合得到微凝胶微粒，经分离提纯得到抗菌共价微凝胶。

Claims (9)

1.一种具有高效广谱抗细菌、真菌功能的营养型支化结构聚多肽，其特征在于，为分子量3000-7000Da且多分散性指数小于1.2的含有L-赖氨酸、D-赖氨酸结构单元的聚合物多肽，其结构式如下：
Figure FDA0003669116750000011
2.根据权利要求1所述的营养型支化结构聚多肽，其特征在于，其可杀灭的细菌种类包括：(1)革兰氏阳性菌及其耐药型变种菌株；(2)革兰氏阴性菌及其耐药型变种菌株。
3.根据权利要求1所述的营养型支化结构聚多肽，其特征在于，其可杀灭的真菌种类包括：(1)酵母菌类真菌及其耐药变种菌株；(4)霉菌类真菌及其耐药变种菌株。
4.根据权利要求1所述的营养型支化结构聚多肽，其特征在于，其可杀灭支原体及其耐药变种。
5.根据权利要求1所述的营养型支化结构聚多肽，其特征在于，所述聚多肽直接作为固体抗菌剂使用。
6.根据权利要求1所述的营养型支化结构聚多肽，其特征在于，所述聚多肽溶于水溶液、有机溶剂或其混合溶剂中，作为液体抗菌剂使用。
7.根据权利要求1所述的营养型支化结构聚多肽，其特征在于，所述聚多肽通过物理作用和/或化学作用负载于载体材料的表面和/或内部制备成抗菌复合物，所述的载体材料为水凝胶、金属或聚合物基材、纳米微粒、或微凝胶。
8.根据权利要求4或5所述的营养型支化结构聚多肽，其特征在于，所述聚多肽的最低有效杀菌浓度(MIC)为10μg/mL，其抗菌效果达到90％以上。
9.根据权利要求1所述的营养型支化结构聚多肽，其特征在于，所述聚多肽溶于生理盐水，在有效杀菌浓度范围内，经静脉注射或肌肉注射到动物体内且不产生副作用，可作为治疗血液感染相关疾病的抗菌剂使用。
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