CN111228462B - 一种抗微生物肽制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种抗微生物肽制剂，其特征在于：包含不低于10ppm的抗菌肽；其中，所述抗菌肽的序列如下所示：Lys Lys Trp Val Arg Trp Lys His Lys Arg Leu Ala Ala Lys Lys。本发明的抗微生物肽制剂与传统抗生素相比具有作用速度快、无残留、不易产生抗药性、生物活性谱多样性等优点。

Description

一种抗微生物肽制剂及其制备方法

技术领域

本发明提供了一种制剂，具体地，涉及一种用于粘膜组织的抗微生物肽制剂。

背景技术

目前，抗生素的滥用和病毒性疾病的肆虐使得人类健康和养殖业面临越来越大的挑战。抗生素的大量使用，一方面由于抗生素在食物中的残留，严重威胁到人类以及动物的健康，另一方面，由于对传统抗生素产生抗药性菌株的出现，使人们逐渐增大抗生素的用量，于是造成机体内耐药菌越来越多，从而引起恶性循环，造成人类和动物的自身免疫力不断下降。

抗菌肽又称抗微生物肽(antimicrobial peptide)或肽抗生素(peptideantibiotics)，在动植物体内分布广泛，是天然免疫防御系统的一部分。抗菌肽和常规的抗生素不同，它是某个特定基因编码的蛋白产物，因此具有独特的抗菌机制。

抗菌肽是一种小分子多肽，天然的抗菌肽通常由30多个氨基酸残基组成，在水溶液中呈碱性，含有4个或4个以上带正电荷的氨基酸，如赖氨酸(Lys)或精氨酸(Arg)，其N端亲水，C端疏水。水溶性好。抗菌肽种类繁多，到目前为止已经有500多种抗菌肽被分离和鉴定，仅从昆虫体内分离获得的就多达170余种。抗菌肽具有广谱抗菌性，单一一种肽可抑杀多种细菌、真菌，还可杀死某些寄生虫，对多种癌细胞及动物实体瘤也有明显的杀伤作用，甚至对含包膜的病毒都能起作用；另外，还能加速免疫和伤口愈合过程。

抗菌肽的作用对象虽种类繁多，但有一点是相同的，即都含有膜成分。抗菌肽发挥防御作用的基础在于微生物细胞膜结构与动植物的细胞膜不同。抗菌肽的作用机理是快速的透过病菌外膜上造成的孔洞，影响病毒的内外渗透压，造成病菌的细胞膜破坏与死亡；抗生素的作用机理则是通过抑制病菌的某些代谢过程，使病菌因无法代谢而逐渐凋零，两者的作用方式不同。因此，抗菌肽往往需要特定的作用环境使抗菌肽在微生物的细胞膜上产生特殊的螺旋结构，从而将病菌细胞膜破坏。抗菌肽的结构在螺旋面上往往可以分成两个主要的连续区域，一个为带正电或其它亲水性氨基酸所形成的区域，另一个区域则为疏水性氨基酸(芳香族氨基酸为首选)。带正电或亲水性的氨基酸会受到金属盐类离子的干扰或是其他带有负电分子的吸引的干扰，而使得抗菌肽对病毒作用活性降低；而疏水性氨基酸往往会受到一些双性分子(如某些糖类如肝素等)的干扰。此外由于抗菌肽的正电基团氨基酸与芳香族氨基酸都易被大量存在的蛋白酶所分解，从而使其保存与杀菌效果受到一定的限制。

抗微生物肽主要有以下几方面的生物学作用：

(1)抑菌、杀菌研究表明，抗菌肽具有广谱抗细菌活性，单一一种抗菌肽可以抑制或杀灭多种细菌。不同的抗菌肽抗菌活性存在较大差异，抗菌谱也明显不同。抗菌肽不仅自身具有良好的抗菌作用，而且与传统抗生素联合使用可提高抗菌肽和抗生素的药物药效，甚至能拓宽抗生素的抗菌谱。

(2)抗真菌作用某些抗菌肽对真菌具有很好的杀伤作用，如来源于哺乳动物的防御素对一些人类致病真菌具有杀伤作用。截取天蚕素A和蜂毒索分子的片段，合成杂合肽分子处理真菌孢子原生质体，发现不但真菌细胞壁无法恢复，而且细胞也被破坏，无法保持正常的细胞形态。

(3)抗病毒作用抗菌肽能够对具有膜结构的靶目标发挥其抗菌活性，包膜病毒如HIV、孢疹病毒和孢疹性口炎病毒等。研究表明，多种抗菌肽如人α-防御素、牛中性粒细胞indolicidin、昆虫抗菌肽polyphemusin等都具有抗病毒活性。抗菌肽通过多种方式发挥抗病毒作用，有的抗菌肽可以通过与病毒外膜的直接结合发挥作用，有的抗菌肽能够抑制病毒的繁殖，有的抗菌肽通过干扰病毒的组装而对病毒产生作用。

(4)抗原虫作用有些抗菌肽可以有效杀死寄生于人类或动物内的寄生虫，如蛙皮素magainirls可以杀死疟原虫，cecrpin/melittin杂合肽可以杀死莱什曼鞭毛虫。抗菌肽杀灭寄生虫时，作用于寄生虫细胞质膜，其可以迅速降低W/OH的通透性，破坏膜电势，质膜形态也受到损坏。

(5)调节机体免疫力最早的抗菌肽cecropin在天蚕体内发现，其免疫系统中没有抗体、补体的参与，抗菌肽是其中一个重要的部分，迄今已在昆虫中发现超过170种抗菌肽类物质，这些抗菌肽主要由脂肪体合成并释放到血液淋巴中发挥作用，迅速杀灭已侵入的病菌，并阻止病菌的继续侵染。

由于抗菌肽结构和作用机理的特殊性，使其有非常好的药用前景：(1)柞蚕免疫血淋巴治疗乙型肝炎的效果滞育柞蚕蛹经接种灭活的大肠杆菌诱导产生免疫血淋巴，含有多种免疫成分如抗菌肽、抗菌蛋白、溶菌酶等；供治疗乙型肝炎的胶囊，试验证实其在合适剂量能显著或极显著降低鸭血清乙型肝炎病毒水平，能抑制鸭体内乙型肝炎病毒复制增殖作用。(2)抗菌肽在治疗癌症上的应用抗菌肽对体外培养的癌细胞有作用，主要是使癌细胞膜上形成孔洞，内容物外泄，线粒体出现空泡化，嵴脱落，核膜界限模糊不清，有的核膜破损，核染色体DNA断裂，并抑制染色体DNA的合成，细胞骨架也受到一定程度的损伤。昆虫抗菌肽具有广谱抗菌、抗病毒、抗癌能力，以及活性浓度低，无致畸变作用，无蓄积毒性，不易产生抗药性等优点，有望成为新一代的抗菌、抗病毒、抗癌药物。(3)局部感染治疗机体受感染后趋向于在局部区域产生抗菌肽，最早临床研究也是从局部感染治疗开始。目前，已进入临床实验阶段的抗菌肽有细菌素、源于蛙马盖宁的MSI-78及源于猪Protegrin的IB-367。用细菌素治疗奶牛乳头皮肤局部感染时，发现它在1分钟内就可杀死金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克氏杆菌等病原菌，且无毒副作用。(4)系统感染治疗抗菌肽对系统感染也有疗效，人工合成的CAP-18对绿脓杆菌引起的腹部感染有疗效，protegrin能抑杀对二甲氧基苯青霉素产生耐药性的金黄色葡萄球菌，及对万古霉素产生耐药性的肠道球菌和绿脓杆菌；indolicidin可抵御曲霉菌感染。(5)抗菌肽的抗寄生虫作用抗菌肽可有效杀灭使人类及动物共同发生寄生虫病的寄生虫，目前发现一种合成的天蚕素-蜂毒素杂合体对莱什曼原鞭毛虫有损伤作用；Shahabuddin研究发现昆虫抗菌肽对感染蚊子的疟原虫发育的不同时期有不同的作用，主要对疟原虫的卵囊期和子孢子期造成明显的损伤。综上上述，一种多肽类的抑菌、抗病毒和提高动物免疫力的物质，与抗生素相比抗菌肽具有作用速度快、无残留、不易产生抗药性、生物活性谱多样性等优点，是抗生素的理想替代品。虽然这些抗微生物肽皆具有广泛的抗菌效力，然而由于抗微生物肽大多数都来自于机体内特定的生理环境，若将其作为药物治疗疾病，抗微生物肽对所处的环境有许多严格的要求，以使其能够发挥正常的药效。由于抗微生物肽是一种小分子的多肽，多肽是由多个氨基酸分子脱水缩合而成，若将其做成药物用于治疗，必须保证其在服用的过程中不被人体或动物体内的各种酶水解或者消化，只有该制剂能够顺利到达所要治疗的部位，才可能发挥其预期的疗效，达到治疗的目的。要想使抗微生物肽在保持药效的前提下顺利达到作用部位，在其配方中的添加剂必须能够在运输的整个过程中很好的保护活性成分，这就需要根据不同的活性成分选择各种不同的添加剂，而不同的添加剂的实际效果需要丰富的理论知识和不断的试验。同时，不同的氨基酸分子所带的电荷和电量不同，因此由不同的氨基酸分子脱水缩合成的多肽所带的电荷和电量不同。当抗微生物肽作为生物性药物时，其所带的电荷并不是全部有利于发挥其药效，一般情况下根据作用的部位以及抗微生物肽种类的不同，需要将其工作的环境维持在一定的条件下，才得以使抗微生物肽的一级或二级结构保持正确的局部电性与疏水端，以发挥良好的抗微生物效果。从抗微生物肽的结构考虑，该类肽结构的疏水性也是不容忽视的一个问题。由于抗微生物肽是由多个氨基酸分子脱水缩合而成，如果该肽在分子折叠的过程中形成亲水性很强的结构，生物体内是一个水环境，当抗微生物肽制剂进入生物体内，就会发生水解反应，将其水解成多个氨基酸分子，从而将其结构破坏，即使氨基酸分子被运送到相应的治疗部位，也发挥不了治疗作用。除了分子结构对抗微生物肽制剂的影响，剂型也会对抗微生物肽制剂的活性产生很大影响。制剂从流动性考虑可以分为液体制剂和固体制剂。液体制剂主要分为根据药物分散情况分为均相液体制剂、非均型液体制剂；根据分散相质点的大小分为分子分散系统、胶体分散系统、粗分散系统；根据给药途经和应用方式分为口服溶液剂、耳用溶液剂、眼用溶液剂、外用溶液剂等；液体制剂中药物分散度大，吸收快，药效发挥速度快，给药途径广泛，易于分剂量，适应于婴幼儿和老年患者，可外用于皮肤、粘膜和人体腔道等，也可通过调整制剂浓度减少刺激性，同时也可以根据病情来调整制剂的浓度；某些固体药物制成液体制剂后有利于提高生物利用度。但液体制剂药物分散度大，易引起药物的化学降解；水性液体制剂容易霉变，需加入防腐剂；非均匀性液体制剂如乳剂、混悬剂等，药物的分散度大，表面积也大，易产生一系列的物理稳定性问题。因此根据身体不同部位的需要，可以将抗微生物肽制成液体制剂，但是在制备过程中，需要综合考虑以上因素，在确保其疗效的前提下，还要保证其稳定性和保存时间，因此在需要寻找合适的配方使其达到最好的效果。将一种药物活性成分制成制剂所需的添加剂要根据活性成分的结构以及其理化性质和所适用的部位选择。若想将增加该制剂的疗效，并使其可应用的局部范围更加广泛，又需更额外的其他添加剂。然而在扩大其应用范围的同时，其相应的工作环境也会对其影响很大。

综上上述，要想将该抗菌肽做成一种制剂的形式，需要满足以下几个方面的要求：(1)维持多肽制剂在缓冲溶液中的活性；(2)多肽制剂保存的完整性；(3)避免配方中离子的干扰，或是其他物质的干扰；(4)维持多肽的高效活性的酸碱度；(5)降低多肽被自身或者细菌酵素迅速分解速度；(6)延长在特定部位维持有效作用浓度的时间；(7)如何加速多肽的作用速度，促使多肽能获得最大的效果。由此可见，在本领域中仍然需要能够取代传统抗生素制剂的杀菌效率高、起效迅速、并且稳定期长、易于保存的抗微生物制剂。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种易于保存的抗微生物肽制剂。

本发明提供了一种抗微生物肽制剂，其特征在于：包含不低于10ppm的抗菌肽；

其中，上述抗菌肽的序列如下所示：

Lys Lys Trp Val Arg Trp Lys His Lys Arg Leu Ala Ala Lys Lys。

进一步地，本发明提供得一种抗微生物肽制剂，其特征还在于：还包括保存剂、等渗透压缓冲溶液；

其中，上述保存剂的用量为制剂总重量的0.01-5％；

上述等渗透压缓冲溶液的用量为制剂总重量的0.1-2％。

进一步地，本发明提供得一种抗微生物肽制剂，其特征还在于：上述保存剂选自乙二胺四乙酸二钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、柠檬酸、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸异丁酯、羟苯乙酯、对羟基苯甲酸丁酯、甲基对苯甲酸中的一种或几种的混合。

进一步地，本发明提供得一种抗微生物肽制剂，其特征还在于：上述等渗透压缓冲溶液选自乙酸钠、乙酸钾、磷酸二氢盐、磷酸氢盐、氯化钠、硼酸盐中的一种或几种的混合。上述溶液的质量百分比浓度在1-90％之间。

进一步地，本发明提供得一种抗微生物肽制剂，其特征还在于：还包括保湿剂；

其中，上述保湿剂的用量为制剂总重量的0.5-10％。

进一步地，本发明提供得一种抗微生物肽制剂，其特征还在于：上述保湿剂选自山梨醇、透明质酸、甘油、丁二醇、羧甲基纤维素钠、丙二醇、聚乙二醇-20、PEG-7甘油椰油酸酯、甲基葡糖倍半硬脂酸酯、芦荟胶中的一种或几种的混合。

进一步地，本发明提供得一种抗微生物肽制剂，其特征还在于：还包含卡伯波树脂；

上述卡伯波树脂的pH值介于5.5-6.5之间；

上述卡伯波树脂的用量为制剂总重量的0.5％以上。该卡伯波树脂的用量由剂型和使用部位决定。

进一步地，本发明提供得一种抗微生物肽制剂，其特征还在于：由如下质量百分比的物质制备而成：

进一步地，本发明提供得一种抗微生物肽制剂的制备方法，其特征在于，由如下工艺步骤制造而成：

步骤一、于水中加入等渗透压缓冲溶液、保存剂及保湿剂，在10-50℃的温度下，搅拌10-60分钟；

步骤二、在搅拌的状态下，加入抗菌肽；

步骤三、在搅拌的状态下，加入卡伯波树脂，继续搅拌10-60分钟；

步骤四、使用氢氧化钠调节pH至5.5.-6.5，即得澄清的抗微生物凝胶。

上述氢氧化钠的添加量一般为为制剂总重量的0.01-1％。

进一步地，本发明提供得一种抗微生物肽制剂，其特征还在于：适用于对口腔粘膜组织、皮肤组织或伤口组织的杀菌消毒，即、消毒剂使用。上述抗菌肽具有抗革兰氏阳性、阴性菌、原生动物、真菌和具有包膜的人类自体免疫缺失病毒的能力。

本发明的作用和效果：

本发明的抗微生物肽制剂与传统抗生素相比具有作用速度快、无残留、不易产生抗药性、生物活性谱多样性等优点，而且针对不同的部位可调整使用不同的剂型，从而使患者能够方便的用药。

具体地，本发明提供的一种用于粘膜组织的抗微生物肽制剂，其中包含的有效剂量的抗菌肽能够起到非常优越的抗菌杀菌效果；保存剂，可抑制蛋白质酶或肽酶的活性以维持肽的药物活性；保湿剂，可维持药剂的湿润以利于药剂与患部结合；渗透压缓冲溶液，可以提供适应生物体的等渗透压环境并缓冲pH值。

另外，当需要进行治疗时，本发明的抗微生物肽制剂可以很方便地被去除，这样不会因部分残留而导致对用药部位的刺激。

同时，由于本发明的制剂提供了可使上述抗微生物肽正常工作的工作环境，因此增加了其在临床上的适用范畴；而且由于该抗微生物肽是用途广泛的抗微生物肽，富含色氨酸序列，还可应用于制备生物抗生素，具有广泛的抗革兰氏阳性、阴性菌、原生动物、真菌和具有包膜的人类自体免疫缺失病毒的能力。

具体实施方式

如下具体实施例中所涉及的抗微生物肽的多肽序列如下：

Lys Lys Trp Val Arg Trp Lys His Lys Arg Leu Ala Ala Lys Lys 15个氨基酸。

该多肽的合成方法可采用Boc多肽合成法或Fmoc多肽合成法等常规方法。

实施例一、

在500ml去离子蒸馏水中加入3.4克乙酸钠，0.65克乙二胺四乙酸二钠(EDTAdisodium)及5克山梨醇(sorbital)，搅拌均匀，约30分钟后依次加入5mg的抗微生物肽，以及5克的卡伯波树脂，充分搅拌均匀约15分钟后，加入1.6克氢氧化钠，搅拌均匀，即得澄清的抗微生物凝胶。

实施例二、

在500ml去离子蒸馏水中加入3.8克乙酸钾，0.85克苯甲酸钠及8克丁二醇，搅拌均匀，约20分钟后依次加入10mg的抗微生物肽，以及5克的卡伯波树脂，充分搅拌均匀约15分钟后，加入氢氧化钠调节至pH为5.6左右，搅拌均匀，即得澄清的抗微生物凝胶。

实施例三、

在500ml去离子蒸馏水中加入2.5克磷酸氢钠，0.7克对羟基苯甲酸丁酯及6克甘油，搅拌均匀，约40分钟后依次加入5mg的抗微生物肽，以及5克的卡伯波树脂，充分搅拌均匀约15分钟后，加入氢氧化钠调节至pH为6.5左右，搅拌均匀，即得澄清的抗微生物凝胶。

实施例四、

在500ml去离子蒸馏水中加入3克乙酸钠，1克柠檬酸及4.5克甲基葡糖倍半硬脂酸酯，搅拌均匀，约40分钟后加入8mg的抗微生物肽，充分搅拌均匀约15分钟后，加入氢氧化钠调节至pH为6左右，搅拌均匀，即得澄清的抗微生物凝胶。

杀菌效果实验

实验菌株：大肠杆菌和金黄色葡萄球菌球菌

将菌株放入LBBroth培养基中，以200转/分的速度在37℃培养约12个小时，菌液的密度以595纳米的吸光度加以确定(吸光值为1时的菌液密度约为1×10⁸/ml)，最后将菌液密度调整至5×10⁶/ml。

实验组-A组：在96孔微量聚丙烯盘中加入10微升的菌液，并加入90微升的本发明制剂，以37℃培养15分钟及5分钟后，取出10微升并加入90微升灭菌水，此为A1；取出10微升A1加入90微升灭菌水，编号为A2；取出10微升A2加入90微升灭菌水，编号为A3；取出10微升A3加入90微升灭菌水，编号为A4；取出10微升A4加入90微升灭菌水，编号为A5。

对照组-B组：在96孔微量聚丙烯盘中加入10微升的菌液，并加入90微升灭菌水，以37℃培养15分钟及5分钟后，取出10微升并加入90微升灭菌水，此为B1；取出10微升B1加入90微升灭菌水编号为B2；取出10微升B2加入90微升灭菌水，编号为B3；取出10微升B3加入90微升灭菌水，编号为B4；取出10微升B4加入90微升灭菌水，编号为B5。

取出A1-A5及B1-B5混合液各10微升，分别均匀涂布于LBBroth培养琼脂上，放入37℃培养箱中培养16-18小时，取出计算菌斑数，以培养盘上菌斑数介于300-15个为标准培养皿(但是A组若仅A1符合检验标准时，仍可采用A1数据)，A组依据编号1-5分别乘上1000，10000，100000，1000000，10000000，即为CFU/mL；B组依据编号1-5分别乘上1000，10000，100000，1000000，10000000，即为CFU/mL。B组的换算结果应介于1x10⁶-1x10⁵之结果方为可信。A组的菌群浓度是否低于B组的1/10，若是达到，则符合检验标准。若A组过低，但B组值为正常，则视同合格；杀菌率的计算结果如下式所示。

以实施例1的产品中抗菌肽的用量为基准进行上述实验后，结果如下表所示：

Peptide浓度(ppm)	10	10	10	10
					作用时间(分钟)	5	15	5	15
菌种	大肠杆菌	大肠杆菌	金黄色葡萄球菌球菌	金黄色葡萄球菌球菌
					杀菌率	99.5％	99.5％	99.5％	99.5％

使用其他抗菌肽的杀菌能力因为受到高浓度钠离子等的影响，使抗菌肽制剂的杀菌效果降至50％以下，这也是抗菌肽在使用上会遇到的重大问题。

由实验结果可以发现，在使用的等渗配方(氯化钠、甘油、葡萄糖或乙酸钠)中，乙酸钠对抗菌肽的杀菌能力没有任何不良影响，与其他的等渗配方相比，其配方具有最佳的杀菌效果(超过99％)。在制剂的杀菌效率上，乙酸钠配方的杀菌速度不管是在15分钟或5分钟的杀菌测试中均能超过99％的杀菌率。

另外，针对制剂的抗老化能力，本实施例1所采用的抗菌肽制剂具有极佳的抗老化能力，在经过长达8个月的实验中，杀菌效率仍然超过90％。

以上实验可以证明：使用本发明上述的配方可以使所采用的抗菌肽具有较其他等渗配方有更高的杀菌率、杀菌速度和抗老化能力，因此可以使抗菌肽达到最好的效果。

其他实施例的产品，经上述实验后发现均具有类似的结论，此处不再冗述。

序列表

<120> 一种抗微生物肽制剂及其制备方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 15

<212> PRT

<213> 抗菌肽(antibacterial peptide)

<400> 2

Lys Lys Trp Val Arg Trp Lys His Lys Arg Leu Ala Ala Lys Lys

1 5 10 15

Claims (5)

1.抗菌肽在制备抗微生物肽制剂中的应用，其特征在于：

所述抗菌肽的氨基酸序列如下所示：

Lys Lys Trp Val Arg Trp Lys His Lys Arg Leu Ala Ala Lys Lys；

所述抗微生物肽制剂，由如下质量百分比的物质制备而成：

使用氢氧化钠调节pH至5.5.-6.5；

所述微生物为大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。

2.如权利要求1所述的抗菌肽在制备抗微生物肽制剂中的应用，其特征在于：所述等渗透压缓冲剂选自乙酸钠、乙酸钾、磷酸二氢盐、磷酸氢盐中的一种或几种的混合。

3.如权利要求1所述的抗菌肽在制备抗微生物肽制剂中的应用，其特征在于：所述保存剂选自乙二胺四乙酸二钠、苯甲酸钠、柠檬酸、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸异丁酯、对羟基苯甲酸丁酯、甲基对苯甲酸中的一种或几种的混合。

4.如权利要求1所述的抗菌肽在制备抗微生物肽制剂中的应用，其特征在于：所述保湿剂选自山梨醇、甘油、丁二醇、丙二醇、聚乙二醇-20、甲基葡糖倍半硬脂酸酯中的一种或几种的混合。

5.如权利要求1所述的抗菌肽在制备抗微生物肽制剂中的应用，其特征在于：所述抗微生物肽制剂由如下工艺步骤制造而成：

步骤一、于水中加入所述等渗透压缓冲剂、保存剂及保湿剂，搅拌10-60分钟；

步骤二、在搅拌的状态下，加入所述抗菌肽；

步骤三、在搅拌的状态下，加入所述卡伯波树脂，继续搅拌15分钟；

步骤四、使用氢氧化钠调节pH至5.5.-6.5，即得澄清的抗微生物凝胶。