CN113350575A - 一种用于调节局部骨代谢的有机-无机复合水凝胶、制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种用于调节局部骨代谢的有机‑无机复合水凝胶的制备方法,包括:以阿仑膦酸钠接枝至HAMA上得ALN‑HAMA,将20份醛基葡聚糖和30份氨基化的生物玻璃、10份ALN‑HAMA分别与0.625份光引发剂混合后溶于缓冲溶液中,上述两种溶液物理混合后经紫外光照射成胶。本发明通过活化羧基反应接枝阿仑膦酸钠的甲基丙烯酰化透明质酸粘合骨小梁上的无机磷酸钙成分、进一步结合共价交联氧化葡聚糖的生物活性玻璃粘合骨小梁上的有机胶原成分,设计构建了兼具促进成骨、抑制破骨,调节内植物周围局部骨代谢的有机‑无机水凝胶,用来固定骨松状态的骨科内植物,具有良好的可注射性及生物相容性,紫外交联后原位粘附凝固并填充在疏松的骨小梁结构里,促进成骨的同时抑制破骨。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料制备技术领域,尤其涉及一种用于调节局部骨代谢的有机-无机复合水凝胶、制备方法及其应用。
背景技术
内植物是指种植、埋藏、固定于宿主受损或病变部位,支持、修复或替代其功能的一类特殊的功能性材料。目前主要用于人工器官再造、外科修复等领域。然而,内植物与组织间的“种植界面”缺乏生物性固定从而导致界面分离一直是影响内植物植入效果的一大难题。骨科内植物主要包括骨钉、钉板系统、髓内钉等,起着在骨折或病损部位临时固定从而利于骨修复的作用,然而这种固定在骨质疏松状态下往往是不牢固的,内植物的过早松动常常宣告着手术的失败。因此,如何解决骨松条件下松质骨与内植物间的“界面骨整合”问题显得尤为的重要。
在骨科内植物植入骨松状态组织后,破骨细胞过度活跃引起的骨代谢失衡导致内植物周围骨小梁结构(疏松多孔)的改变和骨组织成分(有机、无机)的减少。这种疏松多孔的结构改变易使内植物与骨组织之间存在缝隙造成内植物的微动,同时骨基质内有机和无机两相材料的减少更不利于“种植界面”的骨整合。因此,如何平衡骨质疏松条件下局部微环境的骨代谢(促进成骨,抑制破骨),同时匹配骨结构与骨组分的特殊要求是解决内植物松动突破点之一。
生物医用水凝胶具有高含水量、良好的生物相容性和机械性能,是促进局部骨修复的主要生物材料之一。目前,通过水凝胶负载各种药物,可以实现原位粘附凝固并填充在疏松的骨小梁结构里,通过药物释放单一成分且单向抑制破骨细胞的功能,从而促进松质骨重建。然而,在骨质疏松区域存在极强的骨代谢不平衡状态,难以调控松质骨微环境,实现骨内植物和松质骨之间的紧密结合。研究总结,调控骨松状态下骨内植物周围局部骨代谢的水凝胶应当符合以下要求:1、在松质骨区域能够凝固;2、能结合骨小梁上的磷酸钙无机物;3、可以结合骨小梁上有机胶原组织;4、能够促进成骨,抑制破骨;5、与骨内植物有一定的界面亲和性。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术存在的缺陷,本发明提出了一种用于调节局部骨代谢的有机-无机复合水凝胶的制备方法,针对传统水凝胶与周围骨组织无法形成有机-无机双粘附,而骨质疏松状态下实现螺钉周围的有效骨整合必须同时兼顾促进成骨及抑制破骨双向功能,综合二者优点并结合骨松状态下疏松骨结构的特点可以获得一种生物相容性好、有机-无机双粘合、促进成骨及抑制破骨双向调节,最后可以原位固化在松质骨区的水凝胶材料,最大限度模仿脊髓细胞外基质,达到调节螺钉周围局部骨代谢的效果。
为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案是:一种用于调节局部骨代谢的有机-无机复合水凝胶的制备方法,包括:
以阿仑膦酸钠接枝至HAMA上得ALN-HAMA,将20份醛基葡聚糖和30份氨基化的生物玻璃、10份ALN-HAMA分别与0.625份光引发剂混合后溶于缓冲溶液中,上述两种溶液物理混合后经紫外光照射成胶。
进一步地,所述光引发剂选用LAP,将25mg LAP溶于10ml PBS中制成质量浓度为0.25%的引发剂标准溶液。
进一步地,以阿仑膦酸钠接枝至HAMA上得ALN-HAMA,将20mg醛基葡聚糖和30mg氨基化的生物玻璃、10mg ALN-HAMA分别溶于0.25ml光引发剂中,上述两种溶液物理混合后经紫外光照射成胶。
进一步地,20mg ODEX干粉以及30mg ABG溶于0.25ml光引发剂中后,超声加热至50±5℃并保持,直至溶液变黄。
进一步地,所述醛基葡聚糖由如下方法制备:向葡聚糖溶液中滴加氧化剂,氧化反应结束后对反应体系透析过滤,过滤产物冷冻干燥后得醛基葡聚糖的干粉。
进一步地,所述氨基化的生物玻璃由如下方法制备:向有机溶液中依次加入BG以及APTES并振荡均匀,反应产物离心洗涤后得ABG。
进一步地,所述以HAMA接枝至阿仑膦酸钠过程于非碱性环境下进行,接枝过程中阿仑膦酸钠和HAMA的质量比为1:1,偶联剂选用EDC和NHS,耦合得到的产品以截留分子量为2500-3200的透析管进行透析。
进一步地,所述氧化剂选用高碘酸钠溶液,于反应5-7h后向反应体系内加入1±0.5ml乙二醇中止氧化反应,反应体系以截留分子量为3000-3500的透析袋透析。
进一步地,所述过滤产物于-20±5℃环境下预冻,随后转移至冷冻干燥器冻干47-49h。
进一步地,一种用于调节局部骨代谢的有机-无机复合水凝胶,以质量体积比计,包括0.5-3%HAMA,0.5-3%阿仑膦酸钠,3-6%ABG以及3-6%ODEX,以上述物质溶于质量浓度为0.25%的光引发剂溶液中。
进一步地,所述ODEX和ABG聚合后用于结合骨小梁上的有机胶原组织,所述ALN-HAMA用于结合骨小梁上的磷酸钙无机物。
与现有技术相比,本发明的有益效果包括:通过活化羧基反应接枝阿仑膦酸钠的甲基丙烯酰化透明质酸(ALN-HAMA/A-H)粘合骨小梁上的无机磷酸钙成分、进一步结合共价交联氧化葡聚糖的生物活性玻璃(ABG-ODEX/AB-O)粘合骨小梁上的有机胶原成分,设计构建了兼具促进成骨、抑制破骨,调节内植物周围局部骨代谢的有机-无机双粘合水凝胶,用来固定骨松状态下的骨科内植物;该复合水凝胶具有良好的可注射性及生物相容性,紫外交联后原位粘附凝固并填充在疏松的骨小梁结构里,发挥其促进成骨、抑制破骨的双重作用。
附图说明
参照附图来说明本发明的公开内容。应当了解,附图仅仅用于说明目的,而并非意在对本发明的保护范围构成限制。在附图中,相同的附图标记用于指代相同的部件。其中:
图1示意性显示了有机-无机复合水凝胶的制备过程以及作用机制。
图2为DEX and ODEX的红外光谱图。
图3为BG and AB的红外光谱图。
图4为ABG的扫描电镜(SEM)照片。
图5为ABG的激光粒度分布图。
图6为H和A-H的红外光谱图。
图7为A-H,A-H+AB和A-H+AB-O的溶胀测试结果图;于12h处,由上至下依次为A-H+AB-O,A-H+AB和A-H。
图8为A-H,A-H+AB和A-H+AB-O的压缩模量;于10%处由上至下依次为A-H+AB,A-H和A-H+AB-O。
图9为A-H,A-H+AB和A-H+AB-O的失重实验分析图;于28d处,由上至下依次为A-H,A-H+AB和A-H+AB-O。
图10为A-H,A-H+AB,A-H+AB-O的SEM结果照片。
图11为使用BMMs和MC3T3-E1细胞进行活/死染色于水凝胶上种植三天后的结果示意图。
图12为BMMs and MC3T3-E1细胞的CCK8分析结果;图中由左至右依次为Control,A-H+AB-O,A-H+AB和A-H。
图13为ALP和茜素红染色结果。
图14为7天RUNX2和14天OCN的免疫荧光染色结果。
图15显示了A-H,A-H+AB,A-H+AB-O 7d的ALP染色程度及活性。
图16显示了矿化结节使用高氯酸溶解后,溶解液420nm处的吸光度溶解后进行定量分析结果。
图17显示了RUNX2 and OCN半定量分析结果。
图18为collagen 1 and OPN的ELISA分析结果。
图19显示了水凝胶与BMMs细胞在Transwell中共培养5天后进行TRAP染色结果。
图20显示了5天MMP-9免疫荧光水平。
图21为TRAP相关细胞数定量分析结果。
图22为TRAP相关染色细胞区域的定量分析结果。
图23为MMP-9 and TRAP的ELISA分析结果。
图24为Micro-CT 3D重建骨质疏松模型示意图。
图25为H&E and Masson’s染色。
图26为Micro-CT参数分析(BV,BMD,Conn.D,Tb.N,Tb.Th)。
图27为Micro-CT参数分析(and Tb.Sp)。
图28为双粘合水凝胶的体内应用:A)Micro-CT 3D重建;B)Micro-CT分析BV/TV;C)BIC;D-E)Conn.D and Tb.N;图中由左至右依次为Control,A-H+AB-O,A-H+AB和A-H。
图29显示了甲苯胺蓝染色观察骨质疏松大鼠内植物-骨接触(BIC)和骨/螺钉界面螺纹区骨长入情况。
图30中由A至B分别为Control,A-H,A-H+AB和A-H+AB-O的H&E和Masson结果。
具体实施方式
容易理解,根据本发明的技术方案,在不变更本发明实质精神下,本领域的一般技术人员可以提出可相互替换的多种结构方式以及实现方式。因此,以下具体实施方式以及附图仅是对本发明的技术方案的示例性说明,而不应当视为本发明的全部或者视为对本发明技术方案的限定或限制。
一种用于调节局部骨代谢的有机-无机复合水凝胶的制备方法,包括:
以阿仑膦酸钠接枝至HAMA上得ALN-HAMA,将20份醛基葡聚糖和30份氨基化的生物玻璃、10份ALN-HAMA分别与0.625份光引发剂混合后溶于缓冲溶液中,上述两种溶液物理混合后经紫外光照射成胶。
本发明对于氧化葡聚糖的制备方法不作限定,本领域技术人员熟知即可,优选以以下方式制备:将5g葡聚糖溶于100ml去离子水中,5g高碘酸钠溶于60ml去离子水中,在室温、避光、搅拌的条件下,将高碘酸钠溶液逐滴加入葡聚糖溶液中,随后在室温、避光条件下磁力搅拌,反应6h。反应结束后向反应体系内加入1ml乙二醇中止氧化反应。随后将反应体系转移至截留分子量为3000-3500的透析袋中,透析袋置于去离子水中透析48h,透析用去离子水每12h更换一次,透析完成后用滤纸对所得产物进行过滤,过滤后产物置于-20℃冰箱中预冻,随后转移至冷冻干燥器中冻干48h得到醛基葡聚糖(ODEX)的干粉。
ABG的合成方法具体如下:BG(45S5 Bioglass;微孔微球平均直径20-50um)购于MERYER(SHANGHAI)。将0.4g BG置于100ml己烷中振荡均匀,随后加入5ml APTES,于60℃环境下搅拌反应24h,反应产物经过离心后进行分别三次醇洗及三次水洗,最终得到氨基化的BG(ABG)。
ALN-HAMA的合成过程具体如下:先将HAMA(500mg)、NHS(150mg)、EDC(300mg)溶解于100mL PBS(优选将缓冲液pH设置为5.0)中,搅拌3h。然后在上述溶液中加入500mg阿伦膦酸钠,搅拌3天。将得到的产品用透析管(3000MWCO)对蒸馏水进行净化3天,然后进行冻干。
于实施过程中,将20mg的ODEX干粉,30mg的ABG粉末溶于0.25ml光引发剂里,超声加热至50℃并保持,直至溶液变黄。取10mg的ALN-HAMA溶于0.25ml光引发剂中,超声半小时后搅拌,让ALN-HAMA充分溶解。在实际应用时,将上述两种溶液物理混合后注射到钉道内,以紫外光照射成胶。
上述光引发剂选用LAP,将25mg LAP溶于10ml PBS中制成质量浓度为0.25%的引发剂标准溶液。
如图1所示,以上述制备方法所制得的用于调节局部骨代谢的有机-无机复合水凝胶其内包括ODEX、ABG、以及ALN-HAMA,通过将ODEX和ABG溶于光引发剂中,于其实际使用的过程中,因紫外光的照射,光引发剂可吸收一定波长的能量,从而产生自由基、阳离子等,从而引发ODEX和ABG的聚合交联固化从而形成结合共价交联氧化葡聚糖的生物活性玻璃,并促成ABG粘合骨小梁上的有机胶原成分;而其内通过活化羧基反应接枝阿仑膦酸钠的甲基丙烯酰化透明质酸则因其本身具备甲基丙烯基团,使得其本身具备一定光固化性,其与光引发剂结合,能够粘合骨小梁上的无机磷酸钙成分,最后通过光引发剂于骨小梁内成胶,通过结合共价交联氧化葡聚糖的生物活性玻璃促进成骨以及通过活化羧基反应接枝阿仑膦酸钠的甲基丙烯酰化透明质酸抑制破骨,调节内植物周围局部骨代谢的有机-无机双粘合水凝胶,用来固定骨松状态下的骨科内植物。
以下通过多个方面对本发明所提出的一种用于调节局部骨代谢的有机-无机复合水凝胶进行分析。
傅里叶变换红外光谱FTIR
分别将冷冻干燥后的ODEX,DEX,BG,ABG,H,A-H,按照重量比例1:100加入溴化钾(BrK)中均匀研磨,再置入压片机中加压成型为透明片状,采用ATR-FTIR(FTIR,Nicolet6700;Thermo scientific,USA)扫描样品,分辨率4cm-1,通过所得不同的曲线分析不通组分的化学成份异同。
图2至图3为DEX and ODEX,BG and ABG的FTIR光谱,首先,葡聚糖经过氧化反应后,FTIR曲线位于1731cm-1处出现了反应醛基存在的波峰,说明葡聚糖分子链上通过氧化反应成功生成大量醛基。其次,经过APTES改性的生物活性玻璃亦被证明在其表面含有大量接枝的氨基,并在1635cm-1处发现代表NH2的波峰。
分别将冻干后的A-H,A-H+AB,A-H+AB-O膜冷冻干燥后脆断处理,并粘贴在贴有导电胶的样品台上,使用离子溅射仪进行60秒的表面喷金处理(SC7620,QuorumTechnologies,UK)。之后使用SEM在30kV电压下观察(SEM,S-4800;Hitachi,Kotyo,Japan)。
扫描电镜(SEM)照片(图4)表明氨基化的45S5生物活性玻璃表面光滑,且颗粒大小相对均一。激光粒度分布如图5显示,ABG的平均直径是35.52±5.51um。通过酰胺键连接氧化葡聚糖到氨基化的生物活性表面,氧化葡聚糖分子链上另外的醛基可以与骨组织胶原中的氨基相结合,这是双粘合水凝胶实现有机粘附且实现诱导成骨的基础。
水凝胶材料的SEM结果如图10显示,各组水凝胶均为海绵样结构,具有均匀的孔道结构,且连通性较好。A-H+ABG-O水凝胶在微观结构上呈现3D复合孔结构,表面粗糙不平,孔隙分布更加均匀,孔与孔互相贯通,孔径均为100±20μm,孔内均匀连接着BG颗粒。这一结果表明,该有机-无机双粘合水凝胶具有良好的微观物理结构,生物活性微球都可以良好的连接在孔洞内部。
根据以前的文献,通过NHS,EDC活化羧基反应,本研究通过将阿仑膦酸钠上的氨基和甲基丙烯酰化透明质酸上的羧基相互反应,得到接枝了ALN的HAMA(A-H)。FTIR曲线表明,与单纯HAMA相比,A-H在2929cm-1处出现一个新的波峰,这归因于亚氨基(-CH2-)的伸缩振动,因为含有亚氨基的ALN被成功接枝到HAMA聚合物上。而且在1631cm-1处波峰轻度变宽,这是由于酰胺键的形成。此外,在1321cm-1处波峰变弱,这归因于接枝ALN后羧基的消耗(如图6所示)。
溶胀性能是反映水凝胶性能的一大重要指标,我们通过计算不同的水凝胶组在不同的时间点的膨胀率来确定水凝胶的吸水能力。12小时的溶胀实验结果如图7所示,12小时后A-H+AB-O组,A-H+ABG组及A-H组三组溶胀百分比分别为482.9%,337%,184.9%,A-H+AB-O组较其他两组吸水性分别提升了145.9%及298%,这从侧面反映出随着ABG及ODEX的分别加入,水凝胶长链分子的结合紧密度降低,膨胀率增高。这也是水凝胶填充骨松区域疏松多孔结构的基础。
为了考察随着ABG和ODEX的加入,水凝胶的力学性能的变化,对水凝胶进行了力学测试,将所有样品在测试前在室温PBS中预处理12h。压缩试验采用直径5mm、厚度2mm的圆盘试样,试样在Bose ELF 3200万能测试系统(Bose Corp.,Eden Prairie,MN,USA)上以20%应变/分钟的速率进行压缩试验。通过应力应变曲线的线性段计算应力模型。如图8示随着应变比例的增加,A-H+AB-O组较其他两组具有更小的弹性模量。这说明此复合水凝胶具有良好的延展性及韧性,这可能归因于水凝胶分子内部疏松的结合度。
为了进一步探究无机-有机双粘合水凝胶的结构稳定性,进行了失重实验,结果如图9所示,在PBS中浸泡7d后,各组间的失重率无明显差异。随着时间延长,A-H+AB-O组失重率较其他组下降幅度增大。直至第28天时,A-H+AB-O失重率达43.5%,较其他两组相比无显著差异。这说明此种有机-无机双粘合水凝胶具有持久的降解时间。
有机-无机双粘合水凝胶的细胞相容性评价
为了评价双粘合水凝胶的在体外的细胞生物相容性,使用BMMs和MC3T3-E1细胞进行活/死染色,MC3T3-E1及BMMs细胞种植于水凝胶上三天后去除培养基,用PBS冲洗三遍,然后将配好的活死染色溶液(将5μl钙黄绿素和20μl溴乙非啶豪莫二聚体,加入到10ml PBS中)加入到样品中,每个样品200μl,室温孵育30min,去除染色溶液,PBS清洗3次,拍照。结果显示A-H+AB-O水凝胶的活细胞较多(绿色荧光),死亡细胞(红色荧光)较另外两组要少(如图11所示)。
为了对不同组别细胞增殖进行量化分析,使用cell counting kit-8(CCK-8)实验测试3T3及BMMs细胞在水凝胶上1、3、5天后的增殖情况,培养基去除后PBS清洗三遍,300μL培养液加30μL的CCK-8试剂,放入37°培养箱2小时。然后将100μl的孵育介质转移到另一个96孔板中。最后用酶标仪在450nm波长下读出吸光度的数值。得到CCK-8读数如图12所示,共培养第1d,各组OD值的差异无统计学意义(p>0.05)。第3d,5d时,A-H+AB-O组OD值均高于对照组,差异均有统计学意义(均p<0.01)。水凝胶与MC3T3-E1细胞共培养后的电镜照片也显示细胞黏附与伸展良好,大量细胞集落形成,呈簇状生长,相邻细胞形成拉网状结构。这些均说明此有机-无机双粘合水凝胶具有良好的细胞相容性。
体外成骨评价
为了验证水凝胶材料的体外成骨能力,本研究中对不同水凝胶材料和成骨细胞MC3T3-E1在Transwell板中共培养后进行了7d碱性磷酸酶(ALP)染色及活性检查实验,21d茜素红染色及定量分析实验。支架盘放置于12孔Transwell平板的上腔室,下腔室培养3T3细胞。支架浸没7、14天后用ALP染色试剂盒进行ALP染色,7天后用ALP定量试剂盒定量ALP活性,细胞接种14、21天后用茜素红染色试剂盒定量钙结节。支架盘放置于12孔Transwell平板的上腔室,下腔室培养BMMs细胞。支架浸没5天后用TRAP染色试剂盒进行TRAP染色。
如图13上半部所示,ALP染色结果显示含有ABG的A-H+AB-O组和A-H+AB组染色深度均明显高于A-H组和空白组。茜素红染色结果如图13下半部所示,空白组及A-H组可见稀疏的红色矿化结节,形态不规则,团块较小;A-H+AB-O组和A-H+AB组可见较多的红色矿化结节沉积,部分呈团块状,结节状物呈褐色或红色强阳性反应。ALP是成骨分化过程中的关键性蛋白酶之一,水解有机磷酸盐,使局部PO43-浓度升高,与Ca2+结合后促进钙盐沉积,同时能水解对矿化有极强抑制作用的无机焦磷酸盐,调节骨基质的钙化过程,而钙化结节是基质矿化期的重要表现。
本研究7d的ALP染色程度及活性,A-H+AB-O组活性高于其他组,与对照组差异性明显(p<0.01)(如图15所示)。矿化结节使用高氯酸溶解后,测定溶解液420nm处的吸光度溶解后进行定量分析结果如图16所示,A-H+AB-O组和A-H+AB组的矿化能力均明显高于control组和A-H组,并且两组之间没有显著差异。Runx2,Ocn及OPN蛋白分别是早期和晚期基因标志物,我们分别考察了Runx2,Ocn的,免疫荧光染色(如图14所示)。其结果可见A-H+AB-O组Runx2,Ocn荧光表达的活性明显强于A-H及A-H+AB组,这也与荧光强度的半定量相一致(如图17所示),A-H+AB-O组的Runx2及Ocn荧光强度与A-H组有显著差异(P<0.01)。我们也考察了培养上清中的COL-1及OPN两种成骨指标(如图18所示),A-H+AB-O组上清中两种成骨指标的表达较其他组明显增多,与对照组相比有统计学差异(P<0.05)。最后进行了RT-PCR实验评价了Alp,Runx2,Ocn和Opn四种基因在7,14天时的表达水平(FigS5)。这与培养上清中的成骨指标结果也一致,也印证了ALP染色、茜素红染色和免疫荧光染色的实验结果。
体外破骨评价
抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)在破骨细胞、活化的巨噬细胞、神经元和树突状细胞高度表达。水凝胶与BMMs细胞在Transwell中共培养5天后进行TRAP染色。TRAP染色结果如图19显示RANKL诱导对照组破骨细胞分化,负载阿仑膦酸钠的水凝胶显著抑制rankl诱导的破骨细胞分化。染色结果定量分析如图21显示,成熟破骨细胞数量从61.1±3.3(A-H)减少到17.7±4.1(A-H+AB-O),破骨细胞百分比面积(如图22显示)从80.3%±3.3(A-H)下降到7.7±2.1(A-H+AB-O),这可能归因于A-H+AB-O组的有机粘附导致阿仑膦酸钠局部药物浓度高引起。与单纯A-H组比起来,A-H+AB-O组减少了破骨细胞相关基因MMP-9的荧光表达水平(如图20所示),荧光强度半定量显示419.2±32.7(A-H)下降到13.08±9.45(A-H+AB-O)。我们也考察了培养上清中的MMP-9及TRAP两种破骨指标(如图23所示),A-H+AB-O组上清中两种破骨指标的表达较其他组明显减少,与对照组相比有统计学差异(P<0.05)。NFATc1和c-fos是NF-kB促进破骨细胞前体细胞分化为成熟破骨细胞的下游基因。通过进行RT-PCR实验评价NFATc1,TRAP,MMP-9,c-fos四种破骨基因的表达水平,其结果与TRAP染色、荧光半定量及Elisa结果也相互印证。
骨质疏松动物模型的建立
大鼠仰卧位固定,小腹剃毛、清洗、消毒。下腹部正中纵白线切口,行卵巢切除术。实验动物随机分为两组:低雌激素水平行双侧卵巢切除诱导骨质疏松症的OVX组和只切除卵巢周围脂肪组织的(SHAM)组。切除卵巢后,将动物放回笼子,按照上述喂养方案进行喂养。卵巢切除术后8周,就在植入手术干预之前,OVX实验组在吸入麻醉(异氟醚)下通过体内micro-CT(SkyScan1176 in-vivo micro-CT,BRUKER,Kontich,Belgium)进行扫描,以评估骨质量。
OVX组首先通过Micro-CT 3D扫描证实股骨髁骨量减少,与假手术组相比,明显表现为骨小梁减少,骨小梁结构紊乱,骨髓腔扩大(如图24所示)。此外,H&E和Masson染色(图25)也显示两组间有明显变化。OVX大鼠表现为骨小梁棒状退化,与SHAM组正常的板状骨小梁不同。Micro-CT定量分析(图26)进一步揭示了OVX组感兴趣区域的BV,BMD,Conn.D,Tb.N和Tb.Th比SHAM组分别减少了69%,74%,29%和57%。相应的,Tb.Sp在切除卵巢8周后增加了6.8倍(如图27所示)。这些结果证实了去卵巢大鼠骨质疏松症模型的建立。
双粘合水凝胶体内应用
去卵巢手术8周以后,所有的骨质疏松老鼠股骨髁全部置入Ti螺钉,在本研究中A-H组、A-H+AB组、A-H+AB-O组水凝胶分别进行置钉前的钉道内注射。螺钉的置入位置正好位于股骨正中髁,不在膝关节腔内,Ti螺钉的大小与大鼠股骨髁完全吻合。分别在愈合4周、8周后,将所有大鼠在乙醚麻醉下处死,并用Micro-CT分析植入钛螺钉的股骨髁(如图28所示)。为评价不同水凝胶的界面成骨和新骨形成情况,在相同兴趣体积(VOI)下,有机-无机双粘合水凝胶组(A-H+AB-O)骨体积/组织体积百分比(BV/TV)明显最高,这一结果也可能与A-H+AB-O组Ti螺钉界面的材料粘附性和成骨性改善有关。术后8周VOI定量分析表明,A-H+AB-O组的BV/TV(8.967±0.709)比起A-H组(3.567±0.764),A-H+AB组(7.333±0.503)分别提升了2.51及1.22倍,这个结果跟术后一个月A-H+AB-O组的BV/TV(7.3±0.557)相比较而言,也有统计学差异。A-H+AB-O组显著的界面成骨性和良好的骨状态均提示有机-无机双粘合水凝胶能有效地改善内植物周围紊乱的骨代谢。例如,术后8周A-H+AB-O组的Conn.D,Tb.N分别是(25.337±1.932)及(2.464±0.219)与Control组(12.403±1.046,1.059±0.09)相比有明显统计学差异。与术后4周(23.54±1.059,2.09±0.219)比较起来均有统计学差异。事实上,A-H组和A-H+AB组的骨体积也有轻微的改善,新形成的骨状况也有所改善。然而,这两组单粘附功能(无论是改善材料黏附还是诱导成骨)都不能实现与A-H+AB-O组有机-无机双粘附组相媲美。而且,Micro-CT分析显示,单无机粘附的A-H组与A-H+AB组之间无显著差异。这一结果从另一个角度证明了促进内植物周围松质骨骨重建的两种关键因素(有机无机双粘合、诱导成骨及抑制破骨)对于增强界面成骨和改善新形成的骨条件同样重要,特别是在骨质疏松的情况下。为了最终评估骨整合的结果,我们通过先前报道的生物力学拔出试验来测量植入钛螺钉的抗拔出力。骨愈合8周后,与Control组相比,A-H组、A-H+AB组、A-H+AB-O组螺钉平均最大推出力分别增加(1.15)倍、(1.83)倍、(2.24)倍。与愈合4周相比,A-H+AB-O组增加了1.27倍。这也与术后螺钉周围的新生骨形成相一致。
组织学和组织形态定量分析
组织学检查是研究内植物周围骨组织形态的一种直接方法,本研究中,用甲苯胺蓝染色观察骨质疏松大鼠内植物-骨接触(BIC)和骨/螺钉界面螺纹区骨长入情况。如图29所示,术后4周、8周后,未处理的螺钉(Control组)周围界面骨形成较少,而A-H组、A-H+AB组、A-H+AB-O组螺钉螺纹上新形成的骨明显增多。而且,A-H+AB-O组织学切片显示螺钉周围骨基质连续,周边骨小梁明显增加,进一步提示此有机-无机双粘合水凝胶在调节骨代谢,促进成骨抑制破骨作用过程中发挥关键作用。骨种植体接触(Bone implant contact,BIC)定义为骨-移植体直接接触与种植体总表面的长度比,是量化骨结合程度的标准之一。组织形态学分析表明术后8周,与Control组相比,A-H组、A-H+AB组、A-H+AB-O组BIC分别增加(1.19)倍、(2.25)倍、(2.77)倍,与术后4周相比A-H+AB-O组增加了1.16倍。A-H+AB-O组的BIC显著增加,证明了有机-无机双粘合水凝胶在骨质疏松情况下具有良好的骨整合能力。这归因于骨质疏松症中破骨细胞的显著激活,而破骨细胞被阿仑膦酸钠极大地抑制,再整合生物活性玻璃的骨生成能力,从而极大地促进了骨代谢在成骨和破骨之间的平衡。在我们的研究中,骨质疏松大鼠内植物周围显著的骨整合增强也可能与有机-无机双粘合协同作用利于细胞长入、减少水凝胶随体液丢失有关。虽然这一假设需要在未来的研究中进一步证实,但我们的研究结果表明,有机-无机双粘合水凝胶的策略确实是可行的,以改善骨质疏松条件下内植物的骨整合,促进螺钉周围松质骨重建。
为了进一步研究有机-无机双粘合水凝胶钉道内成骨情况,我们将螺钉拧出后的横断面进行术后4周及8周的组织学切片及定量分析(如图30所示),术后4周,A-H+AB、A-H+AB-O组红染的骨胶原纤维(H&E)及蓝染及深红的骨胶原纤维(Masson染色)及明显多于Control组和A-H组,后两者钉道周围由纤维结缔组织填充居多。这种情况在术后8周时进一步明显。进一步的定量分析表明,术后8周时,与Control组、A-H组及A-H+AB相比,A-H+AB-O组H&E红染区域分别增加了2.96倍,2.74倍,1.47倍,与术后4周时A-H+AB-O组比起来增加了1.2倍。这一结果在Masson染色中也得以验证。
术后4周及8周样本的Collagen I及OPN免疫组化染色显示钉道周围组织中广泛的阳性染色区域,与Control、A-H组、A-H+AB组相比,A-H+AB-O组Collagen I及OPN表达普遍增加,Collagen I及OPN的定量分析结果进一步证明了这一趋势。采用TRAP染色法对术后4周及8周组织学切片中的OCs进行鉴定。正如预期的那样,Control组显示了较大的trap阳性区域。这是骨质疏松症下过度的OC活动所导致的。然而,A-H+AB-O组钉道周围很少有OCs存在,这可能归因于此双粘合水凝胶在松质骨内的有机粘附作用,导致阿伦磷酸钠的局部释放高浓度引起。TRAP的定量分析也证明了这一趋势。BG的可以释放硅离子,这使水凝胶具有增强血管化和组织再生的能力,CD31被称为免疫球蛋白超家族成员,通过内皮细胞表达介导细胞间黏附,因此,它被广泛应用于评价体内血运重建的情况。钉道周围血管染色为棕色、圆形或椭圆形结构,术后4周及8周A-H+AB-O及A-H+AB组较Control组、A-H组棕色着色要深且区域较广泛。CD31的定量分析显示示术后8周与Control组(11.703±2.7)、A-H组(8.907±2.515)及A-H+AB(19.83±3.519)相比,A-H+AB-O组阳性区域明显增大(28.9±3.495),与术后4周时A-H+AB-O组比起来也增加了1.39倍。
在本发明中,通过活化羧基反应将阿伦磷酸钠接枝在甲基丙烯酰化透明质酸上,再结合氧化葡聚糖修饰的生物活性玻璃,最后引入紫外光交联将其固化在内植物周围松质骨区,设计了一种能够调节局部骨代谢的可注射“有机/-无机双粘合水凝胶”来固定骨质疏松情况下的骨科内植物。这种双粘合水凝胶不仅可以与骨小梁上的无机磷酸钙粘合,还可以与骨小梁上的有机胶原相结合,同时兼具阿仑膦酸钠的抑制破骨细胞活性和生物活性玻璃的传导性,进而平衡内植物周围的局部骨代谢,从而达到增强骨科内植物锚定的功能。这种有机-无机双粘合复合水凝胶是一种新兴的治疗策略,模拟骨小梁化学成分双粘合的同时,又不失机械稳定性和生物相容性,为增强骨质疏松患者螺钉固定能力提供一种新思路。
本发明的技术范围不仅仅局限于上述说明中的内容,本领域技术人员可以在不脱离本发明技术思想的前提下,对上述实施例进行多种变形和修改,而这些变形和修改均应当属于本发明的保护范围内。
Claims (11)
1.一种用于调节局部骨代谢的有机-无机复合水凝胶的制备方法,其特征在于,包括:
以阿仑膦酸钠接枝至HAMA上得ALN-HAMA,将20份醛基葡聚糖和30份氨基化的生物玻璃、10份ALN-HAMA分别与0.625份光引发剂混合后溶于缓冲溶液中,上述两种溶液物理混合后经紫外光照射成胶。
2.根据权利要求1所述的用于调节局部骨代谢的有机-无机复合水凝胶,其特征在于,所述光引发剂选用LAP,将25mg LAP溶于10ml PBS中制成质量浓度为0.25%的引发剂标准溶液。
3.根据权利要求2所述的用于调节局部骨代谢的有机-无机复合水凝胶,其特征在于,包括:以阿仑膦酸钠接枝至HAMA上得ALN-HAMA,将20mg醛基葡聚糖和30mg氨基化的生物玻璃、10mgALN-HAMA分别溶于0.25ml光引发剂溶液中,上述两种溶液物理混合后经紫外光照射成胶。
4.根据权利要求3所述的用于调节局部骨代谢的有机-无机复合水凝胶,其特征在于,20mg ODEX干粉以及30mgABG溶于0.25ml光引发剂中后,超声加热至50±5℃并保持,直至溶液变黄。
5.根据权利要求1所述的用于调节局部骨代谢的有机-无机复合水凝胶,其特征在于,所述醛基葡聚糖由如下方法制备:向葡聚糖溶液中滴加氧化剂,氧化反应结束后对反应体系透析过滤,过滤产物冷冻干燥后得醛基葡聚糖的干粉。
6.根据权利要求1所述的用于调节局部骨代谢的有机-无机复合水凝胶,其特征在于,所述氨基化的生物玻璃由如下方法制备:向有机溶液中依次加入BG以及APTES并振荡均匀,反应产物离心洗涤后得ABG。
7.根据权利要求1所述的用于调节局部骨代谢的有机-无机复合水凝胶,其特征在于,所述以HAMA接枝至阿仑膦酸钠过程于非碱性环境下进行,接枝过程中阿仑膦酸钠和HAMA的质量比为1:1,偶联剂选用EDC和NHS,耦合得到的产品以截留分子量为2500-3200的透析管进行透析。
8.根据权利要求5所述的用于调节局部骨代谢的有机-无机复合水凝胶的制备方法,其特征在于,所述氧化剂选用高碘酸钠溶液,于反应5-7h后向反应体系内加入1±0.5ml乙二醇中止氧化反应,反应体系以截留分子量为3000-3500的透析袋透析。
9.根据权利要求5所述的用于调节局部骨代谢的有机-无机复合水凝胶的制备方法,其特征在于,所述过滤产物于-20±5℃环境下预冻,随后转移至冷冻干燥器冻干47-49h。
10.一种如权利要求1-9所述用于调节局部骨代谢的有机-无机复合水凝胶的制备方法所制得的用于调节局部骨代谢的有机-无机复合水凝胶,其特征在于,以质量体积比计,包括0.5-3%HAMA,0.5-3%阿仑膦酸钠,3-6%ABG以及3-6%ODEX,以上述物质溶于质量浓度为0.25%的光引发剂溶液中。
11.根据权利要求10所述的用于调节局部骨代谢的有机-无机复合水凝胶,其特征在于,所述ODEX和ABG聚合后用于结合骨小梁上的有机胶原组织,所述ALN-HAMA用于结合骨小梁上的磷酸钙无机物。
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