KR20230091583A - 피코시아닌 및 넙치 콜라겐을 이용한 골 조직 재생용 나노섬유 및 이의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 피코시아닌 및 넙치 콜라겐을 이용한 골 조직 재생용 나노섬유 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명의 피코시아닌, 넙치 유래 콜라겐, 알긴산 칼슘 및 생분해성 고분자를 포함하는 나노섬유는 ALP(Alkaline phosphatase) 활성을 증가시키고, 골미네랄화를 촉진시키는 활성이 우수하여 골 조직 재생 또는 골 형성 촉진을 위한 지지체로 유용하게 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 피코시아닌 및 넙치 콜라겐을 이용한 골 조직 재생용 나노섬유 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 피코시아닌, 넙치 유래 콜라겐, 알긴산 및 생분해성 고분자를 포함하는, 골 조직 재생 또는 골 형성 촉진을 위한 이식재 또는 대체재용 나노섬유에 관한 것이다.
골(뼈)은 인체 내에서 장기를 보호하고, 혈액을 생성하고, 칼슘을 저장하는 등의 역할을 하고 있다. 뼈는 30%의 유기물과 70%의 무기물로 구성되어 있으며, 이 유기물의 거의 90%가 콜라겐이고, 나머지 물질은 대부분 비콜라겐성 단백질, 지질, 프로테오글리칸 및 기타 골기질 단백질인 오스테오폰틴, 오스테오칼신 및 오스테오넥틴이다. 뼈는 체내 중요한 조직의 주요 구조 형성, 근육, 인대 및 힘줄의 결합 역할, 기계적 지지 및 보호를 포함하는 수많은 기능을 수행한다. 또한 조혈과 미네랄은 골수 구조에 의해 제공된다.
이러한 신체에서 중요한 역할을 하는 뼈와 관련하여 발생되는 질환으로는 류마티스 관절염, 골다공증, 요통 등 다양한 근골격계 질환이 있다. 골다공증은 낮은 뼈 질량과 뼈 구조의 파괴를 특징으로 하는 뼈 질환이며, 여성과 노인에게 더 흔하게 나타나고, 폐경기를 지난 여성은 골다공증의 위험이 더 높은 것으로 알려져있다. 이러한 골 조직의 손실 또는 결함이 발생하였을 때에, 지지체와 약물을 사용하여 뼈를 복구하는 과정을 연구중에 있으며, 조직 재생을 돕기 위한 나노, 마이크로 단위의 막에 대해 연구가 광범위하게 진행되고 있다.
최근 골 재생 연구에서 스캐폴드는 환자의 적절한 치료에 중요한 역할을 하는 것으로 간주되었고, 의료 분야에서 많은 유형의 지지체가 사용되고 있다. 많은 연구자들이 용제 주조, 가스 발포, 하이드로겔 및 전기방사를 포함한 스캐폴드를 생산하고 있다. 특히, 세포외 기질에 대한 전기방사 중합체의 구조적 유사성 및 유연한 특성을 갖는 의료용 멤브레인(막)의 제조방법으로 전기방사가 주목을 받고 있다. 전기방사는 표면 형태의 조절이 용이하고, 복잡한 3D 프로파일 설계가 가능하며, 비교적 비용이 저렴하다는 장점이 있다. 다양한 생체재료 중 PLA(poly-lactic acid), PCL(polycaprolactone), PLGA(poly-lactic-glycolic acid), PVA(polyvinyl alcohol), PU(polyurethane), PEO(polyethylene glycol) 등의 합성고분자 또는 콜라겐, 키토산, 알지네이트, 실크, 피브린 등의 천연고분자가 골 재생을 위한 전기방사 섬유로 널리 사용되고 있다. 상기 합성고분자는 인체 내 삽입에 대해 FDA(Food and Drug Administration)의 승인을 받았으며 생체 적합성과 생분해성이 높은 것으로 알려져 있다.
한편, 콜라겐은 세포외기질(ECM)의 주요 단백질이자 결합조직의 주성분으로 전체 단백질의 25%를 차지한다. 모든 유형의 콜라겐은 Gly-X-Y 펩타이드와 같은 3개의 폴리펩타이드 사슬 나선과 조직화된 아미노산을 구성하는 유사한 구조이다. 콜라겐에는 29가지 유형이 있으며, 그 중 1,2,3 유형이 인간의 모든 콜라겐의 90%를 구성하는 주요 유형으로 알려져있다. 1형은 주로 피부, 힘줄, 혈관에 분포하고 2형은 연골, 3형은 혈관벽에 분포한다. 따라서 콜라겐은 생체적합성이 우수하고 항원성이 비교적 낮으며 생분해성이 우수하고 화학주성이라는 특성 때문에 결합조직 재생에서 가장 중요한 생체재료이다. 이러한 특성을 가진 콜라겐은 세포 이동, 접착, 증식 및 확산과 같은 세포 반응을 유도하기에 좋은 생체 모방 환경을 만들 수 있다. 그러나 돼지와 소에서 추출한 상업용 콜라겐을 생물의학 분야에 사용하는 것은 인수공통전염병의 위험성과 종교적 문제가 있으며, 면역거부반응과 환자들의 시술거부 문제로 인해 상용이 제한적이다. 이로 인해 최근 생물의학 분야에서 해양생물 유래 콜라겐에 대한 연구가 증가하고 있다. 또한 해양 콜라겐은 추출이 간단하고 안전성이 높으며 면역원성이 낮고 생산원가가 낮고 수용성이라는 장점이 있다. 해양 생물 가운데 어류는 척추 동물이기 때문에 인간과 유사한 조직 및 대사 과정을 가지고 있으며, 전염성 질병 및 종교적 문제에 영향을 미치지 않으므로 기존 육상 콜라겐을 이용한 의공학 소재들의 대안으로 여겨지고 있다.
미국, 영국 및 일본 등 선진국에서는 일찍이 해양생물을 대상으로 특이한 구조와 효능을 가지는 천연물질에 대한 연구가 활발히 진행 중으로 과거에 활용하지 못했던 여러 물질들을 고부가가치의 상품으로 개발 중에 있다. 현재 사용되는 골대사 개선 주요 약물은 대부분 조골세포 증식 및 분화가 아닌 파골세포 억제효능을 지녔으며, 최근 체내 항상성 조절에 따른 부작용도 보고되어 있어 골대사 개선 대체 약물의 필요성이 돋보이고 있다. 또한, 골결손 부위에 약물을 지속적으로 처리해주기 위한 약물전달체 개발을 통해 기존 약물을 통한 치료보다 빠른 골조직 회복이 가능한 소재 개발이 필요하다.
본 발명자들은 골 조직 재생용 의료기기 및 소재를 개발하고자 연구한 결과, 해양 유래 콜라겐, 피코시아닌 및 생분해성 고분자를 이용하여 골 이식재로 적용가능한 나노섬유를 제조하였으며, 이의 세포부착, 항산화, 항염, ALP 활성, 골 생성 촉진을 통한 골재생 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 골 조직 재생 또는 골 형성 촉진을 위한 이식재 또는 대체재용 나노섬유를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 나노섬유의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 나노섬유를 포함하는 골 조직 재생 또는 골 형성 촉진용 이식재 또는 대체재에 관한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 피코시아닌, 어류 유래 콜라겐, 알긴산 및 생분해성 고분자를 포함하는, 골 조직 재생 또는 골 형성 촉진을 위한 이식재 또는 대체재용 나노섬유를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 피코시아닌은 스피루리나에서 유래한 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 어류는 넙치인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 어류 유래 콜라겐은 넙치 피부를 효소처리하여 텔로부분이 제거된 아텔로콜라겐(atelocollagen)일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 콜라겐은 펩신 용해성 콜라겐 및 산 용해성 콜라겐에서 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 알긴산은 알긴산 칼슘 및 알긴산 나트륨에서 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 폴리락틱산, 폴리카프로락톤, 폴리글리콜산, 폴리락틱산-글리콜산 공중합체, 폴리비닐알콜, 폴리우레탄, 폴리에틸렌글리콜, 폴리디옥사논, 폴리하이드록시부티레이트, 폴리하이드록시부티릭산-하이드록시발러릭산 공중합체, 폴리(γ에틸 글루타메이트) 및 폴리안하이드라이드 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.
또한, 알긴산 함유 용액과 생분해성 고분자를 혼합한 전기방사용 혼합용액을 제조하는 단계(단계 1); 및 전기방사용 혼합용액을 전기방사하는 단계(단계 2);를 포함하고, 상기 알긴산 함유 용액은 용액 전체 부피 대비 0.5 내지 10부피%의 피코시아닌을 함유하는 것을 특징으로 하는, 골 조직 재생 또는 골 형성 촉진을 위한 이식재 또는 대체재용 나노섬유의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단계 1의 알긴산 함유 용액은 알긴산 나트륨 수용액인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단계 2는 전기방사용 혼합용액을 전기방사하여 섬유막을 수득하는 단계(단계 2-1); 및 단계 2-1에서 얻은 섬유막 표면에 콜라겐 원섬유(fibril)를 형성시키는 단계(단계 2-2);를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 제조방법은 알긴산 나트륨 수용액을 이용하여 제조된 섬유막을 염화칼슘 용액을 사용하여 알긴산 나트륨을 알긴산 칼슘으로 이온교환하는 단계;를 더 포함하는 것일 수 있다.
나아가, 본 발명은 상기 나노섬유를 포함하는 골 조직 재생 또는 골 형성 촉진용 지지체를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 골 조직 재생 또는 골 형성 촉진용 지지체는 골 이식재 또는 골 대체재로 사용되는 것일 수 있다.
본 발명의 피코시아닌, 넙치 유래 콜라겐, 알긴산 칼슘 및 생분해성 고분자를 포함하는 나노섬유는 MC3T3-E1 전조골세포 및 골 손실 유발 동물모델에서 골 세포 및 조직에 독성을 나타내지 않으며 생체적합성이 우수하고, 골 조직 재생을 위한 세포의 부착, 증식 및 분화에 유리하며, ALP(Alkaline phosphatase) 활성 증가, 골형성 인자의 발현 증가 및 골 미네랄화 촉진 활성이 우수하여, 효과적으로 골 재생을 유도할 수 있으므로, 골 조직 재생 또는 골 형성 촉진을 위한 지지체, 즉, 골 이식재 또는 골 대체재로 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 스피루리나(Spirulina maxima)로부터 피코시아닌의 추출 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 스피루리나(Spirulina maxima)에서 추출한 피코시아닌의 (A) DPPH 라디칼 소거능; 및 (B) H2O2 라디칼 소거능;을 나타낸 그래프이다.
도 3은 스피루리나 피코시아닌의 RAW 264.7 대식세포에서 (A) 세포독성; 및 (B) 일산화질소(nitric oxide, NO) 생성량;에 대한 효과 측정을 통해 항염증 활성을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 넙치(Paralichthys olivaceus) 피부에서 추출된 콜라겐의 특성을 평가하기 위해 (A) SDS-PAGE 패턴; (B) UV-Vis 흡수 스펙트럼; (C) 푸리에 변환 적외선 스펙트럼; 및 (D) 콜라겐의 X선 회절 패턴;을 분석한 결과이다.
도 5는 스피루리나 피코시아닌의 MC3T3-E1 골아세포에서 (A) 세포독성; 및 (B) 알칼리 인산화효소 (alkaline phosphatase, ALP) 활성;에 대한 효과 측정을 통해 골재생 효능을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다. 이때, 상기 피코시아닌의 농도를 6.25, 12.5, 25, 50, 100 및 200㎍/ml로 다르게 처리하여 골아세포를 3일 동안 배양하였다.
도 6은 스피루리나 피코시아닌 처리 농도에 따른 H2O2로 유발된 MC3T3-E1 세포의 세포 내 ROS 수준에 대한 형광 이미지 및 형광 강도를 나타낸 그래프이다. 이때, MC3T3-E1 세포를 300μM H2O2로 30분 동안 처리한 후, 피코시아닌으로 24시간 처리한 다음 세포를 2',7-디클로로디하이드로플루오레세인 디아세테이트(DCFDA) 및 Hoechst 33342로 염색하고 현미경으로 관찰하였다.
도 7은 (A) H2O2 처리 농도에 따른 MC3T3-E1 세포의 알칼리성 인산분해효소(ALP) 활성; 및 (B) 300μM H2O2 조건에서 전처리한 후 7일 배양 후 스피루리나 피코시아닌으로 처리한 MC3T3-E1 세포의 ALP 활성을 나타낸 결과이다.
도 8은 스피루리나 피코시아닌 처리 농도에 따른 LPS로 유발된 MC3T3-E1 세포의 세포 내 ROS 수준에 대한 형광 이미지 및 형광 강도를 나타낸 그래프이다. 이때, MC3T3-E1 세포를 1μg/ml LPS로 처리한 후, 피코시아닌으로 24시간 처리한 다음 세포를 2',7-디클로로디하이드로플루오레세인 디아세테이트(DCFDA) 및 Hoechst 33342로 염색하고 현미경으로 관찰하였다.
도 9는 (A) LPS 처리 농도 및 처리 기간에 따른 MC3T3-E1 세포의 알칼리성 인산분해효소(ALP) 활성; 및 (B) 1μg/ml LPS 조건에서 전처리한 후 7일 배양 후 스피루리나 피코시아닌으로 처리한 MC3T3-E1 세포의 ALP 활성을 나타낸 결과이다. ALP 활성은 1-단계 pNPP 용액을 사용하여 측정되었다.
도 10은 스피루리나 피코시아닌이 MC3T3-E1 전조골세포에 의한 미네랄화에 미치는 영향 및 골재생 효능을 분석하기 위하여, 7, 14, 21 및 28일에 미네랄화된 결절 형성을 450 nm에서 Alizarin Red S 염색을 통해 정량 분석한 결과(하단); 및 Alizarin Red S를 매트릭스에서 용출하여 550 nm에서 마이크로플레이트 판독기로 염색된 Ca2+를 측정한 결과(상단)이다.
도 11은 스피루리나 피코시아닌의 골재생 효능을 분석하기 위하여, MC3T3-E1세포에 대한 스피루리나 50 및 100 μg/ml 처리군 및 처리하지 않은 군의 세포내 골형성 인자(ALP, OPN 및 OCN) 단백질 발현 수준을 측정한 결과이다.
도 12A는 스피루리나 피코시아닌이 함유된 PLA, PLA/SA, PLA/CA, PLA/CA/PC 및 PLA/CA/PC/Col 전기방사 섬유막의 표면 형태를 분석한 SEM 사진이다.
도 12B는 스피루리나 피코시아닌이 함유된 PLA, PLA/SA, PLA/CA, PLA/CA/PC 및 PLA/CA/PC/Col 전기방사 섬유막의 물 접촉각 및 수분흡수도를 분석한 결과이다.
도 13은 스피루리나 피코시아닌이 함유된 PLA, PLA/SA, PLA/CA, PLA/CA/PC 및 PLA/CA/PC/Col 전기방사 섬유막의 (A) 푸리에 변환 적외선(FT-IR) 스펙트럼; 및 (B) X선 회절 패턴 분석 결과이다.
도 14A는 스피루리나 피코시아닌이 함유된 PLA, PLA/SA, PLA/CA, PLA/CA/PC 및 PLA/CA/PC/Col 전기방사 섬유막의 세포 독성 검토를 위해, MC3T3-E1 세포에 대한 세포 생존율을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 14B는 스피루리나 피코시아닌이 함유된 PLA, PLA/SA, PLA/CA, PLA/CA/PC 및 PLA/CA/PC/Col 전기방사 섬유막의 세포 부착 및 세포증식을 평가하기 위하여, 형광염색법으로 분석한 형광 이미지이다.
도 15는 스피루리나 피코시아닌이 함유된 PLA, PLA/SA, PLA/CA, PLA/CA/PC 및 PLA/CA/PC/Col 전기방사 섬유막의 골재생 효능 평가를 위하여, MC3T3-E1 골아세포의 (A) ALP 활성 분석 결과; 및 (B) 미네랄화를 알리자린 레드 염색으로 측정한 결과이다.
도 16은 스피루리나 피코시아닌이 함유된 PLA, PLA/SA, PLA/CA, PLA/CA/PC 및 PLA/CA/PC/Col 전기방사 섬유막의 골결손 동물모델에 대한 골재생 효능 평가(in vivo)를 위하여, (A) 두개골 표본 외부에서 섬유막 이식군과 대조군 사이의 대조 이미지; (B, C) MRI를 이용한 결함 영역의 3D 재구성 이미지; 및 (D) 12주에 낮은 배율(40배) 및 높은 배율(100배 배율)에서 H&E 염색(남은 섬유질 막은 검은색 화살표로, 기존의 뼈는 HB로, 새로 형성된 뼈는 NB로, 섬유성 조직은 FT로 표시됨)을 통한 조직학적 분석 결과이다.
도 2는 스피루리나(Spirulina maxima)에서 추출한 피코시아닌의 (A) DPPH 라디칼 소거능; 및 (B) H2O2 라디칼 소거능;을 나타낸 그래프이다.
도 3은 스피루리나 피코시아닌의 RAW 264.7 대식세포에서 (A) 세포독성; 및 (B) 일산화질소(nitric oxide, NO) 생성량;에 대한 효과 측정을 통해 항염증 활성을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 넙치(Paralichthys olivaceus) 피부에서 추출된 콜라겐의 특성을 평가하기 위해 (A) SDS-PAGE 패턴; (B) UV-Vis 흡수 스펙트럼; (C) 푸리에 변환 적외선 스펙트럼; 및 (D) 콜라겐의 X선 회절 패턴;을 분석한 결과이다.
도 5는 스피루리나 피코시아닌의 MC3T3-E1 골아세포에서 (A) 세포독성; 및 (B) 알칼리 인산화효소 (alkaline phosphatase, ALP) 활성;에 대한 효과 측정을 통해 골재생 효능을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다. 이때, 상기 피코시아닌의 농도를 6.25, 12.5, 25, 50, 100 및 200㎍/ml로 다르게 처리하여 골아세포를 3일 동안 배양하였다.
도 6은 스피루리나 피코시아닌 처리 농도에 따른 H2O2로 유발된 MC3T3-E1 세포의 세포 내 ROS 수준에 대한 형광 이미지 및 형광 강도를 나타낸 그래프이다. 이때, MC3T3-E1 세포를 300μM H2O2로 30분 동안 처리한 후, 피코시아닌으로 24시간 처리한 다음 세포를 2',7-디클로로디하이드로플루오레세인 디아세테이트(DCFDA) 및 Hoechst 33342로 염색하고 현미경으로 관찰하였다.
도 7은 (A) H2O2 처리 농도에 따른 MC3T3-E1 세포의 알칼리성 인산분해효소(ALP) 활성; 및 (B) 300μM H2O2 조건에서 전처리한 후 7일 배양 후 스피루리나 피코시아닌으로 처리한 MC3T3-E1 세포의 ALP 활성을 나타낸 결과이다.
도 8은 스피루리나 피코시아닌 처리 농도에 따른 LPS로 유발된 MC3T3-E1 세포의 세포 내 ROS 수준에 대한 형광 이미지 및 형광 강도를 나타낸 그래프이다. 이때, MC3T3-E1 세포를 1μg/ml LPS로 처리한 후, 피코시아닌으로 24시간 처리한 다음 세포를 2',7-디클로로디하이드로플루오레세인 디아세테이트(DCFDA) 및 Hoechst 33342로 염색하고 현미경으로 관찰하였다.
도 9는 (A) LPS 처리 농도 및 처리 기간에 따른 MC3T3-E1 세포의 알칼리성 인산분해효소(ALP) 활성; 및 (B) 1μg/ml LPS 조건에서 전처리한 후 7일 배양 후 스피루리나 피코시아닌으로 처리한 MC3T3-E1 세포의 ALP 활성을 나타낸 결과이다. ALP 활성은 1-단계 pNPP 용액을 사용하여 측정되었다.
도 10은 스피루리나 피코시아닌이 MC3T3-E1 전조골세포에 의한 미네랄화에 미치는 영향 및 골재생 효능을 분석하기 위하여, 7, 14, 21 및 28일에 미네랄화된 결절 형성을 450 nm에서 Alizarin Red S 염색을 통해 정량 분석한 결과(하단); 및 Alizarin Red S를 매트릭스에서 용출하여 550 nm에서 마이크로플레이트 판독기로 염색된 Ca2+를 측정한 결과(상단)이다.
도 11은 스피루리나 피코시아닌의 골재생 효능을 분석하기 위하여, MC3T3-E1세포에 대한 스피루리나 50 및 100 μg/ml 처리군 및 처리하지 않은 군의 세포내 골형성 인자(ALP, OPN 및 OCN) 단백질 발현 수준을 측정한 결과이다.
도 12A는 스피루리나 피코시아닌이 함유된 PLA, PLA/SA, PLA/CA, PLA/CA/PC 및 PLA/CA/PC/Col 전기방사 섬유막의 표면 형태를 분석한 SEM 사진이다.
도 12B는 스피루리나 피코시아닌이 함유된 PLA, PLA/SA, PLA/CA, PLA/CA/PC 및 PLA/CA/PC/Col 전기방사 섬유막의 물 접촉각 및 수분흡수도를 분석한 결과이다.
도 13은 스피루리나 피코시아닌이 함유된 PLA, PLA/SA, PLA/CA, PLA/CA/PC 및 PLA/CA/PC/Col 전기방사 섬유막의 (A) 푸리에 변환 적외선(FT-IR) 스펙트럼; 및 (B) X선 회절 패턴 분석 결과이다.
도 14A는 스피루리나 피코시아닌이 함유된 PLA, PLA/SA, PLA/CA, PLA/CA/PC 및 PLA/CA/PC/Col 전기방사 섬유막의 세포 독성 검토를 위해, MC3T3-E1 세포에 대한 세포 생존율을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 14B는 스피루리나 피코시아닌이 함유된 PLA, PLA/SA, PLA/CA, PLA/CA/PC 및 PLA/CA/PC/Col 전기방사 섬유막의 세포 부착 및 세포증식을 평가하기 위하여, 형광염색법으로 분석한 형광 이미지이다.
도 15는 스피루리나 피코시아닌이 함유된 PLA, PLA/SA, PLA/CA, PLA/CA/PC 및 PLA/CA/PC/Col 전기방사 섬유막의 골재생 효능 평가를 위하여, MC3T3-E1 골아세포의 (A) ALP 활성 분석 결과; 및 (B) 미네랄화를 알리자린 레드 염색으로 측정한 결과이다.
도 16은 스피루리나 피코시아닌이 함유된 PLA, PLA/SA, PLA/CA, PLA/CA/PC 및 PLA/CA/PC/Col 전기방사 섬유막의 골결손 동물모델에 대한 골재생 효능 평가(in vivo)를 위하여, (A) 두개골 표본 외부에서 섬유막 이식군과 대조군 사이의 대조 이미지; (B, C) MRI를 이용한 결함 영역의 3D 재구성 이미지; 및 (D) 12주에 낮은 배율(40배) 및 높은 배율(100배 배율)에서 H&E 염색(남은 섬유질 막은 검은색 화살표로, 기존의 뼈는 HB로, 새로 형성된 뼈는 NB로, 섬유성 조직은 FT로 표시됨)을 통한 조직학적 분석 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 '%'는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (w/w) %, 고체/액체는 (w/v) %, 그리고 액체/액체는 (v/v) %이다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
일 측면에서, 본 발명은 피코시아닌, 어류 유래 콜라겐, 알긴산 및 생분해성 고분자를 포함하는, 골 조직 재생 또는 골 형성 촉진을 위한 이식재 또는 대체재용 나노섬유에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용된, 용어, "골 조직 재생" 또는 "골 형성"은 손상된 골 조직을 골 세포가 증식하거나 또는 골아세포가 골 세포로 분화하는 등의 과정을 거쳐 골 손상을 치료, 완화, 개선시키는 모든 현상을 의미할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 상기 골 재생은 특히 골 분화 촉진에 의한 것일 수 있다.
본 발명에 따른 나노섬유에 있어서, 상기 피코시아닌은 스피루리나에서 유래한 것일 수 있다. 상기 피코시아닌은 피코시아닌 단독 성분을 의미하는 것일 수 있고, 피코시아닌을 함유하는 스피루리나 추출물(정제물)을 의미하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 피코시아닌은 스피루리나(Spirulina maxima)를 초순수(ultrapure water)에 침용한 다음, 원심분리하여 얻어진 상청액을 여과함으로써 수득되는 것일 수 있다.
본 발명의 피코시아닌은 하기와 같은 구조를 갖는 것일 수 있다.
[화학식 1]
본 명세서에서 용어, "어류 유래 콜라겐"은 어류로부터 수득된 콜라겐을 의미한다. 상기 어류 유래 콜라겐은 바람직하게 어류의 피부로부터 얻어질 수 있다. 상기 어류는 예를 들면, 연어목 연어과, 농어목 다랑이과, 농어목 고등어과, 농어목 전갱이과, 농어목 시크리드과, 대구목, 가자미목으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게, 상기 어류는 넙치, 명태, 또는 가자미일 수 있고, 가장 바람직하게는 상기 어류는 넙치인 것일 수 있다.
본 발명의 콜라겐은 넙치 피부 유래의 콜라겐일 수 있으며, 상기 넙치 피부는 대한민국 수산물 산업에서 부산물로 다량 발생되는 것으로서, 육상 콜라겐의 훌륭한 대안으로서 이용가능성이 높다.
본 발명에 따른 나노섬유에 있어서, 상기 어류 유래 콜라겐은 바람직하게, 넙치 피부를 효소처리하여 텔로부분이 제거된 아텔로콜라겐(atelocollagen)일 수 있다.
본 명세서에서 용어, '아텔로콜라겐(atelocollagen)'은 제1형 콜라겐 분자의 양쪽 말단에 존재하며, 나선을 형성하지 않은 텔로펩타이드(telopeptide)라고 불리는 강력한 항원성이 있는 펩티드 부분(텔로부분)을 제거한 콜라겐을 의미하는 것일 수 있다. 이러한 아텔로콜라겐은 일반 콜라겐에 비하여 면역반응이 없어 의약품이나 화장품 등의 원료로 많이 사용한다. 텔로펩타이드를 제거하는 방법으로는 효소를 처리하거나 불활성화 과정을 거치는 방법이 알려져있다.
본 발명에서 상기 아텔로콜라겐은 펩신 용해성 콜라겐 및 산 용해성 콜라겐에서 선택되는 하나 이상인 것일 수 있고, 바람직하게는 펩신 용해성 콜라겐(펩신을 처리하여 텔로펩타이드를 제거한 펩신 가용성 아텔로콜라겐)일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 펩신 용해성 콜라겐은 넙치 피부를 펩신 및 아세트산에 10 내지 30시간 용해시킨 다음, 원심분리하여 얻어진 침전물을 아세트산으로 10 내지 30시간 투석 및 초순수로 48 내지 96시간 투석하여 얻어진 투석액일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 산 용해성 콜라겐은 넙치 피부를 아세트산에 10 내지 30시간 용해시킨 다음, 원심분리하여 얻어진 침전물을 아세트산으로 10 내지 30시간 투석 및 초순수로 48 내지 96시간 투석하여 얻어진 투석액일 수 있다.
상기 펩신 용해성 콜라겐 또는 산 용해성 콜라겐을 얻기 위한 넙치 피부는 수산화나트륨(NaOH) 용액과 혼합하여 비콜라겐성 단백질을 제거한 다음, 초순수로 중화시키고, 아세톤 용액으로 탈지한 후, 초순수로 중화시키는 전처리하는 공정을 수행한 다음 사용하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 나노섬유에 있어서, 상기 알긴산(또는 알지네이트)은 바람직하게는 염의 형태로 존재할 수 있으며, 보다 바람직하게는 알긴산 칼슘 및 알긴산 나트륨에서 선택되는 하나 이상인 것일 수 있고, 알긴산 칼슘이 알긴산 나트륨 대비 골 조직 재생효과가 더 우수하게 나타날 수 있다.
본 발명의 상기 생분해성 고분자는 폴리락틱산, 폴리카프로락톤, 폴리글리콜산, 폴리락틱산-글리콜산 공중합체, 폴리비닐알콜, 폴리우레탄, 폴리에틸렌글리콜, 폴리디옥사논, 폴리하이드록시부티레이트, 폴리하이드록시부티릭산-하이드록시발러릭산 공중합체, 폴리(γ에틸 글루타메이트) 및 폴리안하이드라이드 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 골 조직 재생 또는 골 형성 촉진용 이식재 또는 대체제는 생분해성 고분자 소재를 사용함으로써, 이식재 또는 대체재가 기능과 역할을 충분히 수행할 때까지 유지된 후 생체 내에서 완전히 분해되어 없어질 수 있다. 본 발명의 이식재 또는 대체재에 이용되는 생분해성 고분자의 중량 평균 분자량은 1,000 내지 1,000,000 g/mol일 수 있다. 또한 구체적으로 상기 고분자의 중량 평균 분자량은 1,000 내지 900,000 g/mol, 1,000 내지 800,000 g/mol, 1,000 내지 700,000 g/mol, 1,000 내지 600,000g/mol, 1,000 내지 500,000 g/mol, 1,000 내지 400,000 g/mol, 1,000 내지 300,000 g/mol, 또는 1,000 내지 200,000 g/mol일 수 있다. 상기 중량 평균 분자량의 범위 밖에서는 조직 재생용 이식재 또는 대체재로서 물성이 적절하지 않으며, 특히 상기 중량 분자량 범위 이하일 경우, 조직재생의 기능을 충분히 수행하기 전에 분해될 수 있다. 상기 생분해성 고분자는 바람직하게 폴리락틱산, 폴리카프플로락톤 또는 폴리글리콜산일 수 있으며, 보다 바람직하게 폴리락틱산일 수 있다. 상기 폴리락틱산은 생체적합성 및 생분해성 특성을 가지며, 다른 고분자보다 본 발명의 골 조직 재생용 이식재 또는 대체재 제조에 사용하기에 더욱 적합하다.
본 발명에 따른 골 조직 재생 또는 골 형성 촉진을 위한 이식재 또는 대체재용 나노섬유는 ALP(Alkaline phosphatase) 활성을 촉진 또는 증가시키는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 골 조직 재생 또는 골 형성 촉진을 위한 이식재 또는 대체재용 나노섬유는 조골세포의 증식 또는 분화를 촉진 또는 증가시키는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 골 조직 재생 또는 골 형성 촉진을 위한 이식재 또는 대체재용 나노섬유는 ALP(alkaline phosphatase), OPN(osteopontin), OCN(osteocalcin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 골형성 인자의 발현을 촉진 또는 증가시키는 것일 수 있다. 상기 발현은 단백질 또는 유전자의 발현일 수 있다.
본 발명에 따른 골 조직 재생 또는 골 형성 촉진을 위한 이식재 또는 대체재용 나노섬유는 골 미네랄화 및 칼슘 침착을 촉진 또는 증가시키는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는, 생리활성 물질을 포함하는 전기방사 섬유를 사용하여 골조직 재생을 향상시키기 위하여, 스피루리나 유래 피코시아닌 및 넙치 유래 펩신 용해성 콜라겐을 이용하여 섬유막을 제조하고, 피코시아닌 및 섬유막의 생물학적 활성(항산화, 항염, 세포 증식, ALP 활성, 미네랄화) 및 기계적 특성(SEM, FT-IR 및 XRD)을 평가하여 골 재생용 이식재 또는 대체재로 적합한 특성을 가짐을 확인하였으며, 전조골세포(MC3T3-E1)의 분화 촉진 효과 및 마우스 골결손 모델에서의 골 재생 증가 효과를 확인하였다.
또한, 본 발명은 알긴산 함유 용액과 생분해성 고분자를 혼합한 전기방사용 혼합용액을 제조하는 단계(단계 1); 및 전기방사용 혼합용액을 전기방사하는 단계(단계 2);를 포함하고, 상기 알긴산 함유 용액은 용액 전체 부피 대비 0.5 내지 10부피%의 피코시아닌을 함유하는 것을 특징으로 하는, 골 조직 재생 또는 골 형성 촉진을 위한 이식재 또는 대체재용 나노섬유의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 알긴산 함유 용액은 바람직하게는 용액 전체 부피 대비 0.1 내지 5부피% 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단계 1의 알긴산 함유 용액은 알긴산 나트륨 수용액인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단계 2는 전기방사용 혼합용액을 전기방사하여 섬유막을 수득하는 단계(단계 2-1); 및 단계 2-1에서 얻은 섬유막 표면에 콜라겐 원섬유(fibril)를 형성시키는 단계(단계 2-2);를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단계 2는 알긴산 나트륨 수용액을 이용하여 제조된 섬유막을 염화칼슘(CaCl2) 용액을 사용하여 알긴산 나트륨을 알긴산 칼슘으로 이온교환하는 단계;를 더 포함하는 것일 수 있다.
나아가, 본 발명은 상기 나노섬유를 포함하는 골 조직 재생 또는 골 형성 촉진용 지지체를 제공한다.
본 명세서에서 사용된, 용어, "골 조직 재생용 지지체"는 생체 내에서 손상된 뼈 조직의 일부를 대체하며, 뼈의 기능을 보완 또는 대체할 수 있는 구조물을 의미한다. 상기 골 조직 재생용 지지체는 예를 들면 뼈의 복원을 위해 관련 세포가 부착되어 증식 또는 분화될 수 있도록 지지역할을 수행할 수 있다. 상기 골 재생용 지지체는 그 형태와 상관없이 이식의 대상이 되는 골 손상 부위의 형태와 반드시 일치할 필요는 없고, 유사한 형태로 성형이 가공한 정도의 상태이면 족하다. 그러나, 필요에 따라서는 이식 대상의 골 손상 부위의 형태를 미리 파악하여 이에 맞는 모양을 제조할 수도 있으며, 다양한 상황에 일반적으로 적용될 수 있도록 특정 구조로 미리 형상화시킨 것일 수도 있다.
본 발명의 골 조직 재생 또는 골 형성 촉진용 지지체는 골 이식재 또는 골 대체재로 사용되는 것일 수 있다.
본 발명의 골 조직 재생용 지지체는 골 재생을 위한 차폐막, 스캐폴드 또는 임플란트로 제조되어 사용되는 것일 수 있다.
본 발명의 골 조직 재생용 지지체는 골 재생을 위한 생리활성인자를 더 포함할 수 있다. 용어 "생리활성인자"는 생체의 기능을 증진시키거나 혹은 억제시키는 물질을 의미하며, 비타민, 호르몬, 효소, 신경전달물질 등을 지칭할 수 있다. 상기 골 재생을 위한 생리활성인자는 예를 들면, 골형성 단백질(bone morphogenetic protein, BMP), 형질전환 성장인자(transforming growth factor; TGF), 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor; FGF), 혈관내피 성장인자(vascular endothelial growth factor; VEGF), 및 표피 성장인자 (epidermal growth factor; EGF)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게 골형성 단백질, 및/또는 형질전환 성장인자일 수 있다.
본 발명의 골 조직 재생용 지지체는 구체적으로 골 재생 또는 연골 재생에 사용하기 위한 것일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 골 전도성 지지체 또는 연골 재생용 지지체로서 이용될 수 있다. 용어 "골 전도성 (Osteoconduction)"은 주위 골조직으로부터 골아세포나 골 전구세포가 이식골 부위로 이동, 무기질 침착에 의해 골이 형성되는 것으로 주변에 골조직이나 분화된 중간엽세포가 있어야만 일어난다. 용어 "골 전도성 지지체"는 지지체의 표면 상에서 또는 그의 기공, 채널 또는 다른 내부 공극 내에서, 원시 세포, 미분화 세포 및 전능성 세포 등이 골 형성 세포 계통이 되도록 자극되어, 새로운 골 성장을 가능하게 하는 환경을 제공하는 지지체를 의미한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
준비예 1. 실험 재료
건조된 해양 미세조류인 스피루리나(Spirulina maxima)는 한국 제주도의 용암 해수로 재배된 것으로, 한국해양과학기술원(KIOST 제주센터, 제주, 한국)으로부터 제공받아 사용하였다. Dulbecco's minimum Eagle's medium (DMEM), α-minimum Eagle's medium (α-MEM), 우태아 혈청(FBS), 트립신(250 U/mg), 페니실린/스트렙토마이신 및 세포 배양 실험에 사용된 기타 물질은 GIBCO™(Gaithersburg, MD, USA)에서 구입하였다. 리포다당류(Lipopolysaccharide; LPS), Griess 시약, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)(MTT), 1-Step p-nitrophenyl phosphate(pNPP) 및 Alizarin Red S는 시그마-알드리치(미국)에서 구입하였으며, 다른 화학 시약 및 물질은 시판되는 분석 등급을 사용했다.
실시예 1. 스피루리나로부터 피코시아닌의 추출
스피루리나 피코시아닌 정제물을 제조하기 위하여, 스피루리나(Spirulina maxima) 동결 건조 분말 1g을 100ml의 초순수(ultrapure water)에 4℃에서 72시간 동안 침용(maceration)하였다. 그 다음 혼합물을 14000rpm에서 30분 동안 원심분리하고 상청액을 여과하여(Whatman No. 1) 세포 파편을 제거하여, 피코시아닌(phycocyanin)을 함유하는 스피루리나 추출물, 즉, 피코시아닌 정제물을 수득하였다. 스피루리나로부터 수득된 피코시아닌 정제물(이하, '스피루리나 피코시아닌'이라 표기)은 동결 건조 후 4℃에서 보관하였다.
실시예 2. 피코시아닌의 항산화 및 항염증 효과
2-1. DPPH 라디칼 소거 활성 및 과산화수소 라디칼 소거 활성 분석
심혈관 질환 및 암을 포함한 대부분의 인간 질병에 자유 라디칼이 관여하며, 특히 자유 라디칼 생성 증가는 상기 질환들에서 특징적으로 나타나는 현상이다. 이에, 스피루리나로부터 수득된 피코시아닌 정제물(스피루리나 피코시아닌)의 항산화 효과를 확인하기 위하여 자유 라디칼 소거능을 평가하였다.
스피루리나 피코시아닌 시료의 라디칼 소거능은 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)의 보라색 메탄올 용액에서 측정되었다. 안정한 DPPH 자유 라디칼 소거 활성을 기준으로 추출물의 라디칼 소거 활성을 결정하였다. 시료 용액 3mL를 0.1mM DPPH 용액 1mL에 첨가하였다. 30분 후 517nm에서 흡광도를 측정하였으며, 시료를 처리하지 않은 DPPH를 대조군으로 사용하였다.
또한, 시료의 라디칼 소거 활성 측정을 위하여, 과산화수소(H2O2) 라디칼 소거 분석을 수행하였다. 40 mM 과산화수소 용액을 인산염 완충용액(1 X, pH 7.4)에 준비하여, 농도를 달리한 시료 용액 1 mL에 과산화수소수 2 mL를 빠르게 혼합하였다. 37℃에서 10 분 배양 후 UV 분광 광도계를 이용하여 230nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료를 처리하지 않은 H2O2 용액을 대조군으로 사용하였다.
DPPH 및 과산화수소 라디칼 소거 활성 백분율은 하기 공식을 사용하여 계산하였다.
라디칼 소거 활성(%)= [(A0-A1)/A0] × 100
여기서, A0는 대조군의 흡광도, A1은 샘플의 흡광도를 의미한다.
분석 결과, 스피루리나 피코시아닌은 DPPH 및 H2O2 라디칼 소거능을 보였다(도 2). 특히, 피코시아닌의 백분율 DPPH 라디칼 소거 효과는 최소 농도 55 μg/ml에서 20.39%의 소거 활성을 나타내었으며, 450 μg/mL 농도에서 68.6% 소거 활성으로 최대 활성을 나타내었고(도 2A), IC50 값은 약 251.67 μg/ml로 확인되었다.
2-2. RAW 264.7 세포에서 세포독성 및 산화질소(NO) 생성 억제 효과 분석
스피루리나로부터 수득된 피코시아닌 정제물(스피루리나 피코시아닌)의 항염증 효과를 확인하기 위하여 RAW 264.7 대식세포에 대한 스피루리나 피코시아닌의 세포독성 및 NO 생성 억제 효과를 평가하였다.
세포독성 평가는 MTT assay로 수행하였다. 먼저, 24웰 플레이트에 플레이팅된 RAW 264.7 대식세포에 5% CO2 가습 대기 및 37℃에서 사전배양한 다음 다양한 농도(100 및 200μg/ml)의 스피루리나 피코시아닌 시료를 처리하여 사전배양과 동일한 조건으로 배양하였다. 배양 1시간 후, LPS(0.5㎍/ml)를 세포 배양 배지에 처리하고 사전배양과 동일한 조건에서 배양하였다. MTT 스톡 용액(DMEM 중 0.5 mg/ml)을 각 웰에 첨가하였다. 3시간 동안 배양한 후 DMEM을 제거하였다. 각 웰의 포르마잔 결정을 DMSO에 용해시켰다. 흡광도는 마이크로플레이트 리더를 사용하여 540 nm에서 측정하였다.
DMEM에 축적된 산화질소(NO)는, NO의 주 생성물인 아질산염을 측정하여 산화질소의 생성량을 분석하였다. 24웰 플레이트에 플레이팅된 RAW 264.7 대식세포를 다양한 농도(6.25, 12.5, 25, 50, 100 및 200μg/ml)의 스피루리나 피코시아닌이 처리 또는 비처리된 상태에서 24시간 배양 후, Griess 시약을 사용하여 NO 생성량을 측정하였다. 이때, NO 생성 억제를 평가하기 위해 RAW 264.7 대식세포를 LPS로 자극하였다.
분석 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 스피루리나 피코시아닌은 RAW 264.7 대식세포에서 세포 독성을 나타내지 않았고, LPS-자극군은 비-자극군과 비교하여 뚜렷하게 NO 생성이 유도된 반면, 증가된 NO 생성이 스피루리나 피코시아닌 농도 의존적으로 억제되는 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 3. 넙치 산 용해성 콜라겐(ASC) 및 펩신 용해성 콜라겐(PSC) 추출
넙치(Paralichthys olivaceus)는 남해에서 채집하여 피부(껍질)를 분리하였다. 껍질을 칼로 벗겨내고 4℃의 찬물로 하루 정도 씻어 염분을 제거한 후 작게 썰었다. Singh, Benjakul, Maqsood, & Kishimura(Food chemistry, 124(1), 97-105, 2011)의 방법을 약간 변형하여, 상기 넙치에서 분리한 피부 조각으로부터 효소처리로 텔로펩타이드가 제거된 아텔로콜라겐인 산-용해성 콜라겐(Acid-soluble collagen; ASC) 및 펩신-용해성 콜라겐(pepsin soluble collagen; PSC)을 추출하였다. 절차의 모든 단계는 4℃에서 부드럽게 교반하면서 수행되었다.
구체적으로, 넙치 피부 조각과 0.1M NaOH 용액을 1:10(w/v)의 비율이 되도록 혼합하여, 2일 동안 비콜라겐성 단백질을 제거한 후, 피부 조각을 중성 pH가 될 때까지 초순수(ultrapure water)로 세척하였다. 넙치 피부 조각과 아세톤 용액을 1:10(w/v)의 비율이 되도록 혼합하고, 새 아세톤 용액으로 12시간마다 교체하면서, 2일 동안 넙치 피부 조각을 아세톤 용액으로 탈지한 후, 초순수로 철저히 세척하였다.
상기 방법으로 전처리 된 넙치 피부 조각을 0.5M 아세트산에 1:20(w/v)의 넙치 피부 조각 대 용액 비율로 하루 동안 현탁하고, 현탁액을 4℃에서 30분 동안 15,000×g에서 원심분리하였다. 상층액은 최종 농도 0.9M의 NaCl을 첨가하여 염을 제거하였다. 침전물은 15,000×g에서 1시간 동안 원심분리하여 수집한 다음 0.5M 아세트산에 용해시킨 후, 용액을 0.1M 아세트산으로 1일 동안 투석하고 초순수로 3일 동안 투석하였다. 생성된 투석액은 동결건조하였으며, 산 용해성 콜라겐(ASC)으로 지칭하였다.
또한, 동일한 방법으로 전처리된 넙치 피부 조각으로부터 펩신 가용성 콜라겐(PSC) 추출을 실시하였다. 피부 조각을 4℃에서 24시간 동안 펩신(pepsin 1:3000, Sigma, USA)과 함께 0.5M 아세트산에 용해시킨 후, 15,000rpm에서 30분 동안 원심분리하였다. 상청액은 최종 농도 0.9M의 NaCl을 첨가하여 염을 제거하였다. 생성된 침전물은 15,000×g에서 1시간 동안 원심분리하여 수집한 다음 0.5M 아세트산에 용해시켰다. 그 다음, 용액을 0.1M 아세트산으로 1일 동안 투석하고 초순수로 3일 동안 투석하였다. 생성된 투석액은 동결건조하였고, 펩신 가용성 콜라겐(PSC)으로 지칭하였다.
실시예 4. 넙치에서 추출된 ASC 및 PSC의 특성 분석
4-1. ASC 및 PSC의 SDS-PAGE 분석
넙치(Paralichthys olivaceus) 피부로부터 추출된 콜라겐, 산 용해성 콜라겐(ASC) 및 펩신 용해성 콜라겐(PSC)의 특성을 분석하기 위하여, 나트륨 소데실 설페이트 폴리아크릴아미드-겔 전기영동(SDS-PAGE)은 7.5% 분리 및 5% 스태킹 젤을 사용하여 Laemmli(nature, 227(5259), 680-685, 1970)의 방법을 약간 변형하여 수행되었다.
구체적으로, 콜라겐 샘플을 샘플 완충액에 용해시키고 얻어진 혼합물(1 mg/1 ml)을 100℃에서 5분 동안 가열하였다. 혼합물을 실온에서 미세원심분리기를 사용하여 4000rpm에서 5분 동안 원심분리하여 debit을 제거했다. 샘플 10㎍을 폴리아크릴아미드 겔에 로딩하고 MiniProtein II unit(Bio-Rad Laboratories, Inc. Richmond, CA, USA)을 사용하여 1시간 동안 정전압(100V)에서 전기영동하였다. 생성된 젤을 50%(v/v) 메탄올 및 10%(v/v) 아세트산에서 0.1%(w/v) Coomassie blue R-250으로 2시간 동안 염색하고 40%(v/v) 메탄올 및 10%(v/v) 아세트산으로 탈색하였다. 콜라겐의 분자량을 추정하기 위해 고분자량 마커를 콜라겐과 함께 로딩하고 돼지 피부 타입 I 콜라겐을 표준 콜라겐으로 단백질 마커 옆에 로딩하였다.
넙치 피부에서 추출된 콜라겐(ASC 및 PSC)과 돼지 콜라겐의 SDS-PAGE 구성요소 분석 결과를 도 4A에 나타내었다. 돼지 콜라겐, ASC 및 PSC는 모두 α1 및 α2 사슬과 고분자량 β 및 γ 성분으로 구성됨에 따라, 추출된 ASC와 PSC는 콜라겐 유형 I에 해당함을 확인하였다. ASC는 PSC보다 약간 더 높은 밴드 강도의 γ 성분을 포함하는데, 이는 콜라겐의 훨씬 더 풍부한 내부 및 분자간 교차 결합으로 인해 발생할 수 있으며, 감마 밴드에서 A와 B의 강한 차이는 콜라겐의 분자 가교 수준이 다르다는 것을 나타낸다.
4-2. ASC 및 PSC의 푸리에 변환 적외선 분광법(FT-IR) 분석
넙치(Paralichthys olivaceus)에서 추출된 콜라겐, ASC 및 PSC의 2차 구조에 대한 정보를 확인하여, 기능 그룹을 분석하기 위해 콜라겐에서 FT-IR 분광법(Perkin Elmer, USA) 데이터를 수집하였다. IR 스펙트럼은 4cm-1의 해상도에서 500~4000cm-1 사이의 평균 30회 스캔을 나타낸다.
넙치에서 추출된 ASC와 PSC의 FTIR 스펙트럼 분석 결과를 도 4C에 나타내었다. 스펙트럼 피크의 변화는 아미드(amide) A, B 밴드 및 아미드 I-III 영역의 변화를 포함하는 것으로 나타났다. 3300cm-1의 아미드 A 밴드, 2972cm-1의 아미드 B 피크는 N-H 신축 진동 및 CH2의 비대칭 신축과 관련이 있다. 또한, 1635cm-1에서 아미드 Ⅰ 피크는 주로 폴리펩타이드 백본 또는 COO-와 함께 C=O의 신축 진동과 관련이 있다. 콜라겐 유형 I의 아미드 II는 CN 신축 진동과 결합된 N-H 굽힘 진동으로부터 약 1549cm-1에서 나타난다. 1239cm-1에서 아미드 III는 C=N 신축 진동과 글리신 백본 및 프롤린 측쇄의 아미드 결합 CH2 기로부터 N-H 변형 사이의 피크를 나타낸다. 도 4C에 나타난 바와 같이, type Ⅰ 콜라겐에서 나타나는 밴드와 거의 유사한 강도 및 위치의 아미드 A, B, I-III 밴드가 ASC 및 PSC에서 발견되었다.
4-3. ASC 및 PSC의 X선 회절 분석
콜라겐 섬유소의 형성과 형태를 조사하기 위하여, X선 회절 패턴을 사용하여 분석을 수행하였다. 넙치(Paralichthys olivaceus)에서 추출된 콜라겐, ASC 및 PSC의 X선 회절(XRD) 분석은 Cu-Kα 방사선이 있는 Ultima IV 시스템(Rigaku Co., Tokyo, Japan)을 사용하여 수행되었다. 회절 강도는 2° min-1의 주사율에서 6 내지 60° 범위 내에서 기록되었다.
도 4D에 돼지 콜라겐, ASC 및 PSC의 X-선 스펙트럼을 나타내었다. 그 결과, 넙치에서 추출된 콜라겐에 대해 약 7°, 21°의 2θ 값에서 두 개의 전형적인 밴드가 발견되었다. XRD에서 콜라겐 밴드는 이 단백질이 섬유소 형성으로 연속적인 형태를 가짐을 나타내었다.
4-4. ASC 및 PSC의 UV 흡광도 분석
콜라겐을 식별하는 간단한 방법 중 하나는 콜라겐의 삼중 나선 구조가 230 nm에서 흡수를 가지므로 UV(200 - 400 nm)에서 콜라겐 샘플을 스캔하는 것이다. 넙치(Paralichthys olivaceus)의 피부에서 추출된 콜라겐 ASC 및 PSC의 UV 흡수 스펙트럼을 분석하기 위하여, 추출된 각 콜라겐 샘플(1mg)을 1mL의 0.5M 아세트산에 용해시키고 콜라겐 용액을 4°C에서 10분 동안 15,000rpm에서 원심분리하였다. 콜라겐 용액을 경로 길이가 1mm인 석영 셀에 넣었다. 콜라겐 용액은 1 nm 간격으로 초당 2 nm의 스캔 속도로 200 내지 500 nm의 파장에서 흡광도를 조사하였다. 모든 스펙트럼은 UV-가시광선 분광광도계(UV-1800 Spectrophotometer, Shimadzu, Japan)를 사용하여 얻었다.
추출된 콜라겐의 UV 스펙트럼 분석 결과, 도 4B에 나타난 바와 같이 돼지 콜라겐, ASC 및 PSC는 230 nm에서 최대 흡수 피크를 나타냈으며, 이는 콜라겐 폴리펩타이드의 COO-, CONH2, C=O 그룹과 관련이 있다. 또한, 콜라겐에는 250 및 280 nm에서 UV를 흡수하는 몇 가지 트립토판, 히스티딘, 티로신 및 페닐알라닌이 있는 것으로 확인되었다.
4-5. ASC 및 PSC의 아미노산 조성 분석
넙치(Paralichthys olivaceus)의 피부에서 추출된 콜라겐 ASC 및 PSC의 아미노산 조성은 C18 컬럼(5μM, 4.6×250 nm, Watchers, MA, USA)이 있는 자동 분석기(Hitach Model 835-50, Tokyo, Japan)를 사용하여 분석되었다. 반응은 38℃에서, 검출 파장은 254 nm, 유속은 1.0 ml/min에서 수행하였다. 모든 화학 분석(각 탱크에서)은 3회 수행되었다. ASC, PSC 및 돼지 콜라겐의 아미노산 성분 및 함량(잔기/1000 아미노산 잔기)을 하기 표 1에 나타내었다.
| 아미노산(Amino acid) | 돼지 콜라겐(Type I Collagen) | 넙치 산 용해성 콜라겐 (ASC) | 넙치 펩신 용해성 콜라겐 (PSC) |
| 아스파트산 (Aspartic acid, Asp) | 53.6 | 41.0 | 56.2 |
| 트레오닌 (Threonine, Thr) | 17.9 | 34.8 | 27.4 |
| 세린 (Serine, Ser) | 33.1 | 50.5 | 44.8 |
| 글루탐산 (Glutamic acid, Glu) | 96.0 | 98.7 | 95.6 |
| 글리신 (Glycine, Gly) | 238.3 | 228.8 | 247.3 |
| 알라닌 (Alanine, Ala) | 91.0 | 107.7 | 108.2 |
| 시스테인 (Cysteine, Cys) | 1.6 | 3.3 | 2.0 |
| 발린 (Valine, Val) | 18.3 | 18.1 | 16.6 |
| 메티오닌 (Methionine, Met) | 5.7 | 11.6 | 11.0 |
| 이소류신 (Isoleucine, Ile) | 9.4 | 9.0 | 6.9 |
| 류신 (Leucine, Leu) | 28.8 | 24.2 | 23.7 |
| 티로신 (Tyrosine, Tyr) | 1.2 | 4.9 | 2.1 |
| 페닐알라닌 (Phenylalanine, Phe) | 18.4 | 21.6 | 20.5 |
| 히스티딘 (Histidine, His) | 35.9 | 35.7 | 36.9 |
| 라이신 (Lysine, Lys) | 6.4 | 9.3 | 7.3 |
| 아르기닌 (Arginine, Arg) | 80.0 | 86.0 | 84.8 |
| 프롤린 (Proline, Pro) | 126.0 | 77.4 | 96.9 |
| 하이드록시프롤린 (Hydroxyproline, Hyp) | 138.3 | 137.5 | 111.7 |
| 이미노산 (Imino acid: Pro + Hyp) | 264.3 | 214.9 | 208.6 |
| 총(Total) | 1000 | 1000 | 1000 |
돼지 콜라겐, ASC 및 PSC는 글리신(1000당 238.3, 228.28 및 247.3)을 갖고 티로신, 히스티딘, 메티오닌 및 시스테인이 낮은 것으로 나타났다. 추출된 콜라겐(돼지 콜라겐, ASC, PSC)의 이미노산 함량은 1000개당 264.3, 214.9, 208.6이었다. 이미노산이 높은 콜라겐은 프롤린과 하이드록시프롤린의 피롤리딘으로 인해 나선 구조에서 더 안정적이다.
실시예 5. MC3T3-E1 세포에서 피코시아닌의 골형성 및 골재생 효과
5-1. MC3T3-E1 세포 배양
MC3T3-E1 전조골세포(preosteoblasts)는 American Type of Culture Collection (Rockville, MD, USA)에서 구입하였다. MC3T3-E1 세포를 100㎍/ml 스트렙토마이신, 100U/ml 페니실린 및 10% 비-불활성화 소태아혈청(FBS)이 보충된 α-MEM에서 배양하였다. 세포를 5% CO2 가습 대기 및 37℃ 조건에서 배양하고 2일마다 계대 배양하였다.
5-2. MC3T3-E1의 피코시아닌 처리에 따른 세포 생존력 분석
MC3T3-E1 전조골세포(preosteoblasts)에 대한 스피루리나 피코시아닌(phycocyanin)의 세포 독성 평가는 MTT 분석(MTT assay)으로 수행하였다. 24웰 플레이트에 플레이팅된 MC3T3-E1 세포는 5% CO2 가습 대기 및 37℃에서 사전 배양한 다음 다양한 농도(6.25, 12.5, 25, 50, 100 및 200μg/ml)로 시료를 처리하였다. 3일 후, MTT 스톡 용액(DMEM 중 0.5 mg/ml)을 각 웰에 첨가하였다. 3시간 동안 배양한 후 상층액을 제거하였다. 각 웰의 포르마잔 결정을 DMSO(디메틸 설폭사이드)에 용해시켰다. 흡광도는 마이크로플레이트 판독기로 540 nm에서 측정하였다.
그 결과, 스피루리나 피코시아닌은 6.25, 12.5, 25, 50, 100 및 200㎍/ml의 농도에서 MC3T3-E1 전조골세포에 세포독성을 나타내지 않았다(도 5A).
5-3. MC3T3-E1에 대한 피코시아닌의 ALP 활성 분석
알칼리성 포스파타제(Alkaline phosphatase; ALP)는 초기 조골세포 분화 마커로 알려져 있으며 MC3T3-E1 전조골세포의 분화를 인지하는 특징이 있다.
MC3T3-E1에 대한 스피루리나 피코시아닌의 ALP 활성은 1-StepTM PNPP kit(Thermo Scientific, USA)를 이용하여 측정하였다. 96웰 플레이트에 플레이팅된 MC3T3-E1 세포는 5% CO2 가습 대기 및 37°C에서 사전배양한 다음 다양한 농도로 시료를 처리하였다. 피코시아닌은 MTT 분석과 동일한 농도인 6.25, 12.5, 25, 50, 100 및 200㎍/ml로 처리되었다. 3일, 5일 및 7일 후, 1-StepTM PNPP 시약(100㎕)을 웰에 첨가하고 30분 동안 인큐베이션하였다. 2N NaOH 용액을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 흡광도는 마이크로플레이트 판독기로 405 nm에서 측정하였다.
도 5B에 나타난 바와 같이, 3, 5 및 7일 후에 모든 농도에서 비처리군과 비교하여 증가된 ALP 활성을 확인하였으며, 특히, 50 및 100 μg/ml 처리군은 ALP 활성을 유의하게 증가시켰다.
5-4. MC3T3-E1에서 피코시아닌의 ROS 소거 활성 분석
MC3T3-E1에서 스피루리나 피코시아닌의 항산화 효과를 확인하기 위하여, MC3T3-E1에서 스피루리나 피코시아닌의 ROS(Reactive oxygen species) 소거 효과를 평가 하였으며, 이때, ROS를 생성하기 위하여 MC3T3-E1 세포를 H2O2 노출로 전처리하였다.
구체적으로, MC3T3-E1 세포에서 스피루리나 피코시아닌의 ROS 소거 활성을 측정하기 위해 20,7-디클로로디히드로플루오레세인 디아세테이트(DCFDA) 염색 및 DCFDA 분석을 수행하였다. MC3T3-E1을 24웰 플레이트의 현미경 커버 유리에 웰당 1×104 세포의 농도로 시딩하고 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 세포를 37℃에서 30분 동안 300μM H2O2로 처리한 다음 300μM H2O2를 흡인하였다. 세포는 24시간 동안 각 샘플에서 FBS 없이 추출된 α-MEM을 사용하여 처리되었다. 샘플 처리후 6시간 또는 24시간의 시간에 세포를 암실에서 60분 동안 DCFDA(30μM)로 염색하고 PBS로 헹구고 3.7% 파라포름알데히드로 20분 동안 고정하였다. 또한, 세포는 Hoechst 33342(10μg/ml)로 20분 동안 핵에 대해 염색되었다. 현미경을 사용하여 세포 이미지를 관찰하였다.
MC3T3-E1에서 스피루리나 피코시아닌의 ROS 소거능을 분석한 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 300μM H2O2 조건에서 시료 처리가 없는 대조군은 24시간에 촬영한 이미지에서 높은 형광 강도를 보인 반면에, 스피루리나 피코시아닌으로 처리된 세포는 시간에 따라 낮은 형광 강도와 이미지를 보였다. 스피루리나 피코시아닌으로 처리하면 그룹 간에 낮은 형광 강도와 이미지가 나타났다. 이러한 결과는 스피루리나 피코시아닌이 우수한 항산화 활성을 가지고 있음을 의미한다.
5-5. MC3T3-E1에서 피코시아닌의 ROS 환경 및 염증 환경에서 ALP 활성 분석
MC3T3-E1 전조골세포의 항염증 효과를 분석하기 위하여, 상기 실시예와 동일한 방법으로 ROS 환경 및 염증 환경에서 알칼리성 인산분해효소(ALP) 활성을 분석하였다.
먼저, ROS 환경에서 ALP 활성을 분석하기 위하여, ROS를 생성하기 위해 MC3T3-E1 전조골세포를 30분 동안 300μM H2O2 노출로 전처리하였다. 300 μM H2O2 조건에서 시료를 처리하지 않은 대조군은 7일째에 낮은 ALP 활성을 보인 반면, 스피루리나 피코시아닌으로 처리한 그룹은 시료를 처리하지 않은 그룹보다 높은 ALP 활성을 보였다(도 7). 이러한 결과는 스피루리나 피코시아닌이 ROS로부터 세포를 보호함으로써 ALP 활성을 증가시킴을 나타낸다.
또한, 염증 환경에 대한 ALP 활성을 분석하기 위하여, MC3T3-E1을 LPS로 처리하여 세포에 염증 환경을 조성하였다. 그 결과, 염증이 유발된 환경에서 높은 형광 강도를 볼 수 있었고, 이는 세포가 염증의 영향으로 ROS를 생성함을 나타낸다(도 8). 스피루리나 피코시아닌을 처리한 그룹은 시료를 처리하지 않은 대조군에 비해 이미지의 형광 강도를 감소시키는 것으로 나타났다(도 8). 또한, LPS 처리 농도 및 시간이 증가할수록 염증 유발에 의해 시료를 처리하지 않은 대조군보다 ALP 활성이 더욱 감소하였다(도 9A). ALP 활성의 감소는 스피루리나 피코시아닌을 처리한 경우에 억제되어, ALP 활성이 다시 증가되었다(도 9B).
이러한 ROS 수준을 감소시키고 ALP 활성을 증가시키는 결과는 스피루리나 피코시아닌이 MC3T3-E1 전조골세포에서 항염증 효과를 갖는다는 것을 나타낸다.
5-6. MC3T3-E1의 피코시아닌 처리에 따른 미네랄화(mineralization) 분석
MC3T3-E1 전조골세포의 미네랄 침착에 대한 스피루리나 피코시아닌의 영향을 분석하기 위하여, 칼슘 미네랄화는 Alizarin Red S 염색에 의해 칼슘 미네랄화를 평가하였다.
MC3T3-E1 세포를 골형성 분화 배지인 실험용 α-MEM에서 7, 14, 21 및 28일 배양하였다. 배양기간 동안 α-MEM은 2일마다 교체하였다. 그 후, MC3T3-E1 세포를 10% 포름알데히드로 고정하고 25℃에서 1시간 동안 탈이온수(pH = 4.1~4.3)에서 Alizarin Red S 염색 assay를 이용하여 염색하였다. Alizarin Red S를 흡인하여 제거한 후, MC3T3-E1 세포를 탈이온수로 3회 세척하였다. 정량을 위해 Alizarin Red S로 염색한 세포를 cetylpyridinium chloride로 염색한 후 마이크로플레이트 판독기(microplate reader)를 이용하여 450 nm에서 흡광도 값을 측정하여 미네랄화를 정량하였다. 염색된 Ca2+는 550 nm에서 마이크로플레이트 판독기로 탈염액을 사용하여 관찰되었다.
7, 14, 21 및 28일의 MC3T3-E1을 Alizarin Red S 염색 assay를 이용하여 Ca2+ 염색을 통해 염색 및 정량한 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, 14일 이상부터 Ca2+ 증가를 확인하였고, 7일째에는 무처리군과 차이가 없었다. 21일째 50㎍/ml의 무기질화는 비처리군보다 유의하게 높았으며, 특히, 50 및 100 μg/ml의 미네랄화는 28일에 다른 농도 중에서 유의하게 가장 높았다.
5-7. 피코시아닌 처리에 따른 조골세포 분화의 표현형 마커의 발현 수준 분석(웨스턴 블롯 분석)
골형성 분화의 표현형 마커의 단백질 ALP, OPN 및 OCN의 발현 수준에 대한 프리루리나 피코시아닌의 효과는 웨스턴 블롯팅 분석에 의해 조사되었다.
세포 단백질 추출물(30 μg) 또는 조직 단백질 추출물(50 μg)을 10% 나트륨 도데실 설페이트(SDS)-폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 분리하고, 겔을 니트로셀룰로오스 막에 옮겼다. 섬유막은 0.1% Tween 20(TBS-T)이 포함된 Tris 완충 식염수 중 5% 탈지유로 2시간 동안 차단되었다. 1차 항체는 1:1000 희석으로 사용되었다. 막을 4℃에서 1차 항체와 함께 밤새 인큐베이션하고 TBS-T로 세척한 다음 실온에서 90분 동안 1:10000 희석으로 2차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 발현 수준은 Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus(PerkinElmer Life Sciences, Inc., Boston, MA)를 사용하여 확인하였으며 Western Imaging 시스템(Fujifilm Life Science, Tokyo, Japan)을 사용하여 정량화되었습니다.
MC3T3-E1세포에 대한 스피루리나 피코시아닌 50 및 100 μg/ml 처리군 및 처리하지 않은 군의 세포내 골형성 인자(ALP, OPN 및 OCN) 단백질 발현 수준을 측정한 결과, 도 11에 나타난 바와 같이 스피루리나 피코시아닌 처리는 7일 동안 ALP의 단백질 발현 수준을 증가시켰으며, 7, 14일에 OPN과 OCN의 단백질 발현 수준을 증가시켰다. 이러한 결과는, 스피루리나 피코시아닌이 MC3T3-E1 전조골세포에서 골형성 및 골 분화를 촉진하였음을 의미한다.
실시예 6. 피코시아닌이 함유된 나노/마이크로 섬유막의 제조
골 재생용 의료기기를 제작하기 위해 상기 실시예에서 골재생 효능이 확인된 스피루리나 피코시아닌(PC; phycocyanin)과 합성고분자인 폴리락틱산(PLA; poly lactic acid) 및 천연 고분자인 알긴산나트륨(SA; Sodium alginate)을 이용하여 나노/마이크로 섬유막을 제작하였으며, 친수성 막을 형성하기 위해 상기 실시예의 방법으로 제조된 넙치 유래의 펩신 용해성 콜라겐(PSC, Col; Collagen)을 이용하여, 섬유막을 단계별로 PLA, PLA/SA, PLA/CA, PLA/CA/PC, PLA/CA/Col 및 PLA/CA/PC/Col를 제작하였다. 섬유막은 폴리락틱산(PLA) 및 알긴산나트륨(SA)을 사용한 전기방사를 통해 제조되었다. 준비된 막을 염화칼슘으로 연결한 후 막 표면에 콜라겐을 조립하였다.
먼저, 전기방사는 다음과 같이 실시하였다. 섬유막 제조를 위한 전기방사 용액을 내경이 0.7 mm인 강철 무딘 바늘이 장착된 5 ml 주사기에 첨가하였다. 바늘 끝은 DC 고전압 전원(나노엔씨코리아)에 연결된 금속 클립으로 부착하였다. 바늘 끝에서 특정 거리에 놓인 전기적으로 접지된 알루미늄 호일을 사용하여 전기방사 섬유를 수집했다. 주사기 펌프(KD Scientific Co., Ltd, LEGATO® 101 syringe pump, USA)를 사용하여 주입 속도를 조절하였다.
PLA/SA 에멀젼은 다음과 같이 제조되었다. SA는 증류수에 용해시켜 40mg/ml의 SA 수용액을 제조하였다. Span80(0.3g)을 클로로포름 10ml에 용해시켰다. 마지막으로 PLA를 용액에 첨가하고 혼합물을 2,000rpm에서 2시간 동안 교반하여 균일한 에멀젼을 얻었다. 전기방사 전에 에멀젼을 고속으로 10분 동안 교반하여 안정적인 에멀젼 시스템을 얻은 다음 에멀젼을 평평한 끝 금속 바늘(내경 0.7mm)이 있는 수평으로 위치한 플라스틱 주사기(5ml)에 넣었다. 주사기는 주사기 펌프로 작동되어 용액을 1.5 ~ 2.0 ml/h의 속도로 공급하고, 바늘은 20 kV의 고전압 DC 전력을 가하였다. 수집기는 바늘 끝에서 15cm 떨어진 곳에 위치하도록 하였다. PLA/SA 에멀젼의 전기방사를 통해 PLA/SA 섬유막을 수득하였다.
수용성 알긴산나트륨(SA)을 비수용성 알긴산 칼슘(CA; calcium alginate)으로 바꾸기 위하여, 이온 교환 방법을 이용하여 염화칼슘(calcium chloride; CaCl2) 용액을 사용하여 Na+를 대체하여 친수성 환경에서 잘 녹지 않는 알긴산 칼슘을 얻었다. PLA/SA 섬유막을 2 mg/ml 농도의 CaCl2 용액 20 ml에 담궈 PLA/CA 섬유막을 수득하였다.
PLA/CA/PC 섬유막의 경우, 상기 PLA/CA 섬유막과 동일한 방법으로 섬유막을 제조하되, PLA/SA 섬유막 제작과정에서 SA와 함께 SA 수용액 전체 부피 대비 1%의 피코시아닌(PC)을 함유시켜 PLA/SA/PC 섬유막을 제작하고, 염화칼슘을 이용하여 알지네이트 가교결합을 시켜 PLA/CA/PC 섬유막을 제작하였다.
동결건조된 PSC(넙치 유래 펩신 용해성 콜라겐)를 0.1M 아세트산에 3mg/mL 농도로 용해하고 추가 사용 전에 4℃에서 보관했다. 먼저, 제조된 PSC 용액(=콜라겐 용액; Col 용액)을 인산염 완충 식염수(PBS, 10x)에 6:1의 비율로 ice bath에서 희석하였다. 그런 다음 희석된 용액의 pH를 0.1M NaOH로 7.0으로 조정하였다. 중화된 콜라겐 용액(50㎕)을 PLA/CA 섬유막 또는 PLA/CA/PC 섬유막에 떨어뜨렸다. 마지막으로, 콜라겐 용액을 떨어뜨린 각 섬유막 샘플을 37℃에서 30분 동안 인큐베이터에 두어 자가 조립 과정이 이루어지도록 하였다. 각 샘플을 탈이온수로 3회 세척하여 PLA/CA/Col 섬유막 또는 PLA/CA/PC/Col 섬유막을 수득하였다.
실시예 7. 나노/마이크로 섬유막의 특성 및 형태
7-1. 주사전자현미경을 이용한 섬유막의 표면 형태 분석
상기 실시예에서 제작된 전기방사 섬유막(PLA, PLA/SA, PLA/CA, PLA/CA/PC 및 PLA/CA/PC/Col)의 구조적 형태를 15 kV에서 주사전자현미경(SEM, Tescan, Czech, VEGA II LSU)을 사용하여 조사하였다. 나노/마이크로 섬유막의 직경은 이미지 분석 소프트웨어(Image J, National Institutes of Health, USA)를 사용하여 SEM 이미지에서 측정되었다.
15kV에서 주사전자현미경(SEM, Tescan, Czech, VEGA II LSU)으로 섬유막의 형태 및 분포를 조사한 결과를 도 12A에 나타내었다. 5가지 섬유막의 표면은 균일하고 비드의 형성이 없이 매끄러웠으며, 무작위적으로 분포하였다. 스피루리나 피코시아닌을 첨가시에도 PLA/CA 대비 형태와 직경에는 큰 변화가 없었다. PSC(Col)로 조립된 PLA/CA/PC/Col의 경우, 마이크로 나노섬유 구조가 형성되어, SEM 이미지상에서 Col이 포함된 그룹과 포함되지 않은 그룹에서 얇은 섬유 이외에 섬유와 섬유 사이에 섬유보다 얇고 거미줄처럼 분산되어 있는 구조, 즉, 섬유질 막 표면에 거미줄 모양의 콜라겐 원섬유 형성(fibril formation)이 확인되었다.
7-2. 섬유막의 접촉각 분석
습윤성은 접촉각 측정기 VCA Optima Surface Analysis System(WCA, Data Physics Corporation, DSA25S, Germany)에서 10초 동안 고착된 후 물 접촉각 측정을 통해 평가되었다. 기계적 테스트를 위해 인장 테스트 전에 금형을 통해 스트립(15.0x3.0x0.1mm)을 준비했습니다. 하중 변형 날짜는 기계적 시험기(Shanghai Hengyi Precision Instruments Co., China)를 사용하여 2.5mm/min의 속도로 측정되었습니다.
PLA, PLA/SA, PLA/CA, PLA/CA/PC 및 PLA/CA/PC/Col 5가지 유형의 섬유막 표면의 물 접촉각은 각각 118.31°±2.65°, 64.74°±0.13°, 50.15°±0.62°, 24.49°±1.51° 및 22.51°±3.36°으로 친수성 알지네이트(알긴산), 피코시아닌 및 콜라겐의 존재로 인하여 점점 낮아지는 것을 확인하였다(도 12B).
7-3. 섬유막의 푸리에 변환 적외선(FT-IR) 분광법 분석
상기 실시예에서 제조된 섬유막의 기능 그룹을 조사하기 위하여, 펩신 용해성 콜라겐(pepsisn-soluble collagen), 피코시아닌(phycocyanin), 알긴산나트륨(sodium alginate), 섬유막(PLA, PLA/SA, PLA/CA, PLA/CA/PC 및 PLA/CA/PC/Col)을 대상으로 FT-IR 분광법(Perkin Elmer, USA)을 이용하여 데이터를 수집하였다. IR 스펙트럼은 4cm-1의 해상도에서 500~4000cm-1 사이의 평균 30회 스캔을 나타낸다.
막의 구성을 알아보기 위해 FT-IR 분석을 통해 알긴산(alginate) 및 콜라겐이 섬유막에 분포되어 있음을 확인하였고, 그 결과를 도 13A에 나타내었다. 순수 PLA 섬유막 에서 C=O 결합의 신축 진동으로 인한 1750 cm-1에서 강한 특성 흡수 밴드가 나타났고, 알긴산의 경우 C-O-C 스트레칭으로 인해 1620 cm-1에서 피크를 나타냈다. PLA와 알긴산의 특성 피크를 비교한 결과, 1620 cm-1에서 변화 피크가 존재하였다. PLA/CA/PC/Col 섬유에서 PLA의 강한 피크는 알긴산과 콜라겐의 존재로 인해 약간 감소했다. PLA/CA/PC/Col의 경우, 1635 cm-1, 1549 cm-1, 1239 cm-1에서 콜라겐의 아미드 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ로 인한 새로운 피크가 확인되었다. 이러한 결과는 PLA/CA/PC/Col 섬유에 PLA, 알긴산 및 콜라겐이 포함되어 있음을 보여준다.
7-4. 섬유막의 X선 회절 분석
PLA, PLA/SA, PLA/CA, PLA/CA/PC 및 PLA/CA/PC/Col 섬유막에 대한 X선 회절(XRD) 분석은 Cu-가 포함된 Ultima IV 시스템(Rigaku Co., Tokyo, Japan)을 사용하여 수행되었다. Kα 방사선. 회절 강도는 2° min-1의 주사율에서 6 내지 60° 범위 내에서 기록되었다.
XRD 분석은 약 32°의 2θ 값에서 피크가 알긴산의 egg-box 형성에 의해 식별될 수 있음을 보여주며, 이는 PLA/CA, PLA/CA/PC 및 PLA/CA/Col 섬유의 알긴산 성분이 알긴산나트륨(SA)에서 알긴산칼슘(CA)으로 변경되었음을 의미한다. 그리고 약 7°의 2θ 값을 기반으로 PLA/CA/Col 섬유가 콜라겐 피브릴로 덮여 있음을 확인했다(도 13B).
실시예 8. MC3T3-E1 세포에서 섬유막의 골형성 및 골재생 효과(in vitro)
8-1. MC3T3-E1의 섬유막 처리에 따른 세포 생존율 분석
MC3T3-E1 전조골세포(preosteoblasts)에 대한 섬유막(PLA, PLA/SA, PLA/SA/PC, PLA/CA, PLA/CA/PC, PLA/CA/Col 및 PLA/CA/PC/Col)의 세포 독성을 조사하기 위하여, MTT 분석에 의해 세포 생존율을 평가하였다.
섬유막을 펀칭하고 24웰 배양 플레이트에 놓았다. MC3T3-E1은 트립신-EDTA 처리에 의해 수집되었고 PLA, PLA/SA, PLA/SA/PC, PLA/CA, PLA/CA/PC, PLA/CA/Col 및 PLA/CA/PC/Col 섬유(fiber)에 시딩되었으며, 37℃ 및 5% CO2 대기에서 배양하였다. 배양 후, 각 섬유막에 시딩된 세포를 PBS로 세척하고 MTT 용액(0.5mg/ml)과 함께 DMEM에서 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 2시간 후, 배지를 흡인하고 30분 동안 37℃에서 DMSO와 함께 포르마잔(formazan)을 용해하였다. 30분 후 마이크로플레이트 리더(Gen 5TM ELISA BioTek, USA)를 이용하여 540 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
MTT 분석 결과, 섬유막 처리군은 MC3T3-E1 전조골세포의 생존율이 세포만 파종한 조직 배양 플레이트(TCP) 대조군과 크게 다르지 않아, 세포독성을 나타내지 않음을 확인하였다(도 14A).
8-2. 섬유막에서 성장한 MC3T3-E1의 세포골격 조직 및 표현형 연구
PLA, PLA/SA, PLA/SA/PC, PLA/CA, PLA/CA/PC, PLA/CA/Col 및 PLA/CA/PC/Col 섬유에서 성장한 MC3T3-E1의 세포골격 조직의 형태를 분석하였다. 48시간 배양 후 세포를 3.7% 포름알데히드로 10분간 고정하고 0.1% Triton X-100으로 5분간 투과화한 다음, Phalloidin(Invitrogen, CA, USA)으로 20분간 염색 및 Hoechst 33342(Sigma- Aldrich)으로 어두운 조건에서 10분 동안 염색하였다.
형광현미경에서 세포 플레이트에 넓게 퍼진 세포의 핵산을 염색하는 hoechst 33342 및 살아있는 세포만 염색하는 FDA 형광 시약을 사용하여 명시야에서 관찰 및 비교하여 세포 생존율을 모니터링하였다. Hoechst 염색 및 FDA 염색을 비교한 결과, MC3T3-E1 전조골세포는 일반적으로 섬유질 막과 직접 접촉하여 살아 있는 것을 확인하였다(도 14B).
8-3. MC3T3-E1에 대한 섬유막의 미네랄화 및 ALP 활성 분석
PLA, PLA/SA, PLA/SA/PC, PLA/CA, PLA/CA/PC, PLA/CA/Col 및 PLA/CA/PC/Col 섬유막에서 배양된 MC3T3-E1 전조골세포의 골형성 분화를 확인하기 위하여, 칼슘 미네랄화 및 ALP 활성을 평가하였다.
MC3T3-E1 전조골세포를 50㎍/ml 아스코르브산 및 10mM β-글리세로포스페이트를 함유하는 실험적 골형성 분화 배지에서 배양하였다. 배양하는 동안 실험 배지는 2일마다 교체되었다. 그 후, 세포를 10% 포름알데히드로 고정하고 탈이온수(pH = 4.2)에서 Alizarin Red S로 실온에서 30분 동안 염색하였다. Alizarin Red S를 흡인하여 제거한 후, 세포를 정제수로 3회 세척하였다. 정량을 위해 Alizarin Red S로 염색된 세포를 cetylpyridinium chloride로 염색한 후 추출된 염색물을 96 well plate에 옮겨 마이크로플레이트 리더를 이용하여 550 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 7일째에 MC3T3-E1의 골형성 분화에 대한 섬유막의 효과를 추가로 평가하기 위해 ALP 염색을 수행하였다. 칼슘 결절의 형성은 후기 골형성의 표지자로 알려져 있으므로, MC3T3-E1의 골형성 분화에 대한 섬유막의 효과를 평가하기 위해 14일 및 21일에 Alizarin Red 염색을 수행하였다.
7일 동안 배양한 후, MC3T3-E1은 콜라겐을 비함유하는 섬유막에 비해 콜라겐-I 조립된 막에서 유의하게 더 높은 ALP 활성을 나타냈다. 칼슘 침착은 PLA/CA/Col 및 PLA/CA/PC/Col 그룹과 함께 배양된 MC3T3-E1에서 볼 수 있었고 더 높은 골형성 활성을 나타냈다(도 15).
실시예 9. 골결손(calvarial defect) 동물 모델에서 섬유막의 골형성 및 골재생 효과(in vivo)
9-1. 골결손 동물모델의 준비 및 섬유막 이식
실험 프로토콜은 부경대학교 동물관리 및 실험위원회의 승인을 받았으며 실험동물의 관리 및 사용에 대한 관련 지침 및 규정에 따라 수행되었다. 섬유막의 골 재생 능력을 결정하기 위해, 수컷 CrljOri:CD1(ICR) 마우스(평균 체중 300-350g)를 생체내(in vivo) 골결손 모델로 사용하였다. 실험은 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었다. ICR 마우스는 통제된 환경(상대 습도: 40-70%, 온도: 20-24°C)에서 12시간의 명암 주기로 유지되었다.
골 결손 재생을 검증하기 위해 마우스 두개골 결손 모델을 도입하였고, 두개골의 골막도 벗겨내고 PLA 및 PLA/CA/PC/Col 섬유로 대체 이식하였다(도 16A). 3가지 섬유막 처리군(미처리, PLA 섬유, PLA/CA/PC/Col 섬유)은 모두 사용하기 전에 UV로 살균하였으며, Povidone-iodine 및 70% 에탄올을 사용하여 수술 부위를 소독하였다. 모든 실험 절차는 전신 마취하에 마우스로 수행되었다. 골재생 효능 분석을 위하여, 수술 4주 및 12주 후, SD 쥐를 안락사시키고 두개골 표본을 채취하여 10% 포르말린에 고정하였다.
모든 정량적 데이터는 신선한 시약을 사용하여 수행된 3개 이상의 개별 실험에서 평균 ± 표준 편차(SD)로 표시되었으며, 그룹 간의 유의한 차이는 짝을 이루지 않은 스튜던트 t-검정을 사용하여 결정되었다. 차이는 p< 0.05에서 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
9-2. 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 분석
마우스에 골결손이 생긴 후 PLA 섬유, PLA/CA/PC/Col 섬유로 덮었습니다.
먼저, 수술 후 12주차에 미세하게 골형성과정을 특징짓기 위해 micro-CT를 시행하였다. 두개골 표본의 결함 영역을 조사하기 위하여 80kV, 0.06mA으로 설정된 Micro-CT(NFR Polaris-G90, NanoFocusRay Co., Ltd, Korea)를 사용한 결과, 도 16B의 micro-CT 3D 이미지에 나타난 바와 같이, 섬유막과 대조군 사이에 결손 부위의 현저한 차이가 관찰되었다. 눈에 띄지 않는 뼈만 형성한 대조군에서는 눈의 띄지 않는 뼈만 형성된 반면에, PLA/CA/PC/Col 섬유는 넙치 유래 콜라겐에 의한 섬유질 구조와 스피루리나 피코시아닌의 시너지 효과에 의하여 골형성 촉진에 대한 현저한 상승된 효과를 나타냈다.
골 결손 부위에 대한 추가적인 분석을 위하여, MRI를 이용하여 Mimic 소프트웨어(Radiant, Poland)를 통해 두개골 결함 영역의 3차원(3D) 구조를 재구성하였다. 골결손 부위의 크기를 분석한 결과, 도 16C에 나타난 바와 같이, PLA/CA/PC/Col 섬유군(5.64±0.85 mm2)의 값이 PLA 섬유군(7.26±1.24 mm2) 및 대조군(7.76±1.26 mm2)보다 작은 것으로 확인되었다.
조직학적 검사는 결함 영역의 미세한 세부 사항을 추가로 분석하기 위해 수행되었다. 두개골(Calvarial) 표본은 상온에서 5일 동안 10% 포르말린에 고정시키고 8% 포름산에서 탈회한 다음 알코올 구배에 의해 탈수하여 파라핀 블록에 포매하였고, 결함 영역 중앙을 가로질러 5 μm 두께의 섹션으로 절단하고 헤마톡실린&에오신(hematoxylin and eosin; H&E) 또는 Masson's 염색약으로 염색하여 골재생 정도를 평가하였다. 분석에 앞서 저배율 시야에서 3mm 결손 부위를 식별하여 새로 형성된 뼈(new bone; NB)와 기존의 뼈(host bone; HB)를 먼저 구별하고 표지하였다. 그 결과, H&E 염색 이미지에 표시된 바와 같이, PLA/CA/PC/Col 섬유에서의 골 재생 효능이 대조군 및 PLA 섬유보다 우수 한 것을 확인하였다(도 16D).
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (7)
- 피코시아닌, 어류 유래 콜라겐, 알긴산 및 생분해성 고분자를 포함하는, 골 조직 재생 또는 골 형성 촉진을 위한 이식재 또는 대체재용 나노섬유.
- 제1항에 있어서, 상기 피코시아닌은 스피루리나에서 유래한 것인, 골 조직 재생 또는 골 형성 촉진을 위한 이식재 또는 대체재용 나노섬유.
- 제1항에 있어서, 상기 어류 유래 콜라겐은 넙치 피부를 효소처리하여 텔로부분이 제거된 아텔로콜라겐(atelocollagen)인 것인, 골 조직 재생 또는 골 형성 촉진을 위한 이식재 또는 대체재용 나노섬유.
- 제1항에 있어서, 상기 나노섬유는 ALP(alkaline phosphatase) 활성을 촉진 또는 증가시키는 것을 특징으로 하는, 골 조직 재생 또는 골 형성 촉진을 위한 이식재 또는 대체재용 나노섬유.
- 제1항에 있어서, 상기 나노섬유는 ALP(alkaline phosphatase), OPN(osteopontin), OCN(osteocalcin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 골형성 인자의 발현을 촉진 또는 증가시키는 것을 특징으로 하는, 골 조직 재생 또는 골 형성 촉진을 위한 이식재 또는 대체재용 나노섬유.
- 제1항에 있어서, 상기 나노섬유는 골 미네랄화 및 칼슘 침착을 촉진 또는 증가시키는 것을 특징으로 하는, 골 조직 재생 또는 골 형성 촉진을 위한 이식재 또는 대체재용 나노섬유.
- 알긴산 함유 용액과 생분해성 고분자를 혼합한 전기방사용 혼합용액을 제조하는 단계(단계 1); 및
전기방사용 혼합용액을 전기방사하는 단계(단계 2);를 포함하고,
상기 알긴산 함유 용액은 용액 전체 부피 대비 0.5 내지 10부피%의 피코시아닌을 함유하는 것을 특징으로 하는,
골 조직 재생 또는 골 형성 촉진을 위한 이식재 또는 대체재용 나노섬유의 제조방법.
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2021
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| CN117344391B (zh) * | 2023-12-06 | 2024-02-27 | 江苏青昀新材料有限公司 | 一种闪蒸纺丝高分子薄片材料的制备方法及其应用 |
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