CN114159625B - 一种复合水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于水凝胶制备技术领域，具体涉及一种复合水凝胶及其制备方法和应用。本发明提供了一种复合水凝胶，包括海藻酸盐水凝胶和脱细胞基质水凝胶；所述脱细胞基质水凝胶的制备原料包括脱细胞基质和谷氨酰胺转氨酶；所述海藻酸盐水凝胶包括海藻酸盐络合物；所述海藻酸盐水凝胶和脱细胞基质水凝胶构成三维交联结构。本发明中的谷氨酰胺转胺酶能够催化脱细胞基质之间形成肽键，进而发生交联形成脱细胞基质水凝胶；另外，海藻酸盐水凝胶和脱细胞基质水凝胶相互穿插缠绕，形成三维交联结构，具有密实、稳定的特性，通过协同作用进一步提高了复合水凝胶的粘附性能。

Description

一种复合水凝胶及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于水凝胶制备技术领域，具体涉及一种复合水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
角膜是眼表面的透明组织，易受到创伤和感染，从而导致角膜透明度不可逆的损失，最终导致失明。传统的角膜修复方法以人类供体角膜移植为主，但手术费用高昂。
水凝胶是一种高含水量的三维网状聚合物，具有良好的生物相容性。水凝胶结构和机体组织类似，既不影响生命体的代谢过程，代谢产物还可以通过水凝胶排除，因此水凝胶常常被用作人体器官以及组织的替代物。
现阶段，应用于角膜修复的水凝胶包括丙烯酸酯水凝胶、纤维蛋白胶以及聚乙二醇凝胶。虽然上述材料能够有效的封闭角膜穿孔，作为角膜移植的替代产物，但是存在粘附性差、易脱落的缺陷。例如，公开号为CN109575316A的中国专利公开了一种以N-丙烯酰基干氨酰胺和羟乙基丙烯酰胺为反应原料，通过自由基聚合得到的水凝胶，可作为天然玻璃体的替代物，但是其自身缺乏粘附性，在用于角膜修复时具有一定的局限性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种复合水凝胶及其制备方法和应用，本发明提供的复合水凝胶具有优异的粘附性。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种复合水凝胶，包括海藻酸盐水凝胶和脱细胞基质水凝胶；
所述脱细胞基质水凝胶的制备原料包括脱细胞基质和谷氨酰胺转氨酶；
所述海藻酸盐水凝胶包括海藻酸盐络合物；
所述海藻酸盐水凝胶和脱细胞基质水凝胶构成三维交联结构。
优选的，所述海藻酸盐水凝胶和脱细胞基质水凝胶的质量比为1：1～4；
所述海藻酸盐水凝胶的质量以海藻酸盐的质量计，所述脱细胞基质水凝胶的质量以脱细胞基质的质量计。
优选的，所述海藻酸盐络合物包括海藻酸盐和金属阳离子，所述海藻酸盐包括未修饰的海藻酸盐、肽修饰的海藻酸盐和多巴胺修饰的海藻酸盐中的一种或几种。
优选的，所述金属阳离子包括钙离子、镁离子和锌离子中一种或几种。
本发明还提供了上述技术方案所述复合水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
将脱细胞基质溶液、海藻酸盐溶液、谷氨酰胺转胺酶和缓冲溶液混合后，利用金属阳离子溶液进行三维交联，得到所述复合水凝胶。
优选的，所述脱细胞基质溶液的质量浓度为1～3％。
所述海藻酸盐溶液的质量浓度为2～10％。
所述脱细胞基质溶液和海藻酸盐溶液的体积比为1～5：1。
优选的，所述谷氨酰胺转氨酶和所述脱细胞基质溶液中的脱细胞基质的用量比为20～100U：1g。
优选的，所述缓冲溶液包括磷酸盐缓冲溶液或三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液；
所述缓冲溶液的浓度为10～100mmol/L；
所述缓冲溶液的pH值为6～8；
所述缓冲溶液的体积占脱细胞基质溶液体积的1～5％。
优选的，所述金属阳离子溶液的摩尔浓度为0.2～5mol/L。
所述金属阳离子溶液的体积占海藻酸盐溶液体积的0.5～1％。
本发明还提供了上述技术方案所述复合水凝胶或上述技术方案所述的制备方法制备得到的复合水凝胶在制备角膜供体、角膜粘合剂、水凝胶敷料或药物载体中的应用。
本发明提供了一种复合水凝胶，包括海藻酸盐水凝胶和脱细胞基质水凝胶；所述脱细胞基质水凝胶的制备原料包括脱细胞基质和谷氨酰胺转氨酶；所述海藻酸盐水凝胶包括海藻酸盐络合物；所述海藻酸盐水凝胶和脱细胞基质水凝胶构成三维交联结构。本发明中的谷氨酰胺转胺酶具有催化形成异肽键的能力，将其作为制备脱细胞基质水凝胶的原料可以催化脱细胞基质之间形成异肽键，进而发生交联形成脱细胞基质水凝胶；同时能够催化脱细胞基质与角膜基质之间形成异肽键，增加脱细胞基质水凝胶与角膜基质之间的粘附性能；另外，海藻酸盐水凝胶和脱细胞基质水凝胶相互穿插缠绕，形成三维交联结构，具有密实、稳定的特性，通过协同作用进一步提高了复合水凝胶的粘附性能。
附图说明
图1为实施例1得到的复合水凝胶的扫描电镜测试图；
图2为实施例1得到的复合水凝胶的活死细胞染色荧光测试图；
图3为应用例1中的角膜修复区域的光学相干断层扫描测试图；
图4为对应用例1和对比例1中的角膜修复区域所能承受的最大眼内压的测试结果图；
图5为应用例1中的角膜修复区域的大体观察测试结果图；
图6为应用例1中的角膜修复区域的荧光素钠染色观察测试结果图；
图7为应用例1中的角膜修复区域的角膜神经染色测试结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种复合水凝胶，包括海藻酸盐水凝胶和脱细胞基质水凝胶；
所述脱细胞基质水凝胶的制备原料包括脱细胞基质和谷氨酰胺转氨酶；
所述海藻酸盐水凝胶包括海藻酸盐络合物；
所述海藻酸盐水凝胶和脱细胞基质水凝胶构成三维交联结构。
在本发明中，所述海藻酸盐水凝胶和脱细胞基质水凝胶的质量比优选为1：1～4，进一步优选为1：2～3；所述海藻酸盐水凝胶的质量以海藻酸盐的质量计，所述脱细胞基质水凝胶的质量以脱细胞基质的质量计。
在本发明中，所述海藻酸盐水凝胶包括海藻酸盐络合物。在本发明中，所述海藻酸盐络合物优选包括海藻酸盐和金属阳离子。在本发明中，所述海藻酸盐优选包括未修饰的海藻酸盐、肽修饰的海藻酸盐和多巴胺修饰的海藻酸盐中的一种或几种；所述未修饰的海藻酸盐进一步优选为未修饰的海藻酸钠；所述肽修饰的海藻酸盐进一步优选为肽修饰的海藻酸钠；所述多巴胺修饰的海藻酸盐进一步优选为多巴胺修饰的海藻酸钠；当所述海藻酸盐为上述具体选择中的两种以上时，本发明对所述具体物质的比例没有特殊的限定，采用任意比例混合均可。
在本发明中，所述肽修饰的海藻酸盐优选采用多肽和海藻酸盐经酰胺化反应得到所述肽修饰海藻酸盐。本发明对所述多肽的种类没有特殊要求，采用本领域技术人员熟知的即可。
在本发明中，所述多巴胺修饰的海藻酸盐优选采用多巴胺和海藻酸盐经酰胺化反应得到所述多巴胺修饰的海藻酸盐。在本发明中，所述多巴胺修饰的海藻酸盐上的儿茶酚基团能够和角膜基质发生化学交联，进一步提高了复合水凝胶的粘附性能。
在本发明中，所述金属阳离子包括钙离子、镁离子和锌离子中一种或几种，当所述金属阳离子为上述具体选择中的两种以上时，本发明对所述具体物质的比例没有特殊的限定，采用任意比例混合均可。
在本发明中，所述脱细胞基质水凝胶的制备原料包括脱细胞基质和谷氨酰胺转氨酶；所述脱细胞基质优选包括人源或动物源脱细胞基质；所述人源脱细胞基质优选为人角膜脱细胞基质或人羊膜脱细胞基质；所述动物源脱细胞基质优选为猪角膜脱细胞基质。在本发明中，所述谷氨酰胺转氨酶和脱细胞基质的用量比优选为20～100U：1g，进一步优选为30～90U：1g，更优选为40～80U：1g。
本发明还提供了上述技术方案所述复合水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
将脱细胞基质溶液、海藻酸盐溶液、谷氨酰胺转胺酶和缓冲溶液混合后，利用金属阳离子溶液进行三维交联，得到所述复合水凝胶。
在本发明中，若无特殊说明，所以制备原料均为本领域技术人员熟知的市售产品。
在本发明中，所述脱细胞基质溶液中的脱细胞基质和上述技术方案中所述的脱细胞基质相同，在此不再赘述。在本发明中，所述脱细胞基质溶液的质量浓度优选为1～3％，进一步优选为1.5～2.5％，更优选为1.8～2.3％。
在本发明中，所述海藻酸盐溶液中的海藻酸盐和上述技术方案所述的的海藻酸盐相同，在此不再赘述。在本发明中，所述海藻酸盐溶液的质量浓度优选为2～10％，进一步优选为3～9％，更优选为4～8％。
在本发明中，所述脱细胞基质溶液和海藻酸盐溶液的体积比优选为1～5：1，进一步优选为1.5～4.5:1，更优选为2～4：1。
在本发明中，所述缓冲溶液优选包括磷酸盐缓冲溶液或三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液。在本发明中，所述磷酸盐缓冲溶液优选包括PBS缓冲液。在本发明中，所述缓冲溶液的浓度优选为10～100mmol/L，进一步优选为20～80mmol/L，更优选为30～70mmol/L。在本发明中，所述缓冲溶液的pH值优选为6～8，进一步优选为6.2～7.8，更优选为6.4～7.6。在本发明中，所述缓冲溶液的体积优选占脱细胞基质溶液体积的1～5％，进一步优选为2～4％，更优选为3％。在本发明中，所述缓冲溶液能够提高谷氨酰胺转氨酶的溶解性。
在本发明中，所述谷氨酰胺转氨酶和所述脱细胞基质溶液中的脱细胞基质的用量比优选为20～100U：1g，进一步优选为30～90U：1g，更优选为40～80U：1g。在本发明中，所述谷氨酰胺转氨酶具有优异的粘附性，同时能够和所述脱细胞基质溶液中的脱细胞基质之间形成肽键，进而发生交联得到脱细胞基质水凝胶，使得脱细胞基质水凝胶具有优异的粘附性能。
在本发明中，所述混合的过程优选为：将谷氨酰胺转氨酶溶解在缓冲溶液后，再和脱细胞基质溶液、海藻酸盐溶液进行混合。本发明对所述溶解和混合的具体实施方式没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的即可。
在本发明中，所述金属阳离子溶液中金属阳离子的摩尔浓度优选为0.2～1mol/L，进一步优选为0.3～0.9mol/L，更优选为0.4～0.8mol/L。在本发明中，所述金属阳离子和上述技术方案所述的金属阳离子一致，在此不再赘述。在本发明中，所述金属阳离子溶液优选包括氯化钙溶液、氯化锌溶液或氯化镁溶液。在本发明中，所述金属阳离子溶液的体积优选占海藻酸盐溶液体积的0.5～1％，进一步优选为0.6～0.9％，更优选为0.7～0.8％。
在本发明中，所述三维交联的具体实施方式优选为：将吸附有金属阳离子溶液的薄膜覆盖在所述混合后得到的溶液表面，进行三维交联，得到所述复合水凝胶。本发明对所述薄膜的材料以及覆盖的过程没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的即可。
在本发明中，所述三维交联优选在无菌环境下进行。
在本发明中，所述金属阳离子能够和海藻酸盐发生络合反应生成海藻酸盐水凝胶，所生成的海藻酸盐水凝胶和脱细胞基质水凝胶相互穿插缠绕，形成三维交联结构，具有密实、稳定的特性，通过协同作用进一步提高了复合水凝胶的粘附性能。
本发明提供的复合水凝胶具有可控的降解速率和优异的机械强度，且使用方便，可迅速封闭受伤区域。
本发明还提供了上述技术方案所述复合水凝胶或由上述技术方案所述制备方法制备得到的复合水凝胶在制备角膜供体、角膜粘合剂、水凝胶敷料或药物载体中的应用。本发明对所述应用的方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的即可。
本发明提供的复合水凝胶作为眼表损伤的水凝胶敷料，能够促进眼表上皮快速愈合；作为角膜供体材料，能够很好的对角膜损伤区域进行修复，保持眼球的完整性；作为眼科药物的载体，能够实现局部给药且具有很好的药物缓释效果。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种复合水凝胶及其制备方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
将0.3U谷氨酰胺转氨酶溶解于5uL浓度为50mmol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液(pH＝7.4)后，再和150uL质量浓度为3％的脱细胞基质溶液、45uL质量浓度为4％的多巴胺修饰海藻酸钠溶液进行混合得到混合液，将吸附有浓度为0.5mol/L氯化钙溶液的薄膜覆盖在混合液的表面，得到所述复合水凝胶。
实施例2
将0.3U谷氨酰胺转氨酶溶解于5uL浓度为50mmol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液(pH＝7.4)后，再和150uL质量浓度为3％的脱细胞基质溶液、45uL质量浓度为5％的海藻酸钠溶液进行混合得到混合液，将吸附有浓度为0.5mol/L氯化钙溶液的薄膜覆盖在混合液的表面，得到所述复合水凝胶。
应用例1
将健康的新西兰大白兔麻醉后，在角膜中央用环钻剥除直径为6.25mm，厚度为200um的角膜基质，制备角膜基质缺损模型；
将实施例1得到的前驱体溶液注射到直径为8mm的角膜接触镜上后，浸泡在0.5mol/L的氯化钙溶液中5秒，然后将角膜接触镜覆盖在兔角膜表面2秒后，取下角膜接触镜，实现复合水凝胶对角膜缺损区域的填补；
用生理盐水将角膜修复区域冲洗干净，带上角膜绑带镜，将新西兰兔送回饲养间饲养，其中术后的七天内，每天早晚涂抹典必殊眼膏。
性能测试
测试例1
将实施例1得到的复合水凝胶利用超临界二氧化碳干燥后，通过扫描电子显微镜进行观察测试，测试结果如图1所示。从图1可以看出，本实施例得到的复合水凝胶呈现三维网络状结构。
测试例2
在实施例1得到的复合水凝胶上接种人源角膜上皮细胞，经过三天的细胞培养后，进行活死细胞染色荧光测试，测试结果如图2所示，其中，a为人源角膜上皮细胞在复合水凝胶表面的活死细胞染色荧光测试结果，b为人源角膜上皮细胞在培养皿上的活死细胞染色荧光测试结果，红色为死细胞，绿色为活细胞。从a可以看出细胞的成活率在98％以上，从b可以看出在培养皿上细胞的成活率为98.75％，表明本实施例得到的复合水凝胶具有优异的生物相容性。
测试例3
在术后当天，对应用例1中的角膜修复区域进行光学相干断层扫描(OCT)，测试条件为：层扫模式，测试结果如图3所示，其中，a为未经修复的角膜缺损区域的OCT扫描图，b为经本发明提供的复合水凝胶修复的角膜缺损区域的OCT扫描图，从b可以看出，本发明提供的复合水凝胶可以修复角膜基缺损，恢复正常的屈光度。
测试例4
对实施例1得到的复合水凝胶和市售的猪源纤维蛋白粘合剂(采购于广州倍绣生物技术有限公司)所能承受的最大眼内压进行测试，测试方法为用人工前房进行测试，测试装置如图4中的a所示，a为水凝胶体外修复角膜3.5mm穿孔模型和粘合10mm角膜撕裂伤的模型，测试结果如图4中的b所示，从b可以看出本发明提供的复合水凝胶(粘附性水凝胶)所能承受的最大眼内压高于猪源纤维蛋白粘合剂，表明本发明提供的复合水凝胶具有优异的粘附性和机械强度。
测试例5
术后三个月，对应用例1中的角膜修复区域进行大体观察测试，测试方法为用裂隙灯进行观察，测试结果如图5所示，其中，a为未经修复的角膜大体观察图，，b为经复合水凝胶修复的角膜大体观察图，从a和b可以看出，经过本发明提供的复合水凝胶修复的角膜区域，无瘢痕产生，而未经修复的角膜区域有明显的云翳。
测试例6
术后两周，对应用例1中的角膜修复区域进行荧光素钠染色观察测试，测试方法为：对角膜修复区域进行染色，用生理盐水冲洗后，在钴蓝光下拍照观察。测试结果如图6所示，其中，a为未经修复的角膜荧光素钠染色图，b为经复合水凝胶修复的角膜荧光素钠染色测试图，从a和b可以看出，经过本发明提供的复合水凝胶修复的角膜上皮完全修复，而未经处理的角膜中央有明显的的上皮缺损。
测试例7
术后六个月，对应用例1中的角膜修复区域进行角膜神经染色测试，测试方法为：对修复区域进行免疫荧光染色，角膜神经被beta III Tubulin抗体标记。测试结果如图7所示，其中，a为未经修复的角膜神经染色图，b为经复合水凝胶修复的角膜神经染色图。从a和b可以看出，经过本发明提供的复合水凝胶修复的角膜神经纤维的长度和密度明显高于未经处理的角膜。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (6)

1.一种复合水凝胶，其特征在于，包括海藻酸盐水凝胶和脱细胞基质水凝胶；
所述脱细胞基质水凝胶的制备原料包括脱细胞基质和谷氨酰胺转氨酶；
所述海藻酸盐水凝胶包括海藻酸盐络合物；所述海藻酸盐络合物包括海藻酸盐和金属阳离子，所述海藻酸盐为多巴胺修饰的海藻酸盐；
所述海藻酸盐水凝胶和脱细胞基质水凝胶构成三维交联结构；
所述复合水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
将脱细胞基质溶液、海藻酸盐溶液、谷氨酰胺转胺酶和缓冲溶液混合后，利用金属阳离子溶液进行三维交联，得到所述复合水凝胶；
所述脱细胞基质溶液的质量浓度为1～3％；所述海藻酸盐溶液的质量浓度为2～10％；所述脱细胞基质溶液和海藻酸盐溶液的体积比为1～5：1；
所述谷氨酰胺转氨酶和所述脱细胞基质溶液中的脱细胞基质的用量比为20～100U：1g；
所述复合水凝胶作为角膜供体材料使用。
2.根据权利要求1所述的复合水凝胶，其特征在于，所述海藻酸盐水凝胶和脱细胞基质水凝胶的质量比为1：1～4；
所述海藻酸盐水凝胶的质量以海藻酸盐的质量计，所述脱细胞基质水凝胶的质量以脱细胞基质的质量计。
3.根据权利要求1所述的复合水凝胶，其特征在于，所述金属阳离子包括钙离子、镁离子和锌离子中一种或几种。
4.权利要求1～3任一项所述复合水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将脱细胞基质溶液、海藻酸盐溶液、谷氨酰胺转胺酶和缓冲溶液混合后，利用金属阳离子溶液进行三维交联，得到所述复合水凝胶；
所述脱细胞基质溶液的质量浓度为1～3％；所述海藻酸盐溶液的质量浓度为2～10％；所述脱细胞基质溶液和海藻酸盐溶液的体积比为1～5：1；
所述谷氨酰胺转氨酶和所述脱细胞基质溶液中的脱细胞基质的用量比为20～100U：1g。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲溶液包括磷酸盐缓冲溶液或三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液；
所述缓冲溶液的浓度为10～100mmol/L；
所述缓冲溶液的pH值为6～8；
所述缓冲溶液的体积占脱细胞基质溶液体积的1～5％。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述金属阳离子溶液中金属阳离子的摩尔浓度为0.2～5mol/L；
所述金属阳离子溶液的体积占海藻酸盐溶液体积的0.5～1％。
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