CN110393823A - 一种3d生物打印的水凝胶墨水及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种3D生物打印的水凝胶墨水及其制备方法,按照质量百分比,包括以下组份:1‑10%的可固化聚合物;1‑10%的脱细胞基质水凝胶;1‑10%的胞外囊泡混悬液;5‑15%的生物大分子材料;1‑5%的生物活性分子;0.1‑0.5%的促溶剂;余量为水,总质量为100%。本发明中的可固化聚合物采用了水溶性的天然多糖和天然的高分子材料,解决了其与细胞的相容性。为了进一步提高可固化聚合物足以提供3D模型的构建,本发明在生物墨水中加入了生物大分子材料,可辅助可固化聚合物进一步提高墨水粘度,使得最终的3D模型力学强度更好,其次生物大分子材料也可提供部分细胞生长所需的物质,保证细胞的活性。
Description
技术领域
本发明属于3D打印与生物材料技术领域,具体涉及一种3D生物打印的水凝胶墨水及其制备方法。
背景技术
生物3D打印技术具有高精度、高效率、个性化制造等特点,在生物医药领域已引起人们足够重视,具有非常广泛的应用前景。生物3D打印最为核心的技术是细胞三维受控组装工艺,按照器官解剖学的数字模型,通过控制单个细胞和细胞团簇的3D组装,实现可整合于人体新陈代谢系统的用于修复和替代病损组织和器官的人造器官的制造。目前,生物3D打印在包括牙齿、骨骼、软骨等结构性组织的再造方面已取得一定进展。
生物墨水、生物打印技术及目标生物细胞作为生物3D打印的三大要素被广泛、深入研究。迄今为止,采用3D打印技术制造真正适合于体内植入的器官或组织还面临很大的挑战,其中研发适合于3D打印的生物材料是关键。目前广泛采用的3D打印材料是热塑性可降解吸收聚醋塑料(PLA、PLGA、PCL、PEG及它们的共聚物等)。这些材料通过有机溶剂或者高温处理才能进行3D打印,打印出的支架结构稳定,但精度有限,不能与细胞或活性分子混合打印。现有材料无论单独使用还是复合都很难兼顾细胞相容性、生物活性和力学性能。
发明内容
本发明的目的是提供一种3D生物打印的水凝胶墨水及其制备方法,解决目前3D打印墨水中打印材料与细胞活性难兼顾的问题。
本发明这种3D生物打印的水凝胶墨水,按照质量百分比,包括以下组份:
1-10%的可固化聚合物;1-10%的脱细胞基质水凝胶;1-10%的胞外囊泡混悬液;5-15%的生物大分子材料;1-5%的生物活性分子;0.1-0.5%的促溶剂;余量为水,总质量为100%。
3D生物打印的水凝胶墨水,按照质量百分比,包括以下组份:1-4%的可固化聚合物;1-4%的脱细胞基质水凝胶;2-7%的胞外囊泡混悬液;7-12%的生物大分子材料;2-4%的生物活性分子;0.2-0.5%的促溶剂;余量为水,总质量为100%。
3D生物打印的水凝胶墨水,按照质量百分比,包括以下组份:2%的可固化聚合物;2%的脱细胞基质水凝胶;3.5%的胞外囊泡混悬液;11%的生物大分子材料;2.5%的生物活性分子;0.3%的促溶剂;余量为水,总质量为100%。
所述的可固化聚合物为海藻酸钠、明胶、透明质酸中的一种。
所述脱细胞基质水凝胶源自哺乳动物的周围神经、脊髓、心脏、胎盘、羊膜或小肠黏膜下层,作为优选:哺乳动物为人或猪。
所述胞外囊泡混悬液是从异体、自体或异种来源的细胞、体液中提取得到的胞外囊泡悬浮于PBS缓冲液中,制得,其中胞外囊泡的浓度为0.1-0.9mg/ml。
所述生物大分子材料为动物软组织源性细胞外基质纳米纤维微粉,优选为猪、牛或羊真皮软组织源性细胞外基质纳米纤维微粉,其主要成分为I型,III型以及V型胶原,采用超低温粉碎研磨得到平均粒径低于30μm的颗粒。
所述生物活性分子为活性因子和功能短肽中的一种或多种。
所述活性因子为R-NGF(神经生长因子)、VEGF(血管内皮生长因子)、BDNF(脑源性神经营养因子)、NT-3(神经营养因子)、血小板来源生长因子(PDGF),骨肉瘤来源生长因子(ODGF),表皮生长因子(EGF),转化生长因子(TGFα和TGFβ)、成纤维细胞生长因子(αFGF、βFGF),类胰岛素生长因子(IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ),神经生长因子(NGF),白细胞介素类生长因子(IL-1、IL-1、IL-3),红细胞生长素(EPO)或者集落刺激因子(CSF)中的一种或多种,
所述功能短肽为RGD或IKVAV(合成神经活性多肽,氨基酸序列为异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸);RGD序列由精氨酸、甘氨酸和天门冬氨酸组成,存在于多种细胞外基质中,可与11种整合素特异性结合,能有效地促进细胞对生物材料的粘附。
所述促溶剂为盐酸、磷酸、醋酸中的一种。
所述的水为蒸馏水或超纯水。
所述的3D生物打印的水凝胶墨水的制备方法,包括以下步骤:
按照比例,将可固化聚合物,脱细胞基质水凝胶,生物大分子材料,生物活性分子,促溶剂,与水混合,搅拌至溶解完全,调节pH为6-7.5,加入胞外囊泡混悬液,混合均匀,即得3D打印生物墨水。
本发明的有益效果:1)本发明中的可固化聚合物采用了水溶性的天然多糖和天然的高分子材料,解决了其与细胞的相容性。2)为了进一步提高可固化聚合物制备3D模型的力学强度,本发明在生物墨水中加入了生物大分子材料,可辅助可固化聚合物进一步提高墨水粘度,使得最终的3D模型力学强度更好,其次生物大分子材料也可提供部分细胞生长所需的物质,保证细胞的活性。3)为了使细胞能够在打印过程中保持高度的活性,本发明在生物墨水中脱细胞基质水凝胶、胞外囊泡混悬液和生物活性分子,保证细胞的体外生存环境,使细胞在3D打印过程中不易失活。4)本发明的生物活性分子中,引入了功能短肽,存在于多种细胞外基质中,可与11种整合素特异性结合,能有效地促进细胞对生物材料的粘附。
具体实施方式
实施例1
将5wt%的海藻酸钠,6wt%的猪脊髓脱细胞基质水凝胶,10wt%的羊真皮软组织源性细胞外基质纳米纤维微粉,1wt%的VEGF,0.1wt%的醋酸,与水混合,搅拌至溶解完全,调节pH为7,加入1.5wt%胞外囊泡混悬液(浓度为0.5mg/ml,小鼠上皮细胞胞外囊泡混悬液),混合均匀,得到3D打印生物墨水。
按照5x105个/mL将小鼠成纤维细胞与得到的生物墨水混合,得到细胞生物墨水。
细胞生物墨水3D打印条件:3D打印机喷头移动速度为250mm/min,细胞生物墨水挤出速度为260mm/min,得到的加载细胞的水凝胶压缩模量130kPa,打印完成后,小鼠成纤维细胞存活率达到91%,培养7天后,细胞存活率达到96%。
实施例2
将7wt%的海藻酸钠,8wt%的猪小肠黏膜下层脱细胞基质水凝胶,12wt%的羊真皮软组织源性细胞外基质纳米纤维微粉,2wt%的VEGF,0.2wt%的磷酸,与水混合,搅拌至溶解完全,调节pH为6.8,2.5wt%胞外囊泡混悬液(浓度为0.7mg/ml,猪小肠黏膜上皮细胞胞外囊泡混悬液),混合均匀,得到3D打印生物墨水。
按照1x106个/mL将人血管内皮细胞与得到的生物墨水混合,得到细胞生物墨水。细胞生物墨水3D打印条件:3D打印机喷头移动速度为450mm/min,细胞生物墨水挤出速度为470mm/min。
得到的加载细胞的水凝胶压缩模量120kPa,打印完成后,人血管内皮细胞存活率达到85%,培养7天后,细胞存活率达到93%。
实施例3
将8wt%的明胶,3wt%的人脊髓脱细胞基质水凝胶,10wt%的牛真皮软组织源性细胞外基质纳米纤维微粉,3wt%的RGD(序列是由精氨酸、甘氨酸和天门冬氨酸组成),0.1wt%的醋酸,与水混合,搅拌至溶解完全,调节pH为7,加入4wt%胞外囊泡混悬液(浓度为0.45mg/ml,瘤牛皮肤细胞胞外囊泡混悬液),混合均匀,得到3D打印生物墨水。
按照2x107个/mL将小鼠成纤维细胞与得到的生物墨水混合,得到细胞生物墨水。
细胞生物墨水3D打印条件:3D打印机喷头移动速度为250mm/min,细胞生物墨水挤出速度为260mm/min,得到的加载细胞的水凝胶压缩模量130kPa,打印完成后,小鼠成纤维细胞存活率达到94%,培养7天后,细胞存活率达到98%。
实施例4
将8wt%的透明质酸,4wt%的人脊髓脱细胞基质水凝胶,10wt%的羊真皮软组织源性细胞外基质纳米纤维微粉,2wt%的IKVAV,0.1wt%的醋酸,与水混合,搅拌至溶解完全,调节pH为7,加入1.5wt%胞外囊泡混悬液(浓度为0.7mg/ml,小鼠成纤维细胞胞外囊泡混悬液),混合均匀,得到3D打印生物墨水。
按照1x107个/mL将小鼠成纤维细胞与得到的生物墨水混合,得到细胞生物墨水。
细胞生物墨水3D打印条件:3D打印机喷头移动速度为250mm/min,细胞生物墨水挤出速度为260mm/min,得到的加载细胞的水凝胶压缩模量130kPa,打印完成后,小鼠成纤维细胞存活率达到92%,培养7天后,细胞存活率达到97%。
实施例5
将5wt%的透明质酸,4wt%的猪脊髓脱细胞基质水凝胶,10wt%的羊真皮软组织源性细胞外基质纳米纤维微粉,2.0wt%的NGF,2.0wt%的RGD(序列是由精氨酸、甘氨酸和天门冬氨酸组成)0.1wt%的醋酸,与水混合,搅拌至溶解完全,调节pH为7,加入5wt%胞外囊泡混悬液(浓度为0.9mg/mL,猪小肠上皮细胞胞外囊泡混悬液),混合均匀,得到3D打印生物墨水。
按照8x106个/mL将小鼠成纤维细胞与得到的生物墨水混合,得到细胞生物墨水。
细胞生物墨水3D打印条件:3D打印机喷头移动速度为250mm/min,细胞生物墨水挤出速度为260mm/min,得到的加载细胞的水凝胶压缩模量130kPa,打印完成后,小鼠成纤维细胞存活率达到90%,培养7天后,细胞存活率达到98%。
Claims (10)
1.一种3D生物打印的水凝胶墨水,按照质量百分比,包括以下组份:
1-10%的可固化聚合物;1-10%的脱细胞基质水凝胶;1-10%的胞外囊泡混悬液;5-15%的生物大分子材料;1-5%的生物活性分子;0.1-0.5%的促溶剂;余量为水,总质量为100%。
2.根据权利要求1所述的3D生物打印的水凝胶墨水,其特征在于,所述的3D生物打印的水凝胶墨水,按照质量百分比,包括以下组份:1-4%的可固化聚合物;1-4%的脱细胞基质水凝胶;2-7%的胞外囊泡混悬液;7-12%的生物大分子材料;2-4%的生物活性分子;0.2-0.5%的促溶剂;余量为水,总质量为100%。
3.根据权利要求1所述的3D生物打印的水凝胶墨水,其特征在于,3D生物打印的水凝胶墨水,按照质量百分比,包括以下组份:2%的可固化聚合物;2%的脱细胞基质水凝胶;3.5%的胞外囊泡混悬液;11%的生物大分子材料;2.5%的生物活性分子;0.3%的促溶剂;余量为水,总质量为100%。
4.根据权利要求1~3所述的3D生物打印的水凝胶墨水,其特征在于,所述的可固化聚合物为海藻酸钠、明胶、透明质酸中的一种;所述脱细胞基质水凝胶源自哺乳动物的周围神经、脊髓、心脏、胎盘、羊膜或小肠黏膜下层;所述胞外囊泡混悬液是从异体、自体或异种来源的细胞、体液中提取得到的胞外囊泡悬浮于PBS缓冲液中,制得,其中胞外囊泡的浓度为0.1-0.9mg/ml;所述生物大分子材料为动物软组织源性细胞外基质纳米纤维微粉,其主要成分为I型,III型以及V型胶原。
5.根据权利要求4所述的3D生物打印的水凝胶墨水,其特征在于,所述的可固化聚合物为海藻酸钠;所述的哺乳动物为人或猪中的一种;所述的生物大分子材料为猪、牛或羊真皮软组织源性细胞外基质纳米纤维微粉。
6.根据权利要求1~3所述的3D生物打印的水凝胶墨水,其特征在于,所述生物活性分子为活性因子和功能短肽中的一种或多种;所述促溶剂为盐酸、磷酸、醋酸中的一种;所述的水为蒸馏水或超纯水。
7.根据权利要求6所述的3D生物打印的水凝胶墨水,其特征在于,所述活性因子为R-NGF(神经生长因子)、VEGF(血管内皮生长因子)、BDNF(脑源性神经营养因子)、NT-3(神经营养因子)、血小板来源生长因子(PDGF),骨肉瘤来源生长因子(ODGF),表皮生长因子(EGF),转化生长因子(TGFα和TGFβ)、成纤维细胞生长因子(αFGF、βFGF),类胰岛素生长因子(IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ),神经生长因子(NGF),白细胞介素类生长因子(IL-1、IL-1、IL-3),红细胞生长素(EPO)或者集落刺激因子(CSF)中的一种或多种。
8.根据权利要求6所述的3D生物打印的水凝胶墨水,其特征在于,所述功能短肽为RGD或IKVAV。
9.根据权利要求8所述的3D生物打印的水凝胶墨水,其特征在于,所述的IKVAV为合成神经活性多肽,氨基酸序列为异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸;RGD序列由精氨酸、甘氨酸和天门冬氨酸组成,存在于多种细胞外基质中,可与11种整合素特异性结合,能有效地促进细胞对生物材料的粘附。
10.一种根据权利要求1所述的3D生物打印的水凝胶墨水的制备方法,包括以下步骤:
按照比例,将可固化聚合物,脱细胞基质水凝胶,生物大分子材料,生物活性分子,促溶剂,与水混合,搅拌至溶解完全,调节pH为6-7.5,加入胞外囊泡混悬液,混合均匀,即得3D打印生物墨水。
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