CN117777491A - 一种氧化透明质酸-多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种氧化透明质酸‑多巴胺‑聚丙烯酰胺水凝胶及其制备方法和应用。该水凝胶的制备方法包括：将氧化透明质酸、1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N‑羟基琥珀酰亚胺加入磷酸缓冲盐溶液中，充分搅拌后加入盐酸多巴胺，调节pH为4‑6进行搅拌反应，透析后得到多巴胺‑氧化透明质酸；加入丙烯酰胺水溶液中，搅拌混合均匀后，依次加入N,N‑亚甲基双丙烯酰胺、过硫酸铵和四甲基乙二胺；将混合物溶液在氮气保护下凝胶化，得到该水凝胶。本发明得到的水凝胶具有很强的力学性能、出色的粘附性，可以有效填补和封堵纤维环缺损，并具有一定的促修复效果。由该水凝胶制备的纤维环封堵器生物相容性好，能满足临床应用的需求。

Description

一种氧化透明质酸-多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶及其制备方法 和应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种氧化透明质酸-多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶及其制备方法和在制备修复椎间盘纤维环缺损的药物中的应用。

背景技术

腰椎间盘突出症是骨科门诊的常见病之一。正常的椎间盘为圆柱形，由上下两端的终板软骨，外围环形的纤维环及包裹在内的髓核构成，腰椎间盘突出症的病理机制是纤维环及髓核因退变而负重能力减弱，被挤压的髓核突破纤维环的阻挡，压迫神经根从而引发腰腿不适等症状。现有的医疗技术下，通过微创孔镜或者开放手术的方式，切开部分纤维环，将病变椎间盘的髓核取出。该方法虽能缓解髓核挤压带来的症状，但由于纤维环缺损的存在以及纤维环自我修复能力弱的生理特点，导致椎间盘突出症极易复发。

传统的椎间盘纤维环缺损修复手段包括直接缝合修补技术和纤维环封堵器，这些方法通过物理封堵预防髓核的再突出，但无法促进椎间盘的生物学修复和再生。组织工程技术能促进生物学修复，近年来在椎间盘纤维环封堵修复领域受到了大量的关注和研究。水凝胶是一种组织工程技术的重要材料，因其具有组织相容性好、机械强度可调、易于修饰等优势，在组织工程修复领域得到了大量的研究和应用。但就应用于椎间盘纤维环封堵而言，传统的水凝胶存在生物力学强度不足、粘性不足无法很好封闭住缺损等问题。例如，申请号为201911085427.5的专利公开了一种京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶。该专利通过对牛尾椎间盘纤维环进行脱细胞处理制得脱细胞基质胶，再由京尼平进行交联。所得水凝胶的修补效果通过细胞培养实验和大鼠尾椎间盘纤维环缺损模型实验得到了验证。但由于椎间盘纤维环供体来源有限，以及脱细胞步骤较为复杂且存在成品质量难以掌控的问题，故在大规模推广应用上可能存在一定的困难。申请号为202010821270.4的专利公开了一种由末端为琥珀酰酯基团的四臂聚乙二醇、氧化透明质酸和末端为氨基的四臂聚乙二醇复合交联而成的水凝胶。经测试，该水凝胶具有较强的机械性能，良好的细胞生物相容性，并对猪椎间盘纤维环缺损具有良好的初始封堵效果。但该水凝胶只研究了其初始机械性能，随着植入体内后水凝胶的降解机械性能会减小，该专利并未指出其机械性能支撑时间，亦未研究其粘附性能。

因此由于椎间盘的生理构造、特殊的承重功能，以及纤维环组织自我修复能力较差的特点，目前亟需设计一种机械强度较高、粘附性强的水凝胶用于椎间盘纤维环缺损的封堵和修复。

发明内容

为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供了一种氧化透明质酸-多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶及其制备方法和在制备修复椎间盘纤维环缺损的药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面是提供一种氧化透明质酸-多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

步骤一，多巴胺-氧化透明质酸的合成：将氧化透明质酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺加入磷酸缓冲盐溶液中，充分搅拌后加入盐酸多巴胺，调节pH为4-6进行搅拌反应，透析后得到多巴胺-氧化透明质酸；

步骤二，水凝胶的制备：将多巴胺-氧化透明质酸加入丙烯酰胺水溶液中，搅拌混合均匀后，依次加入N,N-亚甲基双丙烯酰胺、过硫酸铵和四甲基乙二胺；将混合物溶液在氮气保护下凝胶化，得到氧化透明质酸-多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶。

进一步地，上述氧化透明质酸钠通过如下方法配制：向透明质酸钠水溶液中加入高碘酸钠并在室温下避光搅拌过夜，使用超纯水透析24-50小时并冻干以获得氧化透明质酸。

进一步地，上述透明质酸钠的分子量为60万-80万。

进一步地，在上述方法中，搅拌过夜后，采用乙二醇来中和过量的高碘酸钠。

进一步地，氧化透明质酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和盐酸多巴胺的添加质量比为1：(1-3)：(0.5-2)：(2.5-5.5)。

进一步地，在步骤一中，充分搅拌的时间为0.5-2h。

进一步地，在步骤一中，反应的条件为：氮气保护下，搅拌6-24小时。

进一步地，在步骤一中，透析为采用去离子水进行透析2-5天，优选3天。

进一步地，上述丙烯酰胺水溶液的质量/体积比为25～30w/v％。

进一步地，在步骤二中，多巴胺-氧化透明质酸和丙烯酰胺的质量比为1：(3-8)，优选为1:5；丙烯酰胺和N,N-亚甲基双丙烯酰胺的质量比为(100-300)：1；丙烯酰胺和过硫酸铵的质量比为(30-100)：1；四甲基乙二胺与反应溶液的体积比为1：700-1：1000。

进一步地，在步骤二中，凝胶化的时间为1～3h。

进一步地，上述制备方法还包括添加其它利于纤维环修复或者干细胞生长、粘附、增殖和分化的因子或生物活性试剂的步骤。

本发明的第二方面是提供上述制备方法制备的氧化透明质酸-多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶。

本发明的第三方面是提供上述氧化透明质酸-多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶在制备修复椎间盘纤维环缺损的药物中的应用。

本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

本发明所述制备方法，通过引入不同官能团组分，使复合水凝胶中的成分实现三重交联，大大提高水凝胶的力学性能、抗疲劳性能和粘附性能。其中，多巴胺-氧化透明质酸通过醛基与丙烯酰胺单体交联作为第一层化学交联网络。第二，丙烯酰胺单体之间聚合形成第二层交联网络。第三，多巴胺-氧化透明质酸中的多巴胺通过氢键互相交联形成第三层物理交联。通过上述方法得到的三交联氧化透明质酸-多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶具有很强的力学性能，其出色的粘附性由具有粘附性能的多巴胺提供，可以有效填补和封堵纤维环缺损，并具有一定的促修复效果。由该氧化透明质酸-多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶制备的纤维环封堵器生物相容性好，能满足临床应用的需求。

附图说明

图1是本发明一实施例中制备氧化透明质酸-多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶的合成路线示意图；

图2为实施例1、2、3所制备的氧化透明质酸-多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶的压缩模量图；

图3显示了实施例2提供的水凝胶的成胶性(图a)和可注射性(图b)；

图4显示了实施例2提供的水凝胶的粘附性；其中，图a-d分别显示了采用烧杯、60g重溶液、50g重砝码和两个50g重砝码验证水凝胶粘附性的结果；

图5为大鼠纤维环细胞在实施例2所制备的水凝胶上培养48小时后的活死染色实验结果图；

图6为实施例2提供的水凝胶的动态频率扫描曲线图；

图7为实施例2提供的水凝胶在大鼠尾椎间盘纤维环损伤模型中应用2月后尾椎间盘的MRI图。

具体实施方式

下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。

实施例1

本实施例提供一种氧化透明质酸-多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶，其制备方法包括如下步骤(参见图1)：

1.氧化透明质酸(OHA)的制备：称1g的透明质酸钠(HA)溶解在100mL蒸馏水中。然后加入0.5g的高碘酸钠(NaIO₄)并在室温下避光搅拌过夜。通过向混合物溶液中添加1ml乙二醇来中和过量的高碘酸钠并搅拌1小时。将反应混合物装入透析袋中，使用超纯水透析48小时并冻干以获得氧化透明质酸。

2.多巴胺-氧化透明质酸的合成：将1g的氧化透明质酸溶解100ml磷酸缓冲盐溶液(50mmol，pH 5.7)中。将1.936g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)和1.164gN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)添加到溶液中并搅拌30分钟，然后添加3.84g盐酸多巴胺(dopamine)。将溶液的pH调节至4-6，并将混合溶液在氮气保护下搅拌12小时，以防止多巴胺的自聚合。然后将混合溶液装入透析袋中，用去离子水透析3天，然后冷冻干燥得到多巴胺-氧化透明质酸(OHA-DA)。

3.水凝胶的制备：用去1ml离子水配置质量分数为30wt％的丙烯酰胺(AM)溶液并向其中加入多巴胺-氧化透明质酸使其质量分数达到4wt％，并将其混合搅拌混合均匀。依次添加0.1wt％的N,N-亚甲基双丙烯酰胺、14mg过硫酸铵和1μl四甲基乙二胺。将混合物溶液在氮气保护下凝胶化1h，得到氧化透明质酸-多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶。

实施例2

本实施例提供一种氧化透明质酸-多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶，其制备方法包括如下步骤(参见图1)：

1.氧化透明质酸的制备：称1g的透明质酸钠溶解在100mL蒸馏水中。然后加入0.5g的高碘酸钠并在室温下避光搅拌过夜。通过向混合物溶液中添加1ml乙二醇来中和过量的高碘酸钠并搅拌1小时。将反应混合物装入透析袋中，使用超纯水透析48小时并冻干以获得氧化透明质酸。

2.多巴胺-氧化透明质酸的合成：将1g的氧化透明质酸溶解100ml磷酸缓冲盐溶液(50mmol，pH 5.7)中。将1.936g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和1.164g N-羟基琥珀酰亚胺添加到溶液中并搅拌30分钟，然后添加3.84g盐酸多巴胺。将溶液的pH调节至4-6，并将混合溶液在氮气保护下搅拌12小时，以防止多巴胺的自聚合。然后将混合溶液装入透析袋中，用去离子水透析3天，然后冷冻干燥得到多巴胺-氧化透明质酸。

3.水凝胶的制备：用去1ml离子水配置质量分数为30wt％的丙烯酰胺溶液并向其中加入多巴胺-氧化透明质酸使其质量分数达到6wt％，并将其混合搅拌混合均匀。依次添加0.1wt％的N,N-亚甲基双丙烯酰胺、14mg过硫酸铵和1μl四甲基乙二胺。将混合物溶液在氮气保护下凝胶化1h，得到氧化透明质酸-多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶。

实施例3

本实施例提供一种氧化透明质酸-多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶，其制备方法包括如下步骤(参见图1)：

1.氧化透明质酸的制备：称1g的透明质酸钠溶解在100mL蒸馏水中。然后加入0.5g的高碘酸钠并在室温下避光搅拌过夜。通过向混合物溶液中添加1ml乙二醇来中和过量的高碘酸钠并搅拌1小时。将反应混合物装入透析袋中，使用超纯水透析48小时并冻干以获得氧化透明质酸。

2.多巴胺-氧化透明质酸的合成：将1g的氧化透明质酸溶解100ml磷酸缓冲盐溶液(50mmol，pH 5.7)中。将1.936g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和1.164g N-羟基琥珀酰亚胺添加到溶液中并搅拌30分钟，然后添加3.84g盐酸多巴胺。将溶液的pH调节至4-6，并将混合溶液在氮气保护下搅拌12小时，以防止多巴胺的自聚合。然后将混合溶液装入透析袋中，用去离子水透析3天，然后冷冻干燥得到多巴胺-氧化透明质酸。

3.水凝胶的制备：用去1ml离子水配置质量分数为30wt％的丙烯酰胺溶液并向其中加入多巴胺-氧化透明质酸使其质量分数达到8wt％，并将其混合搅拌混合均匀。依次添加0.1wt％的N,N-亚甲基双丙烯酰胺、14mg过硫酸铵和1μl四甲基乙二胺。将混合物溶液在氮气保护下凝胶化1h，得到氧化透明质酸-多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶。

实施例4

本实施例验证上述实施例制备的水凝胶的性能，具体的实验步骤和结果如下：

1.压缩模量

依据实施例1-3得到直径1.0cm，厚度为1.0cm的水凝胶圆柱体。使用万能测试仪检测水凝胶的压缩模量，施加的压缩应变设置为1毫米/分钟，得到水凝胶的应力-应变曲线，并根据曲线计算水凝胶的压缩模量。

结果如图2所示，相比于实施例1的复合水凝胶(234.5±19.2KPa)，实施例2的复合水凝胶的压缩模量更高(322.4±25.5KPa)，接近了纤维环组织的压缩模量。然而，实施例3的复合水凝胶的压缩模量相对于实施例2的复合水凝胶大幅下降(121.6±5.6KPa)，这可能是由于凝胶内过多的多巴胺影响了丙烯酰胺之间的聚合所致。基于此，以下对实施例2的复合水凝胶的其他性能进行验证。

2.成胶性和可注射性

在实施例2的步骤3中，待溶液成胶前，使用1ml注射器将凝胶溶液吸入针筒内，静置待溶液成胶。针筒内溶液成胶后，将针头伸入装有PBS的西林瓶中进行水凝胶注射能力表征。

结果如图3所示，该水凝胶具有可在1-3小时内形成水凝胶，并且具有良好的可注射性。

3、粘附性

水凝胶成胶后将其粘附于200ml玻璃烧杯底、装满水的50ml离心管管盖上、50g砝码上，以及手部皮肤上，以检测改水凝胶对玻璃、塑料、金属和人体组织等介质的粘附性。

结果如图4所示，该水凝胶具有良好的粘附能力：可以粘附于金属玻璃、塑料、金属和人体组织等介质表面，并可抵抗一定的拉力。

4、提高细胞的活性

在实施例2的步骤3中，待溶液充分混匀后，将其倒入模具中成胶，得到直径1.5cm，厚度为0.5cm的水凝胶圆柱体，将水凝胶用去无菌离子水漂洗，去除未反应的丙烯酰胺及交联剂和催化剂后，紫外线照射24h灭菌。将水凝胶放入24孔板中。将大鼠纤维环细胞以每孔5×10³个的密度接种在水凝胶表面，培养48h后，使用Calcein-AM/PI LIVE-DEAD细胞染色试剂盒检测细胞活力。

结果如图5所示，培养48h后，氧化透明质酸-多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶上大部分纤维环细胞存活(绿色)，而几乎没有死亡细胞(红色)。说明该水凝胶具有良好的细胞相容性，允许纤维环细胞存活和增殖。

5、流变力学性能

在实施例2的步骤3中，待溶液充分混匀后，将其倒入模具中成胶，得到直径2.0cm，厚度为0.2cm的水凝胶圆柱体。使用流变仪对水凝胶进行频率扫频检测，应变设置为1.0％，频率设置为10^-2Hz至10¹Hz。

结果如图6所示，在0.01Hz至10Hz的范围内，水凝胶的储能模量(G’)和损耗模量(G”)始终维持在稳定的范围内，且G’远大于G”，显示出固态水凝胶的特征。在0.01Hz至10Hz的范围内，水凝胶储能模量为4000～5000Pa。

6、动物实验

在实施例2的步骤3中，溶液充分混匀后，待溶液成胶前，使用1ml注射器将凝胶溶液吸入针筒内，静置待溶液成胶。针筒内溶液成胶后，将其放入无菌去离子水中漂洗去除未反应的丙烯酰胺及交联剂和催化剂，并用紫外线照射24小时灭菌。

10～12周龄雄性SD大鼠15只分为3组：假手术组、纤维环缺损组、纤维环缺损+水凝胶组(每组大鼠＝5只)。使用0.5％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠。选择鼠尾Co6/Co7和Co7/Co8椎间盘进行造模。对相应椎间盘区域的皮肤进行消毒。对于纤维环缺损组(Defect)，切开皮肤暴露纤维环后，使用18G针穿刺纤维环造成纤维环缺损并注意避免损伤髓核。造模完成后缝合皮肤，正常饲养动物。对于纤维环缺损+水凝胶(ODP)组，造模后将制备的水凝胶注射入纤维环缺损内并缝合皮肤。对于假手术(Sham)组，仅切开皮肤而不造模即进行缝合。术后8周对鼠尾相应椎间盘节段进行核磁共振检测，表征椎间盘的退变情况。

结果如图7所示，相比于假手术组，术后八周纤维环缺损组的椎间盘发生了明显的退变，而纤维环缺损+水凝胶组的相应椎间盘的退变情况得到了明显的改善，证明氧化透明质酸-多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶可以封堵纤维环缺损并防止椎间盘退变。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (14)

1.一种氧化透明质酸-多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一，多巴胺-氧化透明质酸的合成：将氧化透明质酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺加入磷酸缓冲盐溶液中，充分搅拌后加入盐酸多巴胺，调节pH为4-6进行搅拌反应，透析后得到多巴胺-氧化透明质酸；

步骤二，水凝胶的制备：将多巴胺-氧化透明质酸加入丙烯酰胺水溶液中，搅拌混合均匀后，依次加入N,N-亚甲基双丙烯酰胺、过硫酸铵和四甲基乙二胺；将混合物溶液在氮气保护下凝胶化，得到氧化透明质酸-多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，上述氧化透明质酸钠通过如下方法配制：向透明质酸钠水溶液中加入高碘酸钠并在室温下避光搅拌过夜，使用超纯水透析24-50小时并冻干以获得氧化透明质酸。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，上述透明质酸钠的分子量为60万-80万。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在上述方法中，搅拌过夜后，采用乙二醇来中和过量的高碘酸钠。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，氧化透明质酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和盐酸多巴胺的添加质量比为1：(1-3)：(0.5-2)：(2.5-5.5)。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤一中，充分搅拌的时间为0.5-2h。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤一中，反应的条件为：氮气保护下，搅拌6-24小时。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤一中，透析为采用去离子水进行透析2-5天，优选3天。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，上述丙烯酰胺水溶液的质量/体积比为25～30w/v％。

10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤二中，多巴胺-氧化透明质酸和丙烯酰胺的质量比为1：(3-8)，优选为1:5；丙烯酰胺和N,N-亚甲基双丙烯酰胺的质量比为(100-300)：1；丙烯酰胺和过硫酸铵的质量比为(30-100)：1；四甲基乙二胺与反应溶液的体积比为1:700-1:1000。

11.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤二中，凝胶化的时间为1～3h。

12.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，还包括添加其它利于纤维环修复或者干细胞生长、粘附、增殖和分化的因子或生物活性试剂的步骤。

13.如权利要求1-12所述制备方法制备的氧化透明质酸-多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶。

14.如权利要求13所述的氧化透明质酸-多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶在制备修复椎间盘纤维环缺损的药物中的应用。