CN115887781B - 一种用于软骨损伤修复的可注射水凝胶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种用于软骨损伤修复的可注射水凝胶的制备方法，包括：步骤一、提供负载2‑([1,1‑联苯]‑4‑基氨基甲酰)苯甲酸的牛血清白蛋白纳米颗粒；步骤二、提取丝素蛋白；步骤三、制备可注射水凝胶，具体包括：将丝素蛋白溶液、E7肽溶液、负载2‑([1,1‑联苯]‑4‑基氨基甲酰)苯甲酸的牛血清白蛋白纳米颗粒分散液、辣根过氧化物酶水溶液和过氧化氢溶液混合，得到用于软骨损伤修复的可注射水凝胶。采用本发明方法得到用于软骨损伤修复的可注射水凝胶兼具招募内源性干细胞和良好的软骨分化能力的用于软骨损伤修复的生物医用材料。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种用于软骨损伤修复的可注射水凝胶的制备方法。
背景技术
急性创伤或者重复性微创伤可能会导致软骨损伤，若不及时治疗，损伤部位炎症会引起多种降解酶活性提高，加速关节软骨的降解，最终发展为软骨关节退行性疾病，以致影响患者身心健康。
由于关节软骨结构组成的特殊性，其在损伤后无法进行自我修复。目前软骨损伤修复用医用材料基本依托软骨分化，采用移植细胞进行处理，这种方式会造成细胞体外培养和免疫排斥，引发新的风险。目前的因软骨损伤造成的软骨组织缺陷而植入的软骨修复填充材料，仅具有针对促进新生软骨再生的生物相容性、软骨分化活性和可控的降解性能，无法满足当前软骨损伤修复的要求。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种用于软骨损伤修复的可注射水凝胶的制备方法。本发明通过提供负载 2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的牛血清白蛋白纳米颗粒分散液、提取丝素蛋白以及将上述分散液、丝素蛋白、E7肽、辣根过氧化物酶和过氧化氢溶液混合，得到用于软骨损伤修复的可注射水凝胶，该水凝胶兼具招募内源性干细胞和良好的软骨分化能力的用于软骨损伤修复的生物医用材料。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种用于软骨损伤修复的可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，包括：
步骤一、提供负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的牛血清白蛋白纳米颗粒，具体包括：
步骤101、将2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸溶液滴加到牛血清白蛋白溶液中，得到混合体系；
步骤102、将无水乙醇连续加入到所述混合体系中，得到浑浊体系；
步骤103、向所述浑浊体系中加入戊二醛溶液，搅拌，离心纯化，得到负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的牛血清白蛋白纳米颗粒；
步骤二、提取丝素蛋白，具体包括：将经精细脱胶和干燥后蚕茧溶解于LiBr溶液中，得到蚕丝体系，将所述蚕丝体系经水浴溶解、过滤和透析冻干，得到丝素蛋白；
步骤三、制备可注射水凝胶，具体包括：将丝素蛋白溶液、E7肽溶液、负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的牛血清白蛋白纳米颗粒分散液、辣根过氧化物酶水溶液和过氧化氢溶液混合，得到用于软骨损伤修复的可注射水凝胶。
上述的用于软骨损伤修复的可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤101中，所述混合体系中2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的质量为牛血清白蛋白质量的0.01倍～0.05倍；所述2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰) 苯甲酸溶液为2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸和无水乙醇的混合溶液，所述牛血清白蛋白溶液为牛血清白蛋白的水溶液。
上述的用于软骨损伤修复的可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤102中，将无水乙醇连续加入到所述混合体系中为以 1.5mL/min～2.0mL/min的速率进行加入。
上述的用于软骨损伤修复的可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤102中，所述无水乙醇的体积为牛血清白蛋白质量的190倍～590倍，所述无水乙醇体积的单位为mL,牛血清白蛋白质量的单位为g。
上述的用于软骨损伤修复的可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤103中，所述戊二醛溶液的质量百分含量为8wt％～10％，所述戊二醛溶液的体积为牛血清白蛋白质量的1250倍，所述戊二醛溶液体积为μL，牛血清白蛋白质量的单位为g；所述搅拌的时间为24h～48h。
上述的用于软骨损伤修复的可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤二中，所述精细脱胶为将蚕茧置于碳酸钠溶液中煮沸，所述碳酸钠溶液的质量为蚕茧质量的40倍～60倍，所述碳酸钠溶液的质量百分含量为 0.5wt％～0.8％；所述LiBr溶液浓度为9.3M～9.8M。
上述的用于软骨损伤修复的可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤三中，所述用于软骨损伤修复的可注射水凝胶在上述体系混合后静置 3min～7min即可成胶；
上述的用于软骨损伤修复的可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤三中，所述丝素蛋白溶液为丝素蛋白溶解于去离子水中得到的丝素蛋白溶液，所述丝素蛋白溶液中丝素蛋白的质量百分含量为2.5％～10％；所述丝素蛋白质量为E7肽质量的125倍～500倍。
上述的用于软骨损伤修复的可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤三中，所述负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的牛血清白蛋白纳米颗粒分散液为负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的牛血清白蛋白纳米颗粒重悬于水中得到的负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的牛血清白蛋白纳米颗粒分散液。
上述的用于软骨损伤修复的可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤三中，所述丝素蛋白体积、负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的牛血清白蛋白纳米颗粒分散液体积、辣根过氧化物酶水溶液体积和过氧化氢溶液体积的比值为200:6:5:5。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明的用于软骨损伤修复的可注射水凝胶的制备方法通过提供负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的牛血清白蛋白纳米颗粒分散液、提取丝素蛋白以及将上述分散液、丝素蛋白、E7肽、辣根过氧化物酶和过氧化氢溶液混合，得到用于软骨损伤修复的可注射水凝胶，该水凝胶兼具招募内源性干细胞和良好的软骨分化能力的用于软骨损伤修复的生物医用材料。
2、作为优选，本发明的方法包括将提取得到的丝素蛋白与辣根过氧化物酶和过氧化氢混合，以促进丝素蛋白分子上的酚羟基发生化学交联。
3、本发明的方法首次通过去溶剂法合成负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的牛血清白蛋白纳米颗粒，以该方法得到的负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的牛血清白蛋白纳米颗粒再与E7肽共同负载到酶交联的丝素蛋白水凝胶中，可实现E7肽的快速释放和KGN的持续释放，促进干细胞迁移到软骨损伤部位，增强干细胞的软骨分化。
3、本发明的制备方法简单、重现性好，应用前景广阔。
下面结合附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1为实施例1步骤一负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的牛血清白蛋白纳米颗粒的SEM图。
图2为实施例1步骤一负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的牛血清白蛋白纳米颗粒的DLS图。
图3为实施例1中可注射水凝胶的可注射性的示意图。
图4为实施例1中可注射水凝胶的细胞毒性实验结果图。
图5为实施例1中可注射水凝胶的细胞迁移实验结果图。
图6为实施例1中可注射水凝胶的促软骨分化实验结果图。
具体实施方式
以下实施例中各试剂均为市售可得。
实施例1
本实施例提供用于软骨损伤修复的可注射水凝胶的制备方法，包括：
步骤一、提供负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的牛血清白蛋白纳米颗粒分散液，具体包括：
步骤101、将0.1g牛血清白蛋白(BSA)溶解于5ml水中，调节pH 值至8.2，得到牛血清白蛋白水溶液；
步骤102、将所述牛血清白蛋白水溶液超声处理15min，然后在室温条件下以500rpm的转速搅拌10min，得到搅拌后牛血清白蛋白水溶液；
步骤103、将2mg 2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸(KGN)溶解于 1ml无水乙醇中，得到KGN溶液；
步骤104、将所述KGN溶液逐滴加入到所述搅拌后牛血清白蛋白水溶液中，搅拌30min，得到混合体系；
步骤105、将19ml无水乙醇以1.5mL/min～2.0mL/min的速率连续加入到所述混合体系中，得到浑浊体系；
步骤106、向所述浑浊体系中加入125μL质量百分含量为8wt％的戊二醛溶液，搅拌24h后，离心纯化，得到负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰) 苯甲酸的牛血清白蛋白纳米颗粒；搅拌的速率为600rpm，所述离心纯化次数为3次，每次离心纯化的速率为10000rpm，时间为10min；
步骤107、将所述负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的牛血清白蛋白纳米颗粒重悬于5mL水中，得到负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的牛血清白蛋白纳米颗粒分散液；
步骤二、提取丝素蛋白，具体包括：
步骤201、将50g蚕茧置于2000g质量百分含量为0.5wt％的碳酸钠溶液中，95℃煮沸30min进行精细脱胶，得到脱胶后体系；
步骤202、过滤所述脱胶后体系，得到蚕丝，将所述蚕丝用蒸馏水清洗4次后置于60℃烘箱中干燥，得到干燥蚕丝；
步骤203、将所述干燥蚕丝溶解于浓度为9.3M的LiBr溶液中，得到蚕丝浓度为0.1g/mL的蚕丝体系，将所述蚕丝体系于60℃水浴条件下溶解 2h，得到溶解后体系；
步骤204、用纱布过滤所述溶解后体系，将过滤后所得固相装入7KDa 的透析袋，以蒸馏水为透析剂透析3d，冻干，得到丝素蛋白；所述冻干的温度为-60℃，时间为3d；
步骤三、制备可注射水凝胶，具体包括：
步骤301、将所述丝素蛋白溶解于去离子水中，得到质量百分含量为 10％丝素蛋白溶液；
步骤302、将1mL所述丝素蛋白溶液、220μg E7肽溶液、30μL所述负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的牛血清白蛋白纳米颗粒分散液、 25μL 1000U/ml辣根过氧化物酶水溶液和25μL 4mg/mL过氧化氢溶液混合，得到用于软骨损伤修复的可注射水凝胶，所述用于软骨损伤修复的可注射水凝胶在上述体系混合后静置3min即可成胶；所述E7肽溶液为将 200μg E7肽溶解于20μL H2O，所述E7肽溶液中E7肽的质量百分含量为 90wt％，所述E7肽为EPLQLKM，购买自丹港生物科技有限公司。
实施例2
本实施例提供用于软骨损伤修复的可注射水凝胶的制备方法，包括：
步骤一、提供负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的牛血清白蛋白纳米颗粒分散液，具体包括：
步骤101、将0.1g牛血清白蛋白(BSA)溶解于5ml水中，调节pH 值至8.2，得到牛血清白蛋白水溶液；
步骤102、将所述牛血清白蛋白水溶液超声处理15min，然后在室温条件下以500rpm的转速搅拌10min，得到搅拌后牛血清白蛋白水溶液；
步骤103、将3mg 2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸(KGN)溶解于1ml无水乙醇中，得到KGN溶液；
步骤104、将所述KGN溶液逐滴加入到所述搅拌后牛血清白蛋白水溶液中，搅拌30min，得到混合体系；
步骤105、将39ml无水乙醇以1.5mL/min～2.0mL/min的速率连续加入到所述混合体系中，得到浑浊体系；
步骤106、向所述浑浊体系中加入125μL质量百分含量为8wt％的戊二醛溶液，搅拌24h后，离心纯化，得到负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰) 苯甲酸的牛血清白蛋白纳米颗粒；搅拌的速率为500rpm，所述离心纯化次数为3次，每次离心纯化的速率为10000rpm，时间为10min；
步骤107、将所述负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的牛血清白蛋白纳米颗粒重悬于5mL水中，得到负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的牛血清白蛋白纳米颗粒分散液；
步骤二、提取丝素蛋白，具体包括：
步骤201、将50g蚕茧置于2000g质量百分含量为0.5wt％的碳酸钠溶液中，95℃煮沸30min以进行精细脱胶，得到脱胶后体系；
步骤202、过滤所述脱胶后体系，得到蚕丝，将所述蚕丝用蒸馏水清洗3-5次后置于60℃烘箱中干燥，得到干燥蚕丝；
步骤203、将所述干燥蚕丝溶解于浓度为9.3M的LiBr溶液中，得到蚕丝浓度为0.1g/mL的蚕丝体系，将所述蚕丝体系于60℃水浴条件下溶解 2h，得到溶解后体系；
步骤204、用纱布过滤所述溶解后体系，将过滤后所得固相装入7KDa 的透析袋，以蒸馏水为透析剂透析3d，冻干，得到丝素蛋白；所述冻干的温度为-60℃，时间为3d；
步骤三、制备可注射水凝胶，具体包括：
步骤301、将所述丝素蛋白溶解于去离子水中，得到质量百分含量为 5％丝素蛋白溶液；
步骤302、将1mL所述丝素蛋白溶液、220μg E7肽溶液、30μL所述负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的牛血清白蛋白纳米颗粒分散液、 25μL 1000U/ml辣根过氧化物酶水溶液和25μL 4mg/mL过氧化氢溶液混合，得到用于软骨损伤修复的可注射水凝胶，所述用于软骨损伤修复的可注射水凝胶在上述体系混合后静置5min即可成胶；所述E7肽溶液为将 200μg E7肽溶解于20μL H2O，所述E7肽溶液中E7肽的质量百分含量为 90wt％，所述E7肽为EPLQLKM，购买自丹港生物科技有限公司。
本实施例的用于软骨损伤修复的可注射水凝胶性能与实施例基本一致。
实施例3
本实施例提供用于软骨损伤修复的可注射水凝胶的制备方法，包括：
步骤一、提供负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的牛血清白蛋白纳米颗粒分散液，具体包括：
步骤101、将0.1g牛血清白蛋白(BSA)溶解于5ml水中，调节pH 值至8.2，得到牛血清白蛋白水溶液；
步骤102、将所述牛血清白蛋白水溶液超声处理15min，然后在室温条件下以500rpm的转速搅拌10min，得到搅拌后牛血清白蛋白水溶液；
步骤103、将5mg 2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸(KGN)溶解于 1ml无水乙醇中，得到KGN溶液；
步骤104、将所述KGN溶液逐滴加入到所述搅拌后牛血清白蛋白水溶液中，搅拌30min，得到混合体系；
步骤105、将59ml无水乙醇以1.5mL/min～2.0mL/min的速率连续加入到所述混合体系中，得到浑浊体系；
步骤106、向所述浑浊体系中加入125μL质量百分含量为8wt％的戊二醛溶液，搅拌24h后，离心纯化，得到负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰) 苯甲酸的牛血清白蛋白纳米颗粒；搅拌的速率为800rpm，所述离心纯化次数为3次，每次离心纯化的速率为10000rpm，时间为10min；
步骤107、将所述负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的牛血清白蛋白纳米颗粒重悬于5mL水中，得到负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的牛血清白蛋白纳米颗粒分散液；
步骤二、提取丝素蛋白，具体包括：
步骤201、将50g蚕茧置于2000g质量百分含量为0.5wt％的碳酸钠溶液中，95℃煮沸30min以进行精细脱胶，得到脱胶后体系；
步骤202、过滤所述脱胶后体系，得到蚕丝，将所述蚕丝用蒸馏水清洗3-5次后置于60℃烘箱中干燥，得到干燥蚕丝；
步骤203、将所述干燥蚕丝溶解于浓度为9.3M的LiBr溶液中，得到蚕丝浓度为0.1g/mL的蚕丝体系，将所述蚕丝体系于60℃水浴条件下溶解 2h，得到溶解后体系；
步骤204、用纱布过滤所述溶解后体系，将过滤后所得固相装入7KDa 的透析袋，以蒸馏水为透析剂透析3d，冻干，得到丝素蛋白；所述冻干的温度为-60℃，时间为3d；
步骤三、制备可注射水凝胶，具体包括：
步骤301、将所述丝素蛋白溶解于去离子水中，得到质量百分含量为 2.5％丝素蛋白溶液；
步骤302、将1mL所述丝素蛋白溶液、220μg E7肽溶液、30μL所述负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的牛血清白蛋白纳米颗粒分散液、 25μL 1000U/ml辣根过氧化物酶水溶液和25μL 4mg/mL过氧化氢溶液混合，得到用于软骨损伤修复的可注射水凝胶，所述用于软骨损伤修复的可注射水凝胶在上述体系混合后静置7min即可成胶；所述E7肽溶液为将 200μg E7肽溶解于20μL H2O，所述E7肽溶液中E7肽的质量百分含量为 90wt％，所述E7肽为EPLQLKM，购买自丹港生物科技有限公司。
本实施例的用于软骨损伤修复的可注射水凝胶性能与实施例基本一致。
实施例4
本实施例提供一种用于软骨损伤修复的可注射水凝胶的制备方法，包括：
步骤一、提供负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的牛血清白蛋白纳米颗粒分散液，具体包括：
步骤101、将0.1g牛血清白蛋白(BSA)溶解于5mL水中，调节pH 值至8.2，得到牛血清白蛋白水溶液；
步骤102、将所述牛血清白蛋白水溶液超声处理15min，然后在室温条件下以600rpm的转速搅拌10min，得到搅拌后牛血清白蛋白水溶液；
步骤103、将1mg 2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸(KGN)溶解于 1ml无水乙醇中，得到KGN溶液；
步骤104、将所述KGN溶液逐滴加入到所述搅拌后牛血清白蛋白水溶液中，搅拌30min，得到混合体系；
步骤105、将39mL无水乙醇以1.5mL/min～2.0mL/min的速率连续加入到所述混合体系中，得到浑浊体系；
步骤106、向所述浑浊体系中加入125μL质量百分含量为9wt％的戊二醛溶液，搅拌48h后，离心纯化，得到负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰) 苯甲酸的牛血清白蛋白纳米颗粒；搅拌的速率为500rpm，所述离心纯化次数为3次，每次离心纯化的速率为10000rpm，时间为10min；
步骤107、将所述负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的牛血清白蛋白纳米颗粒重悬于5mL水中，得到负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的牛血清白蛋白纳米颗粒分散液；
步骤二、提取丝素蛋白，具体包括：
步骤201、将50g蚕茧置于3000g质量百分含量为0.6wt％的碳酸钠溶液中，95℃煮沸30min进行精细脱胶，得到脱胶后体系；
步骤202、过滤所述脱胶后体系，得到蚕丝，将所述蚕丝用蒸馏水清洗5次后置于60℃烘箱中干燥，得到干燥蚕丝；
步骤203、将所述干燥蚕丝溶解于浓度为9.5M的LiBr溶液中，得到蚕丝浓度为0.1g/mL的蚕丝体系，将所述蚕丝体系于60℃水浴条件下溶解 2h，得到溶解后体系；
步骤204、用纱布过滤所述溶解后体系，将过滤后所得固相装入7KDa 的透析袋，以蒸馏水为透析剂透析3d，冻干，得到丝素蛋白；所述冻干的温度为-60℃，时间为3d；
步骤三、制备可注射水凝胶，具体包括：
步骤301、将所述丝素蛋白溶解于去离子水中，得到质量百分含量为 5％的丝素蛋白溶液；
步骤302、将1mL所述丝素蛋白溶液、220μg E7肽溶液、30μL所述负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的牛血清白蛋白纳米颗粒分散液、 25μL 1000U/ml辣根过氧化物酶水溶液和25μL 4mg/mL过氧化氢溶液混合，得到用于软骨损伤修复的可注射水凝胶，所述用于软骨损伤修复的可注射水凝胶在上述体系混合后静置5min即可成胶；所述E7肽溶液为将 200μg E7肽溶解于20μL H2O，所述E7肽溶液中E7肽的质量百分含量为 90wt％。
本实施例的用于软骨损伤修复的可注射水凝胶性能与实施例基本一致。
实施例5
本实施例提供一种用于软骨损伤修复的可注射水凝胶的制备方法，包括：
步骤一、提供负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的牛血清白蛋白纳米颗粒分散液，具体包括：
步骤101、将0.1g牛血清白蛋白(BSA)溶解于5ml水中，调节pH 值至8.2，得到牛血清白蛋白水溶液；
步骤102、将所述牛血清白蛋白水溶液超声处理15min，然后在室温条件下以800rpm的转速搅拌10min，得到搅拌后牛血清白蛋白水溶液；
步骤103、将2mg 2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸(KGN)溶解于 1ml无水乙醇中，得到KGN溶液；
步骤104、将所述KGN溶液逐滴加入到所述搅拌后牛血清白蛋白水溶液中，搅拌30min，得到混合体系；
步骤105、将59mL无水乙醇以1.5mL/min～2.0mL/min的速率连续加入到所述混合体系中，得到浑浊体系；
步骤106、向所述浑浊体系中加入125μL质量百分含量为10wt％的戊二醛溶液，搅拌36h后，离心纯化，得到负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰) 苯甲酸的牛血清白蛋白纳米颗粒；搅拌的速率为800rpm，所述离心纯化次数为3次，每次离心纯化的速率为10000rpm，时间为10min；
步骤107、将所述负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的牛血清白蛋白纳米颗粒重悬于5mL水中，得到负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的牛血清白蛋白纳米颗粒分散液；
步骤二、提取丝素蛋白，具体包括：
步骤201、将50g蚕茧置于2500g质量百分含量为0.8wt％的碳酸钠溶液中，95℃煮沸30min进行精细脱胶，得到脱胶后体系；
步骤202、过滤所述脱胶后体系，得到蚕丝，将所述蚕丝用蒸馏水清洗3次后置于60℃烘箱中干燥，得到干燥蚕丝；
步骤203、将所述干燥蚕丝溶解于浓度为9.8M的LiBr溶液中，得到蚕丝浓度为0.1g/mL的蚕丝体系，将所述蚕丝体系于60℃水浴条件下溶解 2h，得到溶解后体系；
步骤204、用纱布过滤所述溶解后体系，将过滤后所得固相装入7KDa 的透析袋，以蒸馏水为透析剂透析3d，冻干，得到丝素蛋白；所述冻干的温度为-60℃，时间为3d；
步骤三、制备可注射水凝胶，具体包括：
步骤301、将所述丝素蛋白溶解于去离子水中，得到质量百分含量为 2.5％的丝素蛋白溶液；
步骤302、将1mL所述丝素蛋白溶液、220μg E7肽溶液、30μL所述负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的牛血清白蛋白纳米颗粒分散液、 25μL 1000U/ml辣根过氧化物酶水溶液和25μL 4mg/mL过氧化氢溶液混合，得到用于软骨损伤修复的可注射水凝胶，所述用于软骨损伤修复的可注射水凝胶在上述体系混合后静置7min即可成胶；所述E7肽溶液为将 200μg E7肽溶解于20μL H2O，所述E7肽溶液中E7肽的质量百分含量为 90wt％。
本实施例的用于软骨损伤修复的可注射水凝胶性能与实施例基本一致。
性能评价
图1为实施例1步骤一负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的牛血清白蛋白纳米颗粒的SEM图，根据图1可知，负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的牛血清白蛋白纳米颗粒外形呈球形，表面光滑。
图2为实施例1步骤一负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的牛血清白蛋白纳米颗粒的DLS图，测试方法为用纳米粒度及Zeta电位分析仪进行测试。根据图2可见，上述纳米颗粒的平均尺寸为409.8nm，分散性指数为0.119。
图3为实施例1中可注射水凝胶的可注射性的示意图，其测试方法包括：将上述体系溶液混合均匀后，通过10ml注射器针头注射到去离子水中。根据图 3可知，制备的水凝胶具有可注射性。
图4为实施例1中可注射水凝胶的细胞毒性实验结果图，测试方法包括：将实施例1的可注射水凝胶放进50mL无菌离心管中，加入DMEM培养液，得到可注射水凝胶浓度为0.1g/mL的培养体系，将所述培养体系置于37℃的含有5％CO2的无菌培养箱中培养3天，得到水凝胶浸提液；将在96孔板中培养24h 的hBMSCs细胞中原有DMEM培养液去除，加入上述水凝胶浸提液，分别培养24、48或72h，对照组为DMEM培养液，培养相应时间后在每个孔中加50μL的MTT，放置2h～4h，吸去孔中所有溶液，加入150μLDMSO，于490nm下在酶标仪中测定吸光度，根据OD值计算细胞存活率。结果表明，添加有本发明可注射水凝胶的细胞存活率均高于100％，基于ISO标准(ISO 10993.12-25) 可知，本发明的可注射水凝胶细胞毒性为0级，具有良好的生物相容性，可用于生物体。
图5为实施例1中可注射水凝胶的细胞迁移实验结果图，测试方法包括：将实施例1中可注射水凝胶置于50mL无菌离心管中，加入DMEM培养液，得到可注射水凝胶浓度为0.1g/mL的培养体系，将所述培养体系置于37℃的含有 5％CO2的无菌培养箱中培养3天，得到水凝胶浸提液；将hBMSCs细胞在6 孔板中培养24h，使细胞贴壁，使用200μL枪头尖端底部进行划痕，然后利用 PBS清洗2次，吸出原有DMEM培养液，加入上述水凝胶浸提液培养24h，对照组为DMEM培养液，细胞培养0h和24h，用倒置显微镜拍照并用Image J对迁移区域进行量化。
实验结果表明，添加有本发明可注射水凝胶的细胞迁移率高于40％，表明本发明可注射水凝胶能促进细胞迁移。
图6为实施例1中可注射水凝胶的促软骨分化实验结果图，测试方法包括：将实施例1中可注射水凝胶置于50mL无菌离心管中，加入DMEM培养液，得到可注射水凝胶浓度为0.1g/mL的培养体系，将所述培养体系置于37℃的含有 5％CO2的无菌培养箱中培养3天，得到水凝胶浸提液；将hBMSCs细胞在24 孔板中培养24h，使细胞贴壁，吸出原有DMEM培养液，加入上述水凝胶浸提液培养14d，对照组为DMEM培养液，培养结束后，使用甲苯胺蓝染色确定 hBMSCs的成软骨分化的效果。相较于对照组，实验结果表明，添加有本发明可注射水凝胶能够促进hBMSCs向软骨细胞分化。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何限制，凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。
Claims (9)
1.一种用于软骨损伤修复的可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，包括：
步骤一、提供负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的牛血清白蛋白纳米颗粒，具体包括：
步骤101、将2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸溶液滴加到牛血清白蛋白溶液中，得到混合体系；
步骤102、将无水乙醇连续加入到所述混合体系中，得到浑浊体系；
步骤103、向所述浑浊体系中加入戊二醛溶液，搅拌，离心纯化，得到负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的牛血清白蛋白纳米颗粒；
步骤二、提取丝素蛋白，具体包括：将经精细脱胶和干燥后蚕茧溶解于LiBr溶液中，得到蚕丝体系，将所述蚕丝体系经水浴溶解、过滤和透析冻干，得到丝素蛋白；所述精细脱胶为将蚕茧置于碳酸钠溶液中煮沸；所述碳酸钠溶液的质量为蚕茧质量的40倍~60倍，所述碳酸钠溶液的质量百分含量为0.5%~0.8%；
步骤三、制备可注射水凝胶，具体包括：将丝素蛋白溶液、E7肽溶液、负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的牛血清白蛋白纳米颗粒分散液、辣根过氧化物酶水溶液和过氧化氢溶液混合，得到用于软骨损伤修复的可注射水凝胶。
2.根据权利要求1所述的用于软骨损伤修复的可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤101中，所述混合体系中2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的质量为牛血清白蛋白质量的0.01倍~0.05倍；所述2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸溶液为2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸和无水乙醇的混合溶液，所述牛血清白蛋白溶液为牛血清白蛋白的水溶液。
3.根据权利要求1所述的用于软骨损伤修复的可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤102中，将无水乙醇连续加入到所述混合体系中为以1.5mL/min~2.0mL/min的速率进行加入。
4.根据权利要求1所述的用于软骨损伤修复的可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤102中，所述无水乙醇的体积为牛血清白蛋白质量的190倍~590倍，所述无水乙醇体积的单位为mL, 牛血清白蛋白质量的单位为g。
5.根据权利要求1所述的用于软骨损伤修复的可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤103中，所述戊二醛溶液的质量百分含量为8%~10%，所述戊二醛溶液的体积为牛血清白蛋白质量的1250倍，所述戊二醛溶液体积为μL，牛血清白蛋白质量的单位为g；所述搅拌的时间为24h~48h。
6.根据权利要求1所述的用于软骨损伤修复的可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤二所述LiBr溶液浓度为9.3M~9.8M。
7.根据权利要求1所述的用于软骨损伤修复的可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤三中，所述丝素蛋白溶液为丝素蛋白溶解于去离子水中得到的丝素蛋白溶液，所述丝素蛋白溶液中丝素蛋白的质量百分含量为2.5%~10%；所述丝素蛋白质量为E7肽质量的125倍~500倍。
8.根据权利要求1所述的用于软骨损伤修复的可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤三中，所述负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的牛血清白蛋白纳米颗粒分散液为负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的牛血清白蛋白纳米颗粒重悬于水中得到的负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的牛血清白蛋白纳米颗粒分散液。
9.根据权利要求1所述的用于软骨损伤修复的可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤三中，所述丝素蛋白溶液体积、负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的牛血清白蛋白纳米颗粒分散液体积、辣根过氧化物酶水溶液体积和过氧化氢溶液体积的比值为200:6:5:5。
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