KR20090038063A

KR20090038063A - 피부미용 및 성형을 위한 지방조직에서의 세포 분리 및이의 사용 방법

Info

Publication number: KR20090038063A
Application number: KR1020070103341A
Authority: KR
Inventors: 이영섭; 이은종
Original assignee: 이영섭; 이은종
Priority date: 2007-10-15
Filing date: 2007-10-15
Publication date: 2009-04-20

Abstract

본 발명은 지방흡입술에 의해 얻어진 지방 조직을 콜라게네이즈가 함유된 용액이 담겨있는 용기에 넣고 교반, 원심분리하여 단일지방세포와 지방전구세포, 줄기세포, 혈관내피세포, 근육세포 및/또는 섬유아세포를 포함하는 피부 미용 또는 성형용 조성물을 얻고 이를 이식하는 방법을 제공한다.

지방조직, 세포분리, 피부미용, 성형

Description

피부미용 및 성형을 위한 지방조직에서의 세포 분리 및 이의 사용 방법{A method for isolating cells from adipose tissues for using in the esthetic or plastic surgery}

본 발명은 지방흡입술에 의해 얻어진 지방 조직을 단일지방세포와 지방전구세포, 줄기세포, 혈관내피세포, 근육세포 및/또는 섬유아세포를 포함하는 피부 미용 또는 성형용 조성물을 얻고 이를 이식하는 방법에 관한 발명이다.

지방조직에서 유래한 재생능력을 가진 세포들에는 지방전구세포, 줄기세포, 혈관내피세포, 근육세포 및 섬유아세포 등이 포함되어 있다. 지방 조직이 줄기세포의 근원이 될 수 있다는 사실이 최근 보고되었으며(Zuk et al., 2001), 이러한 지방조직 유래 줄기세포들이 성장인자 또는 배양조건의 최적화 등 인위적인 외부조건을 설정해 줌으로써 근육세포 계열로 분화하거나(Lee, W.-C.C et al., 2006), 토끼의 두개관 복원에 있어서 골형성능을 보여준다는 논문(Dudas, J.R. et. al., 2006) 등 지방조직 유래의 줄기세포들의 다양한 분화능력에 대한 연구결과들이 지속적으 로 나오고 있다. 또한 지방조직에서 유래된 분화가 가능한 줄기세포에 대한 특허(US 6,777,231) 및 당뇨병치료 등을 목적으로 선구지방세포를 지방세포로 분화하는 특허(US 6,248,791, US 5,854,292) 등 지방조직 내의 줄기세포에 대한 특허도 다수 등록되어 있다.

지방이식은 신체의 어느 한 부위로부터 추출한 지방을 다른 신체부위에 재주입하는 시술법으로(Coleman, 1995) 각종 신체 표면의 주름 제거, 특정 신체부위의 융비 등 미용성형의 효과를 보기위한 시술법으로 시행되고 있으며(Bircoll et al., 1987), 윤리적인 문제가 없고, 다량을 추출할 수 있으며, 국소마취 하에 채취할 수 있고, 환자에게 최소한의 고통을 줄수 있으며 축적된 노하우와 발전된 기구들을 통해 안전하게 수행될 수 있다(Patricia et al., 2001). 아울러 지방조직은 골수나 피부, 근육, 간 및 뇌와 같은 성체줄기세포의 근원이 될 수 있는 조직들과 비교하여 볼 때 비교적 다량으로 수확하기 용이하다(Commons et al., 2001).

그러나 기존의 지방이식법은 지방추출에서 수획한 세포군의 다양성으로 인하여 재생성이 불량한 세포들까지 포함된 정제되지 않은 조성물이 체내에 주입되어 지질괴사성 위포낭(liponecrotic pseudocyst)이 생겨나고 이로 인하여 주입부위에 미세부위 석회화 (microcalcification)등의 부작용이 발생할 가능성이 있었다(Castello et al., 1999). 또한 지방을 채취한 신체부위와 채취량에 따라 생착률이 차이가 난다는 보고들이 언급되었으며, 채취 및 주입방법, 주입전 베타메다손(betametasone)이나 인슐린(insulin)등의 약물처리 등에 의한 생착률 개선방법에 대한 제안들이 계속 되어왔다.

본원 발명자는 지방이식 등에 사용하기 위해 인체로부터 분리한 지방조직으로부터 지방세포와 다분화능을 가진 재생성 세포군을 복잡한 시스템을 가동하지 않고 시술현장에서 간편하게 분리, 정제하는 방법을 개발함으로써, 종래에 분리, 정제 과정 없이 채취한 지방조직 전체를 이식할 경우 발생할 수 있는 부작용 등을 감소시킬 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 지방조직으로부터 지방세포 및 재생성 세포군을 간편하게 분리, 정제하는 방법 및 상기 정제된 세포군을 피부미용 또는 성형의 목적으로 사용하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명은 지방조직으로부터 지방세포와 재생성 세포군을 분리, 정제하는 방법 및 이와 같이 분리된 지방세포와 재생성 세포군을 주름제거 등의 피부미용이나 융비술 같은 외과적 성형 등에 사용하는 방법에 관한 것이다.

구체적으로, 본 발명은 성형외과 등 병원에서 지방흡입 및 이식술을 시행하기 위해 복잡한 시스템을 가동시키지 않고 채취된 지방조직을 콜라게네이즈 등이 함유된 지방조직 분해용액이 포함된 백(bag) 또는 병(bottle, jar) 내에서 처리함으로써 간편하게 지방조직으로부터 재생성 세포군을 분리 정제하는 것을 포함하는 방법이다.

본 발명에서, “지방조직”은 결체조직의 하나로 지방세포와 섬유로 이루어진 결합조직이다. 지방세포는 보통 공모양으로 일반 세포에 비해 50-100um정도로 크며, 각 지방세포는 섬유로 싸여 있고 세포 사이에는 모세혈관이 고밀도로 분포한다. 이러한 지방조직은 피하 ·대망막(大網膜), 장간막, 특히 신장, 심장표면, 관절 주위, 및 장골 속에서 많이 볼 수 있으며, 저장 영양물로서 뿐만 아니라 에너지원으로도 쓰이며 열의 손실을 막기도 하고 기관(器官)의 주위에서 보호 기능을 갖기도 한다. 그 밖에 조직 사이의 공간을 채우고 혈관·신경 등의 구조물을 지탱하는 기능도 가지고 있다.

본 발명에서, “재생성 세포군”은 다분화능(totipotency)를 가지고 있는 세포들, 예를 들어 조혈모세포(HSC; Hematopoietic stem cell), 지방조직유래 줄기세포(ASC; Adipose-derived stem cell), 혈관내막세포(Vescular endothelial cell), 섬유아세포 (Fibroblast) 등의 세포들을 총칭하는 용어로서, 바람직하게는 단일지방세포, 지방전구세포, 줄기세포, 혈관내피세포, 근육세포, 섬유아세포를 함유하는 세포군락을 의미한다.

본 발명에서, “지방흡입술”은 미용을 위한 성형외과시술의 일종으로, 여러 신체 부위에서 지방을 제거하는 시술로서, 시술하는 신체 부위로는 복부, 허벅지, 둔부, 팔 등을 포함한 전신이 가능한 시술을 칭한다. 지방의 흡입은 카눌라(cannula)를 통해 주사기의 음압이나 흡입기(aspirator)를 이용하여 수행된다.

본 발명에서, “지방삽입술”은 지방흡입술을 이용하여 채취된 지방을 주름 부위나 반흔 뿐만 아니라 융비술을 원하는 분위에 다양한 층(근육층, 피하지방층, 진피층 등)에 주입하는 것을 말한다.

본 발명에서, “융비술”은 분리된 지방세포 및 재생성 세포군을 함몰부위의 융비를 위해 주사하는 방법으로, 이마, 뺨, 엉덩이 등의 함몰이나 낮은 코나 작은 턱 등의 융비를 위해 또한 함몰된 반흔에 주사하여 융기시키는 것을 말한다.

종래기술은 지방흡입술에 의해 추출된 지방조직을 별도의 처리를 하지 않거나 간단한 세척 단계만을 거친후 그대로 인체 등에 주입하여 시술하였는데, 이렇게 주입된 지방조직에는 재생성이 불량한 세포들과 혈액세포들이 다량 포함되어 있으며, 이로 인하여 지질괴사성 위포낭 또는 미세부위 석회화 등의 이상조직이 형성되는 등의 부작용이 발생할 가능성이 있었다. 한편, 분리된 지방조직의 세척, 조직해리 등의 공정을 일괄적으로 수행할 수 있는 고도의 복합적이고 밀폐된 챔버 시스템을 이용한 처리방법(대한민국 공개특허 10-2007-0038538)도 있으나 실제로 임상 현장에 적용하기에는 그 규모면에서 무리가 있다.

따라서, 본 발명에서는 지방이식 등에 사용하기 위해 분리된 지방조직을 콜라게네이즈 등이 함유된 지방조직 분해용액이 포함된 백(bag) 또는 병(bottle, jar) 내에서 처리하여 간편하게 재생성 세포군을 분리 정제함으로써, 종래의 기술에 따른 부작용을 줄이고, 고도의 복합적인 장비를 사용하지 않고도 실제 수술실에서 간편하게 실시 가능한 지방조직으로부터 지방세포와 재생성 세포군을 분리하는 방법을 개발하였다.

구체적으로, 본 발명은 (a) 적출된 지방조직을 세척하는 단계, (b) 상기 세척한 지방조직을 배양액(DMEM, DMEM/F12, IMDM 또는 RPMI1640) 또는 하트만덱스 용액, 콜라게네이즈, 및 페놀레드를 포함하는 지방조직 분해용액이 담긴 용기에서 배양하여 지방조직을 분해하는 단계, 및 (c) 상기 용기를 원심분리하여 재생성 세포군을 분리하는 단계를 포함한다.

보다 구체적으로, 상기방법은 채취된 지방조직의 세척 및 효소반응 정지에 사용하고자, 미리 환자의 자가혈청을 준비하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일반적으로, 조직의 세척 및 효소반응에는 우태아혈청(FBS, Fetal Bovine Serum) 또는 우혈청(Fetal Calf Serum) 등 소에서 유래된 혈청을 사용할 수 있는데, 이러한 소유래의 물질에는 광우병 바이러스 등을 비롯한 오염원을 포함하고 있을 가능성이 있으므로, 본 발명에서는 환자 본인의 자가혈청을 사용하였다. 환자의 자가혈청은 처리될 지방조직의 양에 비해 혈청이 5%의 비율로 첨가 되도록 계산하여 필요한 혈청량의 4배 이상의 혈액을 채혈하고 상온에서 원심분리한 후, 사용하기 전까지 4℃에서 보관하는 방법으로 준비될 수 있다.

상기 적출된 지방조직을 세척하는 단계는 지방흡입술 등으로 적출한 지방조직을 혈액 등의 불순물 제거를 위해 생리식염수 또는 환자의 자가혈청을 포함하는 생리식염수로 세척하는 단계를 포함한다. 상기 지방조직 분해용액은 콜라게네이즈 외에도 하트만덱스 및 페놀레드 등을 더 포함할 수 있다. 이들 물질의 농도는 당업계에서 지방조직으로부터 세포를 분리하게 위해 사용하는 공지된 적정농도로 사용할 수 있으며, 바람직하게 분해할 지방조직에 비해 1~5배의 부피비로 사용한다.

지방조직을 분해용액이 담긴 용기에서 배양하는 단계는, 바람직하게 상기 용기를 교반하는 것을 포함한다. 상기 용기는 바람직하게는 백(bag) 또는 병(bottle, jar)이며, 이를 교반하는 경우 온도는 30~38℃, 바람직하게는 31~37℃, 더욱 바람직하게는 35~37℃에서 10~120분간, 바람직하게는 30분~100분, 더욱 바람직하게는 60분~90분간 배양기에서 교반기로 교반하면서 배양한다. 배양이 끝난 후 백(bag) 또는 병(jar, bottle)을 500~2000rpm, 바람직하게는 700~1500rpm, 더욱 바람직하게는 1000~1200rpm(200xg)의 속도로 원심분리한다. 원심분리 된 백(bag) 또는 병(jar, bottle)에 환자로부터 채취한 자가혈청을 첨가하여 효소반응을 정지시킨 후, 상층액과 펠렛을 조심스럽게 수획하여 각각을 새로운 용기에 담고 생리식염수로 세척함으로써 재생성 세포군을 수획할 수 있다.

한편, 본 발명에서 사용되는 백(bag)은 advanced scientifics사의 PVC 재질 의 것을 사용할 수 있으며, 병(jar, bottle)을 사용하는 경우, nalgene사의 폴리카보네이트, PE 또는 PVC 병을 사용할 수 있다.

이하에서 본 발명을 실시예를 통해 보다 구체적으로 설명한다. 본 발명은 후술하는 실시예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명에 의한 효과는 본 발명의 실시예에 기재된 것에 의해 한정되지 않는다.

본 발명에서 기술한 분리방법에 의하여 불순성분물질이 제거된 단일지방세포, 지방전구세포, 줄기세포, 혈관내피세포, 근육세포, 및 섬유아세포를 포함하는 조성물을 신체의 모든 주름, 바람직하게는 이마, 코 옆 팔자주름, 볼, 목주름 등 주름부위에 직접 주입하여 절개에 의한 반흔이나 조직손상 등의 부작용없이 원하는 부위에 직접 주사할 수 있다.

실시예 1. 지방조직에서 재생성 세포군의 분리

1-1. 환자 자가혈청 채취

추후 채취하는 지방조직의 세척 및 효소반응 정지 등에 사용하기 위하여 환자 자신의 혈액에서 혈청을 채취하여 냉장보관후 사용하였다. 혈청의 채취방법은 다음과 같이 수행하였다. 처리될 지방 양에 혈청이 5%가 되도록 계산하여 필 요한 혈청량의 4배 이상의 혈액을 채혈하였으며, 우선, 채혈관(VACUETTE, greiner bio-one)을 알코올솜으로 닦은후, 채혈관의 고무마개를 보비돈볼, 알코올볼, 코튼볼의 순으로 소독하였다.

환자를 채혈대에서 편안한 마음으로 준비할 수 있도록 안내한 후, 채혈과정을 설명하고, 홀더에 진공 주사바늘(vacuum needle)과 스켈프 주사바늘(Scalp needle)을 연결하여 준비하였다. 대상자의 팔에 토니켓을 묶은 후 채혈하기 위한 적절한 부위를 선택하였는데, 이때, 팔은 심장보다 아래에 위치하도록 하였다.

알코올솜으로 채혈 부위를 중앙에서 바깥쪽으로 원을 그리며 소독을 3회 이상 시행해서 소독한 부위가 무균상태가 유지되도록 한후, 알코올이 건조된 후 약 15도 각도로 바늘의 사면을 위로 한 채 1cm정도 삽입하여 각 채혈관에 약 7ml씩 채혈하였다. 채혈이 끝나면 3분이상 알코올솜으로 채혈 부위를 눌러주며 팔의 위치는 심장보다 위에 있도록 하였다.

채혈관은 혈액이 잘 섞이도록 5~10회 돌리면서 섞어주었고, 채혈관을 알코올솜으로 다시 한번 닦고 1800xg, 20℃에서 20분동안 원심분리한 후, 채혈관에서 적혈구가 포함되지 않도록 혈청을 조심스럽게 채취하였다. 채취된 혈청은 사용하기 전까지 4℃ 냉장고에서 보관하였다.

1-2. 지방조직 적출

지방이식을 하고자 하는 환자로부터 지방을 채취하고자 하는 부위를 베타딘액으로 소독하고 알코올 스폰지로 닦아내었다. 2% 리도카인을 사용하여 시술부위를 마취하며 피하지방층에는 튜메센트 용액(tumescent solution, 조성: 생리식염수 1리터에 2% 리도카인 40ml, 에피네프린 1ml, 소디움 바이카보네이트 20ml)을 주사하여 마취하였다. 30분 경과후, 약 2mm정도 절개후, 튜메센트 용액을 채취될 지방량의 3배이상을 주입한 후 약 10분간 대기하였다. 10분 경과후 절개부위를 통해 적절한 케뉼라와 주사기의 음압을 통하여 지방조직을 채취하였고, 지방채취후 절개부위를 소독 하고 드레싱을 시행하였다. 주사기에 담겨있는 지방조직은 소독한 운반용 박스에 담아 그 즉시 세포분리시설로 운반하였다.

1-3. 세척 및 불순물 제거

주사기에 담겨있는 지방조직은 원심분리 전 주사기를 약 2~3회 상하로 흔들어 튜메센트 용액과 지방조직이 잘 섞이도록 하였다. 상기와 같이 잘 섞은 지방조직을 코니칼 튜브(conical tube)에 넣고 지방조직 부피의 2배 내지 3배 생리 식염수에 2%의 환자 자가혈청을 첨가하여 부유하고, 2내지 3회 교반하여 원심분리기(vision scientific, VS-550)를 이용하여 4℃, 200xg에서 5분간 원침한 후 상층액을 제거하였다. 상기의 과정을 2회 내지 3회 반복하여 적혈구를 포함한 지방조직 내의 불순물을 제거하였다.

1-4. 지방조직 효소처리

상기의 실시예 1-3에 의하여 세척된 지방조직을 주사기를 이용하여 아 디포믹스 I(adipomix I, 하트만덱스 용액 50ml, 콜라게네이즈 타입 I 38mg, 페놀 레드 0.75mg)이 들어있는 백 또는 병에 주입하였다. 50ml의 용액에서 반응할 수 있는 지방량은 10ml 내지 50ml이다.

아디포믹스 I과 지방조직이 잘 섞일 수 있도록 2~3회 흔들어 준 후, 37℃의 반응 배양기(hybridization incubator, Combi-V12, FINEPCR)에서 30~40분 동안 교반하며 반응시켰다.

1-5. 효소반응 정지

30~40분 경과후, 조직이 용해된 것을 육안으로 확인하고, 상기 실시예 1-1의 방법으로 제조하여 4℃ 냉장고에 보관한 환자 자가혈청을 상기 반응액의 5~10%의 부피로 주입하여 아디포믹스 I 내의 콜라게네이즈 타입 I 효소의 반응을 정지시켰다.

1-6. 지방세포의 분리

수혈세트(수혈세트-S, 두원메디텍)를 상기의 아디포믹스 I 및 지방조직이 담긴 백 또는 병에 삽입한 후 수혈세트를 주사기에 연결하여 수용액을 제거한 후 조심스럽게 지방층을 주사기로 빼었다.

주사기에 들어있는 지방세포를 아디포믹스 II(멸균 생리식염수)가 들어있는 병에 넣은후, 잘 섞일 수 있도록 2~3회 흔들어 준후, 병의 고무마개부분이 아래로 향하게 하여 원심분리기에 넣고 4℃, 180xg에서 5분간 원심분리를 시행하였다. 원 심분리가 끝나면, 18G의 50cc 주사기를 이용하여 하층부의 수용액을 제거하고, 새로운 10cc 주사기를 이용하여 상층부의 처리된 지방조직을 빼내었다.

실시예 2. 지방세포 조성물의 주입방법

실시예 1의 과정을 통하여 얻어진 지방조직을 성형 및 미용 목적으로 주입하였다.

기존의 지방세포의 주입방법은 최소 21G 특수고안된 지방세포 주입바늘을 이용하여 주입하였으며 주입시 작은 절개를 한후에 지방이식을 시행하였으나, 본 발명을 통하여 처리된 지방은 30G 4mm 길이의 주사바늘을 사용하여 필요한 부분에 직접 주입하므로, 절개에 의한 반흔이나 조직손상 등의 부작용 없이 원하는 부위에 직접 주사할 수 있었다.

실시예 3. 아디포믹스(Adipomix)를 이용하여 분리된 지방세포의 유세포 분석

상기의 실시예 1에서와 같은 방법으로 처리된 지방세포의 특성을 확인하기 위하여 유세포 분석을 실시하였다. 유세포 분석에 사용된 마커로는 지방세포의 특이적 항원인 페릴리펜(perilipin, Sigma-Aldrich, Cat.#P1998)과 신경세포 마커인 Tuj-1 (Neuromics. Cat.#MO15013-100), 혈관세포 마커인 CD31(Chemicon Cat.#CBL468F), Tie-2(R&D Systems, Cat.#FAB3131A)등이다.

우선, 상기의 실시예 1에서와 같은 방법으로 처리된 지방세포와 대조 군으로서 기질 혈관세포 분획(SVF, Stromal vascular fraction)을 각각 15mL 폴리프로필렌 튜브에 검출하고자 하는 항체의 이름을 표시하고 500ul씩을 분주하였다.

항체를 각 튜브에 1ul씩 첨가하고 약하게 vortex 한 후 상온, 암소에서 1시간 방치하였다. 1시간 경과후, 각 튜브에 수세용액 2mL씩 첨가하고 상온에서 500xg, 5분동안 원심분리 하였다. 상층액을 조심스럽게 따라버린 후, 각 튜브에 인산 완충식염수 200μl씩을 첨가하여 Vortex 한 후 유세포 분석 전까지 4 ℃, 암소에서 보관하였다.

유세포 분석결과, 지방세포의 마커인 페릴리핀(perilipin)은 실시예 1의 방법으로 분리한 지방세포에서 84% 이상으로 발현되었고 기질 혈관세포 분획(SVF)에서는 4% 정도 발현됨을 보였다. 이는 지방전구세포에서 지방세포로 분화하는 과정인 기질 혈관세포 분획(SVF)에서 페릴리핀 마커가 검출되는 것으로 판단된다. 혈관세포 마커인 CD31 및 Tie-2는 지방세포에서보다 SVF에서 많은 양이 발현되는 것을 알 수 있었고, 신경세포 마커인 Tuj-1은 지방세포 및 기질 혈관세포 분획(SVF)에서 적은 양이 발현됨을 본 실험을 통하여 알 수 있었다(도 2참조). 이것은 지방조직에서 아디포믹스를 통하여 지방세포 및 기질 혈관세포 분획(SVF)을 분리하는 것은 지방조직에서 완전한 지방세포를 선별적으로 분리하지 않기 때문에 혈관세포 및 신경세포 마커의 발현이 되는 것으로 판단되며 전자현미경 사진에서와 일치한다고 할 수 있다(도 3 내지 5참조).

실시예 4. 아디포믹스 ( Adipomix ) 처리 전후의 지방세포내 단백질 및 DNA 량 변화

4-1. 단백질 정량

별개의 튜브에 아디포믹스로 처리하기 전 지방조직 5ml, 처리 후 지방세포 5ml 및 기질 혈관세포 분획(SVF)을 담고, 2배 부피의 인산 완충식염수를 넣어서 세척한 후 4℃, 1200rpm에서 5분간 원심분리하였다. 원심분리된 튜브중 지방조직 또는 지방세포가 담긴 튜브에서는 하층액을, 기질 혈관세포 분획(SVF)이 담겨있는 튜브에서는 상층액을 조심스럽게 제거하였다.

라이시스 버퍼 I(lysis buffer I, 20mM 트리스-HCl pH8.0, 0.1M KCl, 5mM EDTA, 0.2% 트리톤 X-100, 0.2mM PMSF, 1 ㎍/㎕ 아프로티닌)을 지방조직에는 5ml, 지방세포에는 3ml, 그리고 기질 혈관세포 분획(SVF)에는 2ml 씩 넣고 잘 섞어준 후, 얼음에서 20분간 반응시킨 다음 12000rpm에서 5분간 원심분리하였다. 원심분리가 끝나면 상층액을 새로운 튜브에 옮기고, 이 상층액에서 총 단백질의 양을 Bio-Rad protein assay kit로 정량하였다. 이때 표준 단백질로는 BSA를 사용하였다.

그 결과, 아디포믹스 처리 전후의 세포내 단백질 량은 거의 변화가 없었다. 따라서 아디포믹스 처리에 따른 단백질의 변성 등은 없음을 알 수 있었다(표 1참조).

총 단백질량(mg)
	1 배치	2 배치	3 배치	평균	배치간 표준편차
지방세포조직(처리전)	70.56132	69.34303	68.98387	69.62941	0.82680
지방세포 (처리후)	66.11583	65.39302	66.39839	65.96908	0.51850
지방세포 (처리후)	3.47978	4.28204	4.28483	4.01555	0.46399
지방세포+SVF(처리후)	69.59561	69.67506	70.68322	69.98463	0.98249
세포당 단백질량(mg/g)
Adipose-tissue(처리전)	14.11226	13.86861	13.79677	13.92588	0.165359
Adipocyte+SVF(처리후)	13.91912	13.93501	14.13664	13.99693	0.196498
처리전후 차이	0.19314	-0.06640	-0.33987	-0.07105

4-2. DNA 정량

상기 실시예 4-1과 동일한 방법으로 시료를 준비하였다. 즉, 별개의 튜브에 아디포믹스로 처리하기 전 지방조직 5ml, 처리 후 지방세포 5ml 및 기질 혈관세포 분획(SVF)을 담고, 2배 부피의 인산 완충식염수를 넣어서 세척 한 후 4℃, 1200rpm에서 5분간 원심분리하였다. 원심분리된 튜브중 지방조직 또는 지방세포가 담긴 튜브에서는 하층액을, 기질 혈관세포 분획SVF)이 담겨있는 튜브에서는 상층액을 조심스럽게 제거하였다.

지방조직에는 5ml, 지방세포에는 3ml, 그리고 기질 혈관세포 분획(SVF)에는 2ml의 라이시스 버퍼 II(lysis buffer II, 20mM 트리스-HCl pH8.0, 0.1M KCl, 5mM EDTA, 0.2% 트리톤 X-100, 0.2mM PMSF)를 넣고 잘 섞어준 후, 얼음에서 최종 농도 50㎍/㎖이 되도록 프로티네이즈 K를 넣었다. 70℃에서 30분간 반응시킨 다음 12000rpm에서 5분간 원심분리 후 상층액을 새로운 튜브에 옮겼다.

DNA 정량은 PicoGreen dsDNA quantitiation kit을 사용하여 여기파장(excitation) 480nm와 방출파장(emission) 520nm에서 DNA를 정량하였다. 이때 포준 DNA로는 lamda DNA를 사용하였다.

그결과, 처리 전후의 DNA 양은 실시예 3-1에서 측정한 단백질의 양과 같이 거의 변화가 없없다(표 2). 이는 약 한시간 효소처리과정 후에도 세포가 증식이 되지 않았다는 것을 보여었다. 지방세포는 최종분화된 세포이기 때문에 더 이상 증식하지 않으며, 중간엽줄기세포는 48-72시간의 분열속도(doubling time)를 갖는 것으로 발표되어, 1시간이내의 처리과정 동안 지방세포 및 기질 혈관세포 분획(SVF)의 증식은 나타나지 않는 것으로 보인다.

총 DNA량(mg)
	1 배치	2 배치	3 배치	평균	배치간 표준편차
지방세포조직(처리전)	2.84	2.94	2.68	2.82	0.13
지방세포 (처리후)	2.05	2.14	2.12	2.10	0.05
지방세포 (처리후)	0.71	1.12	0.69	0.84	0.24
지방세포+SVF(처리후)	2.76	3.26	2.81	2.94	0.29

도 1은 본 발명의 전체 단계를 모식화한 도면이다.

도 2는 지방조직을 아디포믹스로 처리한 후,유세포분석을 통하여 세포특성을 조사한 히스토그램이다. 지방세포에서는 지방세포 특이적인 마커인 페릴리핀(perillipin) 양성인 세포가 84% 이상이었고, 기질 혈관세포 분획(Stromal vescular fraction, SVF)에서는 혈관세포 마커인 Tie2에 양성인 세포가 33% 이상이었다.

도 3 a) 및 b)는 인간의 지방조직을 아디포믹스로 처리하기 전 광학현미경으로 관찰한 사진이다(100배).

도 4 a) 및 b)는 인간의 지방조직을 아디포믹스로 처리한 후 광학현미경으로 관찰한 사진이다(100배).

도 5는 인간의 지방조직을 아디포믹스로 처리한 후 주사전자 현미경으로 관찰한 사진이다(a; 300배, b;1250배).

Claims

(a) 적출된 지방조직을 세척하는 단계,

(b) 상기 세척한 지방조직을 DMEM, DMEM/F12, IMDM 또는 RPMI1640중 하나인 배양액, 또는 하트만덱스 용액, 콜라게네이즈, 및 페놀레드를 포함하는 지방조직 분해용액이 담긴 용기에서 배양하여 지방조직을 분해하는 단계, 및

(c) 상기 용기를 원심분리하여 재생성 세포군을 분리하는 단계를 포함하는, 지방조직으로부터 재생성 세포군을 수획하는 방법.
제 1항에서, 배양후 원심분리 전에 지방조직을 적출한 것과 동일 기원에서 채취된 혈청을 첨가하여 지방조직의 분해 반응을 정지시키는 단계를 더 포함하는 방법.
제 1항에서, 상기 재생성 세포군은 단일지방세포, 지방전구세포, 줄기세포, 혈관내피세포, 근육세포 및 섬유아세포를 포함하는 것인 방법.
제 1항에서, 단계 (b)의 배양은 약 30~38℃에서 10-120분간 교반하여 배양하 는 것인 방법.
제 1항에서, 지방조직 분해용액은 배양액(DMEM, DMEM/F12, IMDM 또는 RPMI1640) 또는 하트만덱스 용액 1ml당, 0.6 내지 0.8mg의 콜라게네이즈 및, 0.01 내지 0.02mg의 페놀레드를 포함하는 용액을 지방조직의 약 1 내지 5배 부피비로 혼합하여 사용하는 것인 방법.
제 1항에서, 지방조직을 세척하는 단계는 생리식염수 또는 지방조직을 적출한 것과 동일한 기원에서 채취된 혈청을 포함하는 생리식염수로 세척하는 것인 방법.