CN112316210B - 一种含大豆蛋白的混合水凝胶及其制备方法和应用、血管化网络支架及其制备方法 - Google Patents

一种含大豆蛋白的混合水凝胶及其制备方法和应用、血管化网络支架及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及组织工程技术领域，尤其涉及一种含大豆蛋白的混合水凝胶及其制备方法和应用、血管化网络支架及其制备方法。本发明将富含大豆蛋白的冻干粉与水混合，得到冻干粉分散液；将所述冻干粉分散液、海藻酸盐溶液和促生长因子混合，将所得混合液静置后，形成含大豆蛋白的混合水凝胶；所述富含大豆蛋白的冻干粉的制备方法包括以下步骤：将黄豆和水混合进行破壁处理，对所得物料进行过滤，得到滤液；向所述滤液中加入冻干保护剂，然后采用缓冲溶液调整滤液的pH值为7.4～7.5，最后进行真空冷冻干燥，得到富含大豆蛋白的冻干粉。本发明的混合水凝胶用于制备血管化网络支架，不但能够构建宏观血管网络结构，而且还能实现毛细血管网络的构建。

Description

一种含大豆蛋白的混合水凝胶及其制备方法和应用、血管化 网络支架及其制备方法
技术领域
本发明涉及组织工程技术领域，尤其涉及一种含大豆蛋白的混合水凝胶及其制备方法和应用、血管化网络支架及其制备方法。
背景技术
近几年，组织工程在再生医学领域的应用得到了飞速发展。其中，血管化成为了组织工程中最为重要的部分。目前，血管化网络的制备方法主要有生物3D打印、立体光刻和牺牲材料法等。这些方法都能够制备许多复杂的宏观血管网络结构，但无法制备细微的毛细血管网络结构。目前，毛细血管网络的制备主要是利用蛋白、促生长因子和混合细胞来诱导内皮细胞自生长的方式实现，所以寻找一种有助于毛细血管网络生成的生物材料对于血管化网络的制备显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种含大豆蛋白的混合水凝胶及其制备方法和应用、血管化网络支架及其制备方法，本发明的混合水凝胶具有良好的打印成形能力、良好的生物相容性和降解性，用于制备血管化网络支架，不但能够构建宏观血管网络结构，而且能够有效地促进内皮细胞的生长和发育，并进一步促进血管发芽进程从而实现毛细血管网络的构建。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种含大豆蛋白的混合水凝胶的制备方法，包括以下步骤：将富含大豆蛋白的冻干粉与水混合，得到冻干粉分散液；
将所述冻干粉分散液、海藻酸盐溶液和促生长因子混合，将所得混合液静置后，形成含大豆蛋白的混合水凝胶；
所述富含大豆蛋白的冻干粉的制备方法包括以下步骤：
将黄豆和水混合进行破壁处理，对所得物料进行过滤，得到滤液；
向所述滤液中加入冻干保护剂，然后采用缓冲溶液调整滤液的pH值为7.4～7.5，将pH值＝7.4～7.5的滤液进行真空冷冻干燥，得到富含大豆蛋白的冻干粉。
优选的，所述冻干粉分散液、海藻酸盐溶液和促生长因子的混合液中促生长因子的浓度为90～110ng/mL；
所述冻干粉分散液与海藻酸盐溶液的体积比为1：(5～6)；所述冻干粉分散液中，富含大豆蛋白的冻干粉与水的固液比为1g:(9～10)mL；所述海藻酸盐溶液的浓度为0.4～0.8g/mL。
优选的，所述缓冲溶液为磷酸溶液，所述缓冲溶液的浓度为10～20mmol/L。
优选的，所述海藻酸盐中α-L-古洛糖醛酸的质量含量低于60％时，还包括将所述冻干粉分散液、海藻酸盐溶液和促生长因子的混合液和氯化钙溶液混合进行交联。
本发明提供了上述方案所述制备方法制备得到的含大豆蛋白的混合水凝胶，包括大豆蛋白、海藻酸盐和促生长因子。
本发明提供了上述方案所述含大豆蛋白的混合水凝胶在制备生物支架中的应用。
本发明提供了一种血管化网络支架，由上述方案所述的含大豆蛋白的混合水凝胶的交联物组成。
本发明提供了上述方案所述血管化网络支架的制备方法，包括以下步骤：
采用3D挤出式打印的方式，将含大豆蛋白的混合水凝胶置于打印机的一号挤出头中，将第一交联剂溶液置于打印机的二号挤出头中，将牺牲材料置于打印机的三号挤出头中，每采用所述一号挤出头打印完整一层后，用所述二号挤出头在新形成的混合水凝胶的层面喷涂第一交联剂溶液，然后继续打印下一层；在要打印血管通道的位置时，采用所述三号挤出头进行打印，打印完毕后再继续打印下一层，直至完成整个多层支架的打印，得到预支架；
去除所述预支架中的牺牲材料，得到中空支架；
将所述中空支架浸入第二交联剂溶液中进行交联，得到血管化网络支架。
优选的，所述第一交联剂溶液为柠檬酸钠溶液，所述柠檬酸钠溶液的浓度为15～18mg/mL；所述第二交联剂溶液为氯化钙溶液，所述氯化钙溶液的浓度为3～4mg/mL。
优选的，所述牺牲材料为泊洛沙姆溶液在4～10℃条件下静置后形成的凝胶。
本发明提供了一种含大豆蛋白的混合水凝胶的制备方法，包括以下步骤：将富含大豆蛋白的冻干粉与水混合，得到冻干粉分散液；将所述冻干粉分散液、海藻酸盐溶液和促生长因子混合，将所得混合液静置后，形成含大豆蛋白的混合水凝胶；所述富含大豆蛋白的冻干粉的制备方法包括以下步骤：将黄豆和水混合进行破壁处理，对所得物料进行过滤，得到滤液；向所述滤液中加入冻干保护剂，然后采用缓冲溶液调整滤液的pH值为7.4～7.5，将pH值＝7.4～7.5的滤液进行真空冷冻干燥，得到富含大豆蛋白的冻干粉。
本发明采用富含大豆蛋白的冻干粉、促生长因子和海藻酸盐(作为基底材料)来混合制备水凝胶，其中富含大豆蛋白的冻干粉来源于黄豆，黄豆中除了富含大豆蛋白外，还含有多种生物活性蛋白，如β-淀粉酶、细胞色素c、植物血凝素、脂肪氧化酶、脲酶、Kunitz胰蛋白酶抑制剂和Bowman-Birk胰蛋白抑制剂等，这些营养物质和活性大豆蛋白都有利于细胞的黏附和生长，配合促生长因子的作用，可有效促进内皮细胞的血管化。因此，本发明制备的混合水凝胶具有良好的生物相容性，用于制备血管化网络支架，不但能够构建宏观血管网络结构，而且能够有效地促进内皮细胞的生长和发育，并进一步促进血管发芽进程从而实现毛细血管网络的构建。此外，由于海藻酸盐具有较高的粘度且在极其温和的条件下可以快速形成凝胶，当遇到钙离子就会形成网状交联结构，从而使制得的水凝胶具有良好的打印性能；大豆蛋白和海藻酸盐属于易降解材料，赋予混合水凝胶良好的降解性。
本发明提供了一种血管化网络支架的制备方法，采用生物3D打印和牺牲材料的方法来制备，支架保留了大豆中的蛋白及其他营养物质，支架可任意成形，在支架层与层之间，通过喷涂第一交联剂利用化学交联来进一步加强层间强度，并通过第二交联剂进行整体交联，有利于提高支架的机械强度。
此外，本发明血管化网络支架制备的方式十分快速和简便。
附图说明
图1为本发明预期培养出的血管网络示意图；
图2是本发明的生物3D打印示意图；
图3是本发明的血管化网络支架的制备流程图；
图4是实施例1(左)和实施例2(右)的血管化网络支架结构示意图。
具体实施方式
本发明提供了一种含大豆蛋白的混合水凝胶的制备方法，包括以下步骤：将富含大豆蛋白的冻干粉与水混合，得到冻干粉分散液；
将所述冻干粉分散液、海藻酸盐溶液和促生长因子混合，将所得混合液静置后，形成含大豆蛋白的混合水凝胶；
所述富含大豆蛋白的冻干粉的制备方法包括以下步骤：
将黄豆和水混合进行破壁处理，对所得物料进行过滤，得到滤液；
向所述滤液中加入冻干保护剂，然后采用缓冲溶液调整滤液的pH值为7.4～7.5，将pH值＝7.4～7.5的滤液进行真空冷冻干燥，得到富含大豆蛋白的冻干粉。
在本发明中，未经特殊说明，所用原料均为本领域熟知的市售商品。
下面先对富含大豆蛋白的冻干粉的制备过程进行说明。
本发明将黄豆和水混合进行破壁处理，对所得物料进行过滤，得到滤液。
在进行破壁处理前，本发明优选先将黄豆放入15～20℃冷水中反复清洗2～3次，然后将清洗后的黄豆放入32～37℃温水中浸泡10～12h，随后捞出并再次用15～20℃冷水清洗2～3次。在本发明中，所述温水浸泡的作用是将黄豆泡发，有利于破壁处理；本发明采用温水浸泡可缩短浸泡的时间，同时可以防止破坏大豆内的营养物质。在本发明中，浸泡前用冷水清洗，目的是洗去清洗黄豆表面杂质；浸泡后用冷水清洗，目的是去除经过热水浸泡后黄豆表面的残留气泡及滋生的病菌。本发明对所述清洗的方式没有特殊要求，采用本领域熟知的清洗方式即可。
本发明优选将黄豆和水放入破壁机中进行破壁处理。在本发明中，所述水的温度优选为45～55℃。在本发明中，所述黄豆与水的固液比优选为(1～1.5)g:10mL。
在本发明中，所述破壁机的搅拌速度优选为4000～6000rpm/min，更优选为5000～5500rpm；搅拌时间优选为20～40min，更优选为25～35min。本发明所述破壁处理过程中，黄豆中的大豆蛋白、大豆异黄酮、维生素等营养物质会被释放并溶于水中。
本发明优选采用筛网进行所述过滤，所述筛网的孔径优选为0.5mm。本发明通过过滤去除无用的豆渣。
得到滤液后，本发明向所述滤液中加入冻干保护剂，然后采用缓冲溶液调整滤液的pH值为7.4～7.5，将pH值＝7.4～7.5的滤液进行真空冷冻干燥，得到富含大豆蛋白的冻干粉。
在本发明中，所述冻干保护剂优选为蔗糖；所述缓冲溶液优选为磷酸溶液，所述缓冲溶液的浓度优选为10～20mmol/L，更优选为10mmol/L。
在本发明中，所述冻干保护剂与滤液的固液比优选为1g：20mL。本发明对所述缓冲溶液的用量没有特殊要求，能够调整滤液的pH值为7.4～7.5即可。本发明利用冻干保护剂保护蛋白质不变性，减少受到的低温应力、冻结应力和干燥应力等，防止蛋白质在冻干过程中发生二级结构的改变，利用缓冲溶液稳定冻干过程中的溶液pH值，维持蛋白质的活性。
在本发明中，所述真空冷冻干燥的温度优选为-45℃～-50℃，时间优选不少于36h，真空度优选为10～30Pa。本发明优选将调整pH值后的滤液放入冻干机中，在-40℃温度下进行2h的预冷，调节温度至-45℃～-50℃，冷冻20min，并打开真空泵调节压力为10～30Pa进行冻干，冻干时间不少于36h。本发明的冷冻干燥相比普通的晒干、烘干等方式，能够高质量的制备出含有多种生物活性物质的冻干粉，冻干效果好，可去除绝大部分的水分，并长久储存。
完成所述冷冻干燥后，本发明优选将冻干后的产物(具有稀疏多孔的结构)，放入研钵中进行研磨，得到富含大豆蛋白的冻干粉。本发明对所述研磨没有任何特殊的要求，目测无颗粒感即可。本发明优选向富含大豆蛋白的冻干粉中加入二氧化硅干燥剂袋并放入-4℃冰箱中保存待用。
本发明制得的富含大豆蛋白的冻干粉不但含有活性大豆蛋白，而且还含有人体所需的钙磷铁等微量元素以及维生素等，并含有生物活性因子如β-淀粉酶、细胞色素c、植物血凝素、脂肪氧化酶、脲酶、Kunitz胰蛋白酶抑制剂和Bowman-Birk胰蛋白抑制剂，这些营养物质和活性大豆蛋白都具有良好的生物相容性且有利于细胞的黏附和生长，在促生长因子的作用下会促进内皮细胞的血管化。
下面对本发明所述含大豆蛋白的混合水凝胶的制备方法进行说明。
本发明提供了一种含大豆蛋白的混合水凝胶的制备方法，包括以下步骤：将富含大豆蛋白的冻干粉与水混合，得到冻干粉分散液；
将所述冻干粉分散液、海藻酸盐溶液和促生长因子混合，将所得混合液静置后，形成含大豆蛋白的混合水凝胶。
本发明将富含大豆蛋白的冻干粉与水混合，得到冻干粉分散液。在本发明中，所述富含大豆蛋白的冻干粉与水的固液比优选为1g:(9～10)mL，更优选为1g:10mL。本发明对所述混合的方式没有特殊要求，能够将富含大豆蛋白的冻干粉与水混合均匀即可。
得到冻干粉分散液后，本发明将所述冻干粉分散液、海藻酸盐溶液和促生长因子混合，将所得混合液静置后，形成含大豆蛋白的混合水凝胶。
在本发明中，所述海藻酸盐溶液优选由海藻酸盐溶于水后得到；所述海藻酸盐优选为海藻酸钠；所述海藻酸盐溶液的浓度优选为0.4～0.8g/mL，更优选为0.4～0.5g/mL。在本发明中，所述海藻酸盐中α-L古洛糖醛酸(G)的质量含量优选在60％以上，所述海藻酸盐的分子量优选为150～250kDa，更优选为170～220kDa。在本发明中，当所述海藻酸盐中α-L古洛糖醛酸(G)的质量含量在60％以上时，在剪切速率为200s-1的条件下，得到的含大豆蛋白的混合水凝胶的粘度为1×103～2×103Pa·s，可以满足打印需求。
在本发明中，所述海藻酸盐溶液作为基底材料，其水溶液具有较高粘度且可以在极其温和的条件下快速形成凝胶，当遇到钙离子就会形成网状交联结构。并且，海藻酸盐是从褐藻中提取出来的，具有生物相容性，不会对生物体产生损害。最后，海藻酸盐是一种多糖，它的水溶液能够溶解大豆蛋白等活性物质，并且不会发生化学反应，是良好的基底材料。
在本发明中，所述促生长因子优选为VEGF促生长因子。所述促生长因子的作用是促进血管内皮细胞的增殖和迁移，并能够进一步促进血管的形成。
本发明对所述冻干粉分散液、海藻酸盐溶液和促生长因子混合的方式没有特殊要求，采用本领域熟知的混合方式即可。
在本发明中，所述冻干粉分散液与海藻酸盐溶液的体积比优选为1：(5～6)，更优选为1:5；所述混合液中促生长因子的浓度优选为90～110ng/mL，更优选为95～105ng/mL。
本发明优选将混合得到的混合液放在超净台中静置24小时，在真空环境下排出溶液中的气泡，得到含有大豆蛋白的混合水凝胶。在本发明中，所述真空环境的真空度优选为-0.1～-0.085MPa。本发明将混合水凝胶中的气泡排出可以防止后续在打印过程中出现断丝，或丝中混有气泡影响打印质量。
在本发明中，当所述海藻酸盐中α-L-古洛糖醛酸(G)的质量含量低于60％时，得到的含大豆蛋白的混合水凝胶的粘度难以满足打印要求(即达不到1×103～2×103Pa·s)，本发明优选将冻干粉分散液、海藻酸盐溶液和促生长因子的混合液和氯化钙溶液混合进行交联，然后再将所得混合液静置，以提高混合水凝胶的粘度。在本发明中，所述氯化钙溶液的浓度优选为0.4～0.8g/mL，更优选为0.4～0.5g/mL；冻干粉分散液、海藻酸盐溶液和促生长因子的混合液和氯化钙溶液的体积比优选为(1～1.5)：1，更优选为1:1。本发明利用氯化钙溶液作为交联剂，经混合充分搅拌后可以得到具有剪切稀化特性(即粘度随剪切速率的增大而降低)的混合水凝胶。
本发明提供了上述方案所述制备方法制备得到的含大豆蛋白的混合水凝胶，包括大豆蛋白、海藻酸盐和促生长因子。本发明所述含大豆蛋白的混合水凝胶中除了含有大豆蛋白之外，还含有多种生物活性蛋白，如β-淀粉酶、细胞色素c、植物血凝素、脂肪氧化酶、脲酶、Kunitz胰蛋白酶抑制剂和Bowman-Birk胰蛋白抑制剂等，这些营养物质和活性大豆蛋白都有利于细胞的黏附和生长，在促生长因子的作用下促进内皮细胞的血管化，用于制备血管化网络支架，不但能够构建宏观血管网络结构，而且能够有效地促进内皮细胞的生长和发育，并进一步促进血管发芽进程从而实现毛细血管网络的构建。在本发明中，所述含大豆蛋白的混合水凝胶在剪切速率为200s-1的条件下，粘度为1×103～2×103Pa·s。
本发明提供了上述方案所述含大豆蛋白的混合水凝胶在制备生物支架中的应用。本发明对所述应用的方式没有特殊要求，采用本领域熟知的应用方式即可。
本发明提供了一种血管化网络支架，由上述方案所述的含大豆蛋白的混合水凝胶的交联物组成。
本发明提供了上述方案所述血管化网络支架的制备方法，包括以下步骤：
采用3D挤出式打印的方式，将含大豆蛋白的混合水凝胶置于打印机的一号挤出头中，将第一交联剂溶液置于打印机的二号挤出头中，将牺牲材料置于打印机的三号挤出头中，每采用所述一号挤出头打印完整一层后，用所述二号挤出头在新形成的混合水凝胶的层面喷涂第一交联剂溶液，然后继续打印下一层；在要打印血管通道的位置时，采用所述三号挤出头进行打印，打印完毕后再继续打印下一层，直至完成整个多层支架的打印，得到预支架；
去除所述预支架中的牺牲材料，得到中空支架；
将所述中空支架浸入第二交联剂溶液中进行交联，得到血管化网络支架。
如图2和图3所示，本发明采用3D挤出式打印的方式，将含大豆蛋白的混合水凝胶置于打印机的一号挤出头中，将第一交联剂溶液置于打印机的二号挤出头中，将牺牲材料置于打印机的三号挤出头中，每采用所述一号挤出头打印完整一层后，用所述二号挤出头在新形成的混合水凝胶的层面喷涂第一交联剂溶液，然后继续打印下一层；在要打印血管通道的位置时，采用所述三号挤出头进行打印，打印完毕后再继续打印下一层，直至完成整个多层支架的打印，得到预支架。
本发明对所述打印机的型号没有特殊要求，本领域熟知的能够用于3D挤出式打印的打印机均可。本发明对三个挤出头的规格没有特殊要求，采用本领域熟知的规格即可。在本发明的实施例中，所述一号挤出头采用22G型号的医用针头，所述一号挤出头的直径为0.413mm；所述二号挤出头采用27G型号的医用针头，所述二号挤出头的直径为0.2mm；所述三号挤出头采用22G型号的医用针头，所述三号挤出头的直径为0.413mm。本发明在打印过程中，挤出气压优选通过电气比例阀和压力变送器进行调节，气压值优选为1.8～2.2bar，更优选为1.9～2.1bar。在本发明中，三个挤出头均可沿X、Y和Z三个方向移动。在本发明中，挤出头的移动速度独立优选为5～8mm/s，更优选为5～6mm/s。在本发明中，预支架的纤维直径会随着打印速度减小，气压变大而变粗。在本发明中，所述预支架的纤维直径(也即一号挤出头打印的纤维直径)优选为400～600μm，更优选为450～550μm。
本发明对打印过程中每层的层厚没有特殊要求，采用本领域熟知的3D打印层厚即可。
在本发明中，所述第一交联剂溶液优选为柠檬酸钠溶液，所述柠檬酸钠溶液的浓度优选为15～18mg/mL，更优选为15～17mg/mL。本发明利用第一交联剂溶液实现支架层与层之间的加固。在第一交联剂的作用下，上层底部和下层顶部的海藻酸盐会部分溶解，重新粘连在一起，消除层与层的阶梯现象。
在本发明中，所述牺牲材料优选为泊洛沙姆溶液在4～10℃条件下静置后形成的凝胶。在本发明中，所述泊洛沙姆溶液的浓度优选为0.4g/mL，所述泊洛沙姆溶液的溶剂优选为水。在本发明中，所述泊洛沙姆溶液中泊洛沙姆的型号优选为F-127。在本发明中，所述静置的时间优选为12h以上，在本发明的实施例中具体是静置过夜。本发明将静置时间控制在12h以上，在保证形成凝胶的同时可以确保将凝胶中的气泡排出。在本发明中，所述静置优选在空气氛围下进行。
本发明对所述预支架的形状和尺寸没有特殊要求，根据实际需求进行选择即可。在本发明中，所述牺牲材料的位置对应血管通道。在本发明的实施例1中，所述预支架的形状为立方体，尺寸为20mm×20mm×40mm，血管通道为单通道，通道直径为10mm；在本发明的实施例2中，所述预支架的形状为立方体，尺寸为20mm×20mm×30mm，血管通道直径为5mm，通道结构为形似“Y”的分叉血管通道，分叉结构对称，夹角为60°，主干通道长为20mm。
得到预支架后，本发明去除所述预支架中的牺牲材料，得到中空支架。
在本发明中，去除牺牲材料的过程优选为：将所述预支架浸入PBS溶液中。在本发明中，所述PBS溶液的浓度优选为10～20mmol/L，更优选为10～15mmol/L。本发明对所述浸入的时间没有特殊要求，能够将PBS完全去除即可。本发明对所述PBS溶液的用量没有特殊要求，能够将牺牲材料完全浸没即可。牺牲材料被去除后，会形成中空管道，中空管道即为宏观血管通道，得到中空支架。
得到中空支架后，本发明将所述中空支架浸入第二交联剂溶液中进行交联，得到血管化网络支架。
在本发明中，所述第二交联剂溶液优选为氯化钙溶液，所述氯化钙溶液的浓度优选为3～4mg/mL，更优选为4mg/mL。
本发明对所述第二交联剂溶液的用量没有特殊要求，能够将中空支架完全浸渍即可。在本发明中，所述交联的时间优选为1.5～2h，更优选为2h。所述交联过程中，第二交联剂中的钙离子和中空支架中的海藻酸盐交联，经过交联使血管网络支架整体的机械性得到加强。
完成所述交联后，本发明优选将交联后的支架进行干燥，得到血管化网络支架。在本发明中，所述干燥优选在干燥箱中进行，所述干燥的温度优选为37～45℃。
图1为本发明预期培养出的血管网络示意图。如图1所示，本发明所述血管化网络支架的通道可以构建宏观血管网络结构，而血管化网络支架中的大豆蛋白等活性物质在促生长因子的作用下，能够有效地促进内皮细胞的生长和发育，并进一步促进血管发芽进程从而实现周边毛细血管网络的构建。
下面结合实施例对本发明提供的含大豆蛋白的混合水凝胶及其制备方法和应用、血管化网络支架及其制备方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
a.制备富含大豆蛋白的冻干粉：
将100g新鲜黄豆放入15℃冷水中反复清洗2～3次，然后将黄豆放入37℃中浸泡12h，随后捞出并再用冷水清洗3次。将清洗好的黄豆放入破壁机中，并倒入1000mL的55℃热水，破壁机的转速为5000r/min，旋转搅拌时间为30min。然后，将破壁后的黄豆溶液倒出，用孔径为0.5mm的筛网对其进行过滤，得到滤液。将所述滤液放入烧杯中，加入蔗糖溶液作为冻干保护剂(每100mL中加入5g)和浓度为10mM的磷酸缓冲溶液调整滤液的pH值为7.5，放入冻干机中，在-40℃进行2h的预冷。随后，调节温度至-50℃，冷冻20min，并打开真空泵调节压力为20Pa进行冻干，冻干时间为36h。最后，取出冻干后的产物，整体呈现疏松多孔结构，放入研钵中进行研磨，得到50g冻干粉，将冻干粉中加入二氧化硅干燥剂袋并放入-4℃冰箱中保存。
b.含有大豆蛋白的混合水凝胶的制备：
将40g海藻酸钠(其中，α-L-古洛糖醛酸(G)的质量含量大于60％)放入烧杯中，加入1000mL去离子水，充分搅拌溶解，得到海藻酸钠溶液。
将冻干粉取出，去掉干燥剂袋，取20g冻干粉加入200mL去离子水配成冻干粉分散液。然后，将冻干粉分散液和海藻酸钠溶液以1：5的体积比例混合，并以100ng/mL的浓度比例加入VEGF促生长因子，搅拌并充分混合。最后，将制备的混合溶液放在超净台中静置24小时，在真空环境下排出溶液中的气泡，得到含有大豆蛋白的混合水凝胶材料。
c.交联剂溶液和牺牲材料溶液配备：
将氯化钙粉末溶入去离子水中，制备浓度为3mg/mL的氯化钙溶液(第二交联剂溶液)；将柠檬酸钠粉溶入去离子水中，制备浓度为15mg/mL的柠檬酸钠溶液(第一交联剂溶液)。将泊洛沙姆F-127加入去离子水中，配成0.4g/mL的溶液，并放置在4℃下过夜以使其凝胶化并去除气泡，得到牺牲材料。
d.血管化网络支架的制备：
支架打印的方法是使用基于气动的挤出式打印机，采用三个挤出头，一号挤出头采用22G型号的医用针头，挤出头的直径为0.413mm；二号挤出头采用27G型号的医用针头，挤出头直径为0.2mm。三号挤出头采用22G型号的医用针头，挤出头直径为0.413mm。挤出气压通过电气比例阀和压力变送器进行调节，气压值调节为2.2bar。三个挤出头均可沿X、Y和Z三个方向移动。
将步骤b中制备的混合水凝胶溶液放入一号挤出头中，将步骤c中制备的第一交联剂溶液放入二号挤出头，将步骤d制备的牺牲材料放入三号挤出头中。对所设计的支架进行打印时，挤出头移动的速度为5mm/s，一号挤出头打印的纤维直径为600μm，用一号挤出头打印完整一层后，用二号挤出头对层面进行第一交联剂溶液的喷涂，在要打印通道的位置时，采用三号挤出头打印，然后继续打印下一层，并以此类推，直至完成整个多层支架的打印，得到预支架。
预支架的尺寸为20mm×20mm×40mm的立方体，血管通道为直径10mm的单通道(图4左)。
将所述预支架支架先放入PBS溶液(浓度为10mmol/L)中去除牺牲材料，放入氯化钙交联溶液(浓度为4mg/mL)中，使其完全淹没支架，充分交联2小时后，放入干燥箱中37℃烘干，得到血管化网络支架。
实施例2
a.制备富含大豆蛋白的冻干粉：与实施例1的步骤a相同。
b.含有大豆蛋白的混合水凝胶的制备：
将48g海藻酸钠(其中，α-L-古洛糖醛酸(G)的质量含量小于60％)放入烧杯中，加入1200mL去离子水，充分搅拌溶解，得到海藻酸钠溶液。
将冻干粉取出，去掉干燥剂袋，取20g冻干粉加入200mL去离子水配成冻干粉分散液。然后，将冻干粉分散液和海藻酸钠溶液以1：6的体积比例混合，并以100ng/mL的浓度比例加入VEGF促生长因子，搅拌并充分混合。
配备的混合材料粘度不够，采用部分交联的方法，使混合溶液与氯化钙溶液(浓度为0.4g/mL)以1：1的比例混合，充分搅拌后得到具有剪切稀化特性的水凝胶材料。最后，将制备的混合溶液放在超净台中静置24小时，在真空环境下排出溶液中的气泡，得到含有大豆蛋白的混合水凝胶材料。
c.交联剂溶液和牺牲材料溶液配备：与实施例1的步骤c相同。
d.血管化网络支架的制备：
支架打印的方法是使用基于气动的挤出式打印机，采用三个挤出头，一号挤出头采用22G型号的医用针头，挤出头的直径为0.413mm；二号挤出头采用27G型号的医用针头，挤出头直径为0.2mm。三号挤出头采用22G型号的医用针头，挤出头直径为0.413mm。挤出气压通过电气比例阀和压力变送器进行调节，气压值调节为1.8bar。三个挤出头均可沿X、Y和Z三个方向移动。
将步骤b中制备的混合水凝胶溶液放入一号挤出头中，将步骤c中制备的第一交联剂溶液放入二号挤出头，将步骤d制备的牺牲材料放入三号挤出头中。对所设计的支架进行打印时，挤出头移动的速度为8mm/s，一号挤出头打印的纤维直径为400μm，用一号挤出头打印完整一层后，用二号挤出头对层面进行第一交联剂溶液的喷涂，在要打印通道的位置时，采用三号挤出头打印，然后继续打印下一层，并以此类推，直至完成整个多层支架的打印，得到预支架。
预支架的尺寸为20mm×20mm×30mm的立方体，血管通道为5mm，通道结构为形似“Y”的分叉血管通道，分叉结构对称，夹角为60°，主干通道长为20mm(图4右)。
将所述预支架支架先放入PBS溶液(浓度为10mmol/L)中去除牺牲材料，放入氯化钙交联溶液(浓度为4mg/mL)中，使其完全淹没支架，充分交联2小时后，放入干燥箱中37℃烘干，得到血管化网络支架。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种含大豆蛋白的混合水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将富含大豆蛋白的冻干粉与水混合，得到冻干粉分散液；
将所述冻干粉分散液、海藻酸盐溶液和促生长因子混合，将所得混合液静置后，形成含大豆蛋白的混合水凝胶；
所述富含大豆蛋白的冻干粉的制备方法包括以下步骤：
将黄豆和水混合进行破壁处理，对所得物料进行过滤，得到滤液；
向所述滤液中加入冻干保护剂，然后采用缓冲溶液调整滤液的pH值为7.4~7.5，将pH值=7.4~7.5的滤液进行真空冷冻干燥，得到富含大豆蛋白的冻干粉。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述冻干粉分散液、海藻酸盐溶液和促生长因子的混合液中促生长因子的浓度为90~110ng/mL；
所述冻干粉分散液与海藻酸盐溶液的体积比为1：（5~6）；所述冻干粉分散液中，富含大豆蛋白的冻干粉与水的固液比为1g:(9~10)mL；所述海藻酸盐溶液的浓度为0.4~0.8g/mL。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲溶液为磷酸溶液，所述缓冲溶液的浓度为10~20mmol/L。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述海藻酸盐中α-L-古洛糖醛酸的质量含量低于60%时，还包括将所述冻干粉分散液、海藻酸盐溶液和促生长因子的混合液和氯化钙溶液混合进行交联。
5.权利要求1~4任一项所述制备方法制备得到的含大豆蛋白的混合水凝胶，包括大豆蛋白、海藻酸盐和促生长因子。
6.权利要求5所述含大豆蛋白的混合水凝胶在制备生物支架中的应用。
7.一种血管化网络支架，由权利要求5所述的含大豆蛋白的混合水凝胶的交联物组成。
8.权利要求7所述血管化网络支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
采用3D挤出式打印的方式，将含大豆蛋白的混合水凝胶置于打印机的一号挤出头中，将第一交联剂溶液置于打印机的二号挤出头中，将牺牲材料置于打印机的三号挤出头中，每采用所述一号挤出头打印完整一层后，用所述二号挤出头在新形成的混合水凝胶的层面喷涂第一交联剂溶液，然后继续打印下一层；在要打印血管通道的位置时，采用所述三号挤出头进行打印，打印完毕后再继续打印下一层，直至完成整个多层支架的打印，得到预支架；
去除所述预支架中的牺牲材料，得到中空支架；
将所述中空支架浸入第二交联剂溶液中进行交联，得到血管化网络支架。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述第一交联剂溶液为柠檬酸钠溶液，所述柠檬酸钠溶液的浓度为15~18mg/mL；所述第二交联剂溶液为氯化钙溶液，所述氯化钙溶液的浓度为3~4mg/mL。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述牺牲材料为泊洛沙姆溶液在4~10℃条件下静置后形成的凝胶。
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