CN107261199B - 一种含沸石止血凝胶敷料的制备方法 - Google Patents

Abstract

发明涉及一种基于类人胶原蛋白和沸石的多孔止血凝胶敷料的制备方法，按沸石与类人胶原蛋白质量比为1：10‑1：20向LHC溶液中加入适量沸石、加入无机盐和复合交联剂β‑二亚胺锌配合物和1,2,7,8‑二环氧辛烷并搅拌均匀，调节溶液pH值至酸性条件下，放于40‑80℃水浴中保持0.5‑5h，再反两次高温蒸汽处理和水洗除去盐分和交联剂残留，再经过干燥处理和Co‑60灭菌即可得到一种含沸石止血凝胶敷料。该材料除了具有良好的透气性、防粘连性以及快速止血效果外，凝胶介质本身将沸石颗粒分散大幅度缓解了沸石在发挥止血效果过程中所产生的放热问题，相比与未引入沸石的凝胶，止血时间明显缩短，平均在15‑25s。

Description

一种含沸石止血凝胶敷料的制备方法

技术领域

本发明涉及一种含沸石止血凝胶敷料的制备方法，属于医用止血材料技术领域。

背景技术

沸石是呈架状结构的多孔性含水铝硅酸盐晶体的总称。沸石具有坚固的骨架构造，内部存在空穴，孔道等大体积的空隙，同时在其晶格内部还有许多大小均一的微孔和通道，体积可占沸石体积的50%以上。微孔和通道彼此相联，使沸石具有巨大的表面积。因此沸石具有较高的吸水率和吸水量，当沸石用于止血材料中时，可以吸收血液中的水分，使血小板和凝血因子浓缩，达到止血的目的。利用沸石止血敷料目前已被广泛接受，然而在制备中既能降低沸石吸水时放热温度又能提高其止血效果，是一项亟待解决的难题。

目前市场上所用的外用止血用品多为沸石止血粉，在使用时可直接将沸石止血粉撒在创伤处，但其存在以下缺点：第一，直接将沸石撒在患者伤口，因为沸石会吸水放热，使伤口温度瞬间升高，容易造成伤口烧伤引起患者疼痛；第二，沸石直接撒在伤口处，完成止血后需要将其清理干净，这不但增加了医生清理创伤的难度，同时伤口残留的沸石颗粒可能会引起血管堵塞。因此，临床上迫切的需要一种产热少，止血速度快，安全性高的沸石止血材料，以满足不同程度的紧急外伤的止血需求。

类人胶原蛋白（LHC）是通过发酵生产的人源型胶原蛋白。它是具有良好的细胞黏附性、促新细胞形成、加工性能好、无病毒隐患、水溶性好（避免了酸碱溶剂残留带来的细胞毒性）、排异反应低等特性的一种良好的植入性医疗器械用生物材料。

发明内容

本发明目的是提供一种以类人胶原蛋白（LHC）和沸石作为主要原料，制备出了一种具有透气保湿良好，止血快速且防渗透防粘连的医用止血凝胶敷料。该方法工艺简单，制备的材料生物相容性良好，有望广泛用于战时急救包、临床手术止血等。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种含沸石止血凝胶敷料的制备方法：在水溶性类人胶原蛋白（LHC）和沸石的混合溶液中，加入质量比为1:3-3:1的交联剂β-二亚胺锌配合物和1,2,7,8-二环氧辛烷水溶液以及无机盐水溶液混合均匀，并调节溶液pH值为2-5.5，置其于水浴环境中进行交联反应得含盐水凝胶；对交联后的含盐水凝胶进行两次高压蒸汽处理和蒸馏水浸泡洗涤，除去无机盐和残留的单体交联剂，并进行干燥和Co-60灭菌处理，获得一种含沸石止血凝胶敷料。

上述类人胶原蛋白溶液的浓度为50-400 mg/mL，沸石与类人胶原蛋白的质量比为1：10-1：20。

所述无机盐选自氯化钠、磷酸钠、磷酸氢钠、硫酸铵、硝酸铵、硝酸钾、硫酸钾、氯化钾，无机盐的浓度为10-350 mg/mL，无机盐水溶液的加入体积与类人胶原蛋白溶液的体积比为1:2-1:20。

上述交联剂β-二亚胺锌配合物溶液和1,2,7,8-二环氧辛烷溶液的质量百分比浓度均为0.1-5.0% ，优选0.5-2.0% ，体积均为蛋白溶液体积的1-20%，优选5-10%。

上述反应液酸碱度用盐酸和氢氧化钠溶液调控其pH值为2-5.5；交联反应的温度可为40-80℃，保持时间0.5-5h，优选1-3 h。

上述两次高压蒸汽处理和蒸馏水浸泡洗涤中，第一次将样品在110-121℃下保持时间5-30min，优选保持时间10-20min，然后超纯水浸泡洗涤2-5天；第二次将样品在110-121℃保持1-3 h，优选保持时间1.5-2.5h，然后超纯水浸泡洗涤1-3天，控制交联剂的残留总量低于2μg/g。

上述含沸石止血凝胶敷料的干燥方法可为真空冷冻干燥法或超临界二氧化碳干燥法。

上述交联剂β-二亚胺锌配合物依据文献（Catalytic Reactions Involving C₁Feedstocks: New High-Activity Zn(II)-Based Catalysts for the AlternatingCopolymerization of Carbon Dioxide and Epoxides, J. Am. Chem. Soc. 1998, 120,11018-11019.）的方法合成获得，其分子式如图1所示。

本发明无菌沸石止血凝胶敷料的形成机理：蛋白质分子含有丰富的羧基和氨基，为分子间交联提供了两种好的功能基团。β-二亚胺锌配合物分子内螯合锌的空轨道可与蛋白分子中的氨基形成配位键，实现蛋白质分子的分子间交联。β-二亚胺锌配合物对环氧烷基具有不对称开环催化功能，可加速1,2,7,8-二环氧辛烷的分子两端环氧烷基开环并与蛋白分子中的羧基形成共价键，实现蛋白质分子的分子间交联。故通过β-二亚胺锌配合物对1,2,7,8-二环氧辛烷的开环催化，及两种交联剂对蛋白质的分子间不同基团间的双交联作用，有效实现和强化了水溶性蛋白分子间的交联。沸石被包裹于能够实现交联剂辅助交联，也可以通过大量的氢键等实现分子间或分子内的有效交联。无机盐的加入，有效地破坏了水溶性蛋白质的分子外水化膜，促进了交联剂与蛋白质分子之间的交联反应，此外适量无机盐还兼扮演了成孔剂作用，进一步优化了水凝胶的成孔效果。

本发明以大分子蛋白类人体胶原蛋白和沸石作为主要原料，通过掺杂无机盐和双功能交联剂的协同作用，制备了一种新型的多孔水凝胶敷料。该水凝胶止血敷料止血时间进一步缩短，平均为15-25s，可望用于战时急救包、临床手术止血等领域。本发明还具有以下优点：本发明制备的沸石止血凝胶不仅可以进一步缩短止血时间（相对于未引入沸石凝胶），其平均止血时间可达15-25s；而且彻底解决了沸石在止血过程中严重的放热问题以及残留问题。

附图说明

图1 为合成的β-二亚胺锌配合物的分子结构图；

图2 为实施例1所制备的含沸石止血凝胶敷料的外观图；

图3 为实施例1所制备的含沸石止血凝胶敷料的SEM图；

图4 为实施例4所制备的含沸石止血凝胶敷料对兔肝脏止血效果图；

图5 为实施例4所使用的两种商业化品牌的止血海绵对兔肝脏的止血效果图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1 含沸石止血凝胶敷料的制备

步骤一：取10mL质量浓度为100 mg/mL的水溶性类人胶原蛋白溶液，按沸石和水溶性类人胶原蛋白质量比为1:10加入沸石，再加入浓度均为1%的交联剂β-二亚胺锌配合物和1,2,7,8-二环氧辛烷各1 mL，再加入10mg/mL的KCl 2mL，混合均匀，并用稀盐酸和氢氧化钠溶液调节溶液pH为4.5；

步骤二：将步骤一中的混合溶液分装于模具中，在50℃环境下保持2h后转入高压蒸汽灭菌锅内于121℃保持20min获得凝胶初品；

步骤三：步骤二中的初品凝胶用蒸馏水浸泡洗涤5天，每6h换一次洗涤水，除去盐分和残留交联剂；将洗涤后的初品凝胶转移至高压蒸汽灭菌锅中继续121℃保持2 h，然后再次用蒸馏水浸泡洗涤2天，控制交联剂的残留总量低于2μg/g，获得多孔湿凝胶样品；

步骤四：将骤三中的湿凝胶在-80℃预冻3 h后进行真空冷冻干燥并进行Co-60辐照灭菌后即得到无菌沸石止血凝胶敷料。

图2为本实施例所制备的含沸石止血凝胶敷料冻干样品的外观照片，可以看出其外观上呈不透明乳白色，表面质地较为光滑，呈多孔结构. 本实施例制备的含沸石止血敷料的内部扫描电镜图（SEM图）如图3所示，从SEM扫描电镜图可以看到，含沸石止血敷料的内部呈为多孔结构，孔壁为球形颗粒相互粘连而成，孔径一般在几十纳米到几个微米不等，孔结构较为均匀且致密贯通。

通过进一步检测知，本实例中制备的含沸石止血凝胶敷料弹性好，抗压缩能力强（最大压缩应变和压缩应力分别约为69.4%和5.9 MPa），溶胀速率高(9s基本达到溶胀平衡)，孔隙率约为81.5%；细胞毒性试验结果显示本实例中所制备的医用含沸石止血凝胶敷料具有良好的生物相容性，无细胞毒副性。

实施例2 含沸石止血凝胶敷料的制备

步骤一：取10mL质量浓度为200 mg/mL的水溶性类人胶原蛋白溶液，按沸石和水溶性类人胶原蛋白质量比为1:15加入沸石，再加入浓度均为1%的交联剂β-二亚胺锌配合物和1,2,7,8-二环氧辛烷各2 mL，再加入10mg/mL的Na₂SO₄ 2mL，混合均匀，并用稀盐酸和氢氧化钠溶液调节溶液pH为4；

步骤二：将步骤一中的混合溶液分装于模具中，在60℃水浴环境下保持2h后转入高压蒸汽灭菌锅内于110℃保持30min获得凝胶初品；

步骤三：步骤二中的初品凝胶用蒸馏水浸泡洗涤5天，每6h换一次洗涤水，除去盐分和残留交联剂；将洗涤后的初品凝胶转移至高压蒸汽灭菌锅中继续110℃保持3 h，然后再次用蒸馏水浸泡洗涤2天，控制交联剂的残留总量低于2μg/g，获得多孔湿凝胶样品。

步骤四：将骤三中的湿凝胶在-80℃预冻3 h后进行真空冷冻干燥并进行Co-60辐照灭菌后即得到无菌沸石止血凝胶敷料。

该实施例中所得的多孔水溶胶与实施例1中所得的含沸石止血凝胶敷料理化性质和生物学性能相似。

实施例3 含沸石止血凝胶敷料的制备

步骤一：取10mL质量浓度为400 mg/mL的水溶性类人胶原蛋白溶液，按沸石和水溶性类人胶原蛋白质量比为1:20加入沸石，再加入浓度均为1%的交联剂β-二亚胺锌配合物和1,2,7,8-二环氧辛烷各4 mL，再加入10mg/mL的NaCl 2mL，混合均匀，并用稀盐酸和氢氧化钠溶液调节溶液pH为5；

步骤二：将步骤一中的混合溶液分装于模具中，在70℃水浴环境下保持2h后转入高压蒸汽灭菌锅内于121℃保持15min获得凝胶初品；

步骤三：步骤二中的初品凝胶用蒸馏水浸泡洗涤5天，每6h换一次洗涤水，除去盐分和残留交联剂；将洗涤后的初品凝胶转移至高压蒸汽灭菌锅中继续121℃保持1.5 h，然后再次用蒸馏水浸泡洗涤2天，除去残留交联剂，控制交联剂的残留总量低于2μg/g，获得多孔湿凝胶样品；

步骤四：利用二氧化碳超临界干燥法干燥步骤三所得的湿凝胶样品，并进行Co-60辐照灭菌，即可得到无菌沸石止血凝胶敷料。

该实施例中所得的多孔水溶胶与实施例1中所得的含沸石止血凝胶敷料理化性质和生物学性能相似。

实施例4 沸石止血凝胶敷料的止血实验

选取新西兰白兔为实验动物，建立兔耳创伤出血和肝脏创伤出血模型，并选用本发明实例1中所得的沸石止血凝胶敷料与市场上A、B两种品牌的止血海绵进行止血对比试验。

实施例1制得的止血凝胶敷料的兔耳止血和肝脏止血性能测试可知，制备的沸石止血凝胶敷料对兔耳动脉的平均止血时间大约为16.3 s，对兔子肝脏的平均止血时间为21s，结果见表1。图4展示了对本发明实例1中制得的沸石止血凝胶敷料对兔肝脏止血(A-C)的实验图，可以明显的看到材料止血后不仅未渗透，且未与组织未发生粘连。图5为市场上主流的A、B两种品牌的止血海绵对肝脏止血图，其止血时间平均约为80-90s，且创面上的止血海绵已基本被完全渗透。

与未加入沸石的止血材料相比，实施例1制得的沸石止血凝胶敷料又进一步的提高了止血材料的止血效率，而且止血完成后，样品未渗血且无粘连，可直接从伤口拿下，不会因与伤口粘连而引起痛感。

Claims (7)

1.一种含沸石止血凝胶敷料的制备方法，其特征在于：在水溶性类人胶原蛋白（LHC）和沸石的混合溶液中，加入质量比为1:3-3:1的交联剂β-二亚胺锌配合物和1,2,7,8-二环氧辛烷水溶液以及无机盐水溶液混合均匀，并调节溶液pH值为2-5.5，置其于水浴环境中进行交联反应得含盐水凝胶；对交联后的含盐水凝胶进行两次高压蒸汽处理和蒸馏水浸泡洗涤，除去无机盐和残留的单体交联剂，并进行干燥和Co-60灭菌处理，获得一种含沸石止血凝胶敷料，

所述交联剂β-二亚胺锌配合物的结构式如示（I）所示：

（I）。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：类人胶原蛋白溶液的浓度为50-400 mg/mL，沸石与类人胶原蛋白的质量比为1：10-1：20。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述无机盐选自氯化钠、磷酸钠、磷酸氢钠、硫酸铵、硝酸铵、硝酸钾、硫酸钾、氯化钾，无机盐的浓度为10-350 mg/mL，无机盐水溶液的加入体积与类人胶原蛋白溶液的体积比为1:2-1:20。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：交联剂β-二亚胺锌配合物溶液和1,2,7,8-二环氧辛烷溶液的质量百分比浓度均为0.1-5.0%，体积均为蛋白溶液体积的1-20%。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：反应液酸碱度用盐酸和氢氧化钠溶液调控其pH值为2-5.5；交联反应的温度为40-80℃，保持时间0.5-5h。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：上述两次高压蒸汽处理和蒸馏水浸泡洗涤中，第一次将样品在110-121℃下保持时间5-30min，然后超纯水浸泡洗涤2-5天；第二次将样品在110-121℃保持1-3 h，然后超纯水浸泡洗涤1-3天，控制交联剂的残留总量低于2μg/g。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述含沸石止血凝胶敷料的干燥方法为真空冷冻干燥法或超临界二氧化碳干燥法。

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