CN115453021B - 一种sds脱细胞溶液及其在脱细胞处理或细胞外基质不可溶组分鉴定中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种SDS脱细胞溶液及其在脱细胞处理或细胞外基质不可溶组分鉴定中的应用。首先公开了一种SDS脱细胞溶液，由溶剂PBS溶液和溶质0.5M NaCl、1.5％SDS、0.1％Triton X‑100、0.1％Tween 20和1mM蛋白酶抑制剂混合物组成。进一步公开了其在脱细胞处理或细胞外基质不可溶组分鉴定中的应用。本发明脱细胞方法在SDS法脱细胞前，增加了冷冻/解冻三次循环以及针尖扎眼等步骤，另外利用优化的SDS脱细胞溶液，适用于小鼠整体器官或组织或小块组织的脱细胞，操作简便，且经济成本较低，脱细胞效果显著，最大限度提高了ECM组分的纯度，以后续蛋白质谱鉴定ECM不可溶组分。
Description
技术领域
本发明涉及脱细胞技术领域。更具体地，涉及一种SDS脱细胞溶液及其在脱细胞处理或细胞外基质不可溶组分鉴定中的应用。
背景技术
细胞外基质(ECM)是一个动态复杂的交联蛋白网络，是多细胞生物的基本组成部分。ECM为细胞提供了骨架结构，同时可作用于细胞表面受体将机械信号传达到细胞内，改变细胞的生化信号，并控制细胞发育和内稳态的基本过程，如黏附、迁移、生存和分化等(Dzamba BJ,DeSimone DW.Extracellular Matrix(ECM)and the Sculpting ofEmbryonic Tissues.Curr Top Dev Biol.2018；130:245-274.；Rozario T,DeSimoneDW.The extracellular matrix in development and morphogenesis:a dynamicview.Dev Biol.2010；341(1):126-40.)。ECM成分和结构的改变将伴随或导致疾病的进展，如纤维化、心血管、肌肉骨骼疾病及癌症等(Bonnans C,Chou J,Werb Z.Remodelling theextracellular matrix in development and disease.Nat Rev Mol Cell Biol.2014；15(12):786-801.；Karamanos NK,Theocharis AD,Neill T,Iozzo RV.Matrix modeling andremodeling:A biological interplay regulating tissue homeostasis anddiseases.Matrix Biol.2019；75-76:1-11.；Iozzo RV,Gubbiotti MA.Extracellularmatrix:The driving force of mammalian diseases.Matrix Biol.2018 Oct；71-72:1-9.)。
由于ECM的复杂性和不可溶解性，当前仍难以全面详细了解ECM组成和其中的生化变化。ECM组分主要包括ECM核心蛋白(包括糖蛋白、胶原蛋白和蛋白聚糖)和ECM相关蛋白(包括ECM附属蛋白、ECM调节蛋白和分泌因子)(Shao X,Taha IN,Clauser KR,Gao YT,NabaA.MatrisomeDB:the ECM-protein knowledge database.Nucleic Acids Res.2020；48(D1):D1136-D1144.)。研究已证明任何特定器官组织都包含多种ECM蛋白或ECM相关蛋白，不同组织的ECM组分存在显著的特征差异(Naba A,Clauser KR,Ding H,Whittaker CA,Carr SA,Hynes RO.The extracellular matrix:Tools and insights for the"omics"era.Matrix Biol.2016 Jan；49:10-24.)。
当前，常用的组织器官脱细胞方法包括：1)化学处理(十二烷基硫酸钠[SDS])、十二烷基硫酸钠、乙二胺四乙酸[EDTA]、Triton X-100、Tris-HCl等)；2)酶处理(DNases和RNases)；3)物理方法；4)渗透处理；5)组织机械破碎(或粉碎)；6)冷冻/解冻循环等。这些方法均存在大量细胞组分残留的固有缺陷(Solarte David VA,Güiza-Argüello VR,Arango-Rodríguez ML,Sossa CL,Becerra-Bayona SM.Decellularized Tissues for WoundHealing:Towards Closing the Gap Between Scaffold Design and EffectiveExtracellular Matrix Remodeling.Front Bioeng Biotechnol.2022；10:821852.)。
Lukas Krasny等人(Krasny L,Paul A,Wai P,Howard BA,Natrajan RC,HuangPH.Comparative proteomic assessment of matrisome enrichmentmethodologies.Biochem J.2016.473(21):3979-3995.)系统比较了Triton-X 100,SDS，以及两种当前已商品化的ECM组分分步提取与鉴定法，发现SDS法富集ECM组分的能力最强，但是仍然残留丰富的非细胞外基质蛋白(主要来源于细胞膜，线粒体，细胞质及细胞核)。基于当前SDS脱细胞法，肝、心脏及乳腺ECM骨架中残留非ECM组分仍占～50-70％。由于大量非ECM蛋白的存在，基于脱细胞后ECM骨架不可溶组分的定量分析存在较大偏倚。因此，亟需对当前SDS脱细胞法进行改进，以最大限度剔除非ECM组分，进而精准定量ECM组分。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种改进的SDS脱细胞溶液，以增强脱细胞能力，获得相对高纯度的细胞外基质(ECM)骨架。
本发明的另一个目的在于提供上述SDS脱细胞溶液在器官和/或组织和/或小块组织脱细胞处理中的应用或在鉴定ECM不可溶组分中的应用。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
本发明首先提供了一种SDS脱细胞溶液，由溶剂和溶质组成，所述溶质由如下浓度的各组分组成：0.4M～0.6M NaCl、1.3％～1.7％(m/m％)SDS、0.05％～0.15％(v/v％)Triton X-100、0.05％～0.15％(v/v％)Tween 20和0.5mM～1.5mM蛋白酶抑制剂混合物，所述溶剂为PBS溶液。
在本发明具体的实施方式中，所述溶质由如下浓度的各组分组成：0.5M NaCl、1.5％(m/m％)SDS、0.1％(v/v％)Triton X-100、0.1％(v/v％)Tween 20和1mM蛋白酶抑制剂混合物。
本发明优化了SDS脱细胞溶液，增加SDS的浓度至1.5％，同时添加了0.1％的Triton X-100和0.1％Tween 20，增强了脱细胞能力。
上述SDS脱细胞溶液如下任一中的应用也在本发明的保护范围之内：
A1、在器官和/或组织和/或小块组织的脱细胞处理中的应用；
A2、在获得器官和/或组织和/或小块组织的ECM骨架中的应用；
A3、在鉴定ECM不可溶组分中的应用。
本发明进一步还提供了一种脱细胞的方法，包括如下步骤：
将器官或组织或小块组织置于液氮冷冻后解冻；
于解冻后的器官或组织或小块组织上扎眼；
加入组织血细胞去除液去除血细胞；
加入上述SDS脱细胞溶液脱细胞；
清洗，得到ECM骨架，即可。
进一步，所述器官或组织为小鼠的心、肝、脾、肺、肾、胃、脑、十二指肠或脂肪的器官或组织，所述小块组织是从器官或组织上取部分得到的小块组织。
进一步，所述液氮冷冻后解冻是液氮处理1～2min后冰上解冻，重复3～5次；优选的，所述液氮冷冻后解冻是液氮处理1min后冰上解冻，重复3次。
进一步，所述扎眼是利用1～2ml注射器针尖于解冻后的器官或组织或小块组织上扎眼；优选的，所述扎眼是利用1ml注射器针尖于解冻后的器官或组织或小块组织上扎眼，至少20针/cm2；
进一步，所述加入组织血细胞去除液去除组织血细胞是加入器官或组织或小块组织8～12倍体积的组织血细胞去除液，4℃400～800rpm震荡5～7h，弃去组织血细胞去除液；优选的，所述加入组织血细胞去除液去除组织血细胞是加入器官或组织或小块组织10倍体积的组织血细胞去除液，4℃600rpm震荡6h，弃去组织血细胞去除液。
进一步，所述组织血细胞去除液由溶剂和溶质组成，所述溶质由如下浓度的各组分组成：0.4M～0.6M NaCl、8mM～12mM Tris-base和0.5mM～1.5mM蛋白酶抑制剂混合物，所述溶剂为双蒸水，所述组织血细胞去除液的pH＝7.5；优选的，所述溶质由如下浓度的各组分组成：0.5M NaCl、10mM Tris-base和1mM蛋白酶抑制剂混合物。
进一步，所述加入上述SDS脱细胞溶液脱细胞是加入器官或组织或小块组织8～12倍体积的上述SDS脱细胞溶液，常温(25℃)，800～1200rpm震荡32～60h，弃去SDS脱细胞溶液；优选的为，所述加入上述SDS脱细胞溶液脱细胞是加入器官或组织或小块组织10倍体积的上述SDS脱细胞溶液，常温(25℃)，1000rpm震荡48h，弃去SDS脱细胞溶液。
进一步，所述清洗是加入器官或组织或小块组织8～12倍体积的清洗液，4℃，600～1000rpm震荡0.5-1.5h，重复3～5次；优选的，所述清洗是加入器官或组织或小块组织10倍体积的清洗液，4℃，800rpm震荡1h，重复3次。
进一步，所述清洗液由溶剂和溶质组成，所述溶质为浓度为0.5mM～1.5mM的蛋白酶抑制剂混合物，所述溶剂为PBS溶液；优选的，所述溶质为浓度为1mM的蛋白酶抑制剂混合物。
本发明进一步提供了鉴定ECM不可溶组分的方法，包括如下步骤：
采用上述脱细胞的方法对小块组织进行处理，得到ECM骨架；
对ECM骨架进行蛋白质谱检测前处理后进行蛋白质谱检测，鉴定出ECM不可溶组分。
在本发明具体的实施方式中，所述蛋白质谱检测前处理包括如下步骤：
1、在含有ECM骨架的1.5ml EP管中加入50μl 8M尿素溶液重悬ECM骨架，加入500mMDTT溶液，至工作浓度为10mM，37℃，1400rpm持续震荡2h；
2、加入碘乙酰胺，至终浓度为25mM，室温下避光孵育30min；
3、加入150μl的100mM的碳酸氢铵溶液，稀释8M尿素溶液至2M，加入1000U的PNGaseF，37℃，1400rpm持续震荡2h；
4、加入1μg Lysc，37℃，1400rpm持续震荡2h；
5、加入3μg胰酶，37℃，1400rpm持续震荡过夜；
6、第二天继续加入1μg胰酶，37℃，1400rpm持续震荡2h；
7、加入2-5μl浓度为50％的三氟乙酸终止酶解反应，pH<2.0，得到多肽溶液；
8、使用C18脱盐柱进行脱盐，100％乙晴活化C18脱盐柱(简称柱子)，0.1％甲酸平衡柱子，加载步骤7所述的多肽溶液到柱子上，随后使用0.1％甲酸洗涤柱子，洗掉杂质，最后使用70％乙晴洗脱，收集流穿液，冻干，得到多肽冻干粉末。
在本发明具体的实施方式中，所述蛋白质谱检测使用ORBITRAP ECLIPSE质谱仪，选配FAIMS ProTMInterface，补偿电压CV在-45和-65之间每1s切换一次，Nanospray FlexTM(NSI)离子源，设定离子喷雾电压为2.0kV，离子传输管温度为320℃，质谱采用数据依赖型采集模式，质谱全扫描范围为m/z 350-2000，一级质谱分辨率设为120000，AGC为4e5，C-trap最大注入时间为50ms；二级质谱检测采用“Top Speed”模式，二级质谱分辨率设为15000，AGC为5e4，最大注入时间为22ms，肽段碎裂碰撞能量设为30％，生成质谱检测原始数据(.raw)。
在本发明具体的实施方式中，所述蛋白质谱检测中使用的数据库为Mus_musculus数据库。
在本发明具体的实施方式中，所述蛋白质谱检测中使用的检索软件为ProteomeDiscoverer2.4软件。
本发明的有益效果如下：
本发明优化了SDS脱细胞溶液，增加SDS的浓度至1.5％，同时添加了0.1％的Triton X-100和0.1％Tween 20，增强了脱细胞能力。
本发明脱细胞方法在SDS法脱细胞前，增加了冷冻/解冻三次循环以及针尖扎眼等步骤，另外利用优化的SDS脱细胞溶液，不仅适用于小鼠的整体器官组织包括心、肝、脾、肺、肾、胃、脑、十二指肠及脂肪等脱细胞，也适用于小鼠小块组织的脱细胞以用于后续蛋白质谱鉴定，该方法操作简便，且经济成本较低，脱细胞效果显著，最大限度提高了ECM组分的纯度，以鉴定ECM不可溶组分。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1为小鼠各器官组织脱细胞的操作流程图。
图2为小鼠各器官组织脱细胞前后对比照片。
图3为小鼠各器官组织脱细胞前HE染色和固绿-天狼星红染色，脱细胞后固绿-天狼星红染色以及弹性蛋白染色的结果图。
图4为小鼠各器官组织脱细胞后I型胶原免疫荧光染色的结果图。
图5为ECM骨架用于蛋白质谱检测分析结果，其中，A为各小块组织ECM骨架蛋白纯度的结果图，B为各小块组织ECM骨架蛋白的不可溶组分的结果图。
图6为传统SDS法与本发明改进后SDS法用于小块肝组织脱细胞后蛋白质谱检测分析的结果比较，其中，A为传统SDS法与本发明改进后SDS法用于小块肝组织脱细胞后ECM骨架蛋白纯度的结果比较图，B为传统SDS法与本发明改进后SDS法用于小块肝组织脱细胞后ECM骨架蛋白纯度的结果比较图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
下述实施例中用到的各试剂的贮存方式、工作浓度、储存条件、品牌和货号如表1。
表1各试剂的详细情况
实施例1小鼠心、肝、脾、肺、肾、胃、脑、十二指肠、脂肪等完整器官组织的脱细胞
小鼠各器官组织脱细胞(即改进后SDS法)的操作流程图如图1所示，具体步骤如下：
一、小鼠器官组织取材
12周龄雄性C57BL/6J小鼠，断颈处死，迅速摘取心、肝、脾、肺、肾、胃、脑、十二指肠、脂肪等完整器官或组织，PBS清洗干净。
二、反复冻融及扎眼
将清洗干净的完整器官或组织置于液氮中1min(液氮完全覆盖)，冰上解冻，反复进行3次；
利用1ml注射器针尖于解冻后的器官或组织上尽可能多的扎眼(至少20针/cm2)。
三、血细胞去除
组织血细胞去除液由溶剂和溶质组成：溶质由如下浓度的各组分组成：0.5MNaCl、10mM Tris-base和1mM蛋白酶抑制剂混合物(购自翌圣生物科技(上海)股份有限公司，货号为20124ES03)，溶剂为双蒸水，pH＝7.5。
将步骤二处理后的器官或组织置于15ml或者50ml EP管中(根据器官组织大小选择EP管，保证震荡过程中相应器官组织在EP管中可以运动)，加入适量组织血细胞去除液(组织血细胞去除液的体积为器官或组织的10倍)，4℃600rpm震荡6h，弃去组织血细胞去除液。
四、SDS法脱细胞
改进的SDS脱细胞溶液由溶剂和溶质组成：溶质由如下浓度的各组分组成：0.5MNaCl、1.5％(m/m％)SDS、0.1％(v/v％)Triton X-100、0.1％(v/v％)Tween 20和1mM蛋白酶抑制剂混合物，溶剂为PBS溶液。
向15ml或者50ml EP管中加入改进的SDS脱细胞溶液(改进的SDS脱细胞溶液的体积为器官或组织的10倍)，常温，1000rpm震荡48h(期间每12h换一次改进的SDS脱细胞溶液)，弃去改进的SDS脱细胞溶液。记录各器官组织颜色变白或透明的时间，如图2所示，结果表明：本发明改进后SDS法可用于各器官或组织脱细胞。检测第一次换液前(即12h)及48h时各EP管中DNA浓度及其两者比例，如表2所示，结果表明：本发明改进后SDS法用于各器官或组织脱细胞后获得的ECM骨架中残余的细胞核碎片占比较低。
表2脱细胞12h和48h各EP管中DNA浓度及其两者比例
五、清洗
清洗液：由溶剂和溶质组成，所述溶质为浓度为1mM的蛋白酶抑制剂混合物，所述溶剂为PBS溶液。
向15ml或者50ml EP管中加入清洗液(清洗液的体积为器官或组织的10倍)，4℃，800rpm震荡1h，重复3次，得到ECM骨架。
ECM骨架通过固绿-狼红染色、弹性蛋白染色以及I型胶原免疫荧光染色分析对脱细胞效果进行鉴定，结果如图3和图4所示，结果表明：本发明改进后SDS法用于各器官组织脱细胞后，ECM骨架纯度相对较高。
实施例2小鼠心、肝、脾、肺、肾、胃、脑、十二指肠、脂肪等小块组织(<100mg)的脱细胞及蛋白质谱检测分析
从小鼠心、肝、脾、肺、肾、胃、脑、十二指肠、脂肪取大于20mg小于100mg的小块组织，其脱细胞具体操作步骤同实施例1，区别在于：将15ml或50ml EP管换成1.5ml EP管。
小鼠小块组织脱细胞后剩余的ECM骨架用于蛋白质谱检测分析。
一、蛋白质谱检测前处理，具体步骤如下：
1、在含有ECM骨架的1.5ml EP管中加入50μl 8M尿素溶液重悬ECM骨架，加入500mMDTT溶液，至工作浓度为10mM，37℃，1400rpm持续震荡2h；
2、加入碘乙酰胺，至终浓度为25mM，室温下避光孵育30min；
3、加入150μl的100mM的碳酸氢铵溶液，稀释8M尿素溶液至2M，加入1000U的PNGaseF，37℃，1400rpm持续震荡2h；
4、加入1μg Lysc，37℃，1400rpm持续震荡2h；
5、加入3μg胰酶，37℃，1400rpm持续震荡过夜；
6、第二天继续加入1μg胰酶，37℃，1400rpm持续震荡2h；
7、加入2-5μl浓度为50％的三氟乙酸终止酶解反应，pH<2.0，得到多肽溶液；
8、使用C18脱盐柱进行脱盐，100％乙晴活化C18脱盐柱(简称柱子)，0.1％甲酸平衡柱子，加载上述步骤7所述的多肽溶液到柱子上，随后使用0.1％甲酸洗涤柱子，洗掉杂质，最后使用70％乙晴洗脱，收集流穿液，冻干，得到多肽冻干粉末。
二、LC-MS/MS质谱检测分析，具体步骤如下：
1、质谱上机
配制流动相A液(100％水、0.1％甲酸)和B液(80％乙腈、0.1％甲酸)。使用10μL A液溶解步骤一得到的多肽冻干粉末，4℃下14000g离心20min，取上清1μg样品进样，液质检测。液相色谱洗脱条件如表3所示。使用ORBITRAP ECLIPSE质谱仪，选配FAIMSProTMInterface，补偿电压CV在-45和-65之间每1s切换一次，Nanospray FlexTM(NSI)离子源，设定离子喷雾电压为2.0kV，离子传输管温度为320℃，质谱采用数据依赖型采集模式，质谱全扫描范围为m/z 350-2000，一级质谱分辨率设为120000，AGC为4e5，C-trap最大注入时间为50ms；二级质谱检测采用“Top Speed”模式，二级质谱分辨率设为15000，AGC为5e4，最大注入时间为22ms，肽段碎裂碰撞能量设为30％，生成质谱检测原始数据(.raw)。
表3液相色谱洗脱条件
2数据处理
2.1数据库
数据库的选择是以所需物种、数据库注释完备性及序列可靠性为参考依据的。在选择数据库时，遵循如下原则，若为已经测序生物，直接选用该物种数据库，若为非测序生物，则选择与被测样品最为相关的大类蛋白质组数据库。
本次使用数据库：Mus_musculus数据库。
2.2检索软件
采用Proteome Discoverer2.4软件搜库，检索参数设置如表4所示。
表4检索参数
2.3分析结果
经检测脂肪、脑、十二指肠、心、肾、肝、肺、脾及胃ECM骨架蛋白纯度的结果如图5中A所示，脂肪、脑、十二指肠、心、肾、肝、肺、脾及胃ECM骨架蛋白纯度分别为95.8％，71.6％，81.8％，89.8％，84.9％，89.2％，86.5％，97.1％和74.4％；其中心、肝、肺的ECM骨架纯度远远高于传统SDS法获得ECM骨架(心，～30％；肝，～50％；肺～60％)(Krasny L,Paul A,WaiP,Howard BA,Natrajan RC,Huang PH.Comparative proteomic assessment ofmatrisome enrichment methodologies.Biochem J.2016.473(21):3979-3995.)。ECM骨架蛋白的不可溶组分如图5中B所示，其主要成分为胶原和ECM糖蛋白。传统SDS法与本发明改进后SDS法用于小块肝组织脱细胞后ECM骨架蛋白纯度的比较如图6中A所示，分别为21.2％和89.2％。传统SDS法用于小块肝组织脱细胞后ECM骨架蛋白的不可溶组分如图6中B所示，其主要成分为胶原、ECM糖蛋白和ECM调节蛋白；本发明改进后SDS法用于小块肝组织脱细胞后ECM骨架蛋白的不可溶组分如图6中B所示，其主要成分为胶原。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (9)
1.一种获得器官、组织或小块组织的ECM骨架的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将器官或组织或小块组织置于液氮冷冻后解冻；所述液氮冷冻后解冻是液氮处理1～2min后冰上解冻，重复3～5次；
于解冻后的器官或组织或小块组织上扎眼；所述扎眼是利用1～2ml注射器针尖于解冻后的器官或组织或小块组织上扎眼；
加入组织血细胞去除液去除血细胞；所述加入组织血细胞去除液去除组织血细胞是加入器官或组织或小块组织8～12倍体积的组织血细胞去除液，4℃400～800rpm震荡5～7h，弃去组织血细胞去除液；所述组织血细胞去除液由溶剂和溶质组成，所述溶质由如下浓度的各组分组成：0.5M NaCl、10mM Tris-base和1mM蛋白酶抑制剂混合物，所述溶剂为双蒸水，所述组织血细胞去除液的pH＝7.5；
加入SDS脱细胞溶液脱细胞；所述加入SDS脱细胞溶液脱细胞是加入器官或组织或小块组织8～12倍体积的SDS脱细胞溶液，25℃，800～1200rpm震荡32～60h，弃去SDS脱细胞溶液，所述SDS脱细胞溶液由溶剂和溶质组成，所述溶质由如下浓度的各组分组成：0.5MNaCl、1.5％SDS、0.1％Triton X-100、0.1％Tween 20和1mM蛋白酶抑制剂混合物，所述溶剂为PBS溶液；
清洗，得到ECM骨架，即可；所述清洗是加入器官或组织或小块组织8～12倍体积的清洗液，4℃，600～1000rpm震荡0.5-1.5h，重复3～5次；所述清洗液由溶剂和溶质组成，所述溶质为浓度为0.5mM～1.5mM的蛋白酶抑制剂混合物，所述溶剂为PBS溶液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述器官或组织为小鼠的心、肝、脾、肺、肾、胃、脑、十二指肠或脂肪的器官或组织，所述小块组织是从器官或组织上取部分得到的小块组织。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液氮冷冻后解冻是液氮处理1min后冰上解冻，重复3次。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述扎眼是利用1ml注射器针尖于解冻后的器官或组织或小块组织上扎眼，至少20针/cm2。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述加入组织血细胞去除液去除组织血细胞是加入器官或组织或小块组织10倍体积的组织血细胞去除液，4℃600rpm震荡6h，弃去组织血细胞去除液。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述加入SDS脱细胞溶液脱细胞是加入器官或组织或小块组织10倍体积的SDS脱细胞溶液，25℃，1000rpm震荡48h，弃去SDS脱细胞溶液。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述清洗是加入器官或组织或小块组织10倍体积的清洗液，4℃，800rpm震荡1h，重复3次。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶质为浓度为1mM的蛋白酶抑制剂混合物。
9.一种鉴定ECM不可溶组分的方法，其特征在于，包括如下步骤：
采用权利要求1-8任一所述的方法对小块组织进行处理，得到ECM骨架；
对ECM骨架进行蛋白质谱检测前处理后进行蛋白质谱检测，鉴定出ECM不可溶组分。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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