DE102009022354A1

DE102009022354A1 - Bioreaktorsystem

Info

Publication number: DE102009022354A1
Application number: DE102009022354A
Authority: DE
Inventors: Christian Dipl.-Ing. Derichs; Ulrike Koropp; Jan Hansmann; Michaela Dr. Kaufmann; Heike Prof. Dr. Mertsching
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Priority date: 2009-05-15
Filing date: 2009-05-15
Publication date: 2010-11-18
Anticipated expiration: 2029-05-16
Also published as: EP2430148A1; DE102009022354B4; WO2010130306A8; JP5558560B2; CN102428168A; US20120058560A1; JP2012526522A; WO2010130306A1

Abstract

Die Erfindung betrifft Bioreaktoren zur Kultivierung von Zellen, insbesondere von adhärenten Zellen, die Verwendung der Bioreaktoren, insbesondere zur Kultivierung und Vermehrung von Zellkulturen, und Verfahren zur Kultivierung von Zellen unter Verwendung der erfindungsgemäßen Bioreaktoren. Ein besonderes Anwendungsgebiet ist die Verwendung der Bioreaktoren bei der GMP-konformen vollautomatischen Kultivierung und Vermehrung von Zellen.

Description

Die Erfindung betrifft Bioreaktoren zur Kultivierung von Zellen, insbesondere von adhärenten Zellen, die Verwendung der Bioreaktoren, insbesondere zur Kultivierung und Vermehrung von Zellkulturen, und Verfahren zur Kultivierung von Zellen unter Verwendung der erfindungsgemäßen Bioreaktoren. Ein besonderes Anwendungsgebiet ist die Verwendung der Bioreaktoren bei der GMP-konformen vollautomatischen Kultivierung und Vermehrung von Zellen.
Stand der Technik
Auf dem technischen Gebiet des so genannten Tissue Engineering, besonders im Zusammenhang mit der regenerativen Medizin besteht der Bedarf, biologische Laborprozesse unter Reinraumbedingungen GMP-konform zu automatisieren. Dadurch soll eine höhere Ausbeute, höhere Prozesssicherheit sowie eine standardisierbare Prozessoptimierung und Prozesskontrolle erreicht werden.
Im Laufe der Jahre haben sich bestimmte Standards bei der Produktion im Labormaßstab durchgesetzt. So werden häufig Wegwerfartikel aus Spritzgegossenem Polypropylen oder Polystyrol genutzt, da so die sehr kostenaufwendige Reinigung und Desinfektion der Probenbehälter entfällt. Die zum Aufbau der Gewebekonstrukte benötigten Zellen werden zunächst aus einer Biopat heraus isoliert und anschließend in Zellkulturschalen, -flaschen oder Multiwellplatten unterschiedlicher Größe über einen mehrtägigen Zeitraum kultiviert.
Zur Kultivierung werden die isolierten Primärzellen zunächst in spezifischen Zellkulturmedien resuspendiert. Die Zellsuspension wird an schließend in Einweg-Kulturgefäße pipettiert, in welchen die Zellen auf den speziell vorbehandelten Plastikoberflächen undefiniert adhärieren. Nach einer mehrtägigen Inkubationszeit im Brutschrank, auch als Inkubator bekannt, und regelmäßiger Austausch des alten Zellkulturmediums durch frisches Zellkulturmedium wird die ausreichend dicht gewachsene, also konfluente Zelltkultur von der Kunststoffoberfläche der Zellkulturgefäße abgelöst. Der Ablösevorgang wird entweder rein enzymatisch, beispielsweise mit einer Trypsin/EDTA-haltigen Lösung, oder in Verbindung mit mechanischer Anregung durchgeführt. Dabei haben sowohl die Enzymaktivität als auch die mechanische Belastung negative Auswirkungen auf die Vitalität der Zellen.
Für eine automatisierte Produktion mit größeren Stückzahlen sind die herkömmlichen Zellkulturgefäße unzureichend. Zellen proliferieren nur unter Einhaltung von bestimmten zelltypischen Bedingungen. Ein wichtiger Faktor dabei ist zum Beispiel die Aussaatdichte, also die Zellkonzentration mit der die isolierten Zellen in ein Kulturgefäß gegeben werden. Einerseits muss die Aussaatdichte so hoch gewählt werden, dass die Zellen die für die Proliferation nötigen Zell-Zell-Kontakte untereinander aufbauen können, andererseits muss die Aussaatdichte so niedrig sein, dass ausreichend Wachstumsfläche zur Verfügung steht. Im manuellen Laborbetrieb wird die Einhaltung dieser Bedingungen durch mehrfaches Passagieren, also einem Ablösen der Zellen und der Kultivierung in einem neuen, größeren Gefäß, sichergestellt. Der Prozess der Subkultivierung beinhaltet sehr viele manuelle Arbeitsschritte, wie Zugabe und Abnahme von Lösungen, Inkubation im Brutschrank, mikroskopische Kontrolle der Zellablösung, unterstützende mechanische Einwirkung, Überführen der Zellsuspension in ein Zentrifugenröhrchen, Zellzählung, Zentrifu gation, Abnahme des Überstands, Resuspendierung von Zellen in frischem Medium und erneute Aussaat. Dies führt zu einem erhöhten Verbrauch an Pipetten und Einweggefäßen. Bei der Durchführung der einzelnen Arbeitsschritte werden vom Laborpersonal häufig unterschiedliche Handhabungstechniken angewandt und individuelle Entscheidungen getroffen. Dies betrifft zum Beispiel die Länge der Enzymreaktion, die Kontrolle der Zellablösung, die Wahl, ob und wenn ja welche mechanische Unterstützung angewendet wird, oder die Wahl des Gefäßes zur Überführung der Zellkultur. Auch das Wachstumsverhalten und die Vermehrungsgeschwindigkeit unterschiedlicher Zellarten sind bei ihrer Kultivierung zu beachten. Insgesamt stellt der Prozess einer einheitlichen Kultivierung daher hohe Anforderungen an ein automatisiertes System.
Bisherige Lösungsansätze für automatisierte Zellkultursysteme beschränken sich darauf, durch angepasste Kulturgefäße den Ablauf des manuellen Laborprozess zu kopieren. So ist beispielsweise die CELLSTAR^® AutoFlask^TM Zellkulturflasche der Firma Greiner Bio-One in ihrer Geometrie und in ihrer Handhabung an die Verwendung in existierenden automatisierten Systemen angepasst. Dabei werden die Zellen in derselben Art und Weise passagiert wie in herkömmlichen manuellen Prozessen.
Die Methode Zellen auf PET Membranen zu kultivieren wird im Labor standardmäßig eingesetzt. Hierfür werden sogenannte Zellkultureinsätze, sogenannte Inserts, verwendet, wie sie zum Beispiel aus der WO 2004/020571 A2 bekannt sind. Diese sind allerdings nur in beschränkter Größe erhältlich. Die Verwendung von Insert-Membranen hat im manuellen Laborprozess den Nachteil, dass der Bewuchs der Zellkultur während der Kulturdauer nicht mikroskopisch kontrollierbar ist.
Zusammenfassung der Erfindung
Der Erfindung lag das technische Problem zugrunde, Vorrichtungen und Verfahren bereitzustellen, die eine gegenüber dem Stand der Technik verbesserte und/oder vereinfachte Kultivierung und Expansion von Zellen ermöglichen.
Der Erfindung lag auch das technische Problem zugrunde, Vorrichtungen und Verfahren bereitzustellen, die eine für Zellen schonende Kultivierung und Expansion der Zellen ermöglichen.
Der Erfindung lag auch das technische Problem zugrunde, Vorrichtungen und Verfahren bereitzustellen, die eine automatisierte Kultivierung und Expansion von Zellen ermöglichen.
Der Erfindung lag auch das technische Problem zugrunde, Vorrichtungen und Verfahren bereitzustellen, die eine einfache Kultivierung und Expansion von Zellen ermöglichen.
Der Erfindung lag auch das technische Problem zugrunde, Vorrichtungen und Verfahren bereitzustellen, die eine Schädigung der Zellen durch mehrmaliges Passagieren vermeiden, während insbesondere gleichzeitig die Kulturdauer und Wachstumszeit für die erste Passage verlängert wird.
Der Erfindung lag auch das technische Problem zugrunde, Vorrichtungen und Verfahren bereitzustellen, die ein für adhärente Zellen schonendes Ablösen der Zellen von der Kultivierungsoberfläche ermöglichen.
Das der Erfindung zugrunde liegende technische Problem wird gelöst durch die Gegenstände der unabhängigen Patentansprüche.
Insbesondere wird das der Erfindung zugrunde liegende technische Problem durch einen Bioreaktor gemäß Anspruch 1 gelöst.
Insbesondere wird das der Erfindung zugrunde liegende technische Problem durch einen Bioreaktor zur Kultivierung von Zellen gelöst, wobei der Reaktorraum des Bioreaktors durch eine zumindest in Teilbereichen flüssigkeitsdurchlässige Membran-Einheit in zwei Reaktorbereiche unterteilt wird und wobei jeder dieser zwei Reaktorbereiche eine zum Einlassen und/oder Auslassen einer Flüssigkeit geeignete Öffnung aufweist.
Die Erfindung betrifft also einen Bioreaktor mit einer integrierten Zellwachstumsmembran. Der Bioreaktor umgibt als Gehäuse einen Reaktorraum, auch Reaktorkammer genannt. Dieser Reaktorraum wird durch die in Teilbereichen flüssigkeitsdurchlässige Membran-Einheit in zwei Reaktorbereiche aufgeteilt. Der Bioreaktor weist also zwei Reaktorbereiche beziehungsweise Reaktorraumbereiche auf.
Erfindungsgemäß bevorzugt dient der Bioreaktor zur Kultivierung von adhärenten Zellen.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter ”adhärente Zellen” solche Zellen verstanden, die auf einer inerten Oberfläche, beispielsweise einem Reaktionsgefäß als Monolayer oder als Multilayer, insbesondere aber als Monolayer, in Zellkultur medium angezüchtet werden können. Die adhärenten Zellen kontaktieren die Oberfläche und haften an dieser an. Adhärente Zellen bilden zumeist eine zusammenhängende Zelllage. Adhärente Zellen zeigen oftmals eine dichteabhängige Proliferationshemmung, auch als Kontaktinhibition bezeichnet, die insbesondere bei Überschreiten der Konfluenz eintritt. Adhärente Zellen leiten sich häufig von Geweben ab, wie Haut, Muskulatur, Nerven, Leber, Nieren. Beispiele für adhärente Zellen sind Fibroblasten, HeLa-Zellen und viele Tumorzellen. Als Zellkulturmedium eignen sich die dem Fachmann bekannten Medien, die je nach anzuwachsendem Zelltyp ausgewählt werden.
Es ist allerdings auch möglich, ”Suspensionszellen” zu kultivieren. Suspensionszellen sind Zellen, die nicht als Monolayer oder Multilayer wachsen, also nicht an eine inerte Oberfläche anheften. Beispiele für Suspensionszellen sind Blutzellen, wie Leukozyten, oder lymphoide Zellinien.
Vorteile der vorliegenden Erfindung bestehen unter anderem in der Vermeidung von Passagierschritten bei der Zellexpansion und der damit einhergehenden stark vereinfachten Automatisierbarkeit des Prozesses sowie in der für die Zellen schonenden Prozessführung.
Die Vorteile des erfindungsgemäßen Bioreaktors werden durch die weiter unten folgenden Ausführungen zur erfindungsgemäßen Verwendung des Bioreaktors und zu den erfindungsgemäßen Verfahren offensichtlich.
Folgende bevorzugte und/oder alternative Ausführungsformen können beispielsweise für den erfindungsgemäßen Bioreaktor vorgesehen sein:
Erfindungsgemäß bevorzugt ist der Bioreaktor zerlegbar. Erfindungsgemäß bevorzugt ist der Bioreaktor in mindestens drei Teile zerlegbar.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist der Bioreaktor in mindestens drei Teile zerlegbar, nämlich a) ein Reaktorgehäuseteil, das den ersten Reaktorbereich umgibt, b) ein Reaktorgehäuseteil, das den zweiten Reaktorbereich umgibt und c) die zumindest in Teilbereichen flüssigkeitsdurchlässige Membran-Einheit.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist der Bioreaktor modular aufgebaut.
Erfindungsgemäß bevorzugt wird also das Bioreaktorgehäuse aus mindestens zwei Reaktorgehäuseteilen, insbesondere aus zwei Reaktorgehäuseteilen gebildet.
Alternativ können das erste und das zweite Reaktorgehäuseteil auch miteinander verbunden sein, insbesondere über ein Scharnier.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist das erste Reaktorgehäuseteil als Reaktordeckel und das zweite Reaktorgehäuseteil als Reaktorunterteil ausgestaltet.
Erfindungsgemäß bevorzugt enthält der Bioreaktor ein Reaktorunterteil, einen Reaktordeckel und eine Membran-Einheit. Erfindungsgemäß bevorzugt besteht der Bioreaktor aus einem Reaktorunterteil, einem Reaktordeckel und einer Membran-Einheit. Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Reaktorunterteil nach oben hin geöffnet. Die Membran-Einheit bedeckt dann die Öffnung des Reaktorunterteils, indem die Membran der Membran-Einheit horizontal auf der Öffnung liegt. Der Reaktordeckel hat dann eine nach unten gerichtete Öff nung. Der Reaktordeckel wird dann auf das Reaktorunterteil aufgesetzt, so dass auch die Öffnung des Reaktordeckels durch die horizontale Membran bedeckt wird. Somit grenzt die Membran der Membran-Einheit den durch das Reaktorunterteil gebildete Reaktorbereich oder Reaktorraum von dem durch den Reaktordeckel gebildeten Reaktorbereich oder Reaktorraum ab.
Erfindungsgemäß bevorzugt wird der Reaktorraum also durch die in Teilbereichen flüssigkeitsdurchlässige Membran-Einheit in einen unteren Reaktorbereich und in einen oberen Reaktorbereich aufgeteilt.
Erfindungsgemäß bevorzugt können die zwei Reaktorgehäuseteile miteinander luftdicht verbunden werden. Erfindungsgemäß bevorzugt können die zwei Reaktorgehäuseteile miteinander durch eine Verschraubung luftdicht verbunden werden. Der Fachmann kennt aber auch andere alternative oder zusätzliche Möglichkeiten die zwei Reaktorgehäuseteile luftdicht zu verbinden, beispielsweise durch Klemmen, durch Klemmvorrichtungen, durch Bänder, insbesondere Gummibänder oder durch Verschnürungen.
Erfindungsgemäß bevorzugt sind die zwei Reaktorgehäuseteile während der Kultivierung von Zellen in dem Bioreaktor luftdicht miteinander verbunden.
Erfindungsgemäß bevorzugt besteht die Membran-Einheit aus mindestens einer Membran und mindestens einem Rahmen. Alternativ kann die Membran-Einheit nur aus mindestens einer Membran bestehen.
Erfindungsgemäß bevorzugt besteht die Membran-Einheit aus einer Membran und einem Rahmen. Alternativ kann die Membran-Einheit nur aus einer Membran bestehen.
Erfindungsgemäß bevorzugt weisen die Reaktorgehäuseteile Aufnahmevorrichtungen, beispielsweise Schlitze oder Ausbuchtungen, zur Aufnahme und Positionierung der Membran-Einheit auf.
In einer alternativen Ausführungsform weisen die Reaktorgehäuseteile Aufnahmevorrichtungen, beispielsweise Schlitze oder Ausbuchtungen, zur Aufnahme und Positionierung der Membran auf.
In einer alternativen Ausführungsform weisen die Reaktorgehäuseteile Aufnahmevorrichtungen, beispielsweise Schlitze oder Ausbuchtungen, zur Aufnahme und Positionierung des Rahmens der Membran-Einheit auf.
Wenn die Membran-Einheit einen Rahmen enthält, dient dieser vorzugsweise zum Tragen und zur Ausrichtung der Membran und zur Positionierung der Membran im Bioreaktor.
Der fakultativ vorgesehene Rahmen kann einfach und kostengünstig als Einweg-Spritzguss-Teil hergestellt werden. Das Material des Rahmens, beispielsweise Kunststoff, zum Beispiel Polypropylen oder Polystyrol, kann so gewählt werden, dass der Rahmen sterilisierbar, insbesondere autoklavierbar ist. Es kann vorgesehen sein, dass der Rahmen der Membran-Einheit mehrfach verwendet wird und die Membran, die vorzugsweise nur einmal verwendet wird, im Rahmen auswechselbar ist.
Es kann aber auch vorgesehen sein, dass die gesamte Membran-Einheit, beispielsweise auch der Rahmen, als Einwegprodukt ausgestaltet ist. Der Zellkulturrahmen kann einfach und kostengünstig als Einweg-Spritzguss-Teil hergestellt werden und das Reaktorgehäuse kann wahlweise nach Sterilisation wieder verwendet werden. Aufgrund dessen wird ein breites Anwendungsspektrum geschaffen.
Die Membran ist in der erfindungsgemäßen bevorzugt vorgesehenen Membran-Einheit insbesondere als Membraneinsatz ausgebildet, welcher im Rahmen bevorzugt durch Klemmung gehalten wird.
In einer erfindungsgemäßen alternativen besonderen Ausgestaltungsform kann die Membranfläche, die als Wachstumsfläche der Zellen dient, durch verschieden große Rahmeneinsätze variiert werden, so dass die nutzbare Zellwachstumsfläche bedarfsgemäß angepasst werden kann. Es kann auch vorgesehen sein, dass der Rahmen in seiner Größe variierbar ist, so dass er verschieden große Bereiche der Membran abdeckt. Damit kann die Größe der für die Zellen während der Kultivierung zur Verfügung stehenden Membranoberfläche verändert werden, insbesondere während des Wachstums beziehungsweise Vermehrung der Zellen vergrößert werden.
Die durch die Membran gebildete Zellwachstumsfläche kann auf unterschiedliche Art und Weise vergrößert werden ohne das die Wachstumsbedingungen verletzt werden, beispielsweise durch eine mechanisch variabel einstellbare Zellwachstumsfläche.
In einer weiteren erfindungsgemäßen alternativen besonderen Ausgestaltungsform kann der Bioreaktor so aufgebaut sein, dass der Rahmen im Bioreaktor umdrehbar ist, insbesondere sich automatisiert umdrehen lässt, und somit die Cokultur von unterschiedlichen Zelltypen, beispielsweise auch in verschiedenen Medien, ermöglicht wird. Dabei ist dann erfindungsgemäß bevorzugt vorgesehen, dass beide Oberflächen der Membran als Wachstumsfläche für die Zellen dienen, insbesondere kann die eine Membranoberfläche als Wachstumsfläche für einen ersten Zelltyp dienen und die zweite Membranoberfläche als Wachstumsfläche für einen zweiten Zelltyp dienen. Damit ist beispielsweise die Nachbildung der Blut-Hirn-Schranke möglich.
Es kann auch vorgesehen sein, dass die Membran direkt ohne Rahmen in den Bioreaktor eingelegt wird.
Wenn die Membran ohne Rahmen verwendet wird, kann ein Spannsystem zum Spannen der Membran im Bioreaktor vorgesehen sein.
Weiterhin kann die Membran oder die Membran-Einheit bei der Herstellung des Bioreaktors direkt mit diesem verbunden werden, insbesondere mit einem Reaktorgehäuseteil, beispielsweise mit dem Reaktorunterteil, verbunden werden. Dies ist insbesondere bei Einweg-Bioreaktoren möglich.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist die Membran-Einheit durch die Membran flüssigkeitsdurchlässig. Erfindungsgemäß bevorzugt bildet also die Membran den flüssigkeitsdurchlässigen Teil, insbesondere den einzigen flüssigkeitsdurchlässigen Teil der Membran-Einheit.
In einer alternativen, erfindungsgemäßen Ausführungsform kann die Membran auch durch ein anderes geeignetes poröses Material ersetzt werden, beispielsweise durch ein schwammartiges Material.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist die Membran der Membran-Einheit scheibenförmig oder blattförmig und liegt mit ihren beiden Oberflächen waagerecht zwischen den beiden Reaktorbereichen. Erfindungsgemäß bevorzugt ist die gesamte Membran-Einheit annähernd scheibenförmig oder blattförmig und liegt mit ihren beiden Oberflächen waagerecht zwischen den beiden Reaktorbereichen.
Erfindungsgemäß bevorzugt nimmt die Membran mindestens 25% der Membran-Einheit ein. Erfindungsgemäß bevorzugt nimmt die Membran mindestens 50% der Membran-Einheit ein. Es kann auch vorgesehen sein, dass die Membran mindestens 75%, insbesondere mindestens 90% der Fläche der Membran-Einheit einnimmt.
Erfindungsgemäß bevorzugt nimmt die Membran zwischen 25% und 100% der Fläche der Membran-Einheit ein. Erfindungsgemäß bevorzugt nimmt die Membran zwischen 50% und 100% der Fläche der Membran-Einheit ein.
Die Membran dient als Wachstumsfläche der Zellen. Erfindungsgemäß bevorzugt dient nur eine der zwei Oberflächen der Membran als Wachstumsfläche der Zellen. Wenn die Membran erfindungsgemäß bevorzugt horizontal, also waagerecht, im Bioreaktor eingesetzt wird, dient erfindungsgemäß bevorzugt die obere Oberfläche der Membran als Wachstumsfläche der Zellen.
Insbesondere bei adhärenten Zellen können alternativ aber auch beide Oberflächen der Membran als Wachstumsfläche der Zellen verwendet werden.
Dem Fachmann sind geeignete flüssigkeitsdurchlässige Membranen bekannt, die sich zum Kultivieren von Zellen, insbesondere von adhärenten Zellen, eignen.
Die Zellwachstumsmembran kann beispielsweise aus PET, also Polyethylenterephthalat, oder einem vergleichbaren Material bestehen. Die Membran weist definitionsgemäß eine poröse Struktur auf, so dass ein Flüssigkeitsaustausch über die Membran möglich ist.
Die Zellwachstumsmembran kann beispielsweise aus PET, also Polyethylenterephthalat, oder einem vergleichbaren Material bestehen. Auch ist beispielsweise die Verwendung von Polycarbonat-Membranen möglich. Die Membran weist definitionsgemäß eine poröse Struktur auf, so dass ein Flüssigkeitsaustausch über die Membran möglich ist.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist die Membran ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus PET Membranen, PC Membranen, Nylon Membranen, amphotere Nylon Membranen, positiv geladene Nylon Membranen, negativ geladene Nylon Membranen, PTFE Membranen, Celluloseester Membranen, Celluloseacetat Membranen, Cellulosenitrat Membranen, Cellulosemischester Membranen, regenerierte Cellulose Membranen, Nytran Membranen und Nytran SuPer-Charge++ Membranen.
In einer erfindungsgemäßen alternativen Ausführungsform ist die Membran eine PET Membran. In einer erfindungsgemäßen alternativen Ausführungsform ist die Membran eine PC Membran. In einer erfindungsgemäßen alternativen Ausführungsform ist die Membran eine Nylon Membran. In einer erfindungsgemäßen alternativen Ausführungsform ist die Membran eine amphotere Nylon Membran. In einer erfindungsgemäßen alternativen Ausführungsform ist die Membran eine positiv geladene Nylon Membran. In einer erfindungsgemäßen alternativen Ausführungsform ist die Membran eine negativ geladene Nylon Membran. In einer erfindungsgemäßen alternativen Ausführungsform ist die Membran eine PTFE Membran. In einer erfindungsgemäßen alternativen Ausführungsform ist die Membran eine Celluloseester Membran. In einer erfindungsgemäßen alternativen Ausführungsform ist die Membran eine Celluloseacetat Membran. In einer erfindungsgemäßen alternativen Ausführungsform ist die Membran eine Cellulosenitrat Membran. In einer erfindungsgemäßen alternativen Ausführungsform ist die Membran eine Cellulosemischester Membran. In einer erfindungsgemäßen alternativen Ausführungsform ist die Membran eine regenerierte Cellulose Membran. In einer erfindungsgemäßen alternativen Ausführungsform ist die Membran eine Nytran+ Membran. In einer erfindungsgemäßen alternativen Ausführungsform ist die Membran eine Nytran SuPerCharge++ Membran.
Auch eine Beschichtung der Zellwachstumsmembran oder Aufbringen einer Oberflächenstruktur ist wahlweise möglich.
Erfindungsgemäß bevorzugt weist die Membran eine Porengröße von mindestens 0,01 μm auf. Erfindungsgemäß bevorzugt weist die Membran eine Porengröße von mindestens 0,1 μm auf. Erfindungsgemäß bevorzugt weist die Membran eine Porengröße von mindestens 0,35 μm und auf.
Erfindungsgemäß bevorzugt weist die Membran eine Porengröße von höchstens 20 μm auf. Erfindungsgemäß bevorzugt weist die Membran eine Porengröße von höchstens 10 μm auf.
Erfindungsgemäß bevorzugt weist die Membran eine Porengröße von mindestens 0,01 μm, insbesondere 0,1 μm und höchstens 20 μm, insbesondere höchstens 10 μm auf.
Erfindungsgemäß bevorzugt weist die Membran eine Porengröße von mindestens 0,35 μm, insbesondere 0,4 μm und höchstens 9 μm, insbesondere höchstens 8 μm auf.
Es kann beispielsweise eine Porengröße von 0,4 μm, 0,45 μm, 1,0 μm, 1,2 μm, 3,0 μm, 5,0 μm oder 8,0 μm vorgesehen sein.
Dem Fachmann sind geeignete Porengrößen von Membranen bekannt, die sowohl einen genügenden Flüssigkeitsdurchtritt, insbesondere Zellkulturmediumsdurchtritt, und gleichzeitig eine gute Kultivierung der Zellen gewährleisten.
Erfindungsgemäß bevorzugt weist die Membran der Membraneinheit eine Porendichte von mindestens 10⁵ Poren pro cm² auf. Erfindungsgemäß bevorzugt weist die Membran der Membraneinheit eine Porendichte von höchstens 10⁸ Poren pro cm² auf.
Erfindungsgemäß bevorzugt weist die Membran der Membraneinheit eine Porendichte von mindestens 10⁵ Poren pro cm² und höchstens 10⁸ Poren pro cm² auf. Es kann beispielsweise eine Porendichte von 0,1 × 10⁶, 0,2 × 10⁶, 0,4 × 10⁶, 2 × 10⁶, 22 × 10⁶ oder 100 × 10⁶ pro cm² vorgesehen sein.
Dem Fachmann sind geeignete Porendichten von Membranen bekannt, die sowohl einen genügenden Flüssigkeitsdurchtritt, insbesondere Zellkulturmediumsdurchtritt, und gleichzeitig eine gute Kultivierung der Zellen gewährleisten.
Es kann beispielsweise vorgesehen sein, dass die Membran eine Flächenausdehnung von 50 cm² bis 120 cm², insbesondere von 75 cm² bis 85 cm² hat. Insbesondere kann die Membran eine Flächenausdehnung von etwa 80 cm² haben.
Erfindungsgemäß weist jeder der zwei Reaktorbereiche eine zum Einlassen und/oder Auslassen einer Flüssigkeit geeignete Öffnung auf.
Die Öffnungen verbinden das Innere des Bioreaktors mit dem Äußeren des Bioreaktors, es sind also Öffnungen, die durch das Bioreaktorgehäuse hindurchgehen.
Erfindungsgemäß bevorzugt weist jeder der zwei Reaktorgehäuseteile eine zum Einlassen und/oder Auslassen einer Flüssigkeit geeignete Öffnung auf.
Die Öffnungen können bevorzugt als Anschlüsse ausgebildet sein. Durch die Anschlüsse kann der Biorektor, beispielsweise über Schläuche, an andere Vorrichtungen, beispielsweise in einer automatisierten Gesamtsystem zum Herstellen von Gewebe aus Zellkulturen, angeschlossen werden und durch die Anschlüsse kann eine Flüssigkeit, insbesondere ein Zellkulturmedium oder eine Lösung zum Ablösen der Zellen, dem Bioreaktor zugeführt oder vom Bioreaktor abgeführt werden.
Die Öffnungen können auch als Septen ausgebildet sein.
Die Öffnungen können auch als Pipettieröffnungen ausgebildet sein.
Erfindungsgemäß bevorzugt weist der erste Reaktorbereich eine zum Einlassen einer Flüssigkeit geeignete Öffnung auf. Erfindungsgemäß bevorzugt weist der erste Reaktorbereich eine zum Einlassen und Auslassen einer Flüssigkeit geeignete Öffnung auf.
Erfindungsgemäß bevorzugt sind die Öffnungen verschließbar. Alternativ können die Öffnungen auch nicht verschließbar ausgestaltet sein, beispielsweise, wenn der Bioreaktor mit den Öffnungen über Schläuche an ein Gesamtsystem angeschlossen wird.
Erfindungsgemäß bevorzugt liegt die zum Einlassen und/oder Auslassen einer Flüssigkeit geeignete Öffnung des ersten Reaktorbereichs an der Seite oder auf der Oberseite des Reaktorgehäuseteils. Erfindungsgemäß bevorzugt liegt die zum Einlassen und/oder Auslassen einer Flüssigkeit geeignete Öffnung des ersten Reaktorbereichs an der Seite des Reaktorgehäuseteils.
Erfindungsgemäß bevorzugt weist der zweite Reaktorbereich eine zum Einlassen und Auslassen einer Flüssigkeit geeignete Öffnung auf.
Erfindungsgemäß bevorzugt liegt die zum Einlassen und/oder Auslassen einer Flüssigkeit geeignete Öffnung des zweiten Reaktorbereichs an der Seite oder auf der Oberseite des Reaktorgehäuseteils. Erfindungsgemäß bevorzugt liegt die zum Einlassen und/oder Auslassen einer Flüssigkeit geeignete Öffnung des zweiten Reaktorbereichs an der Seite des Reaktorgehäuseteils.
Erfindungsgemäß bevorzugt sind die zum Einlassen und/oder Auslassen einer Flüssigkeit geeigneten Öffnungen als Ventile ausgeführt. Sie können aber auch als verschließbare oder nichtverschließ bare Stutzen oder Anschlüsse ausgeführt sein, an die eine Zuleitung oder eine Ableitung, beispielsweise in Form einen Schlauchs, angebracht werden können. Dies erlaubt ein kontinuierliches oder ein schrittweises Zuführen von frischer Flüssigkeit, bei gleichzeitigem oder vorangegangenem Abführen von alter Flüssigkeit. Dies ist insbesondere bei der Verwendung des erfindungsgemäßen Bioreaktors in einer automatisierten Vorrichtung zur Kultivierung von Zellen vorteilhaft.
Alternativ kann aber die Flüssigkeit auch anders Zugeführt und/oder Abgeführt werden, insbesondere bei einer manuellen Verwendung des erfindungsgemäßen Bioreaktors, beispielsweise durch Zupipettieren oder Einschütten der Flüssigkeit beziehungsweise durch Abpipettieren, Ablassen, oder Abgießen der Flüssigkeit.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist die Flüssigkeit ein Zellkulturmedium oder eine Lösung zum Ablösen der Zellen von der Membran.
Erfindungsgemäß bevorzugt können der erste und/oder der zweite Reaktorbereich so ausgestaltet sein, dass sie durch eine Reaktorkammer, dem eigentlichen Reaktorbereich, und durch ein Leitsystem, das die Öffnungen mit den Reaktorkammern verbindet, gebildet werden.
Erfindungemäß alternativ kann vorgesehen sein, dass die Reaktorbereiche oder ein Reaktorbereich nur durch Reaktorkammern oder eine Reaktorkammer gebildet werden.
Erfindungemäß alternativ kann vorgesehen sein, dass der Bioreaktor drehbar ist.
Erfindungsgemäß bevorzugt weist der Bioreaktor mindestens eine Belüftungsöffnung auf.
Erfindungsgemäß bevorzugt weist das erste Reaktorgehäuseteil mindestens eine Belüftungsöffnung auf. Erfindungsgemäß bevorzugt weist das erste Reaktorgehäuseteil, insbesondere der Reaktordeckel, eine Belüftungsöffnung auf.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist die mindestens eine Belüftungsöffnung mit einem Sterilfilter versehen.
Es kann auch vorgesehen sein, dass die Belüftungsöffnung verschließbar ist.
Erfindungsgemäß bevorzugt weist der Bioreaktor mindestens eine Pipettieröffnung auf.
Erfindungsgemäß bevorzugt weist das erste Reaktorgehäuseteil mindestens eine Pipettieröffnung auf. Erfindungsgemäß bevorzugt weist das erste Reaktorgehäuseteil eine Pipettieröffnung auf.
Es kann erfindungsgemäß vorgesehen sein, dass der Bioreaktor zwei Pipettieröffnungen aufweist. Dabei kann vorgesehen sein, dass die eine Pipettieröffnung einen Zugang zum ersten Reaktorbereich bildet und die zweite Pipettieröffnung einen Zugang zum zweiten Reaktorbereich bildet. Dabei kann sich zum Beispiel die zweite Pipettieröffnung auf der Oberseite des Reaktordeckels befinden und als Leitung zum unteren, zweiten Reaktorbereich ausgebildet sein. Die Leitung kann zum Beispiel an der Membran oder an der Membran-Einheit vorbei geführt werden. Beispielsweise können speziell ausgeformte Stege die Zuleitung von Flüssigkeit in den unteren Reaktorbereich über die Pipettieröffnung ermöglichen.
Erfindungsgemäß kann insbesondere vorgesehen sein, dass die beiden Pipettieröffnungen auf der Oberseite des Reaktordeckels liegen.
Es kann alternativ auch vorgesehen sein, dass die Pipettieröffnungen die beiden zum Einlassen/und oder Auslassen einer Flüssigkeit geeigneten Öffnungen darstellen. Es ist also in dieser Ausführungsform vorgesehen, dass die Pipettieröffnungen nicht zusätzlich zu, sondern als Ersatz der beiden zum Einlassen/und oder Auslassen einer Flüssigkeit geeigneten Öffnungen vorhanden sind.
Es kann insbesondere vorgesehen sein, dass der Bioreaktor als einzige Öffnungen die zwei Pipettieröffnungen und eine Belüftungsöffnung enthält.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist die Pipettieröffnung verschließbar, insbesondere luftdicht verschließbar. Die Pipettieröffnung kann gegebenenfalls auch mit einem flüssigkeitsdurchlässigen Sterilfilter versehen sein.
Es können alternativ auch weitere, insbesondere verschließbare Öffnungen vorgesehen sein, die die Zugabe und/oder Entnahme von Flüssigkeit, insbesondere Zellkulturmedium oder Zusätze, in den Bioreaktor hinein oder aus dem Bioreaktor heraus erlauben.
Erfindungsgemäß bevorzugt weist das erste Reaktorgehäuseteil mindestens eine, insbesondere mit einem Sterilfilter versehene, Belüftungsöffnung und/oder eine verschließbare Pipettieröffnung auf.
In einer alternativen Ausführungsform ist der Bioreaktor zur Aufnahme von messtechnischen Vorrichtungen, beispielsweise Elektroden, geeignet, es sind dabei also Steckplätze oder ähnliches für die Aufnahme der messtechnischen Vorrichtungen vorgesehen.
Erfindungsgemäß bevorzugt sind in den Bioreaktor messtechnische Vorrichtungen integriert, die die Messung von Daten, beispielsweise zur TEER-Wert-Messung, ermöglichen.
Durch die Messung des TEER-Werts (TEER = Transepithelialer elektrischer Widerstand) kann die Dichte der Zellbesiedlung bestimmt werden. Somit kann der Zeitpunkt bestimmt werden, an dem die Zellen auf der Membran die gewünschte Zelldichte erreicht haben, insbesondere der Zeitpunkt an dem die Zellschicht beinahe konfluent oder konfluent geworden ist.
Als Konfluenz bezeichnet man die dichtest mögliche Anordnung von adhärenten Zellen an der Oberfläche einer Kulturgefäßoberfläche, im vorliegenden Fall also die Membranoberfläche. Die Konfluenz gestaltet sich von Zelllinie zu Zelllinie verschieden.
Kurz vor oder bei Erreichen der Konfluenz durch das Wachsen und/oder die Vermehrung der Zellen können die Zellen geerntet oder passagiert werden.
Erfindungsgemäß bevorzugt weist der Bioreaktor Vorrichtungen, insbesondere Elektroden, zur Messung von Daten auf.
Erfindungsgemäß bevorzugt weist der Bioreaktor Vorrichtungen, insbesondere Elektroden, zur TEER-Wert-Messung auf.
Es können alternativ auch nur Steckplätze für die Vorrichtungen, insbesondere Elektroden zur TEER-Wert Messung, vorgesehen sein.
Erfindungsgemäß bevorzugt weist das erste Reaktorgehäuseteil mindestens eine Elektrode, insbesondere eine Elektrode, zur TEER-Wert-Messung auf. Erfindungsgemäß bevorzugt weist das zweite Reaktorgehäuseteil mindestens eine Elektrode, insbesondere eine Elektrode, zur TEER-Wert-Messung auf.
Erfindungsgemäß bevorzugt weist der erste Reaktorbereich eine Elektrode zur TEER-Wert-Messung und auch der zweite Reaktorbereich eine Elektrode zur TEER-Wert-Messung auf.
Durch die fakultativ eingebauten Elektroden kann die Besiedlungsdichte der Zellen auf der Trägerstruktur mittels TEER-Wert-Messung in vorteilhafter Weise kontrolliert werden.
Erfindungsgemäß bevorzugt sind in den Bioreaktor messtechnische Vorrichtungen integriert, die die Messung der Trübung, des pH-Werts, des Glukosegehalts und/oder des Sauerstoffgehalts der Flüssigkeit, insbesondere des Zellkulturmediums erlauben. Es kann beispielsweise eine optische Trübungsmessung vorgesehen sein.
Erfindungsgemäß bevorzugt weist der erste Reaktorbereich eine Messeinrichtung zur Messung der Flüssigkeitsmenge, bzw. des Flüssigkeitsvolumens auf. Erfindungsgemäß bevorzugt weist der zweite Reaktorbereich eine Messeinrichtung zur Messung der Flüssigkeitsmenge, bzw. des Flüssigkeitsvolumens auf. Durch die Messung der Flüssigkeitsmenge im Bioreaktor oder in Teilbereichen des Bioreaktors kann zum Beispiel die exakt gewünschte Menge an Enzym-Lösung zum ablösen der Zellen eingefüllt werden, um das wei ter unten erfindungsgemäß bevorzugte Ablöseverfahren der Zellen einfach durchführen zu können, insbesondere automatisch durchführen zu können.
Es kann aber auch vorgesehen sein, dass kein Messung der Flüssigkeitsmenge im Bioreaktor erfolgen muss, da die Volumina der Reaktorbereich genau bekannt sind, und die gewünschten beziehungsweise benötigten Mengen dadurch ebenso bekannt sind und, beispielsweise computergesteuert, genau dosiert zugegeben werden können
Insbesondere kann der zweite Reaktorbereich, insbesondere der vom Reaktorunterteil umgebene Reaktorbereich, ein Volumen von 5 ml bis 20 ml haben.
Insbesondere kann der zweite Reaktorbereich, insbesondere der vom Reaktorunterteil umgebene Reaktorbereich, ein Volumen von mindestens 10 ml haben. Insbesondere kann der zweite Reaktorbereich, insbesondere der vom Reaktorunterteil umgebene Reaktorbereich, ein Volumen von höchstens 15 ml haben.
Erfindungsgemäß bevorzugt sind die beiden Reaktorbereiche des erfindungsgemäßen Bioreaktors in etwa gleich groß und/oder nehmen in etwa das gleiche Volumen ein.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist dabei der obere Reaktionsbereich etwas größer, insbesondere größer als der untere Reaktionsbereich.
Erfindungsgemäß bevorzugt weist der Bioreaktor Stützelemente zur Fixierung der Membran auf. Erfindungsgemäß bevorzugt weißt das erste Reaktorgehäuseteil Stützelemente zur Fixierung der Membran auf. Erfindungsgemäß bevorzugt weißt das zweite Reaktorgehäuseteil Stützelemente zur Fixierung der Membran auf. Erfindungsgemäß bevorzugt weißt das erste und das zweite Reaktorgehäuseteil Stützelemente zur Fixierung der Membran auf. Erfindungsgemäß bevorzugt weißt das Reaktorunterteil und der Reaktordeckel Stützelemente zur Fixierung der Membran auf.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Bioreaktorgehäuse, insbesondere die Reaktorgehäuseteile, aus Kunststoff oder Plexiglas hergestellt. Dem Fachmann sind geeignete Kunststoffe, aber auch andere mögliche Materialien für das Bioreaktorgehäuse bekannt. Mögliche Kunststoffe sind beispielsweise Polypropylen oder Polystyrol.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Bioreaktorgehäuse, insbesondere die Reaktorgehäuseteile, zumindest in Teilbereichen durchsichtig. Es können insbesondere durchsichtige Teilbereiche vorgesehen sein, die die Beobachtung der Zellen auf der Membran ermöglichen.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Bioreaktorgehäuse, insbesondere die Reaktorgehäuseteile, sterilisierbar, insbesondere autoklavierbar. Somit kann das Gehäuse des Bioreaktors mehrfach verwendet werden. Dadurch wird ein breites Anwendungsspektrum geschaffen.
Es kann aber auch vorgesehen sein, den Bioreaktor als Einwegprodukt auszuführen.
Insbesondere kann ein Bioreaktor als Einwegprodukt mit einem, mehreren oder allen folgender fakultativer Merkmale vorgesehen sein:

– Alle Bestandteile des Bioreaktors sind als Einwegprodukt ausgestaltet.
– Das Reaktorgehäuse des Bioreaktors besteht aus Kunststoff, insbesondere Polypropylen oder Polystyren.
– Das Reaktorgehäuse ist im Spritzgussverfahren hergestellt.
– Die Membran-Einheit oder die Membran ist an das Reaktorunterteil befestigt.
– Der Bioreaktordeckel kann von der Einheit aus Reaktorunterteil und Membran-Einheit abgehoben werden.
– Der Bioreaktor weist als einzige Öffnungen zwei Pipettieröffnungen und wahlweise eine Belüftungsöffnung auf.
– Die zwei Pipettieröffnungen befinden sich auf der Oberseite des Reaktordeckels.
– Die erste Pipettieröffnung führt zum ersten Reaktorbereich und die zweite Pipettieröffnung führt zum zweiten Reaktorbereich.
– Der Bioreaktor weist Septen auf.
– Der Bioreaktor hat eine Breite von mindestens 6 cm und höchsten 12 cm, insbesondere zwischen 8 cm und 9 cm, und eine Länge von mindestens 10 cm und höchstens 14 cm, insbesondere von mindestens 12 cm und höchstens 13 cm.
– Der Bioreaktor hat eine Breite und eine Länge in der Dimensionierung einer standardisierten Multiwellplatte.
– Der Bioreaktor hat eine Höhe von mindestens 1 cm und höchstens 10 cm.
– Die Membran hat eine Flächenausdehnung von 50 cm² bis 120 cm², insbesondere von 75 cm² bis 85 cm². Insbesondere kann die Membran eine Flächenausdehnung von etwa 80 cm² haben.

Natürlich kann ein solcher Bioreaktor auch andere Merkmale und weitere Merkmale der vorliegenden Erfindung aufweisen.
Ein erfindungsgemäßer Bioreaktor kann GMP-konform ausgestaltet werden, und das Risiko der Kontamination oder des Sterilitätsverlustes bei der Kultivierung der Zellkulturen ist verringert. Dabei wird die Verwendung von Einwegelementen auf ein Minimum reduziert, ohne dass das Kontaminationsrisiko signifikant erhöht werden würde.
Dem Fachmann sind mögliche Formen des Bioreaktors bekannt. Der Fachmann kann ohne weiteres die Form des Bioreaktors seinen Bedürfnissen anpassen. Erfindungsgemäß bevorzugt ist der Bioreaktor kastenförmig, schachtelförmig oder dosenförmig ist.
Insbesondere kann der Bioreaktor eine Länge und eine Breite haben, die standardisierten Längen und Breiten von Zellkulturgefäßen, beispielsweise Multiwellplatten, entspricht.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist ein Bioreaktor, der selbst keine Mikropumpe enthält.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung des erfindungsgemäßen Bioreaktors.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist die Verwendung eines erfindungsgemäßen Bioreaktors zum Kultivieren von Zellen. Erfindungsgemäß bevorzugt ist die Verwendung eines erfindungsgemäßen Bioreaktors zum Kultivieren und Expandieren von Zellen.
Erfindungsgemäß bevorzugt sind die Zellen adhärente Zellen.
Erfindungsgemäß bevorzugt sind die Zellen eukaryotische Zellen. Erfindungsgemäß bevorzugt sind die Zellen tierische Zellen. Erfindungsgemäß bevorzugt sind die Zellen Säugetierzellen, insbesondere humane, bovine oder murine Zellen.
Es können alternativ aber auch prokaryontische Zellen, pflanzliche Zellen oder pilzliche Zellen kultiviert werden, insbesondere wenn es sich um adhärente Zellen handelt.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist die Verwendung eines erfindungsgemäßen Bioreaktors in einer automatisierten Vorrichtung zum Herstellen von Gewebe aus Zellkulturen.
Der erfindungsgemäße Bioreaktor kann alternativ aber auch manuell verwendet werden, beispielsweise unter einer Sterilbank zusammengebaut und befüllt werden und dann in einem Brutschrank inkubiert werden.
Der Bioreaktor kann wahlweise als sogenanntes Stand-Alone-Modul oder als Komponente in einem Gesamtsystem, beispielsweise zur Herstellung von Zellgewebe aus Biopsien, eingesetzt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Kultivierung von Zellen, wobei zur Kultivierung ein erfindungsgemäßer Bioreaktor verwendet wird. Erfindungsgemäß bevorzugt werden die Zellen in dem Verfahren kultiviert und expandiert.
Der erfindungsgemäße Bioreaktor erlaubt das Durchführen eines vollautomatisierten Kultivierungsverfahrens von Zellen, welches in vorteilhafter Weise unter GMP-konformen Bedingungen durchgeführt werden kann.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere auch ein Verfahren zur Kultivierung von Zellen, enthaltend die Schritte a) Bereitstellen eines erfindungsgemäßen Bioreaktors, b) Aufbringen von Zellen auf die Membran der Membran-Einheit, c) Kultivieren der Zellen in dem Bioreaktor.
Es ist dabei vorgesehen, dass die Schritte in der angegebenen Reihenfolge durchgeführt werden. Erfindungsgemäß bevorzugt werden die Schritte a), b) und c) unmittelbar aufeinander folgend, ohne weitere Zwischenschritte durchgeführt.
Erfindungsgemäß bevorzugt werden die Zellen in Schritt b) in einer Flüssigkeit, insbesondere in einem Zellkulturmedium, kultiviert.
Erfindungsgemäß bevorzugt sind die Zellen adhärente Zellen. Erfindungsgemäß bevorzugt sind die Zellen eukaryotische Zellen. Erfindungsgemäß bevorzugt sind die Zellen tierische Zellen. Erfindungsgemäß bevorzugt sind die Zellen Säugetierzellen, insbesondere humane, bovine oder murine Zellen.
Erfindungsgemäß bevorzugt werden die Zellen in Schritt b) adhärieren gelassen, dann wird zu Beginn von Schritt c) der Bioreaktor zum ersten Mal mit Zellkulturmedium geflutet. Dies geschieht bevorzugt über eine der Öffnungen des Bioreaktors.
Um die Einhaltung von Wachstumsbedingungen, beispielsweise in Bezug auf Zell-Zell-Kontakte, und des dadurch nötigen mehrfachen Passagierens zu lösen, wurde eine neuartige Besiedlungsmethode der Zellwachstumsmembran mit Primärzellen entwickelt. Diese wird erfindungsgemäß bevorzugt in Schritt b) verwendet.
Dabei wird erfindungsgemäß bevorzugt die als Zellwachstumsfläche vorgesehene Membran beim Besiedeln nicht ganzheitlich mit Zellflüssigkeit benetzt, sondern einzelne gleichmäßig auf der Zellwachstumsfläche verteilte Zellverbünde erstellt.
Erfindungsgemäß bevorzugt werden die in einem Zellkulturmedium suspendierten Zellen mit einer Pipette tröpfchenweise mit etwa gleichbleibendem, insbesondere mit gleichbleibendem, Abstand in Schritt b) auf die Membran pipettiert.
Bei einer Membran mit einer Länge von 10 cm bis 14 cm und einer Breite von 6 cm bis 10 cm werden die Zellen insbesondere in einem Gesamtflüssigkeitsvolumen von 1 ml bis 10 ml, insbesondere von 3 ml bis 5 ml aufgebracht. Die Gesamtflüssigkeitsmenge wird in Tropfen aufgeteilt.
Bei diesem Vorgang sind für einen Fachmann folgende Parameter variierbar: Tropfenvolumen, Tropfenabstand, Zellkonzentration im Tropfen und/oder Wartezeit bis zum ersten Medienwechsel.
Mit diesen Parametern kann auch das Kultivierungsverhalten der jeweiligen Zellen verändert werden.
Die Zellkonzentration innerhalb eines Tropfens führt dabei zur Einhaltung der für das Zellwachstum notwendigen Zell-Zell-Kontakte bei gleichzeitiger Vergrößerung der verfügbaren Zellwachstumsfläche auf ein Vielfaches der Zellwachstumsfläche eines Standardkulturgefäßes im Labor. Darüber hinaus stellt diese bevorzugte Besiedlungsmethode eine gleichmäßige Verteilung der Zellen über das poröse Material als Kulturfläche sicher, während in den Standardkulturgefäßen die Verteilung der Zellen zufällig erfolgt und häufig in den Randbereichen höher ist als in der Mitte. Eine gleichmäßige Zellverteilung hat den Vorteil, dass die Wachstumsbedingungen auf dem besiedelten porösen Material einheitlich sind. Durch die nun ausreichend große Zellwachstumsfläche können insbesondere zusätzliche Passagierschritte der Zellen, insbesondere im automatisierten Prozess, vermieden werden, wodurch eine Reihe von Handhabungsschritten entfallen, die ansonsten den automatisierten Prozess erschweren und den Zellen schaden.
Erfindungsgemäß bevorzugt liegt das Tropfenvolumen zwischen mindestens 2,5 μl und höchstens 30 μl. Das Tropfenvolumen kann beispielsweise 2,5 μl, 5 μl, 10 μl, 20 μl oder 30 μl betragen.
Erfindungsgemäß bevorzugt sind in einem Tropfen zwischen 10 und 500, insbesondere zwischen 25 und 350 Zellen, beispielsweise etwa 20, 40, 80, 160 oder 320 Zellen, bei Aussaht vorhanden.
Erfindungsgemäß bevorzugt werden die Zellen in einer Zellkonzentration bei der Aussaat von ca. 4000 bis ca. 20.000 Zellen/cm², insbesondere von ca. 4000 bis ca. 16.000 Zellen/cm² auf die poröse Oberfläche aufgebracht. Es können beispielsweise 4.000 Zellen/cm², 5.000 Zellen/cm², 8.000 Zellen/cm², 10.000 Zellen/cm², 16.000 Zellen/cm² oder 20.000 Zellen/cm² auf das poröse Material, insbesondere die Membran, aufgebracht werden. Bei einer Membranfläche von ca. 80 cm² wären dass in etwa 320000–1.280.000 Zellen pro Bioreaktor.
Durch eine gleichmäßige tröpfchenweise Besiedlung der Zellwachstumsfläche, kann diese auf ein vielfaches vergrößert werden, ohne die Bedingungen für eine erfolgreiche Zellexpansion zu verletzen. So wird die, für eine passagierfreie Zellexpansion, notwendige Größe der Zellwachstumsfläche erreicht.
Auch die zusätzliche Schädigung der Zellen beim Passagieren durch die Einwirkung von Enzymreaktionen oder mechanische Belastung können auf ein Minimum, insbesondere auf eine einzige Ablösung der Zellen am Ende des Kultivierungszeitraums, reduziert werden.
Somit bleibt bevorzugt als einziger nötiger Ablösevorgang der Zellen der Zeitpunkt der Zellernte nach abgeschlossener Kultivierung. Weiterhin kann durch eine neue Ablösemethode die schädliche Wirkung des Enzyms auf die Zellen minimiert werden.
Die Besiedlung der Zellwachstumsmembran kann alternativ auch auf eine andere Art und Weise als das Pipettieren von Tröpfchen erfolgen, beispielsweise durch besprühen mit in Flüssigkeit suspendierten Zellen.
Erfindungsgemäß bevorzugt werden adhärente Zellen in Schritt b) an die Membran adhärieren gelassen und dann unter Zugabe von Flüssigkeit, insbesondere von Zellkulturmedium, weiter kultiviert.
Erfindungsgemäß bevorzugt wird in Schritt c) die Flüssigkeit erneuert. Dies kann insbesondere durch die zum Einlassen und/oder Auslassen einer Flüssigkeit geeigneten Öffnungen erfolgen. Die Erneuerung der Flüssigkeit kann kontinuierlich, semi-kontinuierlich oder schrittweise erfolgen.
Erfindungsgemäß bevorzugt wird dabei neue Flüssigkeit durch die Öffnung des ersten oder des zweiten Reaktorgehäusteils eingeführt und alte Flüssigkeit durch die Öffnung des ersten oder des zweiten Reaktorgehäuseteils abgeführt.
Erfindungsgemäß bevorzugt wird dabei neue Flüssigkeit durch die Öffnung des Reaktordeckels eingeführt und alte Flüssigkeit durch die Öffnung des Reaktorunterteils abgeführt.
Es kann aber alternativ auch vorgesehen sein, die Flüssigkeit durch Pipettieröffnungen einzuführen und abzuführen.
Es kann aber alternativ auch vorgesehen sein, die Flüssigkeit nicht zu erneuern.
Es kann vorgesehen sein über eine Prozess-Kontrolle des Schritts c), beispielsweise über Elektroden zur TEER-Wert-Messung und/oder der automatisierten Medienzufuhr der Zustand der Zellen messtechnisch auf unterschiedlichste Parameter zu untersuchen. Insbesondere kann vorgesehen sein, die Dauer des Schrittes c) durch die TEER-Wert-Messung zu bestimmen. Dabei kann Schritt c) in vorteilhafter Weise beendet werden, wenn die gewünschte Zelldichte erreicht ist, insbesondere wenn die Zellen nahezu konfluent sind oder konfluent sind.
Erfindungsgemäß bevorzugt werden die Zellen nach dem Kultivieren von der Membranoberfläche in einem Schritt d) abgelöst. Erfindungsgemäß bevorzugt erfolgt das Ablösen mit einer zum Ablösen der Zellen geeigneten Lösung. Erfindungsgemäß bevorzugt erfolgt das Ablösen enzymatisch.
Das enzymatische Ablösen kann mit enzymhaltigen Lösungen durchgeführt werden, wie sie auch im stand der Technik zum Ablösen adhärenter Zellen verwendet werden. Insbesondere wird der Fachmann als Enzym Trypsin verwenden, insbesondere in einer EDTA-Lösung. Der Fachmann kennt dabei geeignete Trypsinkonzentrationen.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Enzym Trypsin. Es können aber auch andere dem Fachmann bekannte Enzyme verwendet werden, wie zum Beispiel Accutase oder rProtease.
Die Enzym-Lösung kann entweder durch eine der Öffnungen des Bioreaktors oder durch den geöffneten Bioreaktor eingefüllt werden.
Erfindungsgemäß bevorzugt wird die zum Ablösen der Zellen geeignete Lösung durch eine der zum Einlassen und/oder Auslassen einer Flüssigkeit geeigneten Öffnungen in den Bioreaktor eingefüllt und damit zu der Membran gebracht.
Die erfindungsgemäße Konstruktion des Bioreaktors und die Position der zum Einlassen und/oder Auslassen einer Flüssigkeit geeigneten Öffnungen erlauben die Durchführung eines schonenden Ablöseprozesses und eine Steigerung der Vitalität der abgelösten Zellen.
Erfindungsgemäß bevorzugt wird die Ablösung der an der Membran adhärierten Zellen über eine Enzymreaktion gesteuert, wobei das Enzym lediglich durch die poröse Membran am Kontakt der Zellschicht mit der Membran einwirken kann.
Erfindungsgemäß bevorzugt werden die Zellen nach dem Kultivieren von der Membranoberfläche abgelöst, wobei in den Reaktorbereich, der an die nicht zellbehaftete Oberfläche der Membran angrenzt durch die Öffnung dieses Reaktorbereichs eine zum Ablösen der Zellen geeignete Lösung eingefüllt wird, so dass die Lösung mit der Membran Kontakt hat. Erfindungsgemäß bevorzugt hat die zum Ablösen der Zellen geeignete Lösung nur zu den mit der Membran verbundenen Zellausläufern der Zelle Kontakt.
Erfindungsgemäß bevorzugt wird die zum Ablösen der Zellen geeignete Lösung durch die Öffnung des Reaktorunterteils in den Bioreaktor eingebracht. Erfindungsgemäß bevorzugt wird nur soviel der Lösung eingebracht, dass die Füllhöhe der Lösung gerade die Membran erreicht. Da die Zellen vorzugsweise auf der Membranoberfläche anhaften, die dem Reaktordeckel zugewandt ist, hat die zum Ablösen der Zellen geeignete Lösung somit nur zu den mit der Membran verbundenen Zellausläufern der Zellen Kontakt.
Durch Variationen in der Konstruktion des Reaktors ist es ebenfalls möglich den Ablöseprozess zu modifizieren und die enzymatische Ablösung durch physikalische Methoden zu unterstützen oder gege benenfalls zu ersetzen. Als physikalische Methoden kommt eine Druckbeaufschlagung des Reaktorunterteils in Frage, weiterhin ist auch eine Unterstützung des Ablöseprozesses durch Klopfen und/oder Schütteln des Bioreaktors möglich. Als physikalische Methoden kommt auch der Einsatz von Ultraschall oder von aufsteigenden Luftblasen aus der Reaktorunterseite in Frage.
In einer erfindungsgemäßen alternativen Ausführungsform werden in Schritt d) die Zellen enzymatisch abgelöst, wobei das Ablösen durch physikalische Methoden unterstütz wird. Damit wird der Ablösevorgang beschleunigt.
Es kann vorgesehen sein, dass die Zellen in Schritt d) oder nach Schritt d) auch durch Überdruck abgelöst werden. Beispielsweise kann die zum Ablösen der Zellen geeignete Lösung mit Druck durch die Membran hindurchgedrückt werden.
Es kann zum Beispiel vorgesehen sein, in schritt d), insbesondere über das Leitsystem, das Zellkulturmedium zu entfernen und beide Reaktorbereiche mit PBS-/EDTA zu befüllen und für 1 bis 30 min zu inkubieren. Dieser Vorgang kann je nach Zelltyp 1 bis 2 mal wiederholt werden. Dann kann das vollständige Entleeren beider Reaktorbereiche und das anschließende Befüllen des unteren Reaktorbereichs mit einer Enzymlösung erfolgen. Für einen definierten Bereich von 0,2 bis 10 min und der Applikation eines definierten Druckes im Bereich von 50 bis 2000 Pa kann die Enzymlösung durch die Poren mit einem Durchmesser im Bereich von 0,1 bis 10 μm der Membran auch an die Kontaktstellen der Zellen zu der Membranoberseite geführt werden. Anschließend kann ein Inkubationsschritt mit einer Dauer im Bereich von 0,5 bis 10 min erfolgen.
Zur Unterstützung des Ablösevorgangs kann beim Ablösen oder anschließend, also nach dem Ablösen, ein Druck in der unteren Kammer im gleichen Druckbereich angelegt werden. Dieser kann zusätzlich mit einer Frequenz von 0,1 bis 200 Hz moduliert werden. Zusätzlich kann durch mechanische Anregung des gesamten Reaktors der Vorgang verstärkt werden. Durch die angelegten Drücke ergeben sich insbesondere Volumenströme durch die Membran im Bereich von 0,5 bis 20 ml/(min cm²).
Es kann vorgesehen sein, die Zellen nach Beendigung von Schritt d) in einem Schritt e) von der Membran zu entfernen. Beispielsweise können die Zellen in Zellkulturmedium, insbesondere in Serum-haltigem Zellkulturmedium aufgenommen und dann abgesaugt oder abpipettiert werden.
Es kann auch vorgesehen sein nach der Beendigung von Schritt d) in Schritt e) mehr der zum Ablösen der Zellen geeigneten Lösung einzuführen und die Zellen dadurch von der porösen Oberfläche wegzudrücken.
Es kann vorgesehen sein, dass die Zellen in schritt d) oder nach Schritt d) vereinzelt werden, beispielsweise mit Hilfe von Trypsin.
Erfindungsgemäß bevorzugt wird das Verfahren automatisiert, insbesondere in einer automatisierten Vorrichtung zum Herstellen von Gewebe aus Zellkulturen und/oder mit einem Roboter durchgeführt.
Erfindungsgemäß bevorzugt wird das Verfahren in einer automatisierten Vorrichtung zum Herstellen von Gewebe aus Zellkulturen durchgeführt.
Der erfindungsgemäße Bioreaktor erlaubt somit in vorteilhafter weise eine automatisierte Durchführung der Zellkultivierung von Zellen, insbesondere von adhärenten Zellen.
Dabei ist eine vorteilhafte Vergrößerung der Zellwachstumsfläche unter Einhaltung der Zellwachstumsbedingungen möglich.
Der erfindungsgemäße Bioreaktor erlaubt auch eine Vermeidung von Passagierschritten, die, insbesondere in einem automatisierten Prozess, sehr aufwendig sind und die Zeilen leicht schädigen können.
Der erfindungsgemäße Bioreaktor sieht bevorzugt eine Integration von Messtechnik vor, insbesondere zur TEER-Wert-Messung. Somit kann, insbesondere auch in automatisierten Prozessen eine genaue Bestimmung des Erntezeitpunktes erfolgen.
Der erfindungsgemäße Bioreaktor ermöglicht ein erfindungsgemäßes zellschonendes Verfahren zur Ablösung der Zellen von der Membran, bei dem nur die Kontaktbereiche der Zellen zur Membran mit dem zum Ablösen verwendeten Enzym in Kontakt kommen.
Der erfindungsgemäße Bioreaktor, seine erfindungsgemäße Verwendung und die erfindungsgemäßen Verfahren können insbesondere in automatisierten Systemen, die für die Kultivierung von adhärenten Zellen betrieben werden, eingesetzt werden.
Der erfindungsgemäße Bioreaktor, seine erfindungsgemäße Verwendung und die erfindungsgemäßen Verfahren können aber auch im Labormaßstab genutzt werden, insbesondere um das Kontaminationsrisiko zu minimieren und ein direktes Dosieren von Flüssigkeiten auf das Präparat zu vermeiden.
Der erfindungsgemäße Bioreaktor, seine erfindungsgemäße Verwendung und die erfindungsgemäßen Verfahren können insbesondere bei der Kultivierung von Zellen zum Tissue Engineering eingesetzt werden.
Der erfindungsgemäße Bioreaktor, seine erfindungsgemäße Verwendung und die erfindungsgemäßen Verfahren können insbesondere bei der Kultivierung verschiedener Zelltypen zur Herstellung von künstlicher Haut als in vitro Testsystem oder als Transplantat eingesetzt werden.
Der erfindungsgemäße Bioreaktor, seine erfindungsgemäße Verwendung und die erfindungsgemäßen Verfahren können insbesondere auch bei der Kultivierung verschiedener Zelltypen zur Herstellung von künstlichen Knorpeltransplantaten eingesetzt werden.
Erfindungsgemäß bevorzugte und alternative Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Bioreaktors sind auch als erfindungsgemäß bevorzugte und alternative Ausführungsformen der Verwendungen des Bioreaktors und als erfindungsgemäß bevorzugte und alternative Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren zu verstehen.
Erfindungsgemäß bevorzugte und alternative Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verendungen sind auch als erfindungsgemäß bevorzugte und alternative Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Bioreaktors und als erfindungsgemäß bevorzugte und alternative Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren zu verstehen.
Erfindungsgemäß bevorzugte und alternative Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren sind auch als erfindungsgemäß bevorzugte und alternative Ausführungsformen der Verwendungen des Bioreaktors und als erfindungsgemäß bevorzugte und alternative Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Bioreaktors zu verstehen.
Besondere Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich auch aus den Unteransprüchen.
Weitere Vorteile der Erfindung ergeben sich aus den nachfolgend beschriebenen Figuren.
1 zeigt nicht maßstäblich eine erfindungsgemäß bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Bioreaktors in zusammengebautem Zustand.
2 zeigt nicht maßstäblich eine erfindungsgemäß bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Bioreaktors in auseinander gebautem Zustand.
3 zeigt verschiedene Ansichten eines alternativen erfindungsgemäßen Reaktordeckels.
4 zeigt verschiedene Ansichten eines alternativen erfindungsgemäßen Reaktorunterteils.
5 veranschaulicht ein erfindungsgemäß bevorzugtes Verfahren zum aufbringen der Zellen auf die Membran der Membran-Einheit des Reaktors.
1 zeigt nicht maßstäblich eine erfindungsgemäß bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Bioreaktors (100) in zusammengebautem Zustand. Der Bioreaktor besteht aus einem Reak torunterteil (20), einem Reaktoroberteil (30) und einer Membran-Einheit, die aus einer Membran (10) und einem Rahmen (15) gebildet wird. Reaktorunterteil (20) und Reaktoroberteil (30) haben Stützelemente (21, 31), die die Membran (10) fixieren. Reaktorunterteil (20) und Reaktoroberteil (30) sind luftdicht verbunden, so dass einzig die als Anschlüsse ausgebildeten Öffnungen (24, 34) die Reaktorkammern (22, 32) über die Leitsysteme (23, 33) mit der Umgebung des Bioreaktors (100) verbinden. Die Leitsysteme (23, 33) stellen eine kontinuierliche und gleichmäßige Versorgung der Zellwachstumsmembran über die gesamte Fläche sicher. Eine fakultative Belüftungsöffnung oder Pipettieröffnung ist nicht gezeigt. Reaktorunterteil (20) und Reaktoroberteil (30) haben beide Elektroden (26, 36) zur Messung des TEER-Wertes von kultivierten Zellen. Über die gemessenen TEER-Werte kann der Wachstumsprozess kontrolliert und der optimale Erntezeitpunkt bestimmt werden.
Die Membran (10) hat eine Oberseite (11) und eine Unterseite (12). Bevorzugt werden adhärente Zellen auf der Membranoberseite (11) kultiviert. Dabei werden die Reaktorkammern (22, 32) über eine der Öffnungen (24, 34) mit Zellkulturmedium geflutet. Wenn die TEER-Wert-Messung über die Elektroden (26, 36) ergibt, dass eine optimale Zelldichte erreicht ist, beispielsweise dass die Zellen konfluent gewachsen sind, kann das Zellkulturmedium über die untere Öffnung (24) abgelassen werden. Durch die Öffnung (24) kann dann eine Trypsin-haltige Lösung in den Bioreaktor (100) eingeführt werden. Es wird sovile der Lösung eingeführt, dass diese gerade Kontakt zur Membran (10) bekommt. Dadurch werden die Zellen von der Membranoberfläche (11) abgelöst, die Zellen kommen aber nur mit ihren Membrankontaktpunkten mit dem Trypsin in Kontakt, so dass sie weniger geschädigt werden als bei einem konventionellen Ablösen der Zellen.
2 zeigt nicht maßstäblich den erfindungsgemäß bevorzugten Bioreaktors (100) von 1 in auseinander gebautem Zustand. Das Reaktoroberteil (30) und die Membran-Einheit, die aus einer Membran (10) und einem Rahmen (15) gebildet wird, sind vom Reaktorunterteil (20) abgetrennt. Somit ist die Membranoberfläche (11) der Membran (10) zugänglich und kann mit Zellen besiedelt werden, beispielsweise durch Aufpipettieren der Zellen. Danach können Reaktoroberteil (30), die Membran-Einheit und Reaktorunterteil (20) wieder zusammenmontiert werden.
Gezeigt sind wiederum Öffnungen (24, 34), Reaktorkammern (22, 32) und Leitsysteme (23, 33), sowie Elektroden (26, 36).
3 und 4 zeigen verschiedene Ansichten eines erfindungsgemäß bevorzugten Reaktordeckels (30) und eines erfindungsgemäß bevorzugten Reaktorunterteils (20). Reaktordeckel (30) und Reaktorunterteil (20) haben in etwa die Länge und die Breite einer Multiwellplatte. Zu sehen sind bei beiden Reaktorgehäuseteilen die Stützelemente (21, 31).
In 3 sind auch eine Belüftungsöffnung (37) und zwei Pipettieröffnungen (28, 38) zu sehen. Die Pipettieröffnung (38) dient als Zugang zur oberen Reaktionskammer. Die Pipettieröffnung (28) dient als Zugang zur unteren Reaktionskammer. Dieser Zugang wird durch ein Leitsystem ermöglicht, das an der zwischen den Reaktionskammern liegenden Membran abgedichtet vorbeiführt.
Die in 4a gezeigte Vergrößerung zeigt eine spezielle Ausgestaltungsform eines Stegs (28), der die Einleitung von Flüssigkeit durch die Pipettieröffnung (28) vereinfacht. In 4 ist eine montierte Elektrode (26) dargestellt. Durch die Bohrungen (39) können die beiden Reaktorgehäuseteile (20, 30) miteinander verschraubt werden.
5 veranschaulicht ein erfindungsgemäß bevorzugtes Verfahren zum Aufbringen der Zellen auf die Membran der Membran-Einheit des Reaktors. Gezeigt ist eine Membran-Einheit mit einer Membran (10) und einem Rahmen (15). Die Membranoberseite (11) der Membran (10) ist mit zellenhaltigen Tropfen (60) aus Zellkulturmedium gleichmäßig bedeckt. Die Vergrößerung zeigt einem Ausschnitt der Membranoberfläche (11) mit einem Tropfen (61) und darin enthaltenen Zellen (62).

Tabelle 1 zeigt beispielhaft verschiedene Membranen, die verwendet werden können:

Typ	Firma	Material	Porengröße (μm)	Porendichte/cm²
M2020	Oxyphen	PC	0,4	100 × 106
M2014	Oxyphen	PC	5,0	0,4 × 10⁶
M2017	Oxyphen	PC	8,0	0,1 × 10⁶
M2019	Oxyphen	PET	0,4	100 × 10⁶
M2016	Oxyphen	PET	1,0	22 × 10⁶
M2015	Oxyphen	PET	3,0	2 × 10⁶
M2018	Oxyphen	PET	8,0	0,2 × 10⁶
IDO,45	Pall	Nylon	0,45
ID1,2	Pall	Nylon	1,2
ID3,0	Pall	Nylon	3,0
ID5,0	Pall	Nylon	5,0
BDA	Pall	amphoteres Nylon	0,45
BDB	Pall	pos. gel. Nylon	0,45
BDC	Pall	neg. gel. Nylon	0,45
MC CM	Millipore	PTFE	0,4
MC HA	Millipore	Celluloseester	0,45
MC PCF	Millipore	PC	0,4
OE67	Whatman	Celluloseacetat	0,45
CN45	Whatman	Cellulosenitrat	0,45
ME25	Whatman	Cellulosemischester	0,45
RC55	Whatman	regenerierte Celluolse	0,45
BA85	Whatman	reine Cellulose	0,45
N45	Whatman	Nytran+	0,45
SuPer45	Whatman	Nytran SuPerCharge+++	0,45

Tabelle 1: Beispielhafte Auflistung von Membranen, die in dem erfindungsgemäßen Bioreaktor verwendet werden können.

Das Verfahren sieht also vor die in einem Zellkulturmedium suspendierten Primärzellen mit einer Pipette tröpfchenweise mit gleichbleibender Abstand auf die Zellwachstumsmembran zu pipettieren.
Erst nachdem die Zellen adhäriert sind, wird der Bioreaktor (100) zusammengesetzt und mit Zellkulturmedium geflutet. Die Zellkonzentration innerhalb des Tropfens führt dabei zur Einhaltung der für das Zellwachstum notwendigen Zell-Zell-Kontakte bei gleichzeitiger Vergrößerung der verfügbaren Zellwachstumsfläche auf ein Vielfaches der Zellwachstumsfläche eines Standardkulturgefäßes im Labor. Darüber hinaus stellt diese Besiedlungsmethode eine gleichmäßige Verteilung der Zellen über die Kulturfläche sicher, während in den Standardkulturgefäßen die Verteilung der Zellen zufällig erfolgt und häufig in den Randbereichen höher ist als in der Mitte. Eine gleichmäßige Zellverteilung hat den Vorteil, dass die Wachstumsbedingungen innerhalb des Kulturgefäßes einheitlich sind. Durch die nun ausreichend große Zellwachstumsfläche kann auf ein Passagieren der Zellen im automatisierten Prozess verzichtet werden, wodurch eine Reihe von Handhabungsschritte entfallen, die ansonsten den automatisierten Prozess erschweren würden.
Auch eine zusätzliche Schädigung der Zellen beim mehrfachen Passagieren durch die Einwirkung von Enzymreaktionen oder mechanische Belastung können auf ein Minimum, d. h. einen einzige Ablösung der Zellen am Ende des Kultivierungszeitraums, reduziert werden, da die Membran genügend Platz zum Wachstum und zur Vermehrung der Zellen bietet.
Somit bleibt als einziger nötiger Ablösevorgang der Zellen der Zeitpunkt der Zellernte nach abgeschlossener Kultivierung. Weiterhin kann durch die bevorzugte Ablösemethode die schädliche Wirkung des Enzyms auf die Zellen minimiert werden.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

- WO 2004/020571 A2 [0007]

Claims

Bioreaktor zur Kultivierung von Zellen, wobei der Reaktorraum des Bioreaktors durch eine zumindest in Teilbereichen flüssigkeitsdurchlässige Membran-Einheit in zwei Reaktorbereiche unterteilt wird und wobei jeder dieser zwei Reaktorbereiche eine zum Einlassen und/oder Auslassen einer Flüssigkeit geeignete Öffnung aufweist.
Bioreaktor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Bioreaktor in mindestens drei Teile zerlegbar ist, nämlich a) eine Reaktorgehäuseteil, das den ersten Reaktorbereich umgibt; b) eine Reaktorgehäuseteil, das den zweiten Reaktorbereich umgibt; c) die zumindest in Teilbereichen flüssigkeitsdurchlässige Membran-Einheit.
Biorektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das erste Reaktorgehäuseteil als Reaktordeckel und das zweite Reaktorgehäuseteil als Reaktorunterteil ausgestaltet ist.
Biorektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die zwei Reaktorgehäuseteile miteinander luftdicht verbunden werden können, insbesondere durch eine Verschraubung.
Bioreaktor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Membraneinheit aus einer Membran und einem Rahmen be steht oder wobei die Membran-Einheit nur aus einer Membran besteht.
Bioreaktor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Membran-Einheit scheibenförmig ist und mit ihren beiden Oberflächen waagerecht zwischen den beiden Reaktorbereichen liegt.
Bioreaktor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Membran zwischen 25% und 100% der Fläche der Membraneinheit einnimmt.
Bioreaktor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Membran eine Porengröße von mindestens 0,1 μm und höchstens 20 μm aufweist.
Bioreaktor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Membran der Membraneinheit eine Porendichte von mindestens 10⁵ Poren pro cm² und höchstens 10⁷ Poren pro cm² aufweist.
Bioreaktor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das erste Reaktorgehäuseteil mindestens eine, insbesondere mit einem Sterilfilter versehene, Belüftungsöffnung und/oder eine verschließbare Pipettieröffnung aufweist.
Bioreaktor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Bioreaktor Elektroden zur TEER-Wert-Messung aufweist.
Bioreaktor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Bioreaktor kastenförmig oder dosenförmig ist.
Verwendung eines Bioreaktors nach einem der vorhergehenden Ansprüche zum Kultivieren von Zellen.
Verwendung eines Bioreaktors nach einem der vorhergehenden Ansprüche in einer automatisierten Vorrichtung zum Herstellen von Gewebe aus Zellkulturen.
Verfahren zur Kultivierung von Zellen, enthaltend die Schritte: a) Bereitstellen eines Bioreaktors nach einem der Ansprüche 1 bis 12; b) Aufbringen von Zellen auf die Membran der Membraneinheit; c) Kultivieren der Zellen in dem Bioreaktor;
Verfahren nach Anspruch 15, wobei nach dem Kultivieren der Zellen, die Zellen von der Membranoberfläche abgelöst werden, dadurch gekennzeichnet, dass in den Reaktorbereich, der an die nicht zellbehaftete Oberfläche der Membran angrenzt durch die Öffnung dieses Reaktorbereichs eine zum Ablösen der Zellen geeignete Lösung eingefüllt wird, so dass die Lösung mit der Membran Kontakt hat.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 16, wobei das Verfahren automatisiert, insbesondere in einer automatisierten Vorrichtung zum Herstellen von Gewebe aus Zellkulturen und/oder mit einem Roboter durchgeführt wird.