DE69821259T2

DE69821259T2 - Simuliertes biologisches auflösungs- und absorptionssystem

Info

Publication number: DE69821259T2
Application number: DE1998621259
Authority: DE
Inventors: K. Yun Tam; Keith Edward Anderson
Original assignee: TAM YUN
Current assignee: TAM YUN
Priority date: 1997-12-02
Filing date: 1998-11-30
Publication date: 2004-11-18
Anticipated expiration: 2018-12-01
Also published as: ATE258221T1; CN1179035C; US6022733A; DE69821259D1; EP1034251A1; DK1034251T3; ES2214751T3; CA2312833A1; WO1999028437A1; CN1284127A; AU1328499A; HK1034993A1; EP1034251B1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Lösungs- und Absorptionssystem, konkret auf ein System bzw. eine Methode, um die Simulation der biologischen Dissolution einer Arzneiformulierung und die Absorption einer darin enthaltenen Arzneiwirkstoffverbindung zu bewerten.
Hintergrund der Erfindung
Ursprünglich wurden Techniken zur Bewertung der Dissolution von Arzneiformulierungen von den Aufsichtsbehörden in der pharmazeutischen Industrie eingeführt, um Freisetzungsprofile von Formulierungen mit geringer Löslichkeit in wässrigen Medien zu beschreiben. Der steigende Bedarf nach kontrolliertem Einsatz von Arzneiformulierungen hat jedoch dazu geführt, dass nunmehr bei den meisten Formulierungen aus Gründen der Qualitätskontrolle und für aufsichtsbehördliche Zwecke Dissolutionstests eingesetzt werden. Darüber hinaus werden Dissolutionstests bei der Entwicklung von Formulierungen verwendet, um die Freisetzungsrate der Wirkstoffverbindung aus der Formulierung und andere Parameter im Zusammenhang mit der Wirksamkeit der Formulierung zu bestimmen, die optimalen Dosierungsformen festzulegen und in vitro/in vivo-Korrelationen (IVIVK) herzustellen.
Bei der Prüfung der Dissolution einer Arzneiformulierung in einem in vitro-System ist üblicherweise eine hohe in vitro/in vivo-Korrelation (IVIVK) erstrebenswert. Ein in vitro-System, welches Daten liefert, die hohe Korrelation mit Lösungs- und Absorptionscharakteristika in vivo aufweisen, wäre für die pharmazeutische Industrie als Werkzeug für verschiedene Anwendungen, wie etwa die Entwicklung von Dosierungsformen und -erhöhungen, Produktionssteigerungen, vergleichende Bioäquivalenzprüfungen von Chargen, Prüfung neuer Arzneistoffstärken, Prüfung kleiner Formulierungsänderungen, Prüfungen nach Veränderungen am Herstellungsort und als Referenz für Bioäquivalenzanforderungen nützlich.
Mit der Weiterentwicklung der Dosierungsformen müssen auch Dissolutionstests strenger werden, um grundlegende Daten darüber zu liefern, wie viel von einer Arzneiwirkstoffverbindung zu bestimmten Zeiten am/an den Absorptionsort/en verfügbar ist. Weiters ermöglicht das Verhältnis zwischen Dosierungsform und Verfügbarkeit einer Arzneiwirkstoffverbindung am/an den Absorptionsort/en sowie den allgemeinen Werten einer Arzneiwirkstoffverbindung im Blut eine Optimierung der in vivo-Wirksamkeit der Arzneiwirkstoffverbindung durch spezielle Darreichungsformen.
Bislang wurde noch keine Dissolutionstechnologie entwickelt, die die Feststellung der IVIVK für Arzneiwirkstoffverbindungen ermöglicht, deren Membranpermeabilität schwach ist, die im Intestinaltrakt starkem Metabolismus ausgesetzt sind, oder die spezielle Transportsysteme zur Absorption benötigen. Bisher beschränkten sich die Techniken zur Korrelierung von Dissolutionsdaten in vitro und in vivo auf Faktoren wie Interaktion mit Muzinen, Gallensalzen, Verdauungsenzymen, Nahrungsmittelwirkungen, Ionenstärke und pH-Wert. Faktoren wie der gastrointestinale Transit einer Dosierungsform können durch Zeitversetzung der Absorptions und Lösungsdaten berücksichtigt werden. Die mangelnde Übereinstimmung zwischen den in vitro- und in vivo-Werten bei Dissolution und Absorption wurden bisher durch Datentransformation korrigiert, wie etwa durch die Anwendung von intestinalen Gewichtungsfunktionen; diese Transformationen lassen jedoch unter Umständen keine physiologische Interpretation zu. Es besteht daher aktueller Bedarf nach einem System, welches die Dissolutionstechnologie einerseits und ein biologisches Modell der Absorption im Intestinaltrakt, wie etwa Zellkulturen, andererseits für den Einsatz bei der Formulierung und Prüfung von Dosierungsformen von Arzneiformulierungen miteinander verbindet. Der Vorteil eines solchen Systems gegenüber bestehenden Dissolutionsmethoden wäre eine stärkere Ähnlichkeit mit dem physiologischen System.
Die Verwendung von Epithelzellkulturen aus dem menschlichen Intestinaltrakt ist mittlerweile eine weithin anerkannte Methode, um Mechanismen der Absorption von Arzneiwirkstoffverbindungen zu demonstrieren. Konventionelle Zellkulturtechniken ermöglichen eine Herstellung von Korrelationen, wenn Wirkstoffverbindungen Epithelschichten mittels passivem transzellulärem oder parazellulärem Transport, trägervermitteltem Transport und aktivem Transport passieren.
Bei aktiv absorbierten Verbindungen oder Verbindungen, deren Absorption eines Trägers oder eines Energie erfordernden Mechanismus bedarf, weist die Absorption üblicherweise eine Komponente der Sättigbarkeit auf. Die derzeitigen Zellkulturtechniken können Einzelheiten der Absorptionswege sowie Trägeraffinität und -kapazität beschreiben. Darüber hinaus können Zellkulturen auch zur Beschreibung von Effluxsystemen, wie etwa Efflux durch P-Glykoprotein, verwendet werden, welche die Absorption bestimmter Verbindungen herabsetzen. Die Metabolisierung einer Verbindung im Intestinaltrakt kann vorkommen und führt zu deren verminderter Absorption. Diese Erkenntnis wird derzeit dazu herangezogen, um mangelnde Übereinstimmungen in der IVIVK zu erklären, indem die kinetischen Modelle zur Verbesserung der IVIVK um die Kinetik der Sättigbarkeit nach Michaelis-Menton oder stattdessen um die Stoffwechsel- oder Efflux-Kinetik erweitert werden. Die derzeitigen Zellkulturtechniken in 2 Dimensionen über horizontale Filter berücksichtigen die zeitliche Verschiebung, zu der es bei einer Arzneiwirkstoffverbindung durch den gastrointestinalen Transit und andere in vivo auftretende Umstände kommt, nicht. Konventionelle Zellkulturtechniken ermöglichen zwar eine Interpretation der Absorption durch Transformation der in vivo-Daten, liefern adäquate IVIVK jedoch lediglich in der Bewertung passiv absorbierter Verbindungen. Darüber hinaus beschreiben Transportstudien unter Verwendung von Zellkulturen die Verbindung in gelöster Form und berücksichtigen daher nicht die Dissolution oder Diffusion aus einer Dosierungsform bzw. die Auswirkungen der Formulierung oder Dosierungsform auf die Absorption der betreffenden Verbindung.
Es besteht Bedarf nach einer Möglichkeit zur integrierten Prüfung der in vitro-Dissolution von Arzneiformulierungen und der Absorption eines darin enthaltenen Wirkstoffes. Diese beiden Parameter werden konventionell gesondert betrachtet und geprüft. In vivo tritt eine Arzneistoffverbindung unter anderem im Blut auf, weil sich die Formulierung aufgelöst hat und die Verbindung absorbiert wurde. Bei Verbindungen, die passiv absorbiert werden, bestimmen die relativen Dissolutions- und Absorptionsraten, wodurch das Auftreten einer Verbindung im Blut allenfalls gehemmt wird. Mit der Entstehung komplexerer Dosierungsformen, vor allem bei Verbindungen und Formulierungen, die zum Zweck der Absorption (z. B. bioadhäsive Systeme), der Metabolisierung oder des Efflux (d. h. bei nicht passiver Absorption) mit Epitheloberflächen interagieren, bedarf es weiterentwickelter Systeme, damit die Auswirkung der Formulierung auf Dissolution und Absorption geprüft werden kann. Der Vorteil eines Systems, das Dissolution und Absorption integriert, besteht in einer besseren IVIVK ohne die Gefahr von Irrtümern auf Grund von Prognosemodellen, die auf transformierten Daten basieren.
Die Dissolutionstechnologie ist bekannt und wird beispielsweise im United States Patent Nr. 4,681,858 (Chaudhari et al.) beschrieben, das eine Dissolutionszelle und eine Methode zur Feststellung der in vitro-Freisetzung einer Arzneiwirkstoffverbindung aus einer Dosierungsform, wie etwa einem Suppositorium, offenbart. Die Dissolutionszelle ermöglicht die Bestimmung der Rate, mit der die betreffende Verbindung in das Dissolutionsmedium freigesetzt wird. Ebenso offenbart United States Patent Nr. 5.589,649 (Brinker et al.) ein Dissolutionstestgerät aus mehreren Testgefäßen, welches Wärme und ein mechanisches Rührwerk zur Dissolution von Dosierungsformen in den einzelnen Testgefäßen einsetzt.
Bei konventionellen Zellkulturmethoden werden Flaschen, Petrischalen oder Wellplatten verwendet, um Zellen oder Zellmonolayer zu züchten. Bei diesen Methoden wird die Verteilung des Mediums auf die wachsenden Zellen durch Schütteln oder starkes Rühren sichergestellt. Auch andere Arten von Zellkulturkammern wurden entwickelt, so etwa offenbaren die US-Patente Nr. 5,026,650 und 5,153,133 (Schwartz et al.) einen Bioreaktor, der aus einem horizontal rotierenden Zellkultursystem mit Sauerstoffzufuhr über ein Koaxialrohr besteht. Die Zellen wachsen in Mikroträgertröpfchen, die im Medium aufgeschwemmt wurden, während das Kulturgefäß um eine Welle ro tiert, die durch eine Membran für die laufende Sauerstoffzufuhr sorgt. United States Patent Nr. 5.153,131 (Wolf et al.) offenbart eine horizontal rotierende Zellkulturkammer mit einer Dialysemembran für den Austausch von Zellausscheidungen gegen frische Nährstoffe für die aufgeschwemmten Zellen. Der Einsatz einer horizontal rotierenden Kulturkammer, wie sie in den US-Patenten Nr. 5,026,650; 5,153,133 und 5,153,131 beschrieben wird, sorgt für eine gute Durchmischung der Inkubationsmedien ohne Schütteln oder starkes Rühren, die die Zellkultur beschädigen können.
Bei konventionellen Modellen zur Prüfung der Absorption oder Permeabilität einer Arzneiwirkstoffverbindung geht man davon aus, dass innerhalb der Darmwand keine Metabolisierung der Verbindung erfolgt (Chiou, Int. J. Clin. Pharm. Ther. 1994; 32(9): 474). Die vorliegende Erfindung könnte jedoch unter Umständen dazu genutzt werden, den Darmmetabolismus und die Auswirkung auf die Absorption einer Verbindung zu prüfen. Weiters gehen konventionelle Modelle von der Annahme aus, dass eine Verbindung, sobald sie absorbiert wurde, sofort der Clearance auf der basalen Seite des Darms unterliegt. Diese Annahme lässt jedoch Umstände außer Acht, welche diese Clearance verlangsamen können, wie etwa Anästhetika, welche die Blutzufuhr zum Darm herabsetzen und damit diese Form der Arzneistoffclearance verlangsamen.
United States Patent Nr. 5,518,915 (Naughton et al.) beschreibt ein dreidimensionales Kultursystem für Mukosazellen- und -gewebe, in dem Zellen aus dem gewünschten Gewebe auf einer Trägermatrix gezüchtet werden. So kann in dieser dreidimensionalen Kultur etwa die Metabolisierung einer Arzneiwirkstoffverbindung durch die Zellen geprüft werden. Naughton et al. berücksichtigen jedoch ebenfalls die Dissolution einer Arzneiformulierung vor der Prüfung der Metabolisierung oder Absorption der Verbindung durch die Zellkultur nicht.
United States Patent Nr. 5,525,305 (Minekus et al.) offenbart ein in vitro-Modell des Verdauungstraktes. Das System umfasst röhrenartige Kammern aus flexiblem Material, die so verbunden sind, dass sie das Durchströmen von Gasen oder Flüssigkeiten ermöglichen. Der Inhalt der Kammern simuliert Magensäfte, kann aber auch Verdauungsenzyme, Säuren etc. beinhalten. Dieses System ist nützlich für die in vitro-Prüfung der Verdauung und des Austausches von Komponenten mit geringem Molekulargewicht durch permeable Membranen, kann jedoch nicht zur Ermittlung biologischer Parameter wie etwa der Absorption durch eine Membran herangezogen werden und setzt auch keine Zellkulturen ein.
Der kanadische Patentantrag Nr. 2,201,159 (Myers et al.) beschreibt eine künstliche Leber und eine Methode, bei der isolierte Hepatozyten eingesetzt werden; diese können auf inerte Träger aufgebracht und mit Zellkulturmedium aufgeschwemmt werden, um sodann die Reinigung einer Körperflüssigkeit wie Blut zu ermöglichen. Bei Durchfluss der Körperflüssigkeit durch die künstliche Leber wird sie den Hepatozyten ausgesetzt, welche Komponenten der Körperflüssigkeit ähnlich wie die Leber in vivo absorbieren und metabolisieren können. Dieses System setzt isolierte Zellen als Modell für den Lebermetabolismus ein, umfasst jedoch keine Dissolutionstechnologie.
United States Patent Nr. 4,667,504 (Hobson) offenbart eine Durchflussvorrichtung zur Feststellung der Penetrationsrate von Chemikalien durch eine biologische Membran in vitro. Die Vorrichtung umfasst zwei Kammern, von denen eine Medien samt einer Testchemikalie enthält, die andere hingegen Medien, in denen die Testchemikalie festgestellt werden kann, sobald sie durch die biologische Membran transportiert wurde, welche die beiden Kammern trennt. Den Medien in den Kammern können Proben entnommen und diese auf die Konzentration der Testchemikalie analysiert werden. Diese Methode umfasst jedoch keine Dissolutionstechnologie.
Zusammenfassung der Erfindung
Ein Zweck der Erfindung ist die Schaffung einer in vitro-Methode, welche die Prüfung der Dissolution einer Arzneiformulierung mit der Prüfung der Absorption einer darin enthaltenen Arzneiwirkstoffverbindung verbindet.
Die Erfindung bietet ein System zur Prüfung der simulierten biologischen Dissolution einer Arzneiformulierung und der Absorption einer Arzneiwirkstoffverbindung und besteht aus:
einer Dissolutionskammer zur Bestimmung des Dissolutionsprofils der Arzneiformulierung in einem Medium, welches der apikalen Oberfläche einer Zellmonolayer zugeführt wird;
einer Zellkulturkammer, in der es zur Absorption einer Arzneiwirkstoffverbindung durch die Zellmonolayer kommen kann, wobei die Zellkulturkammer wiederum aus
folgenden Teilen besteht:

i) einem Gehäuse;
ii) einem rohrförmigen Filter, der für das Medium permeabel und dazu geeignet ist, die Zellmonolayer auf der Innenoberfläche zu stützen, wobei durch die Einbringung des Filters ins Gehäuse eine apikal gelegene Kammer im Inneren des Filters und eine basal gelegene Kammer zwischen Filter und Gehäusewand entsteht, und der Filter um eine Achse im Gehäuse drehbar ist, welche im Wesentlichen parallel zum Durchfluss der Medien durch die basal und apikal gelegenen Kammern verläuft,
iii) am Gehäuse selbst Zu- und Abfluss von Basalmedium zur basal gelegenen Kammer und von Apikalmedium zur apikal gelegenen Kammer;

Die Rotation des Filters in diesem System kann außerhalb des Gehäuses eingestellt werden oder wird durch die Kräfte reguliert, die aus dem Medienzufluss in die apikal oder basal gelegene Kammer entstehen.
Das System kann weiters je eine Elektrode innerhalb der apikal und der basal gelegenen Kammer umfassen, welche jeweils zur Messung des transepithelialen elektrischen Widerstands über die Zellmonolayer verwendet werden können. Als Dissolutionskammer der Erfindung kann ein Durchfluss-Dissolutionssystem verwendet werden.
Außerdem bietet die Erfindung eine Methode zur Bestimmung der simulierten biologischen Dissolution einer Arzneiformulierung und der Absorption einer Arzneiwirkstoffverbindung daraus in folgenden Schritten: Bestimmung eines Löslichkeitsprofils der Arzneiformulierung im Apikalmedium, Kontakt des Apikalmediums mit der Arzneiformulierung mit der apikalen Oberfläche einer Zellmonolayer, Kontakt der basalen Oberfläche der Zellmonolayer mit einem Basalmedium und Bestimmung der Rate, mit der die Zellmonolayer die Arzneiwirkstoffverbindung aus dem Apikalmedium absorbiert.
Die der Erfindung zugrundeliegende Methode kann dazu verwendet werden, auf Grundlage des Auftretens der Wirkstoffverbindung im Basalmedium die Rate zu bestimmen, mit der die Arzneiwirkstoffverbindung durch die Zellmonolayer absorbiert wird. Um Sink-Bedingungen zu schaffen, kann die Konzentration der Arzneiwirkstoffverbindung bei 15% der Konzentration im Apikalmedium oder darunter gehalten werden. Die Erfindung ermöglicht es, die oben beschriebene Methode zur Bestimmung der IVIVK einer Arzneiwirkstoffverbindung oder Dosierungsform heranzuziehen.
Die in vivo-Wirksamkeit einer Arzneiformulierung oder einer darin enthaltenen Arzneiwirkstoffverbindung hängt unter anderem von der Löslichkeit und Stabilität der Formulierung der Verbindung im biologischen Milieu, von der biologischen Disposition der Formulierung und der Verbindung, von der Kinetik der Freisetzung der Verbindung aus der Formulierung, von der Verweilzeit der Verbindung am Ort der Absorption und des Effektors und vom Transport der Verbindung durch biologische Membrane – mittels einfacher Diffusionsprozesse, wie etwa dem passiven transzellulären oder para zellulären Transport, oder mittels Energie erfordernder Prozesse, wie dem trägervermittelten Transport, mittels erleichtertem Transport, rezeptorenvermittelter Endozytose oder einem anderen aktiven Prozesses – ab. Der Transport durch das gastrointestinale Epithel ist unter anderem von der Masse der am Absorptionsort verfügbaren Verbindung, dem Permeabilitätskoeffizienten (P_app) der Epithelmembran und der Diffusivität der unbewegten Wasserschicht um die Epithelmembran abhängig. Die Formulierung kann sich auf einen oder alle diese Parameter auswirken und die Absorption der Arzneiwirkstoffverbindung beeinflussen.
Eine Arzneiformulierung kann in verschiedensten Dosierungsformen mit verschiedenen Zusammensetzungen, Formen, Größen etc. verabreicht werden. Verschiedene Dosierungsformen einer Formulierung erfordern ebenfalls Dissolutionstests, damit die optimalen Parameter bestimmt werden können. Derzeit beruht die Ausgestaltung einer Dosierungsform auf den Prinzipien der Dissolutions- und Diffusionstheorie. Bei Diffusion handelt es sich um den Prozess des Massentransfers einzelner Moleküle einer Substanz durch zufällige Molekularbewegungen in Verbindung mit einem Konzentrationsgradienten. Diffusion lässt sich durch Lösungen zum 1. und 2. Fick'schen Gesetz der Thermodynamik beschreiben. Das 1. Fick'sche Gesetz besagt, dass die Menge (M) an Material, welche pro Zeiteinheit (t) durch eine Einheit des Querschnitts (S) einer Barriere fließt, Fluss (J) genannt wird. Der Fluss (J) wird wie folgt berechnet:
Der Fluss (J) ist wiederum proportional zum Konzentrationsgradienten. Der Diffusionskoeffizient (D) der diffundierenden Substanz, die Konzentration (C) der diffundierenden Substanz und die Entfernung (x) der Bewegung normal zur Barriereoberfläche kann verwendet werden, um den Fluss (J) wie folgt zu berechnen:
Das 2. Fick'sche Gesetz besagt, dass die Veränderung der Konzentration in der Zeit in einem bestimmten Bereich proportional zur Veränderung des Konzentrationsgradienten an diesem Punkt des Systems ist. Daher lässt sich die Veränderung des Konzentrationsgradienten in der Zeit wie folgt berechnen:
wobei x, y und z für die Entfernung der Bewegung im Verhältnis zur Oberfläche der Barriere stehen.
Dissolution ist die Rate, mit der eine feste Formulierung in Lösung übergeht. Die Noyes-Whitney-Gleichung beschrieb die Rate, in der sich Feststoffe in Lösungsmittel auflösen ursprünglich einfach wie folgt:
wobei δC/δt für die Diffusionsrate steht, D für den Diffusionskoeffizienten des gelösten Stoffs in der Lösung, A für die Grundfläche des dem Lösungmittel ausgesetzten Feststoffs, h der Dicke der Diffusionsschicht, V dem Volumen der Lösung, C_S der Lösbarkeit des gelösten Stoffes und C der Konzentration des gelösten Stoffes zum Zeitpunkt t. Die Gleichungen (I) bis (IV) unterstützen die Prognostizierung des Verhaltens einer Arzneidosierungsform in einer biologischen Umgebung. Diffusion und Dissolution sind eng miteinander verbunden und gehen in derselben Dosierungsform gleichzeitig vor sich, wodurch Systeme möglich sind, die durch eine der beiden oder beide Erscheinungen gesteuert werden. Der Dissolutionstest ermöglicht die Bestimmung der Menge einer Arzneiformulierung in einer Lösung, damit kann auch die Menge der zur Absorption verfügbaren Arzneiwirkstoffverbindung in reproduzierbarer Form nachgewiesen werden. Das Endprodukt des Dissolutionstests ist daher eine kinetische Darstellung der Dosierungsform, die aus der dynamischen Interaktion der Formulierung, der darin enthaltenen Arzneiwirkstoffverbindung und der gastrointestinalen Umgebung resultiert.
Dosierungsformen einer Formulierung können von der einfachen sofortigen Freisetzung und der Freisetzung mit Langzeitwirkung bis zur stoßweisen Freisetzung, osmotischen Pumpe, kontrollierten Freisetzung, gezielten Darreichung etc. viele Formen annehmen, die alle dazu gedacht sind, die verfügbare Menge an Arzneiwirkstoffverbindung, welche an einem bestimmten Ort oder über einen gewissen Zeitraum vom physiologischen System absorbiert werden sollen, zu steuern und dadurch räumlich und/oder zeitlich selektive Anwendung zu ermöglichen. Die Dissolution der Dosierungsform kann vor, während oder nach der Freisetzung der Wirkstoffverbindung aus der Formulierung erfolgen, was die dynamischen Interaktionen zwischen der Verbindung und der Dosierungsform unterstreicht. Eine Dosierungsform kann allgemein als diffusionsgesteuertes System oder dissolutionsgesteuertes System klassifiziert werden, je nachdem, ob Dissolution oder Diffusion der Hemmfaktor für die Verfügbarkeit der Arzneiwirkstoffverbindung am Absorptionsort ist. Manche Darreichungssysteme können allenfalls physiologische Auslöser oder bestimmte Umgebungsbedingungen (z. B. pH-Wertveränderungen), osmotische Kräfte (z. B. osmotische Pumpe), Rezeptoren-Liganden-Bindungen oder andere Formen der bewussten sofortigen Freisetzung einer großen Dosis (engineered dose dumping) benötigen, deren Dissolutions- und Absorptionsprofile komplexer sind.
Die biologische Dissolution einer Arzneiformulierung, die Absorption der darin enthaltenen Arzneiwirkstoffverbindung und die Dosierungsform beeinflussen die in vivo-Wirksamkeit der Wirkstoffverbindung. Verbesserte Korrelationen konnten durch Berücksichtigung der Sink-Bedingungen und der Nernst-Schicht oder unbewegten Wasserschicht, die eine Dosierungsform umgeben, erzielt werden. Die Auswirkungen der Nernst-Schicht kann durch eine Anpassung des Rührens oder eine Optimierung des Aufbaus des Dissolutionsgefäßes, durch die man konstante hydrodynamische Bedingungen in der Umgebung der Dosierungsform schafft, minimiert werden. Wie die Noyes-Whitney-Gleichung (IV) besagt, beeinflusst der Konzentrationsgradient (δC/δt) die Dissolution (C_S – C). Sink-Bedingungen, wonach C < 10–15% von C_S gilt, sind in manchen Fällen wünschenswert, um den Einfluß des Konzentrationsgradienten auf die Dissolution zu minimieren. Da C_S unter bestimmten Bedingungen für eine Arzneiwirkstoffverbindung eine Konstante ist, kann die Sink-Bedingung bei Verbindungen mit geringer Löslichkeit durch eine Herabsetzung von C durch Erhöhung der Medienvolumen oder Entzug der Verbindung aus den Medien erreicht werden. Der Entzug einer Verbindung aus den Medien wurde bisher durch den Einsatz von Feststoffphasenadsorbenten, Teilung der Verbindung in eine zweite organische Phase oder Transport durch eine Membran erreicht. Als Alternative dazu wurde bisher C_S durch Zusatz von organischen Co-Lösungsmitteln, oberflächenentspannenden Substanzen und Co-Lösungsvermittlern erhöht, obgleich die physiologische Relevanz dieser Methoden fraglich bleibt.
Die beliebteste Zellkulturlinie für die Untersuchung des intestinalen Transports ist die CaCo-2-Linie, eine veränderte Kolon-Zellkulturlinie geschwulstbildenden Ursprungs, die als Kultur spontan differenziert ist. CaCo-2-Zellen weisen viele Eigenschaften der Enterozyten im menschlichen Dünndarm auf, wie etwa Bürstensaumenzyme, Folate und Zyanokobalaminrezeptoren, ein p-Glykoprotein-vermitteltes Effluxsystem, Natrium, Kalium, Phosphat und Protonenpumpen, Hexosetransporter und Trägerproteine, Gallensalze und Di- oder Tripeptide. Die Zellkulturlinie HT29 ist eine Schleimhaut-Zellkulturlinie, die ähnliche Eigenschaften aufweist wie die Becherzellen des Darmtraktes. Die Kolon-Zellkulturlinie T84 ist durch starken elektrischen Widerstand gekennzeichnet und weist Eigenschaften auf, die jenen des Dickdarms ähneln. Der Transport von Arzneiwirkstoffverbindungen durch diese und andere Zellkulturlinien mit ähnlichen Eigenschaften wie menschliche Darmzellen können dazu verwendet werden, die Biover fügbarkeit oral dargereichter Dosierungsformen einer Arzneiformulierung zu bestimmen, welche eine Wirkstoffverbindung enthält.
Verschiedene andere Epithelzellentypen können ebenfalls mit der Erfindung verwendet werden. Jede Zellkulturlinie, die geeignet ist, eine Monolayer zu bilden, kann dazu eingesetzt werden. So kann über die oben genannten Intestinal- und Kolon-Zellkulturlinien hinaus etwa die MDCK (Nieren)-Zellkulturlinie zur Anwendung kommen. Epithel-Zellkulturlinien, die an der Blut-Gehirnschranke, an den Blut-Urin-, Blut-Luft- (Alveolar-Zellkulturlinien), Blut-Haut-, Blut-Hepatozyten- oder Blut-Korneozyten (Auge)-Schnittstellen beteiligt sind bzw. andere Schnittstellen zwischen dem zentralen Blutkompartiment und den Stoffwechsel-/Clearance-Organen, können je nach benötigter Information verwendet werden. Zu den mit dieser Erfindung einsetzbaren Zellkulturlinien gehören Co-Kulturen, Zellkulturlinien mit Punktmutationen oder weitere Fortschritte in der Zellkulturtechnologie, die die Verwendung von nicht veränderten Zellkulturlinien erlauben, welche aus menschlichem Gewebe oder dem Gewebe anderer Säuger gewonnen wurden. Je nach Ort der Absorption einer Arzneistoffverbindung können verschiedene Zellkulturlinien verwendet werden. Geht es etwa in einem Forschungsprojekt um die Nierenclearance einer Verbindung, so könnte eine Nieren-Zellkulturlinie eingesetzt werden. Darüber hinaus könnte etwa durch Verwendung einer Leber-Zellkulturlinie der Leberstoffwechsel untersucht werden.
Bei passiv absorbierten Verbindungen lässt sich ein relativ hoher IVIVK dadurch erreichen, dass eine Rangordnung der Verbindungen nach ihrem Öl-Wasser-Trennungskoeffizienten (log K_o/w) erstellt wird. K_o/w ist ein Gleichgewichtsverteilungskoeffizient und wird wie folgt berechnet: Ko/w = Co/CW (V)wobei C_o für die Konzentration der Verbindung in Öl (normalerweise n-Oktanol) steht und C_w für die Konzentration der Verbindung in Wasser in einem im Gleichgewicht be findlichen System bei einer bestimmten Temperatur und einem bestimmten Druck. Der Gleichgewichtsverteilungskoeffizient einer Verbindung ist ein Indikator ihrer Hydrophobie. Die Ölphase kann mit der Lipidmembran einer Zelle verglichen werden, sodass ein höherer K_o/w – Koeffizient eine höhere Absorption anzeigt. Eine konventionell bestimmte IVIVK ist für Verbindungen mit log K_o/w über 3,5 auf Grund von Löslichkeitsproblemen weniger relevant. Eine hydrophile Verbindung (d. h. mit einem niedrigen K_o/w), deren Molekulargewicht unter der parazellulären Molekulargrößenbeschränkung (400–800 Dalton) liegt, hat eine höhere Absorptionsrate, als durch diese einfachen Modelle prognostiziert wird.
Kurze Beschreibung der grafischen Darstellungen
Es folgen Beschreibungen von Ausführungsformen der Erfindung unter exemplarischer Bezugnahme auf die angeschlossenen grafischen Darstellungen, wobei:
1 das Ablaufdiagramm einer Ausführungsform eines simulierten biologischen Dissolutions- und Absorptionssystems ist;
2 die schematische Darstellung der Zellkulturkammer des simulierten biologischen Dissolutions- und Absorptionssystems aus 1 zeigt; und
3 die schematische Darstellung der Zellkulturkammer aus 2 im Querschnitt entlang der Achse B-B ist.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausgestaltungen
Das Ablaufdiagramm in 1 veranschaulicht in schematischer Form ein simuliertes biologisches Dissolutions- und Absorptionssystem (1) in einer erfindungsgemäßen Ausführungsform. Das Medium wird von einer apikal gelegenen Medienquellkammer (2) über eine Gradienten- und Durchflusssteuerung (4) einer Dissolutionskammer (6) zugeleitet. Diese Gradienten- und Durchflusssteuerung kann beliebig nach dem Stand der Technik ausgestaltet sein, z. B. in Form einer peristalischen Pumpe. Die apikal gelegene Medienquellkammer (2) kann Parameter wie die Temperatur und den pCO₂-Gehalt regulieren. Die Gradienten- und Durchflusssteuerung (4) kann zur Änderung der Strömung oder anderer Bedingungen im Apikalmedium vor dessen Einbringung in die Dissolutionskammer (6) verwendet werden. So können z. B. Bedin gungen wie der pH-Wert, die Osmolarität, und der Gallensalz- oder Fettgehalt des apikalen Mediums vor der Einbringung des Mediums in die Dissolutionskammer (6) geändert werden. Parameter wie der pH-Wert und die Osmolarität können unter Verwendung der Gradienten- und Durchflusssteuerung (4) gemessen werden. Vor Feststellung der Dissolution können zahlreiche Variationen des Apikalmediums eingebracht werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Dissolutionskammer (6) eine Mehrzahl apikaler Medien von unterschiedlicher Zusammensetzung von der apikal gelegenen Medienquellkammer (2) zugeleitet.
Das Apikalmedium ist so formuliert, dass es bestimmte Aspekte des luminalen Inhalts des Darmtrakts simuliert und bei einer Temperatur von ungefähr 37,0 + 0,5°C gehalten wird. Der pH-Wert des apikalen Mediums liegt vorzugsweise in einem Bereich von 1 bis 7, abhängig davon, welchen Aspekt des luminalen Darminhalts es simulieren soll. Das Apikalmedium enthält vorzugsweise Bestandteile wie Gallensalze, Muzine, Magensäuren, oder Nährstoffe wie Aminosäuren, Fette oder Kohlehydrate. Das Apikalmedium wird in die Dissolutionskammer (6) eingebracht, um das Dissolutionsprofil der betreffenden Arzneiwirkstoffverbindung zu bestimmen, und um die Verbindung im Medium vor dessen Einbringung in die apikal gelegene Kammer (12) der Zellkulturkammer (9) aufzulösen.
Das Basalmedium, das in die basal gelegene Kammer (13) der Zellkulturkammer (9) einfließt, kann ein beliebiges zur Stützung von Zellkulturen verwendetes Medium sein, und kann Bestandteile wie Wachstumsmediensera, Puffer, Mineralstoffe, Nährstoffe, Hormone, Wachstumsfaktoren, und Antibiotika/Antimykotika enthalten. In einer Ausführungsform ist das basale Medium mit Sauerstoff angereichert, enthält ungefähr 5% CO₂ und wird bei einer Temperatur von ungefähr 37,5°C gehalten. Die Temperatur könnte geändert werden, um thermale Effekte auf die Absorptionsrate zu untersuchen, und die CO₂-Konzentration kann ebenfalls wie erforderlich geändert werden.
Eine basal gelegene Medienquellkammer (3), die die Temperatur und den pCO₂-Gehalt des Basalmediums regulieren kann, leitet das Basalmedium dem basalen Medienzufluss (21) der basal gelegenen Kammer (13) über eine automatisierte Durchflusssteuerung (5) zu. Das Apikal- und Basalmedium werden der apikal (12) bzw. basal gelegenen Kammer (13) durchgehend zugeleitet, sodass während der Feststellung der Absorption der betreffenden Arzneiwirkstoffverbindung ein konstanter Medienfluss besteht.
In der Dissolutionskammer (6) wird eine Dosierungsform einer Arzneiformulierung mit einer betreffenden Arzneiwirkstoffverbindung im Apikalmedium gemäß einer beliebigen bekannten Dissolutionstechnologie aufgelöst. Die Mischungsrate in der Dissolutionskammer (6) beeinflusst die unbewegte Wasserschicht rund um die Dosierungsform und unterliegt daher automatischer Regulierung. Nach erfolgter Auflösung der Formulierung im Apikalmedium, fließt das Medium aus der Dissolutionskammer (6) zu einer Durchflusssteuerung (7). Die Durchflusssteuerung (7) teilt das von der Dissolutionskammer (6) ausfließende Medium, um den Zufluss zur Zellkulturkammer (9) zu regulieren. Wenn aufgrund der Dissolution eine große Menge Apikalmedium die Arzneiformulierung enthält, fließt nur ein Teil davon in die Zellkulturkammer (9) ein, um eine Standardflussrate zu erhalten und eine übermäßige Scherbeanspruchung auf die Zellmonolayer innerhalb der Zellkulturkammer (9) zu verhindern.
Die Durchflusssteuerung (7) zweigt das Apikalmedium außerdem auch von der Dissolutionskammer (6) zu einer Dissolutionsprofil-Analysevorrichtung (8) ab, das die Menge der Arzneiformulierung misst, die sich in dem aus der Dissolutionskammer (6) ausfließenden apikalen Medium in Dissolution oder Suspension befindet. Es kann eine Dissolutionsprofil-Analysevorrichtung (8) gemäß einer beliebigen verfügbaren Methode verwendet werden, um das Dissolutionsprofil der betreffenden Arzneiwirkstoffverbindung im aus der Dissolutionskammer (6) ausfließenden Medium zu bestimmen.
Die Dissolutionskammer (6) kann einen Filtermechanismus zur Steuerung der Größe der aus der Dissolutionskammer ausfließenden Teilchen enthalten. Es kann wünschenswert sein, dass Teilchen der Dosierungsform im Apikalmedium, das dem apikal gelegenen Bereich (12) zugeleitet wird, verbleiben, um Informationen über die Absorption derartiger Teilchen zu gewinnen.
Die Konzentrationen der verschiedenen Bestandteile des Apikal- und Basalmediums vor dem Eintritt in die Zellkulturkammer (9) sind bekannt. Das Dissolutionsprofil des apikalen Mediums wird nach der Zugabe der Arzneiwirkstoffverbindung in der Dissolutionskammer (6) bewertet. Die Probenahme und Analyse sowohl des Apikal- als auch des Basalmediums, nachdem beide durch die Zellkulturkammer (9) geflossen sind, erfolgen mittels einer beliebigen geeigneten Analysemethode.
Für die Dissolutionskammer (6) kann eine beliebige verfügbare Dissolutionstechnologie verwendet werden. Zweckmäßigerweise bewirkt die Durchflussausgestaltung der Dissolutionskammer eine laminare bzw. turbulente Strömung, um eine gute Durchmischung sicherzustellen (Moller, Pharmaceutical Industry 1983; 45: 617–622). Zu anderen verwendbaren Dissolutionstechnologien zählen die Zugabe von Tensiden oder organischen Co-Lösungsmitteln (Abrahamsson et al., Pharmaceutical Research 1994; 11: 1093–7) und ein Zweiphasensystem, wie z. B. eine wässrige/organische Phasenmethode (Grundy et al., Proc. Intern. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 1996; 23, Controlled Release Society. Inc., Baltimore. MD, Aug. 21–22). Es kann eine beliebige verfügbare Lösungsmethode verwendet werden, um nach Bedarf Sink-Bedingungen herbeizuführen.
Die SOTAX^TM-Systeme (SOTAX Corporation, Richmond; VA) stellen Beispiele für derzeit verfügbare Dissolutionstechnologien dar. Der SOTAX AT 7^TM-Dissolutionstestapparat entspricht den aktuellen USP-Testrichtlinien und wurde angepasst, um die Automatisierung von Routinevorgängen zu ermöglichen. Das SOTAX MEDIUM CHANGE^TM-System erlaubt ein- und mehrfache Medienwechsel, und kann auf volle Automatisierung hin angepasst werden. SOTAX Systemplus EE^TM bietet Dissolutionssoftware für die Analyse von Dissolutionsdaten und die Erstellung eines Dissolutionsprofils.
Das apikale Medium wird von der Dissolutionskammer (6) über eine Durchflusssteuerung (7) dem apikal gelegenen Bereich (12) der Zellkulturkammer (9) zugeleitet. Die Durchflusssteuerung (7) reguliert den Zufluss des Apikalmediums in den apikal gelegenen Bereich (12) der Zellkulturkammer (9). Dieser Zufluss kann voll automatisiert sein, um die Zuflussrate in die apikal gelegene Kammer vom Ergebnis des Dissolutionsprofils bestimmen zu lassen.
Wie in 1 veranschaulicht und in 2 im Detail dargestellt, besteht die Zellkulturkammer (9) aus dem Zellkulturkammergehäuse (23) und dem Filtereinbau (24). Durch Einbringung des Filters (28) in das Kammergehäuse (23) wird die Zellkulturkammer in die apikal gelegene Kammer (12) auf der Innenseite des Filters (28), und die basal gelegene Kammer (13), die den Filter (28) umgibt, geteilt. Die apikal (12) und die basal gelegene Kammer (13) sind daher getrennte Kammern, durch die die Medien fließen. Die basale Oberfläche der Zellmonolayer (29) ist somit dem Basalmedium durch den Filter (28), der dem Medium gegenüber permeabel ist, ausgesetzt. Die apikale Oberfläche der Zellmonolayer (29) ist dem Apikalmedium ausgesetzt.
TEER-Analyse (transepithelial electrical resistance – transepithelialer elektrischer Widerstand) (10) kann verwendet werden, um die Integrität der Zellmonolayer innerhalb der Zellkulturkammer (9) festzustellen. Dabei wird der Widerstand der Zellmonolayer gemessen, während diese über Elektroden auf beiden Seiten der Monolayer unter Strom gesetzt wird.
Wie in 2 veranschaulicht, befindet sich zur Messung des transepithelialen elektrischen Widerstands als Anzeiger der Zellintegrität in der Monolayer (29) die apikale Elektrode (26) vorzugsweise in der apikal gelegenen Kammer (12), die ba sale Elektrode (25) in der basal gelegenen Kammer (13). TEER misst die Integrität der dichten Verbindungen zwischen den Zellen. Ein hoher Widerstand weist auf eine konfluente Monolayer hin. Darüber hinaus kann eine beliebige akzeptable Messung der Zellintegrität ebenfalls zur Überprüfung der Integrität der Zellen in der Zellmonolayer (29) verwendet werden. Andere Kennzeichen, wie z. B. PEG-, Mannitol- oder Inulindurchgang durch dichte Verbindungen als Hinweis auf parazellulären Transport können ebenfalls verwendet werden.
Der Filtereinbau (24) besteht aus einem Filter (28), der mit Befestigungsklammern (30) zwischen dem Zufluss (20) und dem Abfluss (35) befestigt ist. Die Rotation des Filtereinbaus (24) innerhalb der Zellkulturkammer (9) wird durch eine Rotationssteuerung (11) reguliert, die in einer bevorzugten Ausführungsform motorisiert ist und sich außerhalb der Zellkulturkammer (9) befindet. Die Rotation des Filters gewährleistet eine gute Durchmischung und minimiert die unbewegte Wasserschicht neben der Zellmonolayer.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Filtereinbau (24) durch eine Rotationssteuerung (11) gedreht, die aus einem Motor besteht, der sich an einem Ende des Zellkulturkammergehäuses befindet (23). Wie in 2 dargestellt, ist die Rotationssteuerung (11) mit dem Filtereinbau (24) verbunden und ermöglicht daher die Rotation des Filtereinbaus (24) entlang einer horizontalen Achse (A) im Zellkulturkammergehäuse (23). Durch die Rotation des Filters (28) und somit durch die Rotation der Zellmonolayer (29) wird eine gute Durchmischung der Medien gewährleistet und daher das Ausmaß der unbewegten Wasserschicht neben der apikalen Oberfläche der Zellmonolayer (29) reduziert. Dadurch wird der Kontakt der Arzneiwirkstoffverbindung und der Nährstoffe im Apikalmedium mit der Zellmonolayer (29) gefördert.
Alternativ dazu kann zur Rotation des Filtereinbaus (24) entlang der Achse (A) die Zuflussrate des Apikal- und Basalmediums in die Zellkulturkammer (9) angepasst werden, um die Rotation durch das Einfließen des Mediums anstelle von durch die Verwendung einer externen Durchflusssteuerung hervorzurufen.
Die Durchflussraten des apikalen Mediums, das die Arzneiformulierung enthält, und des basalen Mediums durch die apikal bzw. basal gelegene Kammer (12) bzw. (13) werden durch die Durchflusssteuerungen (7) und (5) reguliert. Nach erfolgtem Durchfluss der Medien durch die Zellkulturkammer (9), fließt jedes der beiden Medien zu einer weiteren Durchflusssteuerung (14) bzw. (15). Die Durchflusssteuerungen (14) bzw. (15) dienen als Eingänge für die apikale (18) bzw. basale Medienanalysevorrichtung (19).
Vor dem Eintritt des Apikal- bzw. Basalmediums in die jeweilige Analysevorrichtung (18) bzw. (19), können die Medien in die externen Kammern (16) und (17) fließen, welche als Sammelstellen für überschüssiges Medium dienen, oder welche die Medien verdünnen oder die betreffende Verbindung im Medium derivatisieren, oder die Medien auf andere, für die Analyse erforderliche Art, manipulieren können. Bei der Medienanalysevorrichtung (18) bzw. (19) kann es sich um eine beliebige Vorrichtung mit der erforderlichen Empfindlichkeit handeln. Niedrige Werte der betreffenden Verbindung im Basalmedium würden eine extrem empfindliche basale Medienanalysevorrichtung erforderlich machen.
2 veranschaulicht die Zellkulturkammer (9) gemäß der in 1 dargestellten Ausführungsform der Erfindung. 3 zeigt diese Ausführungsform im Querschnitt entlang der Linie B-B von 2. Das Apikalmedium, welches Kontakt mit der apikalen Oberfläche der Zellmonolayer (29) hat, und das Basalmedium, welches Kontakt mit der basalen Oberfläche der Zellmonolayer (29) hat, werden der Zellkulturkammer über den apikalen Medienzufluss (20) und den basalen Medienzufluss (21) zugeleitet.
Im Inneren der Zellkulturkammer (9) befindet sich ein drehbarer Filtereinbau (24) mit einem rohrförmigen Filter (28), der geeignet ist, eine Zellmonolayer (29) auf seiner Innenoberfläche zu stützen. Die Zellen der Monolayer sind polarisiert, sodass sich die basale Zelloberfläche neben dem Filter (28) befindet. Die apikale Zelloberfläche, die dem luminalen Aspekt des Magen-Darmtrakts entspricht, ist dem inneren Lumen des Filters (28) zugewendet. Der entfernbare Filter (28) wird so in das Zellkulturkammergehäuse (23) eingeführt, dass eine apikal (12) und eine basal gelegene Kammer (13) gebildet werden. Das Apikal- und Basalmedium fließen durch die apikal (12) bzw. basal gelegene Kammer (13).
In der in 2 dargestellten Ausführungsform der Erfindung, wird der Filter (28), der die Zellmonolayer (29) enthält, über eine Öffnung (27) im Gehäuse in das Zellkulturkammergehäuse (23) eingebracht. Befestigungsklammern (30) in dem drehbaren Filtereinbau (24) dienen zur Befestigung des Filters (28). Die Länge der Befestigungsklammern (30) ist mit der Länge der Halterungen identisch, die zur Befestigung des Filters in einem primären Kultureinbau verwendet werden können; darauf wird weiter unten genauer eingegangen. Auf dem Teil des Filters, der aufgrund der Klammern nicht zugänglich ist, wachsen keine Zellen.
Das System ist so konzipiert, dass die Durchflussrate durch die apikal gelegene Kammer (12) den Transport durch den gastrointestinalen Trakt simuliert und die Zellmonolayer (29) nicht beeinträchtigt. Die Transportrate durch den menschlichen Magen-Darmtrakt ist unterschiedlich und hängt von Parametern wie dem Radius des Darmabschnitts, der Peristaltik, und der Pendelbewegung der Darmzotten ab. Die luminale Transportrate im gastrointestinalen Trakt des Menschen wird auf ungefähr 3 bis ungefähr 18 mL/Minute geschätzt, basierend auf einem luminalen Radius von 1,3 cm (Chiou, Int. J. Clin. Pharm. Ther. 1994: 32(9): 474). Erfindungsgemäß wird die Durchflussrate des Apikalmediums durch die apikal gelegene Kammer (12) vorzugsweise unter 20 mL/Minute gehalten. Derzeit liegen die Standarddurchflussraten für Durchfluss- Dissolutionsmethoden bei zwischen 8 und 15 mL/Minute. Der Durchfluss hängt vom Durchschnitt – bzw. der Grundfläche des Filters – ab.
Eine höhere Durchflussrate des Apikal- und Basalmediums durch die apikal (12) bzw. basal gelegene Kammer (13) kann erforderlich sein, z. B. um Sink-Bedingungen zu gewährleisten, daher kann eine Durchflussrate von bis zu 50 mL/Minute verwendet werden. Höhere Durchflussraten durch die basal gelegene Kammer (13) beeinträchtigen die Zellmonolayer (29) nur geringfügig, da der Filter (28) die Monolayer (29) von der basal gelegenen Kammer (13) trennt und daher als Barriere gegenüber Turbulenzen, die aufgrund des Medienflusses in der basal gelegenen Kammer (13) entstehen, agiert. Eine Reduzierung des Durchmessers der Grundfläche des Filters (28) kann eine Reduktion der Durchflussrate des apikalen und basalen Mediums durch die Zellkulturkammer (9) zur Folge haben (mit Hinblick auf die Einrichtung physiologisch relevanter Bedingungen).
Die Temperaturregelung der Zellkulturkammer (9) kann die Temperatur des Basalmediums beeinflussen, das Kontakt mit der basalen Oberfläche der Zellmonolayer (29) hat. Die apikale Oberfläche der Zellmonolayer (29) hat Kontakt mit dem Apikalmedium, dessen Temperatur durch eine Vorrichtung außerhalb der Zellkulturkammer (9) reguliert werden kann. Die Rotationssteuerung (11), hier ein Motor außerhalb der Zellkulturkammer, steuert die Rotationsgeschwindigkeit des Filtereinbaus (22). Vorzugsweise sollte die Rotationsgeschwindigkeit 100 rpm nicht übersteigen.
Der apikale Medienzufluss (20) befindet sich an einem Ende der apikal gelegenen Kammer (12), in einer koaxialen Position zur Drehachse (A) des Filtereinbaus (24). Der apikale Medienabfluss (35) findet am anderen Ende der apikal gelegenen Kammer (12), ebenfalls koaxial zur Drehachse (A) des Filtereinbaus (24), statt. Daher erfolgt die Strömung des Apikalmediums parallel zur Drehachse (A) des Filtereinbaus (24). Das aus dem Abfluss (36) ausgeflossene Medium kann dann auf seine Konzentration der betreffenden Arzneiwirkstoffverbindung analysiert werden (auf Metaboliten der betref fenden Verbindung). Außerdem kann die Erfindung für die Bewertung der Metabolitenformierung der betreffenden Arzneiwirkstoffverbindung über die Monolayer (29) bzw. für die Bewertung der Menge beliebiger über die Monolayer (29) transportierter Bestandteile der Arzneiformulierung verwendet werden.
Der basale Medienzufluss (21) befindet sich an einem Ende der basal gelegenen Kammer (13), der basale Medienabfluss (36) befindet sich am axial entgegengesetzten Ende der basal gelegenen Kammer (13). Daher erfolgt die Strömung des Basalmediums parallel zur Drehachse (A) des Filtereinbaus (24). Das aus dem basalen Abfluss (36) ausgeflossene Medium kann dann auf seine Konzentration der betreffenden Arzneiwirkstoffverbindung analysiert werden.
Die Steuerung der Einflussrate in die basal gelegene Kammer (13) kann zur Erzeugung von Sink-Bedingungen über die Zellmonolayer (29) verwendet werden. Die Konzentration der Arzneiwirkstoffverbindung im Basalmedium kann durch Anpassen der Einflussrate des Basalmediums in die basal gelegene Kammer (13) jederzeit bei 15% oder weniger der Konzentration im apikalen Medium gehalten werden. Falls die Absorptionsrate über die Zellmonolayer (29) ansteigt, kann die Durchflussrate des basalen Mediums erhöht werden, um sicherzustellen, dass der Konzentrationsgradient die Absorption durch die Monolayer (29) nicht einschränkt.
Parameter wie die Durchflussrate der Medien durch die apikal (12) und basal gelegene Kammer (13), die Zusammensetzung des Apikal- und Basalmediums, die Sauerstoffanreicherung der Medien, und die Drehgeschwindigkeit des Filtereinbaus können geändert werden, um die Bedingungen für die jeweilige Anwendung zu optimieren.
Das Apikal- und Basalmedium fließen über den apikalen (35) bzw. basalen Medienabfluss (36) aus der Zellkulturkammer aus. Eine Analyse des apikalen Mediums, sowohl vor als auch nach dem Durchfluss durch die Zellkulturkammer (9), und eine Bestimmung der Menge der betreffenden Verbindung im basalen Medium nach dem Durchfluss durch die Zellkulturkammer (9), erlauben die genaue Feststellung der Absorption der betreffenden Verbindung durch die Zellmonolayer (29), die dann auf die Dissolution der getesteten Formulierung bezogen werden kann, um die simulierte biologische Dissolution der Formulierung und resultierende Absorption der betreffenden Verbindung zu ermitteln.
Das bedeutet, dass die Parameter für die Dissolution und Absorption in einem einzigen System festgestellt werden können, um eine Messung der in vitro-Leistung der Dosierungsform der Arzneiformulierung zu ergeben.
In einer Ausführungsform der Erfindung werden die Sink-Bedingungen über die Zellmonolayer (29) beibehalten und der Durchfluss des basalen Mediums so angepasst, dass innerhalb der Zellkulturkammer (9) die Konzentration der betreffenden Arzneiwirkstoffverbindung in der basal gelegenen Kammer (13) 15% der Konzentration in der apikal gelegenen Kammer (12) nicht übersteigt. Erfindungsgemäß wird die Sink-Bedingung vorzugsweise über die Zellmonolayer (29) aufrechterhalten. Sink-Bedingungen zwischen der basal- (13) und apikal gelegenen Kammer (12) der Zellkulturkammer (9) gewährleisten, dass der Transport und andere Aspekte der Absorption bzw. des Metabolismus nicht durch eine übermäßige Konzentration der Arzneiwirkstoffverbindung beeinträchtigt werden.
Darüber hinaus können wahlfrei Sink-Bedingungen auch im apikalen Medium aufrechterhalten werden, sodass die Konzentration der Arzneiwirkstoffverbindung 10 bis 15% der gesättigten Lösungskonzentration nicht übersteigt. Dieser Dissolutionsgradient ist nicht immer zur genauen Bewertung der simulierten biologischen Dissolution und Absorption mit dem System bzw. der Methode der Erfindung erforderlich.
In Verbindung mit dem System der vorliegenden Erfindung werden Zellen von einer Darmzellenlinie, wie z. B. Caco-2-Zellen, auf einem Filter in einer Primärkultur zur Verwendung mit der Erfindung gezüchtet. Ein Filter wird in ein Primärkultureinbaugehäuse eingebracht und dort mittels Halterungen an beiden Enden des Filters befestigt, die vorzugsweise mit der Tiefe der Befestigungsklammern in der Zellkulturkammer identisch sein sollten, um sicherzustellen, dass die Zellen nicht bis an die Enden des Filters wachsen. Der Filter kann entlang einer horizontalen Achse drehbar sein. Es kann eine beliebige Zuchtmethode angewendet werden, die es einer konfluenten Zellmonolayer ermöglicht, an der Innenseite des Filters anzuhaften. In dieser besonderen Ausführungsform wird Zelleninoculum in den luminalen Aspektbereich des Filters im Primärkultureinbau eingebracht, der dann in ein Kulturmedium eingetaucht und in einen Inkubator plaziert wird, um die Entwicklung der Zellmonolayer zu ermöglichen. Der Primärkultureinbau kann entsprechend der verschiedenen Filtergrößen jeweils unterschiedlich groß sein. Das Primärkultureinbaugehäuse kann eine Petrischale mit einer oder mehreren Wellplatten, oder ein beliebiges anderes geeignetes Gefäß sein, das auf einem darin eingebrachten Filter das Wachstum einer Monolayer stützen kann. Der Filter ist vorzugsweise entsorgbar, und hat in der vorliegenden Ausführungsform vorzugsweise einen Durchmesser zwischen 0,5 und 2 cm. Die Verwendung kleinerer Filter für automatisierte Systeme zur Entnahme von Mehrfachproben wird ebenfalls durch die Erfindung vorweggenommen.
Kultivierte Zellen werden auf der Innenoberfläche eines rohrförmigen Filters (28) gezüchtet und sind polarisiert, sodass die apikale Oberfläche der Zellmonolayer (29) dem inneren Teil des Filters zugewendet ist, und sich die basale (basolaterale Membran) Oberfläche der Monolayer neben dem Filter (28) befindet und nach außen gewendet ist. Alternativ können die Zellen auch auf flachen Filterbögen in einem Primärkultureinbau gezüchtet und die Filterbögen vor Einbringung in die Zellkulturkammer rohrförmig gestaltet werden.
Der Filter (28) besteht vorzugsweise aus Cellulosenitrat, Polycarbonat oder einem beliebigen anderen trägen Material, auf dem Zellen kultiviert werden können. Der Filter hat eine festgelegte Porengröße und Oberfläche, mit Ausnahme des Bereichs, der von den Befestigungsklammern (30) bedeckt ist. Nach der Bildung einer Zellmonolayer (29) auf dem Filter (28), kann der Filter aus dem Primärkultureinbau entfernt und in die Zellkulturkammer (9) des simulierten biologischen Dissolutions- und Absorptionssystems eingebracht werden.
Poröse permeable Membranfilter oder Stützen, auf denen gezüchtete Zellen wachsen können, sind ohne weiteres verfügbar. So können z. B. Transwell^TM Permeable Supports von der Corning Costar Corporation (Cambridge, MA, USA) bezogen werden. Transwell^TM Permeable Supports erlauben ausdrücklich einfachen und direkten Zugriff auf die apikale und basale Plasmamembran bei der Züchtung von Zellen in einer Monolayer.
Gemäß dem System und der Methode der Erfindung können Parameter wie z. B. mechanische Spannungen, Darmausdehnungen, Scherbeanspruchung, Artenvariabilität, usw. durch Anpassen der Durchflussrate der Medien durch die Zellkulturkammer adressiert werden. Außerdem könnte der basale Durchfluss im Hinblick auf Sink-Bedingungen angepasst werden, d. h. für Präparate mit niedriger Löslichkeit können höhere Durchflussraten erforderlich sein. Hohe Werte für den basalen Durchfluss können der menschlichen Blutströmungsphysiologie ähneln.
Das System der vorliegenden Erfindung kann verschiedene Durchflussarten durch die Zellkulturkammer enthalten, z. B. laminar peristaltisch, gewunden, usw., welche die gastrointestinale Ausdehnung und den Transport durch den Magen-Darmtrakt simulieren. Eine Pendelbewegung kann durch Schaukeln der Zellkulturkammer erzeugt werden. Diese und andere Manipulierungen der Bedingungen in der Zellkulturkammer können verwendet werden, um den gastrointestinalen Transport zu simulieren.
In einer Ausführungsform der Erfindung könnte der Medienfluss beim Eintritt in die Zellkulturkammer durch ein Ventil bestimmt werden, mit dem der Einfluss in den apikalen Medienzufluss aus der Dissolutionskammer unterschiedlich reguliert werden kann, um die Scherbeanspruchung auf die Oberfläche der Zellmonolayer zu steuern. Gemäß einer Ausführungsform kann der Ventilradius von 0 auf 1,3 cm erweitert werden, um den Durchfluss vorübergehend zu stoppen (nämlich wenn sich der Radius des Ventils bei 0 cm befindet) bzw. die Durchflussrate zu regulieren (wenn der Ventilradius größer als 0 cm ist).
Darüber hinaus kann erfindungsgemäß die Ausgestaltung automatisiert oder verkleinert werden, um eine Mehrzahl gleichzeitiger Messungen mit reduzierten Medien- und Zellmengen zu ermöglichen. Durch gleichzeitiges Testen mehrfacher Einheiten ist eine praktische Bewertung der simulierten biologischen Dissolution und Absorption möglich. Durch die Verkleinerung des Systems ist eine Reduzierung der Menge der erforderlichen Lösung, der gelösten Substanzen, der Zellen sowie der anderen Materialien möglich. Das System kann dazu verwendet werden, die Permeationsmenge einer Arzneiwirkstoffverbindung über die Zellmonolayer (29), den aktiven oder passiven Transport einer Verbindung durch die Zellmonolayer, oder die metabolische Konversion einer Verbindung durch die Monolayer zu bewerten.
Industrielle Anwendbarkeit
Das System und die Methode der Erfindung dienen dem Einsatz in der Bewertung der simulierten biologischen Dissolution von Arzneiformulierungen unter kontrollierten Bedingungen und ermöglichen daher eine verbesserte in vitro/in vivo-Korrelation.

Claims

System für die Bewertung der simulierten biologischen Dissolution einer Arzneiformulierung und der Absorption einer darin enthaltenen Arzneiwirkstoffverbindung, bestehend aus: einer Dissolutionskammer für die Bestimmung des Dissolutionsprofils der Arzneiformulierung in einem Medium, das der apikalen Oberfläche einer Zellmonolayer zuzuleiten ist; einer Zellkulturkammer, in der die Absorption der Arzneiwirkstoffverbindung durch die Zellmonolayer erfolgen kann, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellkulturkammer besteht aus: i) einem Gehäuse; ii) einem rohrförmigen Filter, der einem Medium gegenüber permeabel und geeignet ist, die Zellmonolayer auf seiner Innenoberfläche zu stützen; wobei durch die Einbringung des Filters in das Gehäuse eine apikal gelegene Kammer im Inneren des Filters und eine basal gelegene Kammer zwischen dem Filter und der Gehäusewand entsteht; und wobei der Filter entlang einer Achse im Gehäuse drehbar ist, welche im Wesentlichen parallel zum Durchfluss der Medien durch die basal- und apikal gelegenen Kammern verläuft; iii) am Gehäuse selbst Zu- und Abfluss von Basalmedium zur basal gelegenen Kammer und von Apikalmedium zur apikal gelegenen Kammer; wobei das Medium, das aus der Dissolutionskammer fließt und die Arzneiformulierung enthält, in die apikal gelegene Kammer geleitet wird, und die Rate des Auftretens der Arzneiwirkstoffverbindung im Medium, das aus der basal gelegenen Kammer fließt, analysiert werden kann, um die Absorption der Arzneiwirkstoffverbindung zu bestimmen.
System nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, dass die Rotation des Filters durch eine Rotationssteuerung, die sich außerhalb des Gehäuses selbst befindet, reguliert wird.
System nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, dass die Rotation des Filters durch die Kräfte, die aus dem Mediumzufluss in die apikal bzw. basal gelegene Kammer entstehen, reguliert wird.
System nach Anspruch 1, 2 oder 3, gekennzeichnet dadurch, dass es weiters je eine Elektrode innerhalb der apikal und der basal gelegenen Kammer umfasst, welche jeweils zur Messung des transepithelialen elektrischen Widerstands über die Zellmonolayer verwendet werden können.
System nach Anspruch 1, 2 oder 3, gekennzeichnet dadurch, dass ein Durchfluss-Dissolutionssystem als Dissolutionskammer verwendet wird.
Methode zur Bestimmung der simulierten biologischen Dissolution einer Arzneiformulierung und der Absorption einer Arzneiwirkstoffverbindung daraus in folgenden Schritten: Bestimmung eines Löslichkeitsprofils der Arzneiformulierung im Apikalmedium; Kontakt des Apikalmediums mit der Arzneiformulierung mit der apikalen Oberfläche einer Zellmonolayer; Kontakt der basalen Oberfläche der Zellmonolayer mit einem Basalmedium; und Bestimmung der Rate, mit der die Zellmonolayer die Arzneiwirkstoffverbindung aus dem Apikalmedium absorbiert.
Methode nach Anspruch 6, gekennzeichnet dadurch, dass die Rate, mit der die Arzneiwirkstoffverbindung durch die Zellmonolayer absorbiert wird, auf Grundlage des Auftretens der Wirkstoffverbindung im Basalmedium bestimmt wird.
Methode nach Anspruch 7, gekennzeichnet dadurch, dass die Konzentration der Arzneiwirkstoffverbindung bei 15% der Konzentration im Apikalmedium oder darunter gehalten wird.
Verwendung einer Methode nach Anspruch 6, 7 oder 8, gekennzeichnet dadurch, dass die beschriebene Methode zur Bestimmung der in vitro-/in vivo-Korrelation (IVIVK) einer Arzneiwirkstoffverbindung oder Dosierungsform herangezogen wird.