CN1284127A - 模拟的生物溶解和吸收系统 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用来评价模拟的药物制剂生物性溶解以及从中吸收药物活性化合物的系统和方法。该系统包括一个溶解室和一个细胞培养室。在溶解室中测定药物制剂(或药物)的溶解性。在细胞培养室中,药物活性化合物可能被细胞单层吸收并运输。该细胞培养室包括一个管状滤膜,它能使介质渗透通过,并能将细胞单层载于其内表面上。将该滤膜插入细胞培养室外壳内,形成在滤膜内部的顶室以及滤膜与外壳壁之间的底室。滤膜绕外壳中基本平行于介质流动通过细胞培养室方向的轴旋转。从溶解室流出的介质含有药物制剂,将其提供给顶室。分析流出底室的介质中药物活性化合物出现的速度,以测定药物活性化合物的吸收情况。

Description

模拟的生物溶解和吸收系统

本发明涉及一种溶解和吸收系统，更具体地说，本发明涉及一种用来评价模拟的药物制剂生物性溶解以及其中药物活性化合物的吸收的系统和方法。

发明背景

评价药物制剂溶解的技术最初由制药工业中的制定规章当局引入，目的是为了确定在水性介质中溶解度低的制剂的释放特征。然而，控制药物制剂使用需求的增长使得大多数制剂出于质量控制和规程要求的目的而采用了溶解性测试。而且，溶解测试也用于制剂的开发过程中，以确定制剂释放出活性化合物的速度以及与制剂性能有关的其它参数，从而开发出最优的剂型并建立体外-体内相关性(IVIVC)。

在评价某药物制剂在一体外系统中的溶解时，通常希望体外和体内有很高的关联性(IVIVC)。在制药工业中，产生的数据与体内所得溶解性和吸收数据紧密关联的一种体外系统将是有益的，可作为各种应用(包括剂型开发和放大、生产放大、各批生物等效性测试、新强度的测试、微量制剂变化的测试、改变生产部位后的测试)中的工具，和作为生物等效性要求的参照。

随着剂型变得更加高级，因此溶解测试必需更为精确，以便基本了解在具体时间在吸收部位能获得多少药物活性化合物。另外，在剂型和药物活性化合物在吸收部位的利用率以及药物活性化合物的全身性血液水平之间建立关系，将允许研究者通过专门的输送技术来优化药物活性化合物在体内的性能。

对于表现出膜通透性差、经过充分的肠代谢、或需要专门的运输系统进行吸收的药物活性化合物，能够测定其IVIVC的溶解技术还未被开发出来。迄今为止，关联体外和体内溶解数据的技术还局限于解释下列因素：例如，与粘蛋白的相互作用、胆汁盐、消化性酶、食物的作用、离子强度和pH。剂型通过肠胃等因素可能是造成吸收和溶解数据有短暂置换的原因。以前已通过数据转化(例如通过采用肠加权函数(weighting functions))来校正体外和体内的溶解和吸收数值之间的差异，该转化可能没有考虑到生理性解释。目前需要有一种系统将溶解技术与生物性肠吸收模型(例如细胞培养)结合起来，用来配制和测试药物制剂的剂型。有利的是，与现有的溶解方法相比，这种系统与生理性系统更为相似。

人小肠上皮细胞培养物已得到广泛认同可用来描述药物活性化合物的吸收机制。常规的细胞培养技术能将某化合物通过上皮层的流通量与被动的跨细胞或穿细胞(paracellular)运输、载体介导的运输和主动运输关联起来。

主动吸收的化合物、或通过载体介导或需能机制而吸收的那些化合物通常具有对于它们的吸收能够饱和的组分。目前的细胞培养技术详细地描述了吸收途径以及载体亲和力和容量。另外，细胞培养可用来描述流出系统，例如p-糖蛋白介导的流出系统，它减少了对某些化合物的吸收。可能会发生化合物的肠代谢，并会减少化合物的总体吸收。目前，该信息被用来解释IVIVC中的差别，方法是将动力学模型转化成包括可饱和的Michaelis-Menton动力学、或转化成包括代谢性或流出动力学，以改善IVIVC。目前在平面跨水平滤膜中进行的细胞培养技术没有解释药物活性化合物由于胃肠运输和其它体内条件而引起的短暂置换(temporal displacement)。常规的细胞培养技术能通过转化体内此数据来解释吸收，但除评价被动吸收的化合物外，没有产生足够的IVIVC。另外，用细胞培养的运输研究描述了溶液中的化合物，因此没有说明剂型的溶解或扩散，也没有说明制剂或剂型对于感兴趣化合物吸收的影响。

需要有一种药物制剂体外溶解以及其中活性化合物的吸收的完整的评价方法。在常规方法中，这两个参数是分开进行考虑和评价的。在体内，药物化合物出现在血流中是由制剂的溶解以及化合物的吸收特别引起的。在化合物被被动吸收的情况下，溶解和吸收的相对速度确定了哪一个是化合物出现于血流中的速率限制因素。随着更复杂的剂型的出现，尤其对于通过与上皮表面相互作用来吸收(例如生物粘附系统)、代谢或流出(即非被动吸收的那些)的化合物，需要更先进的系统来评价制剂对于溶解和吸收的影响。有利的是，一个溶解和吸收的综合系统将提供改善的IVIVC，而没有使用转化数据预测模型伴随的误差所带来的不方便。

溶解技术是已知的，在例如美国专利No.4，681，858(Chaudhari等人)中有所描述，该专利公开了用来测定一种剂型(例如栓剂)体外释放药物活性化合物的溶解细胞和方法。该溶解细胞能评价感兴趣的化合物释放到溶解培养基中的速度。另外，美国专利No.5，589，649(Brinker等人)公开了一种溶解测试装置，该装置中装有多个测试容器，它用加热和机械搅拌将剂型溶解到各测试容器中。

常规的细胞培养方法利用瓶、板或孔来生长细胞或细胞单层。这些技术包括搅拌或湍流混合，以确保培养基循环至正在生长的细胞。其它类型的细胞培养室已被开发出来。例如，美国专利No.5，026，650和5，153，133(Schwartz等人)公开了一种生物反应器，它由一个水平转动的细胞培养系统和一个同轴管状充氧器组成。细胞生长发生在悬浮于培养基中的微载体珠粒上，同时，培养管绕一轴旋转，该轴通过一个膜连续地提供充氧。美国专利No.5，153，131(Wolf等人)公开了一种水平旋转的细胞培养室，室中有一透析膜用来交换细胞废物与新鲜营养物并同时维持细胞处于悬浮。利用水平旋转的培养室，如美国专利No.5，026，650，5，153，133和5，153，131中描述的那些，就可良好地混合培养基而无需采用会损伤培养细胞的搅拌或湍流混合。

用来评价药物活性化合物的吸收或渗透的常规模型假设肠壁上不发生化合物代谢(Chiou，Iht.J.Clin.Pharm.Ther.1994；32(9)：474)。然而，本发明可用来评价肠代谢以及对于化合物吸收的影响。另外，常规的模型假设该化合物一旦吸收后立即从肠的基底侧清除。这一假设没有说明可能延迟基底侧清除的条件。例如，麻醉药可能会减少肠的血流，从而减缓基底侧的药物清除。

美国专利No.5，518，915(Naughton等人)提出了一种三维粘膜细胞和组织培养系统，其中所需组织衍生获得的细胞生长在载体基质上。例如，在该三维培养物中可以评价细胞对药物活性化合物的代谢。然而，Naughton等人在评价培养的细胞对化合物的代谢或吸收前没有体现药物制剂的溶解。

美国专利No.5，525，305(Minekus等人)公开了一种消化道的体外模型。该系统包括由柔软材料制成的管状室，这些管状室连在一起便于气体或液体流在其中通过。室内的物质模拟了胃液，并可包括肠酶、酸等。该系统可用来体外评价低分子量组分的消化以及通过渗透膜的交换，但是不能评价例如吸收通过膜的生物参数，并且不包括培养的细胞。

加拿大专利申请No.2，201，159(Myers等人)提出了一种人工肝装置和方法，它采用了分离的肝细胞，该细胞可以附着于惰性载体并悬浮在细胞培养基中，以便纯化生物学液体(如血液)。当生物学液体通过人工肝装置接触肝细胞时，肝细胞能以类似于体内肝功能的方式吸收并代谢生物学液体中的组分。该系统采用了分离的细胞作为体内肝代谢的模型，但是没有结合溶解技术。

美国专利No.4，667，504(Hobson)公开了一种用来测定化学物质体外穿越生物膜的渗透速率的流通(flow-through)装置。该装置包括两个室，一个室含有的培养基中包含受测试化学物质，测试化学物质在运输通过悬挂在两室之间的生物膜后出现在另一室所含培养基中。可对每个室中的培养基取样，分析测试化学物质的浓度。然而，该方法没有结合溶解方法。

发明概述

本发明的一个目的是提供一种体外方法，该方法将对药物制剂溶解的评价与对药物活性化合物的从中吸收的评价联合起来。

本发明提供了一种用来评价模拟的药物制剂生物性溶解以及从中吸收药物活性化合物的系统，该系统包括：

一个溶解室，用来测定该药物制剂在待提供给细胞单层顶部表面的介质(培养基)中的溶解性分布图；

一个细胞培养室，其中细胞单层可能会吸收药物活性化合物，该细胞培养室包括：

ⅰ)一个外壳；

ⅱ)一个管状滤膜，它能使介质渗透通过，并能将细胞单层载于其内表面上；将该滤膜插入外壳内，形成滤膜内部的顶室(apical chamber)以及滤膜与外壳壁之间的底室(basal chamber)；其中滤膜可绕外壳中基本平行于介质流动通过顶室和底室方向的轴旋转，

ⅲ)在所述外壳上为底部介质(培养基)(basal medium)供给和流出底室、顶部介质(培养基)(apical medium)供给和流出顶室而提供的装置；

其中将从溶解室流出的含有药物制剂的介质提供给顶室，分析从底室流出的介质中出现药物活性化合物的速度，以测定药物活性化合物的吸收。

滤膜在该系统中的转动可通过外壳外部的旋转控制装置来控制，或可通过介质流入顶室或底室所产生的力来控制。

该系统还可包括顶室内的一个电极和底室内的一个电极，这些电极可用来测定横跨细胞单层的跨上皮电阻。一个流通溶解系统可用作本发明的溶解室。

另外，本发明提供了一种测定模拟的药物制剂生物性溶解以及从中吸收药物活性化合物的方法，该方法包括下列步骤：测定药物制剂在顶介质中溶解分布图；使细胞单层的顶表面与含有药物制剂的顶介质接触；使细胞单层的底表面与底介质接触；测定细胞单层从顶介质吸收药物活性化合物的速度。

本发明的方法可以根据底介质中出现活性化合物的速度来确定细胞单层吸收药物活性化合物的速度。为了产生渗透条件，底介质中药物活性化合物的浓度宜维持为顶介质浓度的15％或更低。本发明还提供了上述方法测定药物活性制剂或剂型的IVIVC的用途。

药物制剂或其中所含药物活性化合物的体内性能尤其取决于制剂和化合物在生物性环境中的溶解度和稳定性、制剂和化合物的生物性质、制剂释放化合物的动力学、化合物在吸收部位和效应部位的停留时间、以及化合物运输通过生物膜(例如肠胃上皮)。化合物可以通过简单的扩散过程(例如被动的跨细胞或穿细胞运输)或能量驱动的过程(例如载体介导的运输、易化运输、受体介导的胞吞)或其它活跃的过程运输通过生物膜。运输通过肠胃上皮尤其取决于吸收部位处可获得的化合物的质量、化合物在吸收部位的停留时间、吸收部位的表面积、通过上皮膜的表观渗透率(P表观)以及通过上皮膜周围未被搅动的水层的扩散率。制剂可能影响任一或所有这些参数，来影响感兴趣的药物活性化合物的吸收。

药物制剂可以具有不同组成、形状、大小等的各种剂型来输送。制剂的不同剂型也需要进行溶解测试以确定最优的参数。目前，剂型的设计部分根据的是溶解和扩散原理。扩散是物质单分子的质量转移过程，分子随机运动结合浓度梯度而产生。扩散可以用Fick第一和第二热动力学定律的式子来描述。Fick第一定律规定，单位时间(t)通过屏障单位横截面(S)的物质的量(t)称为通量(J)。通量(J)用下式算出： $J=\frac{\mathrm{\δM}}{S\•\mathrm{\δt}}------------\left(I\right)$

通量(J)又和浓度梯度成比例。扩散物的扩散系数(D)、扩散物的浓度(C)以及垂直于屏障表面的移动距离可用来按下式计算通量(J)： $J=-D\frac{\mathrm{\δC}}{\mathrm{\δx}}-----------\left(\mathrm{II}\right)$

Fick第二定律规定，特定区域内的浓度随时间的变化与该系统中此处的浓度梯度变化成比例。因此，浓度随时间的变化可用下式算出： $\frac{\mathrm{\δC}}{\mathrm{\δt}}=D\frac{{\mathrm{\δ}}^{2}C}{\mathrm{\δ}{x}^2}+\frac{{\mathrm{\δ}}^{2}C}{\mathrm{\δ}{y}^2}+\frac{{\mathrm{\δ}}^{2}C}{\mathrm{\δ}{z}^2}----\left(\mathrm{III}\right)$ 其中x，y和z代表相对于屏障表面移动的距离。

溶解是固体制剂进入溶液时的速度。Noyes-Whitney方程式最初用以下的简单式子描述了固体溶解于溶剂的速度： $\frac{\mathrm{\δC}}{\mathrm{\δt}}=\frac{\mathrm{DA}}{\mathrm{Vh}}(C_s-C)---------\left(\mathrm{IV}\right)$ 其中δC/δt是溶解速度，D是溶液中溶质的扩散系数，A是接触的固体的表面积，h是扩散层的厚度，V是溶液体积，C_s是溶质的溶解度，C是在时间t时的溶质浓度。方程式(Ⅰ)至(Ⅳ)有助于预测药物剂型在置于生物环境中时的行为。扩散和溶解是密切相关的，在一剂型中同时发生，从而导致系统受一个或两个现象控制。溶解测试能测定溶液中药物制剂的量，因此可以再现地测定可被吸收的药物活性化合物的量。溶解测试的最终结果是从制剂、其中所含的药物活性化合物以及肠胃环境的动力学相互作用而得到的剂型的动力学表达式。

制剂剂型的范围包括简单的立即释放、持续释放、搏动释放、渗透泵送、控制释放、定向输送和其它许多方式，所有这些方式的设计均用来控制在某一位置或随时间能被生理系统吸收的药物活性化合物的量，从而赋予空间和/或时间上的选择性。剂型的溶解可能发生在制剂释放出活性化合物之前、同时或之后，这强调了化合物与剂型之间动态的相互作用。剂型通常可分为扩散控制的系统或溶解控制的系统，这取决于在吸收部位获得药物活性化合物的速率限制步骤是溶解还是扩散。然而，一些输送系统可能需要生理触发剂或特定的环境条件(例如pH改变)、渗透压(例如渗透泵送)、受体-配体的结合或其它工程改造的剂量倾倒(dose dumping)设计，这将具有更为复杂的溶解和吸收特性分布图。

药物制剂的生物性溶解、从中吸收药物活性化合物以及剂型影响到活性化合物的体内性能。通过说明渗透条件以及剂型周围的能斯特或未搅动的水层，已经获得了改善的相关性。通过调节搅拌速率或优化溶解容器组件以确保剂型周围恒定的流体条件，可以使能斯特层效应最小化。如Noyes-Whitney方程式(Ⅳ)所述，浓度梯度(δC/δt)影响溶解(C_s-C)。在一些情况下，为了最大程度地减小浓度梯度对溶解的影响，希望有渗透条件(其中C＜C_s的10-15％)。由于一个药物活性化合物在某些条件下的C_s是恒定的，因此对于溶解度低的化合物来说，通过增加介质体积或除去介质中的化合物来减少C，就可以实现该渗透条件。以前已经通过使用固相吸附剂、将化合物分配到第二个有机相内、或运输通过一个膜等方法来从介质中除去化合物。另外，以前已通过加入有机助溶剂、表面活性剂和辅助增溶剂来增加C_s，但是这些方法的生理适用性仍需考虑。

用来研究肠运输的最流行的细胞系是Caco-2细胞系，它是在培养时自发分化的转化的致癌性来源的结肠细胞系。Caco-2细胞表现出人小肠肠细胞(enterocyte)的许多特征，包括有刷状缘酶；叶酸和氰钴胺素受体；p-糖蛋白流出系统；钠、钾、磷酸盐和质子泵；己糖转运蛋白；以及胆汁盐和二肽或三肽的载体蛋白。HT-29细胞系是粘液分泌性细胞系，它显示出与肠杯状细胞相似的特征。T-84结肠细胞系具有高的电阻，它表现出与大肠相似的特征。用具有与人肠细胞相似特征的这些和其它细细胞培养系来运输药物活性化合物，就可以确定含活性化合物的药物制剂口服剂型的生物利用度。

其它各种上皮细胞类型也可用于本发明。可以采用能形成单层的任何细胞系。例如，除了上述的肠和结肠细胞系外，还可采用MDCK(肾细胞)系。可采用的上皮细胞系涉及血液-脑屏障、血液-尿液、血液-空气(肺泡细胞系)、血液-真皮、血液-肝细胞或血液-角膜细胞(眼睛)的界面或血液中央区室与代谢性/清除性器官之间的任何其它界面，这取决于所需的信息。可用于本发明的细胞系包括共同培养物、具有点突变的细胞系，或是能使用人组织或其它哺乳动物组织衍生的非转化细胞系的细胞培养技术中的任何进一步进展。根据药物化合物的吸收部位，可以采用不同的细胞系。如果化合物的肾清除是待研究的问题，则可采用肾细胞系。另外，可用肝细胞系评价肝代谢。

对于被动吸收的化合物，通过它们的油-水分配系数(logK_O/W)进行排序，可以得到相当高的IVIVC。K_O/W是平衡分布系数，可用下式来计算：

logK_O/W=C_O/C_W    (Ⅴ)其中C_O是化合物在油(通常是正辛醇)中的浓度，C_W是该化合物在水中的浓度(在指定温度和压力下的平衡系统中)。化合物的平衡分布系数是化合物疏水性的指示剂。油相可以比作细胞的脂膜，因此较高的K_O/W系数表明吸收速度较高。由于溶解度的问题，用常规方法测得的IVIVC与logK_O/W大于3.5的化合物不太相关。另外，分子量小于穿细胞分子大小限制(400-800道尔顿)的亲水性化合物(即低K_O/W)将具有高于这些简单模型所预计的吸收速度。

附图简述

现在将通过实施例并且参照附图来描述本发明的实施方案，其中：

图1是一个生物性溶解和吸收模拟系统例子的流程图；

图2是图1所示生物性溶解和吸收模拟系统的细胞培养室的示意图；和

图3是图2的细胞培养室沿图2中B-B的横截面的示意图。

较佳实施方案详述

图1的流程图示意性地描述了本发明较佳实施方案的生物性溶解和吸收模拟系统(1)。介质从顶介质原料室(2)通过一个梯度和流量控制装置提供给溶解室(6)。用于梯度和流量控制的装置可以是本领域中任何已知的装置，例如蠕动泵。顶介质原料室(2)可以控制诸如温度和pCO₂等参数。梯度和流量控制装置(4)可用来在顶介质导入溶解室(6)之前改变它的流量或其它条件。例如，在将介质导入溶解室(6)之前，可以改变顶介质的pH、摩尔渗透压浓度、胆汁盐或脂质含量。诸如pH和摩尔渗透压浓度等参数可由梯度和流量控制装置(4)来测定。在测定溶解前，可以在顶介质中引入许多变化。在一个较佳的实施方案中，从顶介质原料室(2)向溶解室(6)提供多种组成不同的顶介质。

配制顶介质来模拟肠道腔内物质的某些方面，并保温在大约37.0+0.5℃。顶介质的pH宜在1至7之间，这取决于希望模拟肠腔物质的哪些方面。顶介质宜包含这些组分：例如胆汁盐、粘蛋白、胃酸或营养物如氨基酸、脂质或糖类。向溶解室(6)提供顶介质，以便测定感兴趣的药物化合物的溶解性分布图，在将介质供给细胞培养室(9)之顶室(12)前使其中的化合物溶解。

流至细胞培养室(9)之底室(13)内的底介质可以是用来支持培养细胞的任何类型培养基，它可包含诸如生长培养基、血清、缓冲液、矿物质、营养物、激素、生长因子和抗生素/抗真菌剂等这些组分。在一个实施方案中，底介质将被充氧，将含有大约5％的CO₂，并保温在大约37.5℃。可以改变温度以研究热对吸收速度的影响，CO₂浓度也可按需改变。

底介质的原料室(3)可以控制底介质的温度和pCO₂，它经过一个自动的流量控制装置(5)向底室(13)的底介质流入口(21)提供底介质。顶介质和底介质分别以持续(ongoing)的方式供给顶室(12)和底室(13)，因此在测定感兴趣的药物活性化合物吸收时有恒定的介质流。

在溶解室(6)中，根据任何已知类型的溶解技术，将含有感兴趣药物活性化合物的药物制剂的剂型溶于顶介质中。溶解室(6)中的混合速度影响剂型周围未搅动的水层，因此受自动控制。一旦制剂溶于顶介质，介质就从溶解室(6)流入流量控制装置(7)。为了调节进入细胞培养室(9)的流量，该流量控制装置(7)将从溶解室(6)流出的介质分开。如果溶解产生了大体积的含有药物制剂的顶介质，则其只有一部分将进入细胞培养室(9)，以维持标准的流速，并防止细胞培养室(9)中细胞单层上产生过量的剪切应力。

流量控制装置(7)还将来自溶解室(6)的顶介质分流至一个溶解性分布图分析装置(8)，该装置用于分析溶解或悬浮在离开溶解室(6)的顶介质中的药物制剂的量。根据任何现有方法的溶解性分布图分析装置(8)可用来测定从溶解室(6)中流出的介质中的感兴趣药物化合物的溶解性分布图。

在溶解室(6)中可以插入一个过滤装置，以控制离开溶解室的颗粒粒径。可能希望在供给顶区域(12)的顶介质中保留这些剂型颗粒，以获得关于这些颗粒吸收的信息。

在流入细胞培养室(19)之前，顶介质和底介质中各种组分的浓度是已知的。在溶解室(6)中加入药物活性化合物后评价顶介质的溶解性分布图。在介质流动通过细胞培养室(9)后，用任何合适的分析方法取样并分析顶介质和底介质。

溶解室(6)可采用任何现有类型的溶解技术。方便的溶解室是一种流通型设计，它具有层流或湍流来确保良好的混合(Moller，Pharmaceutical Industry 1983；45：617-622)。可采用的其它类型的溶解技术包括：加入表面活性剂或有机助溶剂(Abrahamsson等人，Pharmaceutical Research 1994；11：1093-7)，采用双相系统(如水相/有机相)的方法(Grundy等人，Proc.Intern.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.，1996；23，Controlled Release Society，Inc.，Baltimore，MD，Aug.21-22)。可用任何可行的增溶技术来按需产生渗透条件。

SOTAX^TM系统(SOTAX Corporation，Richmond，VA)是目前可获得的溶解技术的一些例子。SOTAX AT 7^TM溶解测试装置符合目前的USP测试准则，并已适合自动进行常规的次序。SOTAX MEDIUM CHANGE^TM系统建议改变介质一次或多次，并能适合完全自动化。SOTAX SystemPlus EE^TM为分析溶解数据和溶解性分布图的产生提供了溶解软件。

顶介质从溶解室(6)经过一个流量控制装置(7)输送至细胞培养室(9)的顶部区域(12)。流量控制装置(7)调节流入细胞培养室(9)至顶部区域(12)的顶介质流量。该流量可以完全自动化控制，以便利用溶解性分布图来确定进入顶室的流速。

如图1以及图2具体所示，细胞培养室(9)由细胞培养室外壳(23)以及滤膜组合件(24)组成。将滤膜(28)插入细胞培养室外壳(23)，将细胞培养室分成在滤膜(28)内侧的顶室(12)和在滤膜周围的底室(13)。因此，顶室(12)和底室(13)是介质可以流经通过的不同的室。因此，细胞单层(29)的底表面通过介质能渗透的滤膜与底介质接触。细胞单层(29)的顶表面与顶介质接触。

跨上皮电阻(TFR)分析装置(10)可用来确定细胞培养室(9)中细胞单层的存活力或完整性，方法是横跨单层两侧的电极施加一个电压，测定该细胞单层的电阻。

如图2所示，顶电极(26)宜位于顶室(12)中，底电极(25)位于底室(13)中，用来测定跨上皮电阻作为单层(29)中细胞存活的标记。跨上皮电阻测定的是细胞之间紧密连接的完整性。电阻高表示是铺满的单层。另外，也可用任何可接受的细胞存活测定方法来验证细胞单层(29)中细胞的存活力。也可用其它标记(如PEG、甘露糖醇或胰岛素)通过紧密结合处来表明穿细胞运输。

滤膜组合件(24)包括一个滤膜(28)，它被固定夹(30)固定在流入口(20)和流出口(35)之间。滤膜组合件(24)在细胞培养室(9)中的旋转由一个旋转控制装置(11)来控制，在一个较佳的实施方案中，该装置是机械化的，并在细胞培养室(9)的外部。滤膜的旋转确保了良好的混合，并最大程度地减少了毗邻细胞单层的水层不被搅动。

在一个较佳的实施方案中，滤膜组合件(24)通过一种旋转控制装置(11)来旋转，该装置是位于细胞培养室外壳(23)一端的一个马达。如图2所示，该旋转控制装置(11)与滤膜组合件(24)相连，因此使滤膜组合件(24)绕细胞培养室外壳(23)中的水平轴(A)转动。滤膜(28)的转动以及因此造成的细胞单层(29)的转动确保了介质良好的混合，从而减少了毗邻细胞单层(29)顶表面的未搅动水层的体积。因此，顶介质中的药物活性化合物和营养物与细胞单层(29)的接触得到增强。

另外，为了使滤膜组合件(24)绕轴(A)转动，可以调节进入细胞培养室(9)的顶介质或底介质的流速，从而通过介质的流入来引起这样的转动，而不是采用外部的旋转控制装置。

含有药物制剂的顶介质以及底介质以受流量控制装置(7)和(5)控制的流速分别流经通过细胞培养室(9)的顶室(12)和底室(13)。一旦介质横穿了细胞培养室(9)，每个介质再分别流入另一个流量控制装置(14)和(15)。流量控制装置(14)和(15)作用分别是顶介质和底介质进入顶介质分析装置(18)和底介质分析装置(19)的进入口。

在顶介质和底介质进入各自的分析装置(18)和(19)之前，介质可以流至外部室(16)和(17)，这些室作用为过量介质的收集装置，或可稀释介质或衍生的介质中感兴趣的化合物，或对要求作分析的介质进行其它操作。介质分析装置(18)和(19)可包括具有所需灵敏度的装置。检测底介质中低水平的感兴趣化合物需要灵敏度高的底介质分析装置。

图2描述了图1所示本发明实施方案的细胞培养室(9)。图3显示了该实施方案沿图2中的B-B线的界面。与细胞单层(29)的顶表面接触的顶介质以及与细胞单层(29)底表面接触的底介质将通过顶介质流入口(20)和底介质流入口(21)提供给细胞培养室。

细胞培养室(9)内是可旋转的滤膜组合件(24)，它含有能在其内表面上负载细胞单层(29)的管状滤膜(28)。该单层的细胞被极化，从而使细胞底表面毗邻滤膜(28)。对应于肠胃道腔方向的细胞顶表面朝向滤膜(28)的内腔。将滤膜可移动地插入细胞培养室外壳(23)，从而形成顶室(12)和底室(13)。顶介质和底介质分别流经通过顶室(12)和底室(13)。

在如图2所示的本发明实施方案中，将含有细胞单层(29)的滤膜(28)经外壳中的开口(27)插入细胞培养室外壳(23)。可旋转的滤膜组合件(24)中的固定夹(30)用来保持滤膜(28)的位置。固定夹(30)的长度等于在原代培养组件(primary culture assembly)中用来固定滤膜之支持体的长度，该支持体在下文有进一步详细的讨论。在因为夹子而不可到达的滤膜部分细胞不生长。

设计此系统，使得通过顶室(12)的流速模拟肠胃流体，并且对细胞单层(29)没有破坏作用。通过人肠胃道的流速根据诸如肠段、蠕动收缩以及肠绒毛摆动等因素而不同。估计人肠胃道中腔内流速的范围约为3至18毫升/分钟，以1.3厘米的腔半径计(Chiou，Int.J.Clin.Pharm.Ther.1994；32(9)：474)。根据本发明，顶介质通过顶室(12)的流速宜维持低于20毫升/分钟。目前，流动溶解方法的标准流速范围为8至15毫升/分钟。流量将根据滤膜的直径或表面积而不同。

例如，为确保渗透条件，通过顶室(12)和底室(13)的顶介质和底介质可能需要有较高的流速，因此可以采用高达50毫升/分钟的流速。通过底室(13)的较高流速对细胞单层(29)只有很小的破坏作用，因为滤膜(28)将单层(29)与底室(13)隔开，因此对通过的介质流在底室(13)中引起的湍流起屏障的作用。随着滤膜(28)的直径或表面积的减小，通过细胞培养室(9)的顶介质和底介质的流速可能也要减少，目的是为了建立生理性有关的条件。

细胞培养室(9)的温度控制能影响与细胞单层(29)之底表面接触的底介质的温度。细胞单层(29)的顶表面与顶介质接触，而顶介质的温度由细胞培养室(9)外部的装置控制。旋转控制装置(11)(在本例中是细胞培养室外部的马达)控制着滤膜组合件(22)的转速。该转速宜不超过100ppm。

顶介质流入口(20)位于顶室(12)的一端，并与滤膜组合件(24)的转动轴(A)同轴。顶介质流出口(35)位于顶室(12)的另一端，与滤膜组合件(24)的转动轴(A)同轴。因此，顶介质的流动与滤膜组合件(24)的转动轴(A)平行。然后，就可分析从流出口(36)获得的介质中感兴趣药物活性化合物的浓度或感兴趣化合物之代谢物的存在。本发明还可用来评价通过细胞单层(29)的感兴趣的药物活性化合物的代谢物形成，或可用来测定运输通过单层(29)的药物制剂中任何组分的量。

底介质流入口(21)位于底室(13)的一端，底介质流出口(36)位于底室(13)轴向相对的一端。因此，底介质的流动方向与滤膜组合件(24)的转动轴(A)平行。然后就可分析从底介质流出口(36)获得的介质。

可利用进入底室(13)的流速控制来实现渗透通过细胞单层(29)的条件。通过调节进入底室(13)的底介质的流速，可使底介质中药物活性化合物的浓度始终维持在顶介质中浓度的15％或更低。如果通过细胞单层(29)的吸收速度增加，则可增加底介质的流速，以确保浓度梯度不会限制单层(29)的吸收。

可修改诸如通过顶室(12)和底室(13)的介质流速、顶介质和底介质的组成、介质的充氧以及滤膜组合件的转速等参数，来优化特定应用所需的条件。

顶介质和底介质分别经顶介质流出口(35)和底介质流出口(36)流出细胞培养室。在顶介质流动通过细胞培养室前后分析顶介质，在底介质流动通过细胞培养室(9)后测定底介质中出现的感兴趣化合物的量，这样就能准确地测得细胞单层(29)对活性化合物的吸收，然后将该吸收值与受测试制剂的溶解关联起来，以测定制剂的模拟生物性溶解以及其中的感兴趣化合物的吸收。

因此，在一个系统中就能确定溶解和吸收参数，以提供测定药物制剂剂型的体外性能的方法。

在本发明的一个实施方案中，保持渗透通过细胞单层(29)的条件并调节底介质的流量，使得在细胞培养室(9)中，底室(13)中感兴趣的药物活性化合物的浓度不超过顶室(12)中的浓度的15％。根据本发明，该渗透条件宜维持横跨细胞单层(29)。细胞培养室(9)的底室(13)和顶室(12)之间的渗透条件确保了运输以及吸收或代谢的其它方面不受药物活性化合物过量浓度的影响。

另外，任选的是在顶介质中维持渗透条件，使得药物活性化合物的浓度不超过饱和溶解浓度的10-15％。在用本发明的系统和方法准确地评价模拟的生物性溶解和吸收时，并不总需要这种溶解梯度。

结合本发明的系统，使来自肠细胞系的细胞(如Caco-2细胞)生长在和本发明一起使用的原代培养组件中的滤膜上。将滤膜插入原代培养组件外壳中并维持固定的位置，滤膜的每一端有支持体，这些支持体的深度宜与细胞培养室中的固定夹相同，以确保细胞不生长到滤膜末端。滤膜可以沿水平的轴转动。可以采用使铺满的细胞单层粘附到滤膜内侧上的任何培养方法。在此特定的实施方案中，将细胞接种物插入原代培养组件中的滤膜的腔内区域内，然后将该组合件浸在培养基中，置于培养箱内以使细胞单层发展。大小不同的滤膜所需的原代培养组件的大小可以根据需要而不同。原代培养组件外壳可以是有单孔或多孔的平板，或是能支持在插入其中的滤膜上细胞单层生长的任何其它合适的容器。滤膜宜是一次性的，在本实施方案中，滤膜的直径宜为0.5至2厘米。对于自动化多次取样系统采用尺寸较小的滤膜也是本发明所预期的。

使培养的细胞生长在管状滤膜(28)的内表面上，并进行极化，使得细胞单层(29)的顶表面朝向滤膜的内部，细胞单层的底(基底外侧(basolateral)膜)表面与滤膜(28)毗邻，面朝外。另外，细胞也可生长在原代培养组件中的平的滤膜片上，然后在插入细胞培养室之前将该滤膜片材制成管状。

滤膜(28)宜包含硝酸纤维素、聚碳酸酯或能在其上培育细胞的任何其它惰性材料。滤膜具有确定的孔径和表面积(不包括被固定夹(30)覆盖的面积)。一旦在滤膜(28)上发展成一细胞单层(29)，就可从原代培养组件中取出滤膜，插入生物性溶解和吸收模拟系统的细胞培养室(9)中。

其上能生长培育细胞的多孔可渗透滤膜或支持体是很容易获得的。例如，Transwell^TM可渗透支持体购自Coming Costar Corporation(Cambridge，MA)。当细胞以单层生长时，Transwell^TM可渗透支持体能使介质方便独立地到达顶部和底部的质膜。

根据本发明的系统和方法，通过调节通过细胞培养室的介质的流速，可以涉及诸如机械应力、肠膨胀、剪切力、种类间差异等参数。另外，对于渗透条件，可以调节底介质流，即，对于溶解度低的化合物，可能需要较高的流速。底介质流速范围的高端可以模拟人血流的生理学。

本发明的系统可以包括通过细胞培养室的不同的流动类型，例如成层、蠕动、曲折流动等，以模拟肠胃膨胀和运输。通过摇动细胞培养室，可以产生垂直的运动。细胞培养室中可以加入这些以及其它操作条件来模拟肠胃运输。

在本发明的一个实施方案中，进入细胞培养室的介质流可通过一个阀门来确定，该阀门允许不同比例的溶解室流体进入顶介质流入口，以便控制细胞单层表面上的剪切力。根据一个实施方案，阀门半径可在0至1.3厘米之间伸缩，以便暂时中断流动(例如当阀门半径为0厘米时)或调节流速(例如当阀门半径大于0厘米时)。

另外，根据本发明，该设计可以自动化，或减小尺寸，以便用减少量的介质和细胞同时进行多个测定。因此，同时进行多单元测试能恰当地评价模拟的生物性溶解和吸收。系统的小型化能减少所需的溶液、溶质、细胞和其它物质的量。该系统可用来评价药物活性化合物渗透通过细胞单层(29)的量、细胞单层对化合物的主动或被动运输、或单层对化合物的代谢转变。

工业实用性

本发明的系统和方法在提供改进的IVIVC的控制条件下可用来评价药物制剂的模拟的生物性溶解。

Claims (9)

1．一种用来评价模拟的药物制剂的生物性溶解以及从中吸收药物活性化合物的系统，该系统包括：

一个溶解室，用来测定该药物制剂在待供给细胞单层顶表面的介质中的溶解性分布图；

一个细胞培养室，其中细胞单层可能会吸收药物活性化合物，其特征在于，该细胞培养室包括：

ⅰ)一个外壳；

ⅱ)一个管状滤膜，它能让介质渗透通过，并能将细胞单层载于其内表面上；

将该滤膜插入外壳内，形成滤膜内部的顶室以及滤膜与外壳壁之间的底室；和

其中滤膜可绕外壳中基本平行于介质流动通过顶室和底室方向的轴旋转，

ⅲ)在所述外壳上为底介质供给和流出底室、顶介质供给和流出顶室而提供的装置；

其中将从溶解室流出的含有药物制剂的介质提供给顶室，分析从底室流出的介质中出现药物活性化合物的速度，以测定药物活性化合物的吸收。

2．根据权利要求1所述的系统，其特征在于，滤膜的旋转由在所述外壳外部的旋转控制装置来控制。

3．根据权利要求1所述的系统，其特征在于，滤膜的旋转由介质流入顶室和底室所产生的力来控制。

4．根据权利要求1、2或3所述的系统，其特征在于，它还包括顶室中的一个电极和底室中的一个电极，这些电极可用来测定横跨细胞单层的跨上皮电阻。

5．根据权利要求1、2或3所述的系统，其特征在于，溶解室是一个流通溶解系统。

6．一种测定模拟的药物制剂生物性溶解以及从中吸收药物活性化合物的方法，其特征在于包括下列步骤：

测定顶介质中的药物制剂的溶解性分布图；

使细胞单层的顶表面与含有药物制剂的顶介质接触；

使细胞单层的底表面与底介质接触；和

测定细胞单层从顶介质中吸收药物活性化合物的速度。

7．根据权利要求6所述的方法，其特征在于，细胞单层吸收药物活性化合物的速度根据底介质中出现活性化合物的速度来确定。

8．根据权利要求7所述的方法，其特征在于，底介质中药物活性化合物的浓度维持在顶介质中浓度的15％或更低。

9．权利要求6、7或8所述的方法的应用，其特征在于，用该方法来测定药物制剂或剂型的IVIVC。

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