ES2214751T3 - Sistema de disolucion y absorcion biologicas simuladas. - Google Patents
Sistema de disolucion y absorcion biologicas simuladas.Info
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Abstract
Un sistema para evaluar la disolución biológica simulada de una formulación farmacéutica y la absorción subsiguiente de un compuesto farmacológicamente activo, que consta de: una cámara de disolución para la determinación del perfil de disolución de la formulación farmacéutica en un medio que se suministrará a la superficie apical de una monocapa celular una cámara de cultivo celular en la que puede tener lugar la absorción del compuesto farmacológicamente activo por la monocapa de células, caracterizada por que la cámara de cultivo celular consta de: i) una carcasa ii) un filtro tubular permeable al medio y capaz de proporcionar sostén a la monocapa celular situada en su superficie interna de forma que la inserción del filtro en el interior de la carcasa forma una cámara apical constituida por el interior del filtro y una cámara basal entre el filtro y la pared de la carcasa en la cual el filtro puede girar en el interior de la carcasa alrededor de un eje de forma sustancialmente paralelaa la dirección del flujo de los medios a través de las cámaras basal y apical iii) sistemas provistos en dicha carcasa para el suministro y salida del medio basal en la cámara basal y del medio apical en la cámara apical, de forma que el medio que fluye de la cámara de disolución y que contiene la formulación farmacéutica se suministre a la cámara apical, y se pueda analizar la tasa de aparición del compuesto farmacológicamente activo en el medio que sale de la cámara apical para así determinar la absorción del compuesto farmacológicamente activo.
Description
Sistema de disolución y absorción biológicas
simuladas.
La invención consiste en un sistema de disolución
y absorción y, más específicamente, en un sistema y método para
evaluar la disolución biológica simulada de una formulación
farmacéutica y la absorción subsiguiente de un compuesto
farmacológicamente activo.
Las técnicas para evaluar la disolución de las
formulaciones farmacéuticas fueron inicialmente introducidas en la
industria farmacéutica por las autoridades reguladoras con el fin de
intentar caracterizar los perfiles de liberación de las
formulaciones poco solubles en medios acuosos. Sin embargo, la
creciente demanda para el uso controlado de formulaciones
farmacéuticas ha dado lugar a la incorporación de la realización de
pruebas de evaluación de la disolución con la mayoría de las
formulaciones, con fines de regulación y de control de calidad.
Además, se están utilizando pruebas de disolución en el proceso de
desarro lo de las formulaciones con el fin de determinar la tasa de
liberación del compuesto activo a partir de la formulación y otros
parámetros relacionados con la actuación de la formulación, para así
desarrollar formas galénicas óptimas y establecer correlaciones
in vitro-in vivo (CIVIV).
Cuando se evalúa la disolución de una formulación
farmacéutica en un sistema in vitro, habitualmente se desea
conseguir una elevada correlación in vitro-in vivo
(CIVIV). Un sistema in vitro que genere datos que se
correlacionan estrechamente con los datos de disolución y absorción
obtenidos in vivo sería provechoso para la industria
farmacéutica como instrumento para varias aplicaciones, entre las
que se encuentran el desarrollo y perfeccionamiento de formas
galénicas, el incremento escalonado de la producción, las pruebas de
bioequivalencia entre lotes, las pruebas de evaluación de nuevas
presentaciones de distinta concentración, las pruebas de evaluación
de pequeñas modificaciones en las formulaciones, las pruebas tras
cambios en el lugar de fabricación y como referencia para requisitos
de bioequivalencia.
A medida que las formas galénicas progresan hacia
formas más avanzadas, es preciso que las pruebas de disolución se
hagan más rigurosas con el fin de proporcionar conocimientos
fundamentales acerca de qué cantidad de compuesto farmacológicamente
activo se encuentra disponible en el lugar o los lugares de
absorción en momentos determinados. Además de ello, el
establecimiento de relaciones entre la forma galénica y la
disponibilidad de un compuesto farmacológicamente activo en el lugar
o los lugares de absorción y las concentraciones sanguíneas
sistémicas de un compuesto farmacológicamente activo permitirán a
los investigadores mejorar al máximo la actuación in vivo del
compuesto farmacológicamente activo mediante el uso de técnicas de
suministro especializadas.
No se ha desarrollado aún una tecnología
relacionada con el proceso de disolución que permita la
determinación de las CIVIV para compuestos farmacológicamente
activos caracterizados por presentar una escasa permeabilidad a
través de las membranas, que sufren un importante grado de
metabolismo intestinal o que precisan sistemas especializados de
transporte para su absorción. Las técnicas para correlacionar los
datos de disolución obtenidos in vitro e in vivo han
estado restringidos hasta la actualidad a tomar en consideración
factores tales como las interacciones con mucinas, sales biliares,
enzimas digestivas, efectos de los alimentos, fuerza iónica y pH.
Los factores tales como el tránsito intestinal de una forma galénica
se pueden compensar mediante el desplazamiento temporal de los datos
de absorción y disolución. Las discrepancias entre los valores de
disolución y absorción obtenidos in vivo e in vitro se
han corregido previamente mediante transformaciones de datos, como
la aplicación de funciones de ponderación intestinales, pero es
posible que estas transformaciones no permitan realizar
interpretaciones fisiológicas. En la actualidad se necesita un
sistema que combine la tecnología de la disolución con un modelo
biológico de absorción intestinal, como un cultivo celular, para su
utilización en la formulación y pruebas de evaluación de formas
galénicas de formulaciones farmacéuticas. Un sistema de estas
características presentaría la ventaja de asemejarse en mucha mayor
medida al sistema fisiológico en comparación con los métodos de
disolución existentes.
El cultivo de células epiteliales de intestino
humano ha alcanzado una gran aceptación como método para establecer
los mecanismos de absorción de los compuestos farmacológicamente
activos. Las técnicas convencionales de cultivo celular permiten
establecer una correlación del flujo del compuesto a través de una
capa epitelial mediante transporte pasivo transcelular o
paracelular, transporte mediado por moléculas transportadoras y
transporte activo.
Cuando la absorción del compuesto se realiza de
forma activa o a través de mecanismos que precisan energía o la
intervención de moléculas transportadoras, es habitual que exista un
componente saturable en dicho proceso de absorción. Las técnicas
actuales de cultivo celular pueden permitir establecer los detalles
de las rutas de absorción, así como la afinidad y capacidad de las
moléculas transportadoras. Asimismo, los cultivos celulares pueden
utilizarse para describir sistemas de bombeo hacia el exterior, como
el sistema mediado por la glicoproteína-P, que
disminuye la absorción de ciertos compuestos. Existe la
posibilidad de que un compuesto se metabolice a nivel intestinal, lo
que reducirá la absorción global de dicho compuesto. Esta
información se emplea actualmente para explicar la existencia de
discrepancias en las CIVIV mediante la transformación de los modelos
cinéticos de modo que incluyan la cinética saturable de
Michaelis-Menton o, alternativamente, la cinética
metabólica o de los sistemas de bombeo hacia el exterior para así
mejorar las CIVIV. Las técnicas actuales de cultivo celular
realizadas en dos dimensiones a lo largo de filtros horizontales no
tienen en cuenta el desplazamiento temporal de los compuestos
farmacológicamente activos debido al tránsito gastrointestinal y
otras condiciones presentes in vivo. Las técnicas de cultivo
celular convencionales permiten realizar interpretaciones sobre los
procesos de absorción mediante la transformación de los datos
obtenidos in vivo, pero no generan CIVIV adecuadas, excepto
cuando se evalúan compuestos que se absorben de forma pasiva. A ello
hay que añadir que los estudios de transporte realizados con
cultivos celulares describen el comportamiento del compuesto en
solución, por lo que no tienen en cuenta los procesos de disolución
o difusión que tienen lugar con una determinada forma galénica ni el
efecto que produce una formulación o forma galénica concreta sobre
la absorción del compuesto estudiado.
Es necesario contar con un método de evaluación
integrado de la disolución in vitro de una formulación
farmacéutica y de la absorción subsiguiente de un compuesto activo.
Estos dos parámetros se han considerado y evaluado, clásicamente, de
forma independiente. In vivo, la aparición de un compuesto
farmacéutico en el torrente sanguíneo es consecuencia, entre otras
cosas, de la disolución de la formulación y la absorción del
compuesto. En el caso de los compuestos cuya absorción se realiza de
forma pasiva, las tasas relativas de disolución y absorción
determinan cuál es el factor limitante de la velocidad de aparición
del compuesto en el torrente sanguíneo. La introducción de formas
galénicas más complejas, especialmente para compuestos y
formulaciones que interactúan con las superficies epiteliales para
su absorción (p. ej., sistemas bioadhesivos), metabolismo o bombeo
hacia el exterior (es decir, aquellos cuya absorción no es pasiva),
hace necesario contar con sistemas más avanzados que permitan
evaluar la repercusión de la formulación sobre los procesos de
disolución y absorción. Un sistema integrado de disolución y
absorción presentará la ventaja de proporcionar mejores CIVIV sin la
desventaja del error asociado con los modelos de predicción que
emplean datos transformados.
La tecnología de la disolución es conocida y
aparece descrita, por ejemplo, en la patente estadounidense nº
4,681,858 (Chaudhari y cols.), que da a conocer una celda de
disolución y un método para determinar la liberación in vitro
de un compuesto farmacológicamente activo a partir de una forma
galénica, como, por ejemplo, de un supositorio. La celda de
disolución permite evaluar la tasa de liberación del compuesto
estudiado en el medio de disolución. Asimismo, la patente
estadounidense nº 5,589,649 (Brinker y cols.) da a conocer un
aparato de evaluación del proceso de disolución que incorpora una
gama de recipientes de prueba y usa calor y agitación mecánica para
disolver las formas galénicas en cada recipiente de prueba.
Las metodologías convencionales de cultivo
celular hacen uso de frascos, placas o pocillos para el cultivo de
células o monocapas celulares. Estas técnicas incorporan
procedimientos de agitación o de mezcla turbulenta para garantizar
la circulación del medio por las células en crecimiento. Se han
desarrollado otros tipos de cámaras de cultivo celular. Por ejemplo,
la patente estadounidense nº 5,026,650 y 5,153,133 (Schwartz y
cols.) presenta un biorreactor que está constituido por un sistema
de cultivo celular que rota horizontalmente con un oxigenador
tubular coaxial. El crecimiento celular tiene lugar en cuentas
microtransportadoras que se encuentran suspendidas en los medios,
mientras el recipiente de cultivo gira alrededor de un mástil que
proporciona oxigenación continua a través de una membrana. La
patente estadounidense nº 5.153,131 (Wolf y cols.) presenta una
cámara de cultivo celular que rota horizontalmente, dotada de una
membrana de diálisis para intercambiar productos de desecho celular
por nutrientes frescos, en tanto que las células se mantienen en
suspensión. La utilización de cámaras de cultivo que giran
horizontalmente, tales como las descritas en las patentes
estadounidenses n^{os} 5,026,650, 5,153,133 y 5,153,131 permite
conseguir una adecuada mezcla de los medios de incubación sin
necesidad de realizar procedimientos de agitación o mezcla
turbulenta, que pueden causar daños en la células cultivadas.
Los modelos convencionales empleados para evaluar
la absorción o permeabilidad de un compuesto farmacológicamente
activo presumen que dicho compuesto no sufre proceso metabólico
alguno en la pared intestinal (Chiou, Int. J. Clin. Pharm. Ther.
1994;32(9):474). Sin embargo, la presente invención podría
posiblemente utilizase para evaluar el metabolismo intestinal y su
efecto sobre la absorción de un compuesto. Además, los modelos
convencionales suponen que un compuesto, una vez absorbido, se
elimina inmediatamente de la cara basal del intestino. Esta
presunción no tiene en cuenta aquellas condiciones que podrían
retrasar la eliminación basal. Por ejemplo, los anestésicos pueden
reducir el flujo sanguíneo hacia el intestino, lo que produce un
enlentecimiento de la eliminación basal del
fármaco.
fármaco.
La patente estadounidense nº 5,518,915 (Naughton
y cols.) muestra un sistema de cultivo de células y tejidos mucosos
en tres dimensiones en el que las células derivadas del tejido
deseado crecen sobre una matriz de soporte. Se puede evaluar el
metabolismo que sufre, por ejemplo, un compuesto farmacológicamente
activo en las células que constituyen este cultivo tridimensional.
Sin embargo, Naughton y su equipo no incluyen el proceso de
disolución de una formulación farmacéutica antes de la evaluación
del metabolismo o de la absorción de un compuesto por parte de las
células cultivadas.
La patente estadounidense nº 5,525,305 (Minekus y
cols.) da a conocer un modelo in vitro del tracto digestivo.
El sistema consta de cámaras similares a tubos y fabricadas con un
material flexible, que están conectadas para permitir el flujo de
gases o líquidos a su través. El contenido de las cámaras simula los
líquidos gástricos y puede incluir enzimas intestinales, ácidos,
etc. Este sistema es útil para la evaluación in vitro de la
digestión e intercambio de componentes de bajo peso molecular a
través de membranas permeables, pero no permite evaluar parámetros
biológicos tales como la absorción a través de una membrana ni
incorpora células cultivadas.
La solicitud de patente canadiense nº 2,201,159
(Myers y cols.) presenta un aparato y método que constituyen un
hígado artificial y que emplea hepatocitos aislados que se pueden
unir a moléculas transportadoras inertes y suspenderse en un medio
de cultivo celular para permitir la purificación de un fluido
biológico como la sangre. A medida que el fluido biológico atraviesa
el hígado artificial y se expone a los hepatocitos, estos pueden
absorber y metabolizar los componentes del fluido biológico de un
modo similar al sistema de funcionamiento del hígado in
vivo. Este sistema emplea células aisladas como modelo de
metabolismo hepático in vivo pero no incorpora tecnología de
disolución.
La patente estadounidense nº 4,667,504 (Hobson)
presenta un dispositivo de flujo continuo para determinar la tasa de
penetración de las sustancias químicas a través de una membrana
biológica in vitro. El aparato está constituido por dos
cámaras, una de las cuales contiene medios en los que se encuentra
una sustancia química en estudio, y la otra medios en los que dicha
sustancia aparece cuando se produce su transporte a través de la
membrana biológica que se encuentra suspendida entre ambas cámaras.
Se pueden extraer muestras de los medios que contiene cada cámara y
proceder a su análisis para determinar la concentración de la
sustancia química. No obstante, este método no incorpora metodología
de disolución.
El objetivo de la invención es proporcionar un
método in vitro que combine la evaluación de la disolución de
una formulación farmacéutica con la evaluación de la absorción
subsiguiente de un compuesto farmacológicamente activo.
Conforme a la invención, se proporciona un
sistema para evaluar la disolución biológica simulada de una
formulación farmacéutica y la absorción subsiguiente de un compuesto
farmacológicamente activo, que consta de:
una cámara de disolución para la determinación
del perfil de disolución de la formulación farmacéutica en un medio
que se suministrará a la superficie apical de una monocapa
celular;
una cámara de cultivo celular en la que se puede
producir la absorción del compuesto farmacológicamente activo por la
monocapa de células y constituida por:
- i)
- una carcasa
- ii)
- un filtro tubular permeable al medio y capaz de aportar sostén a la monocapa celular que se encuentra en su superficie interna, de forma que la inserción del filtro en el interior de la carcasa forma una cámara apical constituida por el interior del filtro y una cámara basal entre el filtro y la pared de la carcasa, y en la cual el filtro puede girar en el interior de la carcasa alrededor de un eje de forma sustancialmente paralela a la dirección del flujo de los medios a través de las cámaras basal y apical
- iii)
- sistemas provistos en dicha carcasa para el suministro y salida del medio basal en la cámara basal y del medio apical en la cámara apical, de forma que el medio que fluye desde la cámara de disolución y que contiene la formulación farmacéutica se suministre a la cámara apical, y se pueda analizar la tasa de aparición del compuesto farmacológicamente activo en el medio que sale de la cámara basal para así determinar la absorción del compuesto farmacológicamente activo.
Se puede controlar la rotación del filtro de este
sistema mediante un dispositivo de control de rotación situado fuera
de la carcasa o bien mediante las fuerzas que resultan del flujo del
medio hacia el interior de la cámara apical o basal.
El sistema puede incluir además sendos electrodos
en el interior de las cámaras apical y basal, que se pueden utilizar
para determinar la resistencia eléctrica transepitelial a lo largo
de la monocapa celular. Se puede utilizar un sistema de flujo
continuo como cámara de disolución de la invención.
Además, la invención proporciona un método para
determinar la disolución biológica simulada de una formulación
farmacéutica y la absorción subsiguiente de un compuesto
farmacológicamente activo, que consta de los siguientes pasos:
determinación del perfil de disolución de la formulación
farmacéutica en un medio apical; exposición de la superficie apical
de una monocapa celular al medio apical que contiene la formulación
farmacéutica; exposición de la superficie basal de la monocapa
celular al medio basal; y determinación de la tasa de absorción del
compuesto farmacológicamente activo por la monocapa celular a partir
del medio apical.
El método de la invención puede determinar la
tasa de absorción del compuesto farmacológicamente activo por parte
de la monocapa celular basándose en la tasa de aparición del
compuesto activo en el medio basal. Con el fin de crear condiciones
de sumidero, la concentración del compuesto farmacológicamente
activo en el medio basal debe mantenerse en un nivel igual o
inferior al 15% con respecto a su concentración en el medio apical.
Conforme a la invención, se facilita también el uso del método
anteriormente mencionado para la determinación de la CIVIV de una
formulación farmacológicamente activa o de una forma galénica.
La actuación in vivo de una formulación
farmacéutica o de un compuesto farmacológicamente activo que forma
parte de una formulación depende entre otras cosas de la solubilidad
y la estabilidad de la formulación y del compuesto en el medio
biológico, la disposición biológica de la formulación y del
compuesto, la cinética de liberación del compuesto a partir de la
formulación, el tiempo de permanencia del compuesto en los lugares
de absorción y de acción, y el transporte del compuesto a través de
las membranas biológicas, como, por ejemplo, el epitelio intestinal.
Un compuesto se puede transportar a través de una membrana biológica
mediante procesos de difusión simple, tales como transporte pasivo
transcelular o paracelular, o mediante un proceso que precisa
energía, como el transporte mediado por moléculas transportadoras,
el transporte facilitado, la endocitosis mediada por receptores y
otros procesos activos. El transporte a través del epitelio
gastrointestinal depende, entre otras cosas, de la masa de compuesto
disponible en el lugar de absorción, el tiempo de permanencia en el
lugar de absorción, el área de la superficie del lugar de absorción,
la permeabilidad aparente (P_{ap}) a través de la membrana
epitelial y la capacidad de difusión a través de la capa de agua
estacionaria que rodea a la membrana epitelial. La formulación puede
afectar a todos o a alguno de estos parámetros y así influir en la
absorción del compuesto farmacológicamente activo estudiado.
Una formulación farmacéutica se puede administrar
mediante distintas formas galénicas que difieren en su composición,
forma, tamaño, etc. Las diferentes formas galénicas de una
formulación precisan también la realización de pruebas de disolución
para determinar los parámetros óptimos. En la actualidad, el diseño
de una forma galénica se basa en parte en los principios de la
teoría de la disolución y la difusión. La difusión es el proceso que
consiste en la transferencia de masa de moléculas individuales de
una sustancia, como consecuencia del movimiento molecular aleatorio
combinado con un gradiente de concentración. La difusión se puede
describir mediante las soluciones de la primera y segunda leyes de
Fick de termodinámica. La primera ley de Fick establece que la
cantidad (M) de material que fluye a través de la unidad de
superficie de una sección transversal (S) de una barrera por unidad
de tiempo (t) se denomina flujo (J). El flujo (J) se calcula de la
siguiente manera:
(I)J = \frac{\delta M}{S
\cdot \delta
t}
El flujo (J) es a su vez proporcional al
gradiente de concentración. El coeficiente de difusión (D) y la
concentración (C) del compuesto en difusión y la distancia (x) del
movimiento perpendicular a la superficie de la barrera se pueden
utilizar para calcular el flujo (J) de la siguiente manera:
(II)J = -D \frac{\delta
C}{\delta
x}
La segunda ley de Fick establece que el cambio de
la concentración con el tiempo en una región particular es
proporcional al cambio en el gradiente de concentración en dicho
punto del sistema. Por lo tanto, el cambio de la concentración a lo
largo del tiempo se calcula tal como sigue:
(III)\frac{\delta C}{\delta
t} = D \frac{\delta ^{2}C}{\delta x^{2}} + \frac{\delta
^{2}C}{\delta y^{2}} + \frac{\delta ^{2}C}{\delta
z^{2}}
donde x, y y z representan la distancia del
movimiento con respecto a la superficie de la
barrera.
La disolución es la velocidad a la cual una
formulación sólida se convierte en una solución. La ecuación de
Noyes-Whitney describió originalmente en términos
sencillos la velocidad a la cual un sólido se disuelve en un
solvente de la siguiente forma:
(IV)\frac{\delta C}{\delta
t} = \frac{DA}{Vh} (C_{s} -
C)
donde \deltaC/\deltat es la velocidad de
disolución, D es el coeficiente de disolución del soluto en la
solución, A es el área de superficie: de sólido expuesto, h es el
espesor de la capa de difusión, V es el volumen de la solución,
C_{s} es la solubilidad del soluto y C es la concentración del
soluto en el momento t. Las ecuaciones (I) a (IV) ayudan a predecir
el comportamiento de una forma galénica cuando ésta se introduce en
un medio biológico. La difusión y la disolución son procesos
íntimamente relacionados y a los que una forma galénica está
sometida de forma simultánea, ya que acaecen al mismo tiempo, lo que
da lugar a sistemas que están controlados por uno o ambos fenómenos.
Las pruebas de evaluación de la disolución permiten determinar de la
cantidad de formulación farmacéutica que contiene una solución, por
lo que se puede determinar de forma reproducible la cantidad de
compuesto farmacológicamente activo que se encuentra disponible para
su absorción. El producto final de las pruebas de disolución es, por
lo tanto, una representación cinética de la forma galénica que
resulta de la interacción dinámica entre la formulación, el
compuesto farmacológicamente activo que ésta contiene y el medio
gastrointestinal.
Las formas galénicas de una formulación pueden
variar desde la simple liberación inmediata a formas de liberación
sostenida, liberación pulsátil, bombas osmóticas, liberación
controlada, liberación selectiva en el lugar objetivo y muchas
otras, todas ellas diseñadas para controlar la cantidad de compuesto
farmacológicamente activo disponible para ser absorbido, bien por un
sistema fisiológico localizado en un lugar concreto, o bien a lo
largo del tiempo, es decir, para conferir una determinada
selectividad espacial, temporal o ambas. La disolución de una forma
galénica puede tener lugar antes, durante o después de la liberación
del compuesto farmacológicamente activo a partir de la formulación,
lo que indica la importancia de las interacciones dinámicas entre el
compuesto y la forma galénica. Las formas galénicas se pueden
clasificar en general como sistemas de difusión controlada o
sistemas de disolución controlada, dependiendo de si el paso
limitante de la velocidad para la disponibilidad del compuesto
farmacológicamente activo en el lugar de absorción es la difusión o
la disolución. Sin embargo, algunos sistemas de suministro pueden
precisar la existencia de elementos fisiológicos desencadenantes o
de condiciones medioambientales específicas (p. ej, cambios en el
pH), fuerzas osmóticas (p. ej., una bomba osmótica), unión de un
ligando a un receptor u otros modelos diseñados para descarga rápida
de la dosis, cuyos perfiles de disolución y absorción son más
complejos.
La disolución biológica de una formulación
farmacéutica, la absorción del compuesto farmacológicamente activo a
partir de la misma y la forma galénica influyen sobre la actuación
in vivo del compuesto activo. Se han conseguido mejores
correlaciones teniendo en cuenta las condiciones de sumidero y la
capa de Nernst o capa de agua estacionaria que rodea a la forma
galénica. Los efectos de la capa de Nernst se pueden reducir al
mínimo ajustando las velocidades de agitación u optimizando el
ensamblaje del recipiente de disolución para garantizar la
existencia de unas condiciones hidrodinámicas constantes en torno a
la forma galénica. Tal como explica la ecuación de
Noyes-Whitney (IV), el gradiente de concentración
(\deltaC/\deltat) influye sobre la disolución (C_{S} - C). En
algunos casos es deseable conseguir condiciones de sumidero, donde C
< 10-15% de C_{s}, con el fin de minimizar la
influencia del gradiente de concentración sobre la disolución.
Debido a que C_{S} es un valor constante para un compuesto
farmacológicamente activo concreto en determinadas condiciones, en
el caso de los compuestos poco solubles, las condiciones de sumidero
se pueden alcanzar reduciendo C, bien mediante el aumento del
volumen de los medios, o bien mediante depleción del compuesto en
los medios. Se ha logrado deplecionar de compuesto los medios con
anterioridad mediante el empleo de adsorbentes de fase sólida,
partición del compuesto en una segunda fase orgánica o transporte a
través de una membrana. De forma alternativa, se ha incrementado
C_{S} previamente mediante la adición de cosolventes orgánicos,
surfactantes y solubilizantes adicionales, aunque la importancia
fisiológica de estas metodologías no están clara aún.
La línea celular más utilizada para el estudio
del transporte intestinal es la línea Caco-2, una
línea celular de colon transformada y de origen tumoral, que se
diferencia de forma espontánea cuando se cultiva. Las células
Caco-2 expresan muchas de las características de los
enterocitos de intestino delgado humano, incluidas las enzimas del
borde en cepillo de dichas células, los receptores para el folato y
la cianocobalamina, el sistema de bombeo al exterior de la célula
mediado por la glicoproteína-P, las bombas de sodio,
potasio, fosfato y protones, los transportadores de hexosas y las
proteínas transportadoras de sales biliares y dipéptidos y
tripéptidos. La línea celular HT-29 es una línea
celular mucosa secretora que expresa características similares a las
de las células caliciformes intestinales. La línea celular colónica
T-84 presenta una elevada resistencia eléctrica y
expresa características similares a las del intestino grueso. El
transporte de compuestos farmacológicamente activos por estas y
otras línea de cultivo celular que poseen características similares
a las células intestinales humanas se puede emplear para determinar
la disponibilidad biológica de las formas galénicas de
administración oral de una formulación farmacéutica que contiene un
determinado compuesto activo.
Se pueden utilizar otros tipos de células
epiteliales con la invención. Es posible emplear cualquier línea
celular capaz de formar una monocapa. Por ejemplo, además de las
líneas celulares intestinales y colónicas previamente mencionadas,
se puede usar la línea MDCK (células renales). Se pueden emplear las
líneas celulares epiteliales que forman parte de la barrera
hematoencefálica y de las interfaces sangre-orina,
sangre-aire (líneas celulares alveolares),
sangre-dermis, sangre-hepatocitos o
sangre-corneocitos (oculares) o cualquier otra
interfaz entre el compartimento sanguíneo central y los órganos
encargados del metabolismo o eliminación, según la información que
se necesite. Las líneas celulares que se pueden utilizar con esta
invención incluyen cultivos celulares conjuntos, líneas celulares
con mutaciones puntuales o cualquier tipo de avance en la tecnología
de los cultivos celulares que pudiera permitir el uso de líneas
celulares no transformadas derivadas de tejidos humanos o
procedentes de otras especies de mamíferos. Se pueden emplear
diferentes líneas celulares dependiendo del lugar de absorción del
compuesto farmacológico. Si el tema de investigación estudiado es la
eliminación por vía renal de un compuesto, se podría utilizar una
línea celular renal. Asimismo, se podría evaluar el metabolismo
hepático empleando una línea celular hepática.
En el caso de los compuestos que se absorben de
forma pasiva, se puede lograr una CIVIV relativamente alta
ordenándolos escalonadamente de acuerdo con su coeficiente de
partición aceite-agua (log K_{o/w}) \cdot
K_{o/w} es un coeficiente de distribución de un sistema en
equilibrio y se calcula tal como sigue:
(V)K_{o/w} = C_{o}
/C_{w}
donde C_{o} es la concentración del compuesto
en aceite (generalmente n-octanol) y C_{w}es la
concentración del compuesto en agua en un sistema en equilibrio a
una temperatura y presión especificadas. El coeficiente de
distribución en equilibrio de un compuesto es un indicador del grado
de hidrofobia del dicho compuesto. La fase oleosa se puede comparar
con la membrana lipídica de una célula y, por lo tanto, un
coeficiente K_{o/w} más elevado indica una tasa de absorción más
alta. Una CIVIV determinada de forma convencional reviste una menor
importancia en el caso de compuestos con un log K_{o/w} mayor de
3,5, debido a problemas de solubilidad. Asimismo, un compuesto
hidrofílico (es decir, con K_{o/w} bajo) cuyo peso molecular sea
inferior al tamaño molecular a partir del cual el transporte
paracelular está restringido (400-800 daltons)
presentará una tasa de absorción más elevada que la pronosticada
mediante estos sencillos mode-
los.
los.
A continuación se describirán los modos de
realización de la invención, a modo de ejemplo, con referencias a
los dibujos acompañantes, en los que:
La Figura 1 es un diagrama de flujo de un modo
de realización de un sistema de disolución y absorción biológicas
simuladas.
La Figura 2 es una representación esquemática de
la cámara de cultivo celular del sistema de disolución y absorción
biológicas simuladas representado en la Figura 1.
La Figura 3 es una representación esquemática de
la cámara de cultivo celular representada en la Figura 2 seccionada
transversalmente entre los puntos B-B de la Figura
2.
El diagrama de flujo de la Figura 1 ilustra
esquemáticamente un sistema de disolución y absorción biológicas
simuladas (1) conforme al modo de realización preferido de la
invención. El medio se suministra desde una cámara de suministro de
medio apical (2) al interior de una cámara de disolución (6) gracias
a la existencia de un dispositivo de control del gradiente y del
flujo (4). El dispositivo de control del gradiente y del flujo puede
ser cualquier sistema conocido para este fin, como una bomba
peristáltica. En la cámara de suministro del medio apical (2) se
pueden controlar parámetros tales como la temperatura y la
pCO_{2}. El dispositivo de control del gradiente y del flujo (4)
se puede utilizar para modificar el flujo u otras condiciones en el
medio apical antes de su introducción en la cámara de disolución
(6). Por ejemplo, condiciones tales como el pH, la osmolaridad y el
contenido de sales biliares o de lípidos del medio apical se pueden
modificar antes de la introducción de dicho medio en la cámara de
disolución (6). Algunos parámetros, como el pH y la osmolaridad, se
pueden medir utilizando el dispositivo de control del gradiente y
del flujo (4). Es posible introducir numerosas variaciones en el
medio apical antes de la determinación de la disolución. En un modo
de realización preferido, se suministran varios medios apicales de
diferente composición en la cámara de disolución (6) procedentes de
la cámara de suministro de medio apical (2).
El medio apical se formula de manera que simule
ciertos aspectos del contenido luminal del tracto intestinal y se
mantiene a una temperatura de aproximadamente 37,0 \pm 0,5ºC. El
pH del medio apical oscilará preferentemente entre 1 y 7, según
cuáles sean los aspectos del contenido luminal intestinal que se
desee simular. El medio apical incluirá preferiblemente componentes
tales como sales biliares, mucinas, ácidos gástricos o nutrientes,
como aminoácidos, lípidos o hidratos de carbono. El medio apical se
suministra a la cámara de disolución (6) con el fin de determinar el
perfil de disolución del compuesto farmacológico estudiado y para
que el compuesto se disuelva en su interior antes de suministrar los
medios a la cámara apical (12) de la cámara de cultivo celular
(9).
El medio basal, que fluye hacia la cámara basal
(13) de la cámara de cultivo celular (9), puede pertenecer a
cualquier tipo de medio de los que se emplean para el sustento de
células cultivadas, y puede contener componentes tales como medios
de crecimiento, sueros, amortiguadores de pH, minerales, nutrientes,
hormonas, factores de crecimiento y antibióticos o antifúngicos. En
un modo de realización, se oxigenará el medio basal, que contendrá
alrededor de un 5% de CO_{2} y se mantendrá a una temperatura
aproximada de 37,5ºC. La temperatura podría modificarse para
investigar los efectos de la misma sobre la tasa de absorción y las
concentraciones de CO_{2} se podrían cambiar según las
necesidades.
Una cámara de suministro de medio basal (3), en
la que se podrían controlar la temperatura y la pCO_{2} del medio
basal, proporciona medio basal a la entrada de flujo para el medio
basal (21) de la cámara basal (13) a través de un dispositivo de
control de flujo automatizado (5). Los medios apical y basal media
se suministran a las cámaras apical y basal (12) y (13),
respectivamente, de forma continua, de manera que exista un flujo
constante de medio durante la determinación de la absorción del
compuesto farmacológicamente activo estudiado.
En la cámara de disolución (6) se disuelve en el
medio apical una forma galénica de una formulación farmacéutica que
contiene el compuesto farmacológicamente activo estudiado, conforme
a cualquier tipo de tecnología de disolución conocido. La velocidad
de mezcla en la cámara de disolución (6) influye sobre la capa de
agua estacionaria que circunda a la forma galénica y, por lo tanto,
está sometida a un control automatizado. Una vez que la formulación
se ha disuelto en el medio apical, el medio sale de la cámara de
disolución (6) y fluye hacia un dispositivo de control del flujo
(7). El dispositivo de control del flujo (7) divide el medio que
sale de la cámara de disolución (6) con el fin de regular el flujo
de entrada en la cámara de cultivo celular (9). Si el proceso de
disolución lleva a la generación de un gran volumen de medio apical
que contiene la formulación farmacéutica, sólo una porción del mismo
entrará en la cámara de cultivo celular (9) para así mantener una
tasa de flujo estándar y prevenir que se produzca una tensión de
cizallamiento excesiva sobre la monocapa celular situada en el
interior de la cámara de cultivo celular (9).
El dispositivo de control del flujo (7) también
deriva el medio apical de la cámara de disolución (6) hacia un
dispositivo de análisis del perfil de disolución (8), que analiza la
cantidad de formulación farmacéutica disuelta o suspendida en el
medio apical que abandona la cámara de disolución (6). Se puede
utilizar un dispositivo de análisis del perfil de disolución (8)
acorde con cualquier metodología disponible, con el fin de
determinar el perfil de disolución del compuesto farmacológico
estudiado en el medio que sale de la cámara de disolución (6).
Se puede incorporar un dispositivo de filtración
en la cámara de disolución (6) para controlar el tamaño de las
partículas que abandonan la cámara de disolución. Puede resultar
deseable que permanezcan partículas de la forma galénica en el seno
de los medios apicales que se van a suministrar a la región apical
(12) con el fin de obtener información acerca de la absorción de
dichas partículas.
Antes de entrar en la cámara de cultivo celular
(9) se conoce la concentración de diversos componentes de los medios
apical y basal. El perfil de disolución del medio apical se evalúa
después de la adición del compuesto farmacológicamente activo en la
cámara de disolución (6). Se toman muestras y se analizan los medios
apical y basal tras su paso a través de la cámara de cultivo celular
(9) mediante cualquier método de análisis que resulte adecuado.
En la cámara de disolución (6) se puede utilizar
cualquier tipo de tecnología de disolución disponible. La cámara de
disolución presenta un diseño de flujo continuo con flujo laminar o
turbulento, como corresponda, a fin de garantizar que se consigue
una adecuada mezcla (Moller, Pharmaceutical Industry
1983;45:617-622). Otros tipos de tecnología de
disolución que se pueden emplear son la adición de surfactantes o
cosolventes orgánicos (Abrahamsson y cols., Pharmaceutical Research
1994;11: 1093-7) y un sistema de dos fases, como un
método de fases acuosa/orgánica (Grundy y cols., Proc. Intern. Symp.
Control Rel. Bioact. Mater. 1996;23, Controlled Release Society
Inc., Baltimore, MD, Aug. 21-22). Se puede usar
cualquier técnica de solubilización disponible para generar las
condiciones de sumidero, tal como resulte pertinente.
Los sistemas SOTAX^{TM} (SOTAX Corporation,
Richmond, VA) son ejemplos de tecnologías de disolución disponibles
en la actualidad. El aparato para pruebas de disolución SOTAX AT
7^{TM} satisface las guías vigentes de la USP para la realización
de pruebas y se ha adaptado para realizar secuencias rutinarias de
forma automática. El sistema SOTAX MEDIUM CHANGE^{TM} permite
realizar uno o múltiples cambios en los medios y se puede adaptar
para que funcione de forma completamente automática. SOTAX
SystemPlus EE^{TM} cuenta con software de disolución para el
análisis de los datos relacionados con los procesos de disolución y
para generar un perfil de disolución.
El medio apical se suministra desde la cámara de
disolución (6) a la región apical (12) de la cámara de cultivo
celular (9) previo paso por un dispositivo de control del flujo (7).
El dispositivo de control del flujo (7) regula el paso de los medios
apicales hacia la región apical (12) de la cámara de cultivo celular
(9). Este flujo se puede automatizar completamente para permitir que
el resultado del perfil de disolución determine la velocidad de
flujo hacia la cámara apical.
Tal como ilustra la Figura 1 y como muestra en
detalle la Figura 2, la cámara de cultivo celular (9) está
constituida por la carcasa de la cámara de cultivo celular (23) y el
sistema de filtro (24). La inserción del filtro (28) en el interior
de la carcasa de la cámara de cultivo celular (23) divide a ésta en
una cámara apical (l2), situada en la parte interna del filtro (28),
y una cámara basal (13), que rodea al filtro (28). La cámara apical
(12) y la cámara basal (13) son, por lo tanto, cámaras separadas a
través de las que fluyen los medios. De esta forma, la superficie
basal de la monocapa celular (29) se encuentra expuesta al medio
basal a través del filtro (28), que es permeable a los medios. La
superficie apical de la monocapa celular (29) está expuesta al medio
apical.
Se pueden emplear sistemas de análisis de la
resistencia eléctrica transepitelial (RET) (10) para determinar la
viabilidad o integridad de la monocapa celular en el interior de la
cámara de cultivo celular (9) midiendo la resistencia de la monocapa
celular cuando se aplica un voltaje entre electrodos situados a cada
lado de la monocapa.
Tal como ilustra la Figura 2, es preferible
situar un electrodo apical (26) en la cámara apical (12) y un
electrodo basal (25) en la cámara basal (13) para realizar la
medición de la resistencia eléctrica transepitelial, que servirá
como indicador de la viabilidad celular en la monocapa (29). La
resistencia eléctrica transepitelial mide la integridad de las
firmes uniones existentes entre las células. Una resistencia elevada
indica la existencia de una monocapa confluente. Asimismo, es
posible emplear cualquier tipo de sistema de medición de viabilidad
celular con el fin de comprobar la viabilidad de las células de la
monocapa celular (29). Se pueden utilizar también otros marcadores
tales como el paso de PEG, manitol o inulina a través de las
estrechas uniones celulares para evaluar el transporte
paracelular.
El sistema de filtro (24) está constituido por un
filtro (28) que se mantiene en su lugar mediante la colocación de
clips de montaje (30) entre la entrada de flujo (20) y la salida de
flujo (35). La rotación del sistema de filtro (24) en el interior de
la cámara de cultivo celular (9) se controla mediante un sistema de
control de la rotación (11), que en un modo de realización preferido
es un sistema motorizado y externo a la cámara de cultivo celular
(9). La rotación del filtro asegura la realización de una buena
mezcla y reduce al mínimo la capa de agua estacionaria adyacente a
la monocapa celular.
En un modo de realización preferido, el sistema
de filtro (24) gira gracias a la acción de un sistema de control de
la rotación (11), que es un motor situado en un extremo de la
carcasa de la cámara de cultivo celular (23). Tal como muestra la
Figura 2, el sistema de control de la rotación (11) está acoplado al
sistema de filtro (24), lo que permite la rotación del sistema de
filtro (24) alrededor de un eje horizontal (A) en el interior de la
carcasa de la cámara de cultivo celular (23). La rotación del filtro
(28) y la consiguiente rotación de la monocapa celular (9) aseguran
que se logre una adecuada mezcla de los medios, lo que reduce a su
vez el tamaño de la capa de agua estacionaria adyacente a la
superficie apical de la monocapa celular (29). De esta manera se
incrementa el contacto del compuesto farmacológicamente activo y los
nutrientes presentes en el medio apical con la monocapa celular
(29).
De forma alternativa, con el objetivo de generar
la rotación del sistema de filtro (24) alrededor del eje (A), se
puede ajustar la velocidad del flujo del medio apical o basal hacia
el interior de la cámara de cultivo celular (9) de forma que se
provoque dicha rotación mediante el flujo de entrada del medio, en
lugar de utilizar un sistema de control de rotación externo.
El medio apical que contiene la formulación
farmacéutica y el medio basal fluyen a través de las cámaras apical
y basal (12) y (13), respectivamente, de la cámara de cultivo
celular (9) a velocidades controladas por los dispositivos de
control de flujo (7) y (5). Una vez que los medios han atravesado la
cámara de cultivo celular (9), cada medio fluye hacia uno de los
dispositivos de control de flujo (14) y (15), respectivamente. Los
dispositivos de control de flujo (14) y (15) sirven como puertos de
entrada para los medios apical y basal hacia los sistemas de
análisis del medio apical y del medio basal (18) y (19),
respectivamente.
Antes de la entrada de los medios apical y basal
media en sus respectivos sistemas de análisis (18) y (19), los
medios pueden fluir hacia las cámaras externas (16) y (17) que
sirven como dispositivos de recogida para las cantidades excesivas
de medios, o donde se pueden diluir los medios, generar sustancias
derivadas del compuesto estudiado en los medios o realizar otras
manipulaciones de los medios que puedan ser necesarias para los
análisis. Los sistemas de análisis de los medios (18) y (19) pueden
estar constituidos por cualquier dispositivo que cuente con la
sensibilidad necesaria. La detección de concentraciones bajas del
compuesto estudiado en el medio basal haría necesaria la utilización
de sistemas de análisis de medios basales de alta sensibilidad.
La Figura 2 ilustra la cámara de cultivo celular
(9) de acuerdo con el modo de realización de la invención
representado en la Figura 1. La Figura 3 muestra este modo de
realización en un corte a través de la línea B-B de
la Figura 2. El medio apical, al que se expondrá la superficie
apical de la monocapa celular (29), y el medio basal, al que se
expondrá la superficie basal de la monocapa celular (29) se
suministran a la cámara de cultivo celular a través de la entrada de
flujo para el medio apical (20) y la entrada de flujo para el medio
basal (21).
En el interior de la cámara de cultivo celular
(9) se encuentra un sistema de filtro rotatorio (24) que contiene un
filtro tubular (28) capaz de sustentar una monocapa celular (29) en
su superficie interna. Las células de la monocapa están polarizadas
de forma que la superficie celular basal se encuentra en posición
adyacente al filtro (28). La superficie celular apical, que
corresponde a la cara luminal del tracto gastrointestinal, está
orientada hacia la luz interna del filtro (28). El filtro (28), que
es extraíble, se inserta en el interior de la carcasa de la cámara
de cultivo celular (23) de forma que se constituyen una cámara
apical (12) y una cámara basal (13). Los medios apical y basal
fluyen a través de las cámaras apical y basal (12) y (13),
respectivamente.
En el modo de realización de la invención que
aparece en la Figura 2, el filtro (28) que contiene la monocapa
celular (29) se inserta en la carcasa de la cámara de cultivo
celular (29) a través de una apertura (27) presente en la carcasa.
Para mantener el filtro en su lugar se emplean clips de montaje (30)
que se colocan en el sistema de filtro rotatorio (24). La longitud
de los clips de montaje (30) es equivalente a la longitud de los
soportes que se pueden utilizar para asegurar el filtro en un
sistema de cultivo primario, sobre el que se tratará en detalle más
adelante. Las células no crecen en la porción del filtro que los
clips han hecho inaccesible.
El sistema está diseñado de forma que la
velocidad del flujo que atraviesa la cámara apical (12) simule el
flujo gastrointestinal y no provoque alteraciones en la monocapa
celular (29). La velocidad del flujo a través del tracto
gastrointestinal humano varía de acuerdo con parámetros como el
radio del segmento intestinal, las contracciones peristálticas y el
movimiento pendular de las vellosidades intestinales. Se estima que
la velocidad de flujo luminal en el tracto gastrointestinal oscila
desde aproximadamente 3 a unos 18 ml/minuto, en un cálculo basado en
un radio luminal de 1,3 cm (Chiou. Int. J. Clin. Pharm. Ther.
1994:32(9):474). La velocidad del flujo del medio apical a
través de la cámara apical (12) conforme a la invención se mantiene
preferiblemente por debajo de 20 ml/minuto. En la actualidad, las
velocidades de flujo estándar utilizadas en los métodos de
disolución de flujo continuo oscilan entre 8 y 15 ml/minuto. El
flujo variará de acuerdo con el diámetro o el área de superficie del
filtro.
Puede ser necesario que la velocidad del flujo de
los medios apical y basal a su paso por las cámaras apical y basal
(12) y (13) sea más alta, por ejemplo, para garantizar que se
consiguen las condiciones de sumidero, y, por ello, se puede emplear
una velocidad de flujo de hasta 50 ml/minuto. Las velocidades de
flujo más elevadas en el interior de la cámara basal (13) producen
sólo pequeñas alteraciones en la monocapa celular (29) debido a que
el filtro (28) separa la monocapa (29) de la cámara basal (13) y de
esta forma actúa como una barrera para toda turbulencia que se
pudiera generar en la cámara basal (13) como consecuencia del flujo
del medio a su través. Dado que el diámetro o el área de superficie
del filtro (28) son pequeños, las velocidades de flujo de los medios
apical y basal a través de la cámara de cultivo celular (9) pueden
también reducirse con el fin de establecer las condiciones
pertinentes desde el punto de vista fisiológico.
El control de temperatura de la cámara de cultivo
celular (9) puede influir sobre la temperatura del medio basal, al
que se encuentra expuesta la superficie basal de la monocapa celular
(29). La superficie apical de la monocapa celular (29) está expuesta
al medio apical, cuya temperatura se puede controlar mediante un
sistema externo a la cámara de cultivo celular (9). El sistema de
control de la rotación (11), que en este caso es un motor externo a
la cámara de cultivo celular, controla la velocidad rotacional del
sistema de filtro (22). Es preferible que la velocidad rotacional no
supere las 100 rpm.
La entrada de flujo para el medio apical (20)
está situada en un extremo de la cámara apical (12) y en situación
coaxial con respecto al eje de rotación (A) del sistema de filtro
(24). La salida de flujo para el medio apical (35) está situada en
el otro extremo de la cámara apical (12) y en situación coaxial con
respecto al eje de rotación (A) del sistema de filtro (24). Por lo
tanto, el flujo del medio apical transcurre de forma paralela al eje
de rotación (A) del sistema de filtro (24). El medio obtenido a
nivel de la salida de flujo (36) se puede analizar para determinar
la concentración del compuesto farmacológicamente activo estudiado o
la presencia de metabolitos del compuesto estudiado. La invención se
puede utilizar también para estudiar la formación de metabolitos a
partir del compuesto farmacológicamente activo estudiado en la
monocapa celular (29) o para evaluar la cantidad de cualquier
componente de la formulación farmacéutica transportado a través de
la monocapa celular (29).
La entrada de flujo para el medio basal (21) está
situada en un extremo de la cámara basal (13) y la salida de flujo
para el medio basal (36) se encuentra en el extremo axialmente
opuesto de la cámara basal (13). Por lo tanto, el flujo del medio
basal transcurre en dirección paralela al eje de rotación (A) del
sistema de filtro (24). El medio obtenido a nivel de la salida de
flujo para el medio basal (36) se puede analizar.
El control de la velocidad de flujo en el
interior de la cámara basal (13) se puede utilizar para conseguir
establecer condiciones de sumidero a lo largo de la monocapa celular
(29). La concentración del compuesto farmacológicamente activo en el
medio basal se puede mantener a un nivel igual o inferior al 15% con
respecto a su concentración en el medio apical en todo momento
ajustando la velocidad del flujo de medio basal que entra en la
cámara basal (13). Si se produce un aumento de la tasa de absorción
a nivel de la monocapa celular (29), se puede incrementar la
velocidad de flujo del medio basal para garantizar que el gradiente
de concentración no limite la absorción a nivel de la monocapa
celular (29).
Se pueden modificar parámetros tales como las
velocidades de flujo a través de las cámaras apical (12) y basal
(13), la composición de los medios apical y basal, la oxigenación de
los medios y la velocidad rotacional del sistema de filtro, con el
fin de optimizar las condiciones para una determinada
aplicación.
Los medios apical y basal abandonan la cámara de
cultivo celular a través de las salidas de flujo para el medio
apical y para el medio basal (35) y (36), respectivamente. El
análisis del medio apical antes y después de su paso por la cámara
de cultivo celular (9) y la determinación de la cantidad de
compuesto estudiado que aparece en el medio basal tras su paso a
través de la cámara de cultivo celular (9), permiten determinar de
forma exacta la absorción del compuesto activo por la monocapa
celular (29), que se puede entonces relacionar con la disolución de
una formulación sometida a prueba para determinar la disolución
biológica simulada de la formulación y la absorción subsiguiente del
compuesto estudiado.
De esta forma, los parámetros de disolución y
absorción se pueden determinar con un solo sistema para así
proporcionar una medición de la actuación in vitro de una
forma galénica de una formulación farmacéutica.
En una forma de realización de la invención, se
mantienen las condiciones de sumidero a lo largo de la monocapa
celular (29) y se ajusta el flujo del medio basal de forma que en el
interior de la cámara de cultivo celular (9) la concentración del
compuesto farmacológicamente activo estudiado en la cámara basal
(13) no supere un 15% con respecto a la concentración en la cámara
apical (12). Conforme a la invención, es preferible mantener las
condiciones de sumidero a lo largo de la monocapa celular (29). La
existencia de condiciones de sumidero entre las cámaras basal (13) y
apical (12) de la cámara de cultivo celular (9) garantizan que el
transporte y otros aspectos de la absorción o el metabolismo no
resulten afectados por la presencia de una concentración excesiva
del compuesto farmacológicamente activo.
Asimismo, es opcional mantener las condiciones de
sumidero en el medio apical de forma que la concentración de
compuesto farmacológicamente activo no supere el
10-15% de la concentración de solubilidad saturada.
No es siempre necesario mantener este gradiente de disolución para
evaluar de forma exacta los procesos de disolución y absorción
biológicos mediante el sistema y método de la invención.
Para acompañar al sistema que constituye la
presente invención, se cultivan células procedentes de una línea
celular intestinal, como las células Caco-2, en un
filtro situado en un sistema de cultivo primario, para uso conjunto
con la invención. Se inserta un filtro en un dispositivo para
sistemas de cultivo primarios y se mantiene dicho filtro en su lugar
mediante soportes localizados en cada extremo del filtro, cuya
profundidad será preferiblemente la misma que las de los clips de
montaje de la cámara de cultivo celular, con el fin de garantizar
que las células no crecerán hasta los extremos del filtro. El filtro
puede contar con la posibilidad de girar alrededor de un eje
horizontal. Se puede emplear cualquier método de cultivo que permita
que una monocapa confluente de células se adhiera al la cara interna
del filtro. En este modo de realización concreto, el inóculo celular
se inserta en la región de la cara luminal del filtro situado en el
interior del sistema de cultivo primario, que, a continuación, se
introduce en el medio de cultivo y se coloca en una incubadora para
permitir el desarrollo de la monocapa celular. El tamaño del sistema
de cultivo primario puede variar tal como sea necesario para los
diferentes tamaños del filtro. El dispositivo que alberga el sistema
de cultivo primario puede ser una placa con uno o varios pocillos o
cualquier recipiente adecuado con capacidad para sustentar el
crecimiento de una monocapa en un filtro insertado en su interior.
Es preferible que el filtro sea desechable y, en el presente modo de
realización, es preferible que su diámetro oscile entre 0,5 y 2 cm.
La invención ha previsto también el uso de filtros de menor tamaño
con sistemas automatizados de obtención de múltiples muestras.
Las células cultivadas crecen en la superficie
interna del filtro tubular (28) y están polarizadas de forma que la
superficie apical de la monocapa celular (29) quede orientada hacia
la porción interna del filtro y la superficie basal (membrana
basolateral) de la monocapa quede en posición adyacente al filtro
(28), mirando hacia fuera. De forma alternativa, se puede también
cultivar las células sobre hojas de filtro planas situadas en un
sistema de cultivo primario, a las que a continuación se les
conferirá una forma tubular antes de su inserción en la cámara de
cultivo celular.
Es preferible que el filtro (28) esté constituido
por nitrocelulosa, policarbonato o cualquier material inerte sobre
el que se puedan cultivar células. El filtro presenta un área de
superficie y poros de un tamaño definidos, excepto el área cubierta
por los clips de montaje (30). Una vez que se ha desarrollado una
monocapa celular (29) en el filtro (28), éste se extrae del sistema
de cultivo primario y se inserta en la cámara de cultivo celular (9)
del sistema de disolución y absorción biológicas simuladas.
Los filtros de membrana porosa y permeable o los
soportes sobre los que pueden crecer células cultivadas son
fácilmente asequibles. Por ejemplo, los soportes permeables
Transwell^{TM} se pueden adquirir de Corning, Costar Corporation
(Cambridge, Massachusetts). Los soportes permeables Transwell^{TM}
permiten específicamente un cómodo acceso independiente a las
membranas de plasma apical y basal una vez que las células hayan
crecido formando una monocapa.
Según el sistema y método de la invención, los
parámetros tales como tensiones mecánicas, distensión intestinal,
fuerzas de cizallamiento, variabilidad entre especies, etc., se
pueden abordar ajustando las velocidades de flujo de los medios a
través de la cámara de cultivo celular. Asimismo, se podría ajustar
el flujo basal para lograr condiciones de sumidero; por ejemplo,
para aquellos compuestos cuya solubilidad sea baja, puede ser
necesario emplear velocidades de flujo más elevadas. El extremo
superior del rango del flujo basal puede imitar la fisiología del
flujo sanguíneo en humanos.
El sistema de la presente invención puede
incorporar diferentes tipos de flujo a través de la cámara de
cultivo celular, como, por ejemplo, laminar, peristáltico, tortuoso,
etc., con el fin de simular la distensión y tránsito
gastrointestinales. Se puede crear un movimiento pendular
balanceando la cámara de cultivo celular. Se pueden añadir éstas y
otras manipulaciones de las condiciones presentes en la cámara de
cultivo celular a fin de simular el tránsito gastrointestinal.
En un modo de realización de la invención, se
podría determinar el flujo de medios que entra en la cámara de
cultivo celular haciendo uso de una válvula que permitiese el flujo
de proporciones variables de medio procedente de la cámara de
disolución hacia la entrada de flujo para el medio apical, de forma
que se pueda controlar la fuerza de cizallamiento ejercida sobre la
superficie de la monocapa celular. Conforme a un modo de
realización, el radio de la válvula puede ser extensible desde 0 a
1,3 cm, para permitir la interrupción temporal del flujo (es decir,
cuando el radio de la válvula sea 0 cm) o para regular el flujo (es
decir, cuando el radio de la válvula sea mayor de 0 cm).
Además, conforme a la invención, el diseño puede
ser automatizado o de tamaño reducido para permitir realizar
diversas mediciones simultáneas empleando cantidades reducidas de
medios y células. La realización de pruebas de múltiples unidades de
forma simultánea permite una evaluación más rápida de los procesos
de disolución y absorción biológicos simulados. La miniaturización
del sistema permite reducir las cantidades necesarias de
soluciones, solutos, células y otros materiales. El sistema se puede
usar para evaluar el grado de permeación de un compuesto
farmacológicamente activo a lo largo de la monocapa celular (29), el
transporte activo o pasivo de un compuesto en el seno de la monocapa
celular o la conversión metabólica de un compuesto en la
monocapa.
El sistema y método de la invención son útiles
para la evaluación de la disolución biológica simulada de
formulaciones farmacéuticas en condiciones controladas, lo que
permite obtener mejores CIVIV.
Claims (9)
1. Un sistema para evaluar la disolución
biológica simulada de una formulación farmacéutica y la absorción
subsiguiente de un compuesto farmacológicamente activo, que consta
de:
una cámara de disolución para la determinación
del perfil de disolución de la formulación farmacéutica en un medio
que se suministrará a la superficie apical de una monocapa
celular
una cámara de cultivo celular en la que puede
tener lugar la absorción del compuesto farmacológicamente activo por
la monocapa de células,
caracterizada por que la cámara de cultivo
celular consta de:
- i)
- una carcasa
- ii)
- un filtro tubular permeable al medio y capaz de proporcionar sostén a la monocapa celular situada en su superficie interna de forma que la inserción del filtro en el interior de la carcasa forma una cámara apical constituida por el interior del filtro y una cámara basal entre el filtro y la pared de la carcasa en la cual el filtro puede girar en el interior de la carcasa alrededor de un eje de forma sustancialmente paralela a la dirección del flujo de los medios a través de las cámaras basal y apical
- iii)
- sistemas provistos en dicha carcasa para el suministro y salida del medio basal en la cámara basal y del medio apical en la cámara apical, de forma que el medio que fluye de la cámara de disolución y que contiene la formulación farmacéutica se suministre a la cámara apical, y se pueda analizar la tasa de aparición del compuesto farmacológicamente activo en el medio que sale de la cámara apical para así determinar la absorción del compuesto farmacológicamente activo.
2. Un sistema conforme a la reivindicación 1,
caracterizado porque la rotación del filtro se controla
mediante un sistema de control de la rotación localizado en el
exterior de dicha carcasa.
3. Un sistema conforme a la reivindicación 1,
caracterizado porque la rotación del filtro se controla
mediante las fuerzas resultantes del flujo del medio hacia el
interior de la cámara apical o basal.
4. Un sistema conforme a la reivindicación 1, 2 ó
3, caracterizado porque consta también de sendos electrodos
situados en el interior de las cámaras apical y basal, que se puede
emplear para determinar la resistencia eléctrica transepitelial a lo
largo de la monocapa celular.
5. Un sistema conforme a la reivindicación 1, 2 ó
3, caracterizado porque la cámara de disolución es un sistema
de disolución de flujo continuo.
6. Un método para determinar la disolución
biológica simulada de una formulación farmacéutica y la absorción
subsiguiente de un compuesto farmacológicamente activo,
caracterizadas mediante la combinación de los siguientes
pasos:
determinación del perfil de disolución de la
formulación farmacéutica en un medio apical
exposición de la superficie apical de una
monocapa celular al medio apical que contiene la formulación
farmacéutica
exposición de la superficie basal de una monocapa
celular al medio basal que contiene la formulación farmacéutica
determinación de la tasa de absorción del
compuesto farmacológicamente activo por la monocapa celular a partir
del medio apical.
7. Un método conforme a la reivindicación 6,
caracterizado por que la tasa de absorción del compuesto
farmacológicamente activo por la monocapa celular se determina a
partir de la tasa de aparición del compuesto activo en el medio
basal.
8. Un método conforme a la reivindicación 7,
caracterizado porque la concentración del compuesto
farmacológicamente activo en el medio basal se mantiene en un nivel
igual o inferior al 15% con respecto a su concentración en el medio
apical.
\newpage
9. Uso de un método conforme a la reivindicación
6, 7 u 8, caracterizado porque se utiliza para la
determinación de la correlación in vitro-in vivo
(CIVIV) de una formulación farmacéutica o de una forma galénica.
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