BR112017003167B1 - Método in vitro, aparelho para análise do comportamento de substâncias em ambiente fisiológico simulado e uso do mesmo - Google Patents

Abstract

a presente invenção refere-se a um método in vitro e aparelho para análise do comportamento de substâncias em ambiente fisiológico simulado. o método compreende as etapas de : proporcionar um primeiro fluido, uma matriz de gel e um segundo fluido, separar o primeiro fluido e a matriz de gel por pelo menos uma primeira membrana semipermeável e separar a matriz de gel e o segundo fluido por pelo menos uma segunda membrana semipermeável. o método compreende adicionalmente, as etapas de injetar uma substância no pri-meiro fluido, deixar a substância migrar a partir do primeiro fluido por meio de pelo menos uma primeira membrana semipermeável, através da matriz de gel, por meio de pelo menos uma segunda membrana semipermeável e para o segundo fluido, e determinar a depuração da substância a partir do primeiro fluido.

Description

[001] A invenção refere-se a um método in vitro e aparelho para análise do comportamento de substâncias, preferencialmente, macro- moléculas tais como, por exemplo, proteínas, em ambientes fisiológicos simulados. Especialmente, a invenção refere-se a um método in vitro e aparelho para análise do comportamento de substâncias em condições oculares simuladas.

[002] Para o tratamento de degeneração macular ou doenças da retina tais como, por exemplo, retinopatia diabética, injeções intraví- treas de fármacos demonstraram ser bem sucedidas. Nas injeções in- travítreas uma formulação de fármaco é injetada diretamente no humor vítreo (HV), isto é, no gel transparente que preenche o espaço entre a lente e a retina do globo ocular de, por exemplo, humanos. Isto não é menos devido ao fato de que em injeções intravítreas a fração de uma dose administrada de fármaco inalterado que atinge a retina é elevada, desse modo, injeções intravítreas apresentando geralmente, biodispo- nibilidade elevada.

[003] Contudo, testes in vitro para estudar, por exemplo, estabili dade de uma formulação de fármaco em humor vítreo (HV) tem provado pouco útil quando se simulam condições reais in vivo. HV, quando não em seu ambiente natural, degenera-se rapidamente e um valor de pH de HV pode aumentar rapidamente devido à acumulação de produtos degenerados no HV. Desse modo, testes podem não representar a situação real em um olho de uma pessoa viva, especialmente, não durante longos períodos de tempo, tais como, por exemplo, vários dias. Em sistemas de testes mais recentes, o valor fisiológico do pH de HV pode ser estabilizado aplicando um sistema de tamponamento. Neste, produtos de degradação são deixados a levar o HV por meio de uma membrana semipermeável para uma solução de tampão.

[004] Contudo, esses sistemas não permitem simular diferentes condições de barreira para formulações de fármaco. Especialmente, esses não permitem simular diferentes condições de barreira como, por exemplo, proporcionadas por um tecido de segmento posterior de um olho.

[005] Desse modo, há uma necessidade de um método in vitro aperfeiçoado e aparelho de simulação de ambiente fisiológico para analisar o comportamento de substâncias tais como, por exemplo, ma- cromoléculas. Especialmente, há uma necessidade de um método in vitro e aparelho para análise de estabilidade a longo prazo de substâncias em diferentes ambientes fisiológicos simulados.

[006] De acordo com um aspecto da invenção, é proporcionado um método in vitro para análise do comportamento de uma substância em ambiente natural fisiológico simulado. O método compreende as etapas de proporcionar um primeiro fluido, uma matriz de gel e um segundo fluido. O método compreende adicionalmente as etapas de separação do primeiro fluido e da matriz de gel por pelo menos uma primeira membrana semipermeável e separação da matriz de gel e do segundo fluido por pelo menos uma segunda membrana semipermeá- vel. Ainda etapas adicionais são, injetar uma substância para o primeiro fluido, deixar a substância migrar a partir do primeiro fluido através de pelo menos uma primeira membrana semipermeável, em seguida, através da matriz de gel, em seguida, através de pelo menos uma segunda membrana semipermeável e, em seguida, no segundo fluido, e determinar a depuração (clearance) da substância a partir do primeiro fluido.

[007] Ao dispor uma matriz de gel entre pelo menos uma primeira e pelo menos uma segunda membrana semipermeável permite simular barreiras de difusão de substâncias e difusão da substância através das referidas barreiras de uma forma realista. A matriz de gel é disposta entre um primeiro fluido em que uma substância é injetada, por exemplo, uma molécula, por exemplo, uma macromolécula, tal como uma proteína ou uma formulação de fármaco, em um segundo fluido que serve como solução tampão. O primeiro fluido corresponde ou simula o líquido ou tecido em que a substância é injetada. O primeiro fluido pode ser um fluido extraído de humanos ou animais, mas também pode ser um fluido artificial que simula tal fluido natural. O segundo fluido serve como solução tampão, de modo que, por exemplo, um valor de pH do sistema pode ser mantido sob valores desejados, por exemplo, ser mantido constante. O segundo fluido pode funcionar como reservatório para receber ou absorver produtos de precipitação ou degradação.

[008] O arranjo especial permite simular diferentes condições de barreira do mesmo, mas também de diferentes sistemas fisiológicos. Por exemplo, com injeção de uma formulação de fármaco em humor vítreo, a estabilidade e a biodisponibilidade da formulação podem ser simuladas para olhos de humanos, mas também para animais. Por exemplo, pode ser testado diferente comportamento de difusão e precipitação para, por exemplo, diferentes proteínas em diferentes condições oculares (correspondendo a olhos mais ou menos degenerados, por idade ou por doença) e para tecido ocular anterior e tecido ocular posterior e qualquer combinação destes. Esses tecidos apresentam diferentes propriedades de barreira de molécula, que podem ser simuladas e testadas com o método e aparelho de acordo com a invenção variando as propriedades da matriz de gel e, opcionalmente, também as propriedades das membranas semipermeáveis. Além disso, podem ser obtidos resultados de ensaio mais realistas, especialmente, em estabilidade e biodisponibilidade de uma substância, por exemplo, uma proteína ou uma formulação de fármaco, levando em conta uma distância entre um local eficaz de injeção e o local de uma barreira de difusão, bem como, o ambiente físico e químico presente no local da injeção. Desse modo, o método e o aparelho de acordo com a invenção permitem simular mais realisticamente a geometria de um ambiente natural, mais preferencialmente, de um ambiente ocular. Isso é permitido pelo arranjo especial de fluidos e matriz de gel e o arranjo do aparelho como será descrito em detalhes adicionais abaixo.

[009] O método e aparelho de acordo com a invenção pode ser aplicado, mas não se limitam aos mesmos, avaliações de estabilidade, por exemplo, precipitação dependente de concentração de substâncias tais como, por exemplo, formulações de fármaco, macromolécu- las, proteínas e/ou excipientes ou combinações destes; interações de substâncias tais como, por exemplo, macromoléculas e/ou excipientes em um ambiente de fluido específico, por exemplo, proteínas em humor vítreo; estabilidade de uma substância sob diluição em um fluido específico, por exemplo, humor vítreo e após perda de excipientes es- tabilizantes, por exemplo, tensoativos, açúcares, espécies de tampo- namento e agentes de tonicidade; e estabilidade a longo prazo em ambiente fisiológico simulado, por exemplo, ambiente ocular.

[0010] No seguinte, o método e aparelho referem-se geralmente ao ensaio de substâncias, especialmente, de macromoléculas em ambiente ocular simulado. Consequentemente, em uma modalidade preferida do método, o primeiro fluido é humor vítreo e o segundo fluido é uma solução tampão, de preferência, uma solução tampão fisiologica- mente relevante. Entretanto, o método e aparelho não se limitam a, essas aplicações. Por exemplo, também pode ser simulada uma barreira hematoencefálica para testar, por exemplo, a estabilidade e a bi- odisponibilidade de substâncias no tecido cerebral, quando as substâncias são injetadas, por exemplo, em um vaso sanguíneo. Nesse caso, o primeiro e segundo fluidos podem ser sangue e líquido cerebrospinal ou fluidos simulando sangue e simulando líquido cerebrospinal.

[0011] "Substância" conforme utilizada neste pedido pode referir- se a qualquer substância que pode ser injetada em um fluido e que deve ser analisada em vista de sua estabilidade ou biodisponibilidade no método ou no aparelho de acordo com a invenção. Uma substância pode ser moléculas, por exemplo, macromoléculas tais como proteínas, anticorpos, fragmentos de anticorpos, proteínas de fusão, anticorpos biespecíficos, proteínas conjugadas, peptídeos ou oligonucleotí- deos naturais ou sintéticos, moléculas naturais ou sintéticas, tais como fármacos de pequena molécula, açúcares, tensoativos, tampões, polímeros, ou quaisquer excipientes comumente utilizados. Preferencialmente, uma substância é uma formulação de fármaco tal como, por exemplo, uma solução, suspensão ou emulsão, que também pode estar compreendida em uma matriz sólida ou em qualquer outro sistema de transferência como descrito abaixo neste relatório.

[0012] "Humor vítreo" tal como é utilizado neste pedido pode ser de fontes naturais ou artificiais. O humor vítreo natural pode ser de várias espécies animais, por exemplo, porcina, bovina, canina, felina, de coelhos e primatas não humanos, ou pode ser de humanos. O humor vítreo natural pode, por exemplo, ser obtido a partir de olhos que foram previamente removidos. O humor vítreo artificial imita, de preferência, o humor vítreo humano. O humor vítreo artificial pode ser preparado a partir de vários materiais poliméricos, por exemplo, polímeros naturais tais como, mas não se limitam aos mesmos, ácido hialurônico, algina- to, ágar, quitosano, gelatina, goma xantana, pectinas, colágeno ou, por exemplo, polímeros sintéticos tais como, mas não se limitam aos mesmos, gel plurônico, álcool polivinílico, polifosfazenos, quaisquer polímeros gelificantes diméricos, triméricos ou multiméricos compostos de PEG, PCL, PLA, PGA, PLGA, poliacrilamida, ácido poliacrílico, bem como, combinações desses polímeros sob diferentes concentrações.

[0013] Humor vítreo pode também ser uma mistura de humor ví treo artificial e natural, ou seus componentes em diferentes combinações.

[0014] "Matriz de gel" conforme utilizada neste pedido é um fluido ou semifluido (apresentando propriedades entre um sólido e um líquido) com viscosidade predefinida, mas variável, e concentrações prede- finidas, mas variáveis de compostos de material de matriz de gel. De preferência, a matriz de gel é um líquido viscoso. A matriz de gel representa o núcleo da barreira simulada e é intercalada entre pelo menos uma primeira e pelo menos uma segunda membrana semiper- meável. Preferencialmente, pelo menos uma primeira e pelo menos uma segunda membrana semipermeável são duas membranas semi- permeáveis únicas, preferencialmente, membranas de diálise. Contudo, podem também ser membranas múltiplas semipermeáveis, em que mais de uma, de preferência duas, membranas são dispostas uma acima da outra. As especificações da barreira podem ser alteradas e adaptadas a condições variáveis de teste variando as características físicas e/ou químicas da matriz de gel. Para a matriz de gel, diferentes materiais poliméricos de origem natural ou artificial podem ser utilizados individualmente ou em combinações sob diferentes concentrações. Polímeros naturais com modificações químicas podem ser utilizados para preparar a matriz de gel. Os polímeros naturais, semi- sintéticos e sintéticos podem ser utilizados em diferentes combinações e concentrações para a preparação de matriz de gel. A matriz de gel pode ser preparada a partir de vários materiais poliméricos, por exemplo, polímeros naturais tais como, mas não se limitam aos mesmos, ácido hialurônico, alginato, ágar, quitosano, gelatina, goma xantana, pectinas, colágeno ou, por exemplo, polímeros sintéticos tais como, mas não se limitam aos mesmos, gel plurônico, álcool polivinílico, poli- fosfazenos, quaisquer polímeros gelificantes diméricos, triméricos ou multiméricos compostos de PEG, PCL, PLA, PGA, PLGA, poliacrilami- da, ácido poliacrílico, bem como, combinações desses polímeros sob diferentes concentrações.

[0015] Em algumas modalidades preferidas do método de acordo com a invenção, o Corte de Peso Molecular (MWCO) de pelo menos uma primeira ou de pelo menos uma segunda membrana semiper- meável ou de ambas as membranas é variado. Em algumas modalidades preferidas do método de acordo com a invenção, a composição da matriz de gel é variada, de preferência, variando uma viscosidade da matriz de gel ou variando uma concentração de um composto da matriz de gel. Em algumas modalidades preferidas do método de acordo com a invenção ambos, o CPM de pelo menos uma das membranas e a composição da matriz de gel é variado. Por essas medidas, difusivi- dade através das membranas e/ou permeabilidade da substância através da matriz de gel podem ser alteradas. Pode ser estudada a interação da substância no primeiro fluido com o material da matriz de gel e sua influência na estabilidade, compatibilidade e adequabilidade da substância.

[0016] "Solução tampão" é uma solução preferencialmente apre sentando ou sendo capaz de manter um valor de pH do sistema, por exemplo, entre pH 5,5 e pH 8,5, de preferência, entre cerca de pH 7,0 e cerca de pH 7,6, mais preferencialmente, sob pH 7,4. "Solução tampão fisiologicamente relevante" é uma solução que apresenta prefe-rencialmente ou que é capaz de manter um valor de pH do sistema entre cerca de pH 7,0 e cerca de pH 7,6, mais preferencialmente, sob pH 7,2 a 7,4. De preferência, uma solução tampão compreende sais. A solução tampão pode ser, por exemplo, uma solução salina tampona- da com fosfato (PBS), um tampão bicarbonato, tampão bicarbonato de Ringer, tampão lactato de Ringer, fluidos corporais simulados, outras soluções isotônicas, meios de cultura de células e quaisquer outros tampões fisiologicamente representativos. Os fluidos utilizados como tampão podem também ser utilizados para a preparação da matriz de gel em combinação com os materiais de matriz de gel acima mencio-nados.

[0017] No presente pedido "depuração de uma substância a partir de um fluido", tal como o primeiro fluido, entende-se incluir a difusão da substância fora do fluido, na qual a substância foi injetada. Entretanto, depuração também inclui alterações físicas ou químicas da substância, tais como, por exemplo, uma decomposição ou precipitação da substância no fluido ou em qualquer outra parte do sistema, por exemplo, na matriz de gel ou no segundo fluido. Desse modo, a depuração da substância do primeiro fluido inclui informação sobre, por exemplo, estabilidade e biodisponibilidade da substância nos respectivos fluidos e em todo o ambiente fisiológico simulado.

[0018] Com o método de acordo com a invenção, não é apenas possível analisar o comportamento de uma substância injetada, tal como, por exemplo, uma proteína ou um excipiente. Com o método de acordo com a invenção, também é possível monitorar, por exemplo, decomposição ou alterações físicas e químicas do primeiro fluido ou qualquer outro fluido que ocorra sob injeção da substância no primeiro fluido e difusão fora do primeiro fluido nos outros fluidos.

[0019] De acordo com um aspecto do método de acordo com a invenção, a etapa de determinação da depuração de uma substância a partir do primeiro fluido é realizada por meio de medição de uma concentração da substância no primeiro fluido, no segundo fluido ou em ambos, no primeiro e no segundo fluido. Isto pode, por exemplo, ser realizado tomando uma amostra dos respectivos fluidos e fazendo-os analisar quanto ao seu teor de substância ou produtos de decomposi- ção. Análise pode ser realizada por meio de espectroscopia, por exemplo, espectrometria de fluorescência, espectroscopia de Raman ou espectroscopia visível a ultravioleta. Análise de amostras de fluido pode também ser realizada por meio de cromatografia líquida ou gasosa, por exemplo, cromatografia líquida de alta resolução por exclusão de tamanho (SE-HPLC) ou cromatografia líquida de alta eficiência de permuta iônica (IE-HPLC). Análise pode também ser realizada por métodos de dispersão de luz, por exemplo, dispersão de luz estática, dispersão de luz dinâmica ou turbidimetria. Preferencialmente, medições de concentração ou outra medição para determinação de depuração são realizadas de uma maneira repetida, de preferência periodi-camente. De preferência, as medições são realizadas ao longo de várias horas, mais preferencialmente, durante vários dias, por exemplo, até uma ou duas semanas ou mesmo mais. Duração e intensidade de realização das medições podem ser adaptadas à substância, por exemplo, um tamanho de molécula e permeabilidade do sistema. As medições de concentração ou outras medições, tais como, por exemplo, medições de pH, podem também ser realizadas colocando diretamente uma sonda no respectivo fluido que deve ser medido.

[0020] De acordo com outro aspecto do método de acordo com a invenção, a substância injetada compreende moléculas que apresentam um tamanho em uma faixa entre aproximadamente 100 Da e aproximadamente 400 kDa, preferencialmente, em uma faixa entre aproximadamente 1 kDa e aproximadamente 250 kDa, por exemplo, entre 4 kDa e 150 kDa. As especificações das membranas semiper- meáveis podem ser adaptadas aos tamanhos e às formas (por exem-plo, lineares, globulares) das moléculas utilizadas no método de acordo com a invenção. Por exemplo, o Corte do Peso Molecular (MWCO) das membranas pode ser ajustado dependendo do período de retenção desejado de uma substância, por exemplo, no primeiro fluido ou, por exemplo, na matriz de gel. Por exemplo, se uma substância que deve ser analisada consiste de, ou contém moléculas menores, por exemplo, menores que aproximadamente 10 kDa, em seguida, preferencialmente podem ser utilizadas membranas apresentando MWCOs menores ou iguais a 10 kDa para prolongar o tempo de retenção (por exemplo, até dias). Se o tempo de retenção tem de ser reduzido (por exemplo, até várias horas), podem ser utilizadas membranas apresentando MWCOs maiores que 10 kDa. De preferência, membranas com MWCOs em uma faixa entre aproximadamente 10 kDa a 100 kDa são utilizadas para substâncias que consistem de, ou que contêm macro- moléculas com tamanhos entre aproximadamente 50 kDa a 150 kDa. De preferência, membranas com MWCOs em uma faixa entre aproximadamente 1 kDa a 50 kDa são utilizadas para substância que consistem de, ou que contêm macromoléculas de tamanhos aproximadamente de 10 kDa.

[0021] Preferencialmente, uma primeira membrana semipermeável e uma segunda membrana semipermeável são utilizadas no método e aparelho de acordo com a invenção. Contudo, em vez de uma membrana também podem ser dispostas membranas múltiplas em um suporte. De preferência, as membranas são então dispostas diretamente próxima uma da outra, preferencialmente, em cima uma da outra. Se forem utilizadas várias membranas, por exemplo, duas, as várias membranas podem apresentar MWCOs idênticos ou podem apresentar MWCOs diferentes. Utilizando múltiplas membranas, especificação da barreira pode ser adicionalmente alterada. Múltiplas membranas podem alterar a especificação de uma barreira não apenas devido à espessura adicional das membranas múltiplas, mas também devido às diferentes faixas de tamanho de poros de membranas múltiplas versus uma única membrana (ainda com o mesmo CPM). Também a transição de uma membrana para a seguinte pode contribuir para a especi- ficação da barreira devido a diferentes posições dos poros e dimensões das membranas.

[0022] Preferencialmente, a especificação das membranas é adap tada a uma permeabilidade de um tecido real. Por exemplo, em algumas modalidades preferidas do método de acordo com a invenção, pelo menos uma primeira membrana semipermeável apresenta um Corte de Peso Molecular (MWCO) que corresponde substancialmente ao Limite de Exclusão Retiniana (REL). A expressão "substancialmen-te correspondente" entende-se incluir LER, bem como, valores de CPM que diferem do LER, por exemplo, até cerca de 50 por cento. O RELé geralmente conhecido como o tamanho máximo de moléculas capazes de difundir livremente através da retina de um olho. Para um olho humano saudável, o RELé definido como sendo em uma faixa de cerca de 50 kDa (103 Dáltons) a 100 kDa, de preferência, de 70 kDa. Contudo, essa faixa pode variar significativamente de diferentes espécies e dependendo do estado do olho (alteração devido à idade, falecimento, etc.). Além disso, o RELé altamente dependente da estrutura de uma molécula difusora, por exemplo, em uma estrutura linear ou globular da molécula.

[0023] As membranas semipermeáveis utilizadas no método e no aparelho de acordo com a invenção permitem controlar a taxa de difusão através das membranas. As membranas semipermeáveis são membranas de controle da difusão e podem também ser consideradas membranas seletivas de tamanho de peso molecular. De preferência, as membranas semipermeáveis são membranas de diálise. Uma membrana de diálise é uma película semipermeável, por exemplo, uma folha de celulose regenerada ou ésteres de celulose, contendo poros de vários tamanhos. Geralmente, moléculas maiores que os poros não podem passar através da membrana, mas moléculas pequenas podem passá-las livremente. A característica de separação deter- minada pela faixa de tamanho de poros de uma membrana de diálise é referida como o Corte de Peso Molecular (MWCO) da membrana. A difusão de moléculas próxima do MWCO será mais lenta em comparação com moléculas significativamente menores que o MWCO. O MWCO de uma membrana não é um valor nitidamente definido. Membranas de diálise, dependendo do material de que são fabricadas, podem conter uma ampla faixa de tamanhos de poros. Outros exemplos de membranas de controle de difusão são membranas de filtro com diferentes tamanhos de poros. Geralmente, membranas com MWCO maiores são usadas quando moléculas maiores são injetadas no primeiro fluido e as membranas com MWCO menores são usadas quando moléculas menores são injetadas no primeiro fluido. Contudo, o MWCO de uma membrana pode também ser variado para influenciar tempo de residência de uma substância no primeiro fluido, conforme descrito em linhas gerais acima. Por exemplo, um MWCO pode ser diminuído, quando, por exemplo, uma substância deve ser retida no primeiro fluido durante um período de tempo mais longo, por exemplo, para estudos de interação das moléculas com o primeiro fluido.

[0024] De acordo com um aspecto do método de acordo com a invenção, a etapa de injetar uma substância no primeiro fluido compreende injeção de uma substância através de um sistema de transfe-rência de substância no primeiro fluido. Desse modo, a substância é liberada no primeiro fluido de uma forma retardada. A substância pode ser injetada no primeiro fluido com o auxílio de um sistema de transferência, tal como, por exemplo, nanopartículas, micropartículas, depósitos de fármacos (na forma sólida, líquida ou em gel), implantes que servem como depósitos de fármacos ou dispositivos externos que permitem uma transferência de substância repetida com ou sem injeção repetida. Em tais sistemas de transferência, a substância pode ser encapsulada, conjugada (ligada a uma macromolécula) ou capturada em um material ou elemento, cujo material ou elemento sofre uma alteração física ou química, ou ambas (por exemplo, expansão, degradação) ao longo do tempo para liberar a substância no fluido o sistema de transferência foi então injetado. Por meio da provisão de um sistema de transferência, pode-se obter um atraso temporal da liberação da substância no primeiro fluido. Se ocorrer migração do sistema de transferência no primeiro fluido, o sistema de transferência moverá mais próximo à pelo menos uma primeira membrana semipermeável antes da substância ser liberada e entrar em contato com o primeiro fluido. Em um sistema real, com a utilização de sistemas de transferência, biodisponibilidade pode ser acentuada por ser capaz de trazer substâncias, por exemplo, uma formulação de fármaco, mais próxima de seu local de destino sem ter de variar o local da injeção.

[0025] Em um aspecto do método de acordo com a invenção, o método pode adicionalmente compreender a etapa de crescimento de células em culturas de células 2D ou 3D em uma camada de matriz de gel suportada por membranas semipermeáveis. Por exemplo, as linhagens de células da retina comumente utilizadas, tais como ARPE- 19, D407, RF-6A. As células podem ser cultivadas em cultura ou co- cultura para representar o tecido posterior humano. O sistema pode ser utilizado para estudar a toxicidade à base de células e estudos de depuração da substância injetada ou sistema de transferência ou decomposição celular.

[0026] O método e aparelho de acordo com a invenção podem não apenas ser adaptados para cenários de teste específicos pela escolha dos fluidos, matriz de gel e das membranas semipermeáveis. O método e aparelho podem também ser adaptados para analisar diferentes comportamentos de substâncias em seu ambiente fisiológico pela configuração geométrica dos componentes acima mencionados, por exemplo, dependendo da orientação das membranas semipermeáveis. Por exemplo, estabilidade a longo prazo de uma molécula, por exemplo, uma proteína ou uma formulação de fármaco, ou também, por exemplo, afinidades de ligação com antígeno, podem ser melhores analisadas se um tempo de residência da respectiva molécula em um fluido de teste for suficientemente longo. Testes de estabilidade e os tempos de residência podem, por exemplo, fornecer informações sobre como uma frequência de administração de um fármaco específico deveria ser escolhida. Desse modo, em algumas aplicações seria desejável apresentar um tempo de residência de uma substância no pri-meiro fluido de vários dias, preferencialmente, de várias semanas, mais preferencialmente, de até alguns meses. De preferência, durante o tempo de residência de uma substância no primeiro fluido, as condi-ções de teste permanecem mais próximo quanto possível do ambiente fisiológico. No seguinte, várias modalidades de aparelhos para analisar o comportamento de moléculas em ambiente fisiológico simulado são descritas.

[0027] De acordo com um aspecto adicional da invenção, é pro porcionado um aparelho para analisar o comportamento de moléculas em ambiente fisiológico simulado. O aparelho compreende um primeiro compartimento para receber um primeiro fluido, um segundo compartimento para receber uma matriz de gel, e um terceiro compartimento para receber um segundo fluido. O aparelho adicionalmente compreende um primeiro suporte para suportar pelo menos uma primeira membrana semipermeável e um segundo suporte para suportar pelo menos uma segunda membrana semipermeável. O segundo suporte é disposto em uma distância do primeiro suporte. O primeiro suporte é disposto entre o primeiro compartimento e o segundo compar-timento, e o segundo suporte é disposto entre o segundo compartimento e o terceiro compartimento.

[0028] No aparelho de acordo com a invenção, um primeiro fluido no primeiro compartimento pode ser mantido separado da matriz de gel no segundo compartimento por pelo menos uma primeira membrana semipermeável, que é mantida pelo primeiro suporte. De preferência, pelo menos uma primeira membrana semipermeável é disposta no primeiro suporte. Pelo menos uma primeira membrana semipermeável pode ser disposta no primeiro suporte apenas em partes da borda da membrana. O primeiro suporte pode ser elaborado de tal modo que pelo menos uma membrana pode ser disposta sobre, e ser suportada por substancialmente uma área completa do primeiro suporte. A matriz de gel é também mantida separada do segundo fluido no terceiro compartimento por pelo menos uma segunda membrana semipermeá- vel, a qual é mantida pelo segundo suporte. De preferência, pelo menos uma segunda membrana semipermeável é disposta no segundo suporte. Pelo menos uma segunda membrana semipermeável pode ser disposta no segundo suporte apenas em partes da borda da membrana. O segundo suporte pode ser elaborado de tal modo que pelo menos uma membrana pode ser disposta sobre, e ser suportada por substancialmente uma área completa do segundo suporte.

[0029] O segundo compartimento é principalmente formado por pelo menos uma primeira e pelo menos uma segunda membrana se- mipermeável e, possivelmente, também por paredes laterais do aparelho. Dependendo da modalidade do aparelho e da disposição dos suportes, o segundo compartimento é formado principalmente pelo primeiro suporte e pelo segundo suporte e, possivelmente, também por paredes laterais do aparelho. De preferência, os três compartimentos são dispostos em série. Preferencialmente, a única troca de material que ocorre entre o primeiro e o terceiro compartimento são moléculas que permeiam através de pelo menos uma primeira e pelo menos uma segunda membrana semipermeável e difundida através da matriz de gel.

[0030] Preferencialmente, o primeiro, segundo e terceiro compar timentos são providos de pelo menos uma abertura. Preferencialmente, pelo menos uma abertura dos compartimentos corresponde a pelo menos uma abertura proporcionada em cada um do primeiro e do segundo suporte. De preferência, o primeiro e o segundo suporte são paredes do compartimento providas com pelo menos uma abertura. Pelo menos uma abertura é coberta pelas respectivas, pelo menos uma membrana semipermeável. Em algumas modalidades preferidas, o primeiro suporte forma uma parede porosa do primeiro compartimento e do segundo compartimento e o segundo suporte forma uma parede porosa do segundo compartimento e do terceiro compartimento. Nessas modalidades, o primeiro e segundo suportes são preferencialmente, providos de uma pluralidade de aberturas, as quais são preferencialmente, distribuídas sobre toda a área dos suportes.

[0031] Aspectos e vantagens do aparelho são discutidos em rela ção ao método de acordo com a invenção e não serão repetidos.

[0032] De acordo com um aspecto do aparelho de acordo com a invenção, pelo menos uma primeira membrana semipermeável apresenta um Corte de Peso Molecular MWCOmenor ou igual ao Corte de Peso Molecular MWCO) de pelo menos uma segunda membrana se- mipermeável. Um MWCO maior ou igual de pelo menos uma segunda membrana teoricamente garante que todas as moléculas que passaram por pelo menos uma primeira membrana também podem passar por pelo menos uma segunda membrana e podem ser detectadas no segundo fluido. Em algumas modalidades preferidas do método e aparelho de acordo com a invenção, o Corte de Peso Molecular (MWCO) de pelo menos uma primeira membrana semipermeável corresponde substancialmente ao Limite de Exclusão Retiniana (REL) . Preferencialmente, o MWCO de pelo menos uma primeira membrana situa-se em uma faixa entre e, incluindo, 10 kDa e 100 kDa, especialmente, quando se simula o ambiente ocular.

[0033] De acordo com um aspecto adicional do aparelho de acor do com a invenção, a forma e o tamanho do primeiro suporte são adaptados para a forma e o tamanho de uma retina, de preferência uma retina humana. Uma ou pelo menos uma membrana é em seguida disposta no primeiro suporte para adotar a forma do primeiro suporte. Por isso, pode ser simulada uma distribuição e migração de uma substância injetada no corpo vítreo de um globo ocular. Especialmente, distâncias entre o local da injeção e da retina ou também a anterior de um globo ocular podem ser simuladas de uma forma realista. Desse modo, em algumas modalidades preferidas, pelo menos o primeiro suporte apresenta uma forma côncava. Com isso, pelo menos parte do primeiro compartimento pode simular a forma de parte de um globo ocular, cuja parte corresponde à parte do primeiro compartimento formado pelo primeiro suporte. Esta parte é mais relevante em vista de permeação da macromolécula. Por um suporte côncavo (ou convexo) e forma de compartimento correspondente, possivelmente, também formas de outros órgãos podem ser imitadas de uma forma mais realista pela superfície curvada. De preferência, também o segundo suporte apresenta uma forma côncava, cujo segundo suporte côncavo pode ser disposto concentricamente ao primeiro suporte. O primeiro e o segundo suporte são então dispostos em paralelo entre si e distanciados um do outro. O segundo compartimento pode então ser substancial e totalmente formado pelo primeiro e o segundo suporte (e as membranas correspondentes situadas no respectivo suporte).

[0034] Em tal montagem do primeiro compartimento e pelo menos uma primeira membrana, a geometria, bem como, o ambiente físico e químico dentro do globo ocular é simulada. Em combinação com a matriz de gel e pelo menos uma segunda membrana preferencialmente côncava, a barreira fora do tecido inteiro que cobre o globo ocular, tal como o tecido ocular anterior ou posterior, pode ser simulada.

[0035] O aparelho, ou seja, as paredes do compartimento, e os suportes podem ser produzidos de qualquer material adequado para os fluidos e substâncias utilizadas no aparelho. Preferencialmente, utiliza-se um material inerte tal como vidro, aço inoxidável, ligas de metal inerte, plástico sintético inerte ou materiais poliméricos. Preferencialmente, são utilizados materiais de vidro ou de plástico inerte devido à sua transparência. Preferencialmente, o vidro é utilizado como material para o aparelho, devido à sua inércia e boas propriedades de reutilização. Em algumas modalidades preferidas do aparelho de acordo com a invenção, o aparelho compreende ou é produzido de vidro. Preferen-cialmente, pelo menos um, do primeiro, segundo ou terceiro compartimentos, o primeiro suporte, e o segundo suporte compreende ou é produzido de vidro. De preferência, todas as paredes do aparelho, incluindo, o primeiro e segundo suportes são inteiramente produzidos de vidro.

[0036] De acordo com outro aspecto do aparelho de acordo com a invenção, o aparelho adicionalmente compreende uma cobertura para fechar uma abertura do primeiro compartimento. Através da abertura, o primeiro fluido pode ser preenchido no primeiro compartimento e re-movido do mesmo, novamente. De preferência, o fechamento pode ser realizado de uma maneira hermética. Desse modo, as influências am-bientais, tais como, por exemplo, umidade ou poluição, no primeiro fluido antes e após injeção de substância pode ser mantida no mínimo. Preferencialmente, a cobertura é feita de um mesmo material que o aparelho. De preferência, a cobertura é produzida de vidro.

[0037] Modalidades do aparelho que compreendem suportes para as membranas semipermeáveis são particularmente favoráveis para aplicações com membranas semipermeáveis dispostas horizontal ou substancialmente horizontais. Em uma disposição horizontal de um aparelho, pelo menos dois compartimentos, de preferência, todos os compartimentos são dispostos acima ou no topo uns dos outros. Neste caso, a disposição das membranas semipermeáveis pode ser exatamente horizontal. Entretanto, uma disposição horizontal inclui também, por exemplo, uma forma côncava ou convexa das membranas que simulam uma retina ou outras formas de tecido. Os suportes podem suportar as membranas inteiras, bem como, o peso do fluido ou da matriz de gel atuando sobre as membranas semipermeáveis em uma disposição horizontal. Uma substância injetada tende a migrar-se para baixo devido à força gravitacional. Em uma disposição substancial-mente horizontal das membranas semipermeáveis, uma membrana semipermeável forma basicamente o fundo do respectivo compartimento. Desse modo, a substância tende a acumular-se na membrana semipermeável e pode de preferência permear-se diretamente no compartimento. Verificou-se que, se acumulação de uma substância na membrana é evitada, isto pode ter um efeito no tempo de residência da substância no compartimento. Isto pode ser explicado como segue: se o fundo de um compartimento é fechado, a substância pode redifundir-se no fluido no compartimento até que migre para a localiza-ção da membrana semipermeável. A membrana semipermeável pode, por exemplo, formar uma parede lateral do compartimento. Tais moda-lidades do aparelho são favoráveis para uma disposição vertical ou substancialmente vertical das membranas semipermeáveis. Em disposições verticais, a acumulação de substância nas membranas pode ser evitada ou pelo menos limitada e um tempo de residência de uma substância no primeiro fluido ou também na matriz de gel pode ser prolongado.

[0038] De acordo com outro aspecto da invenção é proporcionado outro aparelho para analisar o comportamento de moléculas em ambiente fisiológico simulado. O aparelho compreende um primeiro com- partimento para receber um primeiro fluido, um segundo compartimento para receber uma matriz de gel, e um terceiro compartimento para receber um segundo fluido. O aparelho compreende adicionalmente pelo menos uma primeira membrana semipermeável e pelo menos uma segunda membrana semipermeável, em que pelo menos uma segunda membrana semipermeável é disposta sob uma distância a partir de pelo menos uma primeira membrana semipermeável. Pelo menos uma primeira membrana semipermeável é disposta entre o primeiro compartimento e o segundo compartimento e pelo menos uma segunda membrana semipermeável é disposta entre o segundo compartimento e o terceiro compartimento.

[0039] Nessas modalidades do aparelho de acordo com a inven ção, as membranas semipermeáveis são dispostas no aparelho sem primeiro e segundo suportes. O aparelho pode compreender suportes para manter pelo menos uma primeira membrana semipermeável e pelo menos uma segunda membrana semipermeável entre os respectivos compartimentos. Tais suportes podem ser, por exemplo, meios de fixação ou meios de ligação, em que as membranas são fixadas ou ligadas. De preferência, os suportes são dispostos em um lado externo do aparelho e não se prolongam no interior do aparelho, especialmente, não se estendem para o interior de qualquer um dos compartimentos. Isto pode simplificar a produção, montagem e a limpeza do aparelho. Além disso, as membranas semipermeáveis podem servir como a única barreira entre os fluidos e a matriz de gel nos compartimentos e nenhum elemento mecânico adicional está presente como no caso de primeiro e segundo suporte.

[0040] De acordo com um aspecto desse aparelho de acordo com a invenção, o primeiro compartimento, o segundo compartimento e o terceiro compartimento são dispostos em uma fileira, em que pelo menos uma primeira membrana semipermeável e pelo menos uma se- gunda membrana semipermeável são dispostas substancial e verticalmente entre os respectivos compartimentos. Em tal disposição vertical das membranas semipermeáveis a força gravitacional atua sobre as membranas, basicamente ao longo das próprias membranas, de modo que podem ser omitidos suportes para as membranas. A matriz de gel e possivelmente também os fluidos (dependendo de sua densi-dade) podem também ter um efeito de suporte sobre as membranas semipermeáveis, quando dispostas lado a lado com a membrana. Em uma disposição substancialmente vertical, a disposição das membranas semipermeáveis pode ser exatamente vertical. Contudo, podem também ser dispostas em um ângulo com a posição vertical exata. "Substancialmente vertical" também inclui, por exemplo, uma forma côncava ou convexa para simular uma parte de um globo ocular o ou outras formas de tecido a serem simuladas.

[0041] Na disposição substancialmente vertical das membranas semipermeáveis, uma substância não pode acumular-se nas membranas como, por exemplo, em modalidades do aparelho, em que os compartimentos são dispostos acima uns dos outros. Desse modo, testes a longo prazo, como, por exemplo, testes de estabilidade no primeiro fluido, por exemplo, humor vítreo, são preferencialmente, realizados em uma montagem do aparelho, onde a força gravitacional não apresenta ou apenas apresenta um efeito limitado sobre a permeabilidade de uma substância através de uma membrana semipermeável.

[0042] Preferencialmente, modalidades do aparelho sem suportes são produzidas de vidro, contudo, com a exceção das membranas semipermeáveis e preferencialmente também dos suportes.

[0043] Aspectos e vantagens adicionais desse aparelho adicional de acordo com a invenção são descritos com relação ao método e ao aparelho de acordo com a invenção compreendendo suportes para as membranas semipermeáveis e não serão repetidos. Em particular, também o aparelho adicional pode ser proporcionado com suportes, cujos suportes podem ser moldados e construídos como descrito anteriormente. Com suportes, os fixadores podem ser omitidos. Ainda adi-cionalmente, pelo menos um primeiro suporte pode ser de perfilado côncavo para simular a forma do globo ocular ou da retina. Também as especificações e realizações das membranas semipermeáveis podem ser as mesmas conforme anteriormente descritas, por exemplo, os MWCOs especificados, ou a realização de uma membrana de controle de difusão, como, por exemplo, na forma de uma única membrana semipermeável ou na forma de uma disposição ou combinação de duas ou mais membranas semipermeáveis.

[0044] Preferencialmente, o aparelho de acordo com a invenção e conforme descrito neste relatório é utilizado para teste in vitro de uma substância, preferencialmente, uma formulação de fármaco, para determinar dados em estabilidade ou biodisponibilidade da substância, preferencialmente, a formulação de fármaco. Preferencialmente, o aparelho de acordo com a invenção é utilizado para realizar o método de acordo com a invenção e conforme descrito neste relatório.

[0045] A invenção é adicionalmente descrita com relação aos exemplos e modalidades, os quais são ilustrados por meio das figuras seguintes, em que: Fig. 1 mostra uma ilustração esquemática de uma montagem de acordo com a invenção; Figs. 2 e 3 mostram taxas de difusão (Fig. 2) e permeabilidade (Fig. 3) de concentração de dextrano versus ácido hialurônico em uma matriz de gel; Fig. 4 mostra o efeito de diferentes membranas na difusão de ma- cromoléculas versus tempo; Figs. 5 e 6 mostram difusão (Fig. 5) e permeabilidade (Fig. 6) de várias macromoléculas; Fig. 7 mostra resultados de teste realizado com anticorpo mono clonal; Figs. 8a-8e mostram uma primeira modalidade ilustrativa de um aparelho de acordo com a invenção; Fig. 9 mostra uma ilustração esquemática de uma segunda moda lidade do aparelho de acordo com a invenção; Figs. 10a, 10b mostram uma variante da modalidade do aparelho de Fig. 9.

[0046] Na Fig. 1 uma modalidade de uma montagem do aparelho e método é mostrada esquematicamente. A montagem simula a geometria e a situação de um olho e pode preferencialmente ser utilizada para testes in vitro simulando condições oculares. O primeiro compartimento 1 para receber humor vítreo é formado por uma parede superior 10 e uma primeira membrana semipermeável 4 cobrindo parte da referida parede superior 10. A parede superior 10 é proporcionada com uma abertura 101 para preencher o primeiro compartimento 1 através da referida abertura 101. A abertura 101 pode ser fechada, preferencialmente de uma maneira hermética, com uma cobertura 6. A cobertura 6 pode ser, por exemplo, um tampão de forma cônica, por exemplo, um tampão de vidro. A membrana semipermeável 4 apresenta a forma de parte de um círculo, por exemplo, 2/3 de um círculo. A forma do primeiro compartimento 1 e da primeira membrana simula a geometria de um globo ocular e retina. O primeiro compartimento 1 é montado em um terceiro compartimento 3. Desse modo, a primeira membrana 4 é preferencial e completamente inserida em uma abertura superior 303 do terceiro compartimento 3 e no interior do terceiro compartimento 3. O terceiro compartimento 3 é para receber uma solução tampão. Uma segunda membrana semipermeável em forma côncava 5 é disposta na abertura superior 303 e cobre parte de uma parede su-perior 30 do terceiro compartimento 3. A segunda membrana 5 tam- bém apresenta a forma de parte de um círculo, por exemplo, 1/2 a 2/3 de um círculo. A primeira, e segunda membrana 4, 5 podem ser suportadas por respectivos primeiro e segundo suportes que formam paredes de compartimento como descrito abaixo em relação às Figs. 8a-8e abaixo. No estado montado do primeiro e terceiro compartimentos 1,3, as duas membranas semipermeáveis 4,5 são distanciadas uma da outra formando um segundo compartimento 2 no intervalo entre a primeira e a segunda membrana. Os tamanhos de abertura podem ser variados, por exemplo, adaptados a um sistema fisiológico que deve ser simulado. A primeira e a segunda membrana 4,5 são dispostas con- centricamente e de modo que apresentem uma distância predefinida entre as membranas, de preferência, sobre todo o prolongamento das membranas. Através da abertura de entrada e saída 102 proporcionada na parede superior 10 do primeiro compartimento 1, uma matriz de gel pode ser preenchida e removida novamente a partir do segundo compartimento 2. Os três compartimentos podem ser selados, por exemplo, mediante a provisão de um anel O disposto na parede superior 30 do terceiro compartimento e disposto circunferencialmente em torno do intervalo que forma o segundo compartimento 2.

[0047] O terceiro compartimento 3 é provido com aberturas de en trada e saída 32, 33. Através da abertura de entrada o terceiro compartimento 3 pode ser preenchido com solução tampão e através da abertura de saída o terceiro compartimento 3 pode ser esvaziado. A entrada e a saída são preferencialmente elaboradas para permitir um fluxo através do terceiro compartimento, de modo a limpar e substituir o teor do terceiro compartimento 3. Um fluxo contínuo ou descontínuo através do terceiro compartimento 3 pode também ser utilizado para amostragem do segundo fluido para análise subsequente da amostra.

[0048] Com o primeiro compartimento e a primeira membrana 4 é simulada a geometria, bem como, o ambiente físico e químico dentro de um globo ocular. Em combinação com a matriz de gel e a segunda membrana 5, a barreira fora do tecido que envolve o globo ocular, tal como o tecido do segmento anterior ou posterior, é simulada. Uma substância, por exemplo, macromoléculas, podem ser injetadas no humor vítreo no primeiro compartimento 1. Esta migra para a primeira membrana, através da primeira membrana 4 e da matriz de gel no segundo compartimento 2, através da segunda membrana e para a solução tampão no terceiro compartimento 3. A tampa removível 6 do primeiro compartimento 1, bem como, a entrada e saída 32, 33 do tercei-ro compartimento permitem a extração de amostras para fins de análise.

[0049] No seguinte, são descritos exemplos realizados com o sis tema conforme descrito na Fig. 1. Todos os experimentos mencionados nos exemplos foram realizados em condições assépticas sob fluxo de ar laminar. As amostras foram coletadas a partir do primeiro e do terceiro compartimento 1,3 (ou compartimento de HV 1 e compartimento FT 3, respectivamente) sob diferentes intervalos de tempo. Exemplo 1:

[0050] Exemplo 1 foi realizado a fim de otimizar uma concentração da matriz de gel de ácido hialurônico. Para isso, foi estudado impacto de diferentes concentrações de matriz de gel (MG) de ácido hialurôni- co (HA) (peso molecular de 1,4 x 106 Dáltons) na taxa de difusão de FITC-Dextrano (40 kDa) a partir do compartimento 1 de humor vítreo (HV) para fluxo através de compartimento 3 de (FT). Compartimento de HV e compartimento de FT foram separados por compartimento 2 de MG, que age como uma barreira controladora de difusão. Foram utilizadas duas membranas de diálise 4,5 para separar esses três compartimentos 1,2,3. A primeira membrana de diálise 4 que separa o compartimento 1 de HV do compartimento 2 de MG foi designada DM1 (membrana controladora de diálise 4), e a segunda membrana de diálise que separa o compartimento de MG de compartimento de FT foi denominada DM-2 (membrana controladora de diálise 5). O Corte de Peso Molecular (MWCO) para DM-1 e DM-2 foi de 50 kDa e 100 kDa, respectivamente. O compartimento 3 de FT foi preenchido com solução salina tampão fosfato estéril (PBS) (pH 7,4) e o compartimento 2 de MG foi preenchido com diferentes concentrações de aproximadamente 3 mL de gel de ácido hialurônico estéril preparado em PBS (que varia de 0-0,9% p/v). Foram adicionados aproximadamente 3,5 mL de humor vítreo estéril de porcino no compartimento de HV. O dispositivo foi selado e o HV foi condicionado da noite para o dia a 37°C. No final da incubação, injetou-se 50 μL de FITC-Dextrano (40 kDa) a 80 mg/mL no compartimento de HV. O aparelho foi selado e incubado a 37°C ao longo do estudo. Amostras foram avaliadas quanto à concentração de FITC-Dextrano por meio de espectrofotômetro de fluorescência sob um comprimento de ondas de excitação de 490 nm e comprimento de ondas de emissão de 520 nm. Fig. 2 ilustra a taxa de difusão versus concentração de ácido hialurônico (HA ) e Fig. 3 ilustra permeabilidade aparente (Pap.) versus concentração de HA . Permeabilidade é a propriedade de uma barreira de controle de difusão (barreira única) para permitir transferência de componentes de um lado para o outro lado da barreira. Quando são envolvidas mais de uma barreira de controle da difusão, permeabilidade é calculada como permeabilidade aparente (Pap. (aparente) ou Pef. (eficaz)). Nas presentes experimentos, Pap. (aparente) foi implementada para facilitar correlação entre os dados de difusão in vitro/ex vivo com dados de difusão in vivo relatados na literatura. Permeabilidade aparente, por exemplo, pode ser calculada a partir da relação Pap. = Q/[A • t • (Co-Ci)], em que Q é a quantidade de permeância transportada através da membrana com a área (A) no tempo t. Co e Ci são a concentração do doador (concentração na câmara de HV) e a concentração do receptor (concentração no compartimento de FT), respectivamente. A permeabilidade aparente (Pap.) pode ser representada em cm/segundo, cm/minuto ou cm/hora.

[0051] Resultados descritos na Fig. 2 sugerem que aumento na concentração de matriz de gel de ácido hialurônico (HA ) reduz significativamente a taxa de difusão, bem como, permeabilidade aparente de macromolécula. A explicação plausível podia ser o aumento na concentração de HA pode resultar em porosidade reduzida da matriz e/ou pode aumentar a interação de dextrano com componentes da matriz resultando em difusão mais lenta de FITC-Dextrano. Esses resultados indicam que alterando a concentração de MG, é possível ajustar a taxa de difusão de macromoléculas através do sistema. Exemplo 2:

[0052] Exemplo 2 foi realizado a fim de analisar o efeito de mem branas de diálise na difusão de macromoléculas.

[0053] Difusão de soroalbumina bovino (BSA) e imunoglobulina G (IgG) na direção do fluxo a partir do compartimento de HV para o compartimento de FT foi investigada por meio de variação de MWCO da membrana de diálise. O experimento foi realizado similarmente conforme descrito no exemplo 1 com pequenas modificações. Utilizaram- se duas diferentes membranas de diálise de COM como DM-1, com MWCO de 50 kDa e 100 kDa, visto que o MWCO de DM-2 foi mantido constante a 100 kDa. O compartimento de HV foi preenchido com 3,5 mL de HV estéril de porcino e o compartimento de MG foi preenchido com aproximadamente 3 mL de gel de HA estéril (0,6% p/v). O compartimento de FT foi preenchido com PBS estéril. O dispositivo foi selado e o HV foi condicionado da noite para o dia a 37°C. No final da incubação, 50 μL de FITC-BSA (80 mg/mL) ou 200 μL de FITC-IgG (20 mg/mL) foram injetados no compartimento de HV. O aparelho foi selado e incubado a 37°C durante todo o estudo. Amostras foram avalia- das quanto à concentração de FITC-BSA e FITC-IgG por meio de es- pectrofotômetro de fluorescência sob comprimento de ondas de excitação de 490 nm e comprimento de ondas de emissão de 520 nm.

[0054] Na Fig. 4 resultados de medições de difusão no comparti mento 3 de FT (denominado como compartimento PBS na figura) versus tempo para BSA com MWCO de DM-1 e DM-2 de 100k Da 81, de IgG (cerca de 144 kDa) com MWCO de DM-1 e DM-2 de 100k Da 82, para BSA com MWCO de DM-1 de 50 kDa e DM-2 de 100 kDa 83 e para IgG com MWCO de DM-1 de 50 kDa e DM-2 de 100 kDa 84 são representados. Os resultados mostrados na Fig. 4 sugerem que DM-1 com MWCO de 50 kDa (83,84) restringiu a difusão tanto de IgG quanto de BSA significativamente quando comparada com a difusão observada com DM-1 com MWCO de 100 kDa (81,82). Portanto, ao alterar o MWCO da membrana de diálise, será adicionalmente possível ajustar a difusão de macromoléculas. Exemplo 3:

[0055] Exemplo 3 foi realizado a fim de observar a difusão de dife rentes macromoléculas (linear e globular).

[0056] Esse experimento foi realizado similarmente conforme des crito no Exemplo 1 com modificações menores. Utilizou-se uma membrana de diálise de MWCO de 50 kDa como DM-1 e utilizou-se membrana de diálise de MWCO de 100 kDa como DM-2. O compartimento de HV foi preenchido com 3,5 mL de HV estéril de porcino e o compartimento de MG foi preenchido com cerca de 3 mL de gel de HA estéril (0,6% p/v). O compartimento FT foi preenchido com aproximadamente 35 mL de PBS estéril. O dispositivo foi selado e o HV foi condicionado da noite para o dia a 37°C. No final de incubação, 50 μL de 80 mg/mL de FITC-dextrano de 4 kDa 91, FITC-dextrano de 40 kDa 92, FITC- dextrano de 70 kDa 94, FITC-BSA 93 ou 200 μL de FITC-IgG (20 mg/mL) 95 foram injetados no compartimento de HV. O aparelho foi selado e incubado a 37°C em todo o estudo. Amostras foram avaliadas quanto a concentração de FITC-Dextrano por meio de espectrofotôme- tro de fluorescência sob comprimento de ondas de excitação de 490 nm e comprimento de ondas de emissão de 520 nm.

[0057] Conforme mostrado na Fig. 5, em que a quantidade das diferentes macromoléculas difundidas versus tempo é representada, macromoléculas exibiram diferente taxa de difusão. Moléculas menores difundidas sob uma taxa mais rápida em comparação com moléculas maiores conforme esperado. O mesmo fenômeno foi observado para tipos de macromoléculas lineares e globulares. Similarmente, moléculas menores exibiram Pap. maior em relação às moléculas grandes, que é representado na Fig. 6. Isto pode ser devido ao fato de moléculas grandes enfrentarem mais resistência pela MG devido ao seu maior raio molecular comparado com as moléculas menores resultando em Pap. baixa. Interessantemente, FITC-Dextrano de 40 kDa e FITC- BSA (66 kDa) exibiram valores similares de Pap. Similaridade de raio molecular (FITC-Dextrano de 40 kDa: 4,5 nm, e FITC-BSA: 3,62 nm) pode atribuir a sua Pap. similar. Exemplo 4:

[0058] Nesse experimento, difusão de um anticorpo monoclonal (mAb1) na presença ou ausência de MG foi investigada na direção do compartimento de HV para compartimento de FT. O experimento foi realizado similarmente conforme descrito no exemplo 1 com pequenas modificações. Novamente, utilizou-se membrana de diálise de MWCO de 50 kDa como DM-1 e utilizou-se membrana de diálise de MWCO de 100 kDa como DM-2. O compartimento de HV foi preenchido com 3,5 mL de VH estéril de porcino e o compartimento de MG foi preenchido com cerca de 3 mL de gel de ácido hialurônico (HÁ) estéril (0,6% p/v) ou PBS estéril (sem matriz). O compartimento de FT foi preenchido com PBS estéril. O dispositivo foi selado e o HV foi condicionado da noite para o dia a 37°C. No final de incubação, 33 μL de mAb1 (120 mg/mL) foram injetados no compartimento de HV. O aparelho foi selado e incubado a 37°C em todo o estudo. Amostras foram avaliadas em relação à concentração de mAb1 por meio de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC).

[0059] Na Fig. 7 é representada a quantidade de mAB1 no com partimento de HV versus tempo. Como mostrada, a difusão de mAb1 foi significativamente reduzida na presença de MG (cerca de 51% de mAb1 difundido fora do compartimento de HV sob 120 h), indicado por curva 85, quando comparado com a difusão observada na ausência de MG (cerca de 87% de mAb1 difundido fora do compartimento de HV sob 120 h), o que é indicado por curva 86. Redução na difusão pode ser atribuída à resistência proporcionada pela matriz de gel. Este re-sultado indica claramente que é possível adaptar o tempo de residência de terapêutica protéica no compartimento de HV 1 alterando a concentração de matriz de gel.

[0060] Nas Figs. 8a a Fig. 8e são mostradas uma modalidade ilus trativa de um aparelho de acordo com a invenção e suas partes. Os mesmos números de referência como na Fig. 1 são utilizados para as mesmas características ou similares. FIG. 8a mostra a tampa 6 apresentando uma forma cilíndrica e apresentando uma circunferência correspondendo ao tamanho da abertura 101 na parede superior 10 do primeiro compartimento 1. Quando em um estado montado conforme mostrado na Fig. 8c, a tampa, de preferência, forma uma vedação hermética com a parede superior 101. Macromoléculas 7, que repre-sentam uma substância, em um primeiro fluido tal como humor vítreo 11 são indicadas com círculos. Na Fig. 8c, as macromoléculas já migraram através do primeiro fluido 11, por exemplo, humor vítreo, no primeiro compartimento 1 na direção da primeira membrana 4. A primeira membrana é disposta em um primeiro suporte 14 formando par te da parede superior 101 do primeiro compartimento 1. Na Fig. 8d, a segunda membrana 5 é disposta em um segundo suporte 15. O segundo suporte 15 forma parte da parede superior 30 do terceiro compartimento 3. O terceiro compartimento é cilindricamente formado, mas pode ter basicamente qualquer outra forma. O terceiro compartimento é preenchido com um segundo fluido, de preferência, uma solução tampão 31, fisiologicamente relevante. A entrada e saída 33, 32 são formadas por seções do tubo ligadas ou preferencialmente, integradas na parede lateral 34 do terceiro compartimento 3. O primeiro e segundo suportes 14, 15, são dispostos equidistantemente no estado montado do primeiro e terceiro compartimentos como mostrado na Fig. 8e. Nesse particular, algumas macromoléculas são indicadas como tendo migrado para a primeira membrana 4, algumas são mostradas como tendo parcialmente passado a matriz de gel 21, no segundo compartimento 2 formado pela primeira e segunda membranas 4,5 (suportadas pelo primeiro e segundo suportes 14, 15) e alguns são quanto a difundir através da segunda membrana 5.

[0061] Os três compartimentos 1,2,3, são dispostos acima ou no topo uns dos outros. As membranas semipermeáveis 4, 5 são dispostas substancial e horizontalmente entre os respectivos compartimentos formando uma "disposição horizontal" do aparelho.

[0062] Todas as partes do aparelho, seguinte às membranas, po dem ser produzidas de vidro. Preferencialmente, o aparelho é produzido apenas de três partes separadas: cobertura, primeiro compartimento e terceiro compartimento, em que as partes separadas podem ser montadas umas com as outras preferencialmente de uma forma hermética. Também o aparelho como mostrado na Fig. 9 é de preferência produzido de vidro.

[0063] O aparelho da Fig. 9 compreende um receptáculo 100, por exemplo, de forma cuboide ou tubular. Uma primeira membrana semi- permeável 4 e uma segunda membrana semipermeável 5 são dispostas no receptáculo de modo a dividir o interior do receptáculo 100 em um primeiro compartimento 1, um segundo compartimento 2 e um terceiro compartimento 3. A primeira membrana semipermeável 4 e a segunda membrana semipermeável 5 são dispostas verticalmente no receptáculo 100 e perpendiculares a um eixo longitudinal 300 do receptáculo 100.

[0064] O primeiro compartimento 1 compreende uma primeira en trada 17 disposta no topo do receptáculo 100 para suprir um primeiro fluido, por exemplo, humor vítreo no primeiro compartimento 1. Uma parede lateral do primeiro compartimento 1 é formada pela primeira membrana semipermeável 4.

[0065] As duas membranas semipermeáveis 4,5 são dispostas dis tanciadas entre si, formando o segundo compartimento 2 entre as duas membranas. Uma distância entre as membranas 4,5 pode variar, por exemplo, adaptada a um sistema fisiológico que deve ser simulado. Preferencialmente, a primeira e segunda membrana 4,5 apresentam uma distância predefinida entre as membranas, de preferência sobre todo o prolongamento das membranas. O segundo compartimento 2 compreende uma segunda entrada 18 disposta no topo do receptáculo 100 para suprir uma matriz de gel e removê-la do segundo compartimento 2.

[0066] O terceiro compartimento 3 é formado como uma câmara por meio de fluxo que compreende entradas e saídas 32, 33, as quais são dispostas na Fig. 9 no topo do receptáculo 100 para suprir e remover um terceiro fluido, por exemplo, uma solução tampão. Entretanto, a entrada e saída podem também ser dispostas em paredes late-rais preferencialmente diferentes (sólidas) do terceiro compartimento. Uma parede lateral do terceiro compartimento 3 (não formada por uma parede de receptáculo) é formada pela segunda membrana semiper- meável 5.

[0067] Os três compartimentos 1,2,3, são dispostos em seguida, um com o outro de um modo lado a lado. As membranas semipermeá- veis 4,5 são dispostas verticalmente no receptáculo formando uma "disposição vertical" do aparelho.

[0068] As membranas semipermeáveis 4,5 são mantidas por fixa dores 24, 25. Os fixadores 24, 25 são dispostos no topo e abaixo do fundo do receptáculo 100 fora do receptáculo 100. Os fixadores 24, 25 podem também ser dispostos circunferencialmente em torno do receptáculo 100. Os fixadores podem ser, por exemplo, grampos.

[0069] Um clampeamento (clamping) das membranas 4,5 pode também ser obtido pelo próprio receptáculo 100. Por exemplo, o receptáculo 100 pode ser produzido por diversas, por exemplo, três partes. Uma membrana semipermeável pode em seguida ser clampeada entre duas partes sob montagem e fixação das partes uma com as ou-tras. Cada parte então forma basicamente um compartimento. Tal modalidade do aparelho é ilustrada na Fig. 10a e Fig. 10b. Fig. 10a mostra as três partes individuais 101, 102, 103 do receptáculo 100, o qual pode ser montado com o aparelho de acordo com a invenção com uma primeira membrana semipermeável 4, fixada entre a primeira e segunda parte 101, 102 e com uma segunda membrana semipermeá- vel 5 fixada entre a segunda e terceira parte 102, 103. Cada uma, das duas partes do receptáculo pode ser proporcionada com meios de clampeamento (clamping) (não mostrados) para manter as duas partes entre si e para obter uma ligação líquida apertada entre as duas partes. Para suportar clampeamento, cada parte 101, 102, 103 é proporcionada com aros circunferencialmente corrediços 1010, 1020, 1021, 1030. No estado montado do receptáculo, mostrado na Fig. 10b, cada um dos dois aros 1010, 1020, 1021, 1030 chega a situar-se um contra o outro, clampeando a membrana semipermeável ao longo de uma parte do anel. Preferencialmente, são proporcionados meios de clam- peamento para prender cada uma das duas partes do aro.

[0070] Preferencialmente, as membranas semipermeáveis 4,5 são membranas planas. Entretanto, se o material das membranas permite, as membranas podem também ser pré-moldadas, por exemplo, côn-cavas ou convexas para simular a geometria de partes de um globo ocular. De preferência, as formas das membranas semipermeáveis 4,5 correspondem uma com a outra. Embora as membranas dispostas verticalmente sejam de preferência mantidas no receptáculo por meio de clampeamento ou outros meios de fixação, a primeira e a segunda membrana 4, 5 podem também ser suportadas por respectivos primei-ro e segundo suportes formando paredes do compartimento conforme descrito acima em relação às Figs. 8a-8e. Fixadores 24, 25 podem então ser omitidos.

[0071] Uma substância, por exemplo, macromoléculas, podem ser injetadas através da primeira abertura 17 no primeiro fluido no primeiro compartimento 1. Este migra para todos os lados. Devido à força gravi- tacional, prefere-se a migração para o fundo do primeiro compartimento. Contudo, o fundo sendo formado por uma parede de receptáculo fechado não permite difusão da substância fora do primeiro fluido por meio do fundo. Apenas sob migração da substância para a primeira membrana semipermeável 4, ocorre uma difusão fora do primeiro compartimento, através da primeira membrana 4, em, e através da matriz de gel no segundo compartimento 2, através da segunda membrana e para a solução tampão no terceiro compartimento 3. A entrada 17, bem como, a entrada e saída 32, 33 do terceiro compartimento também permitem a extração de amostras para fins de análise.

[0072] A invenção foi descrita em relação às modalidades especí ficas. Contudo, modalidades adicionais podem ser realizadas sem desviar-se do escopo da invenção. Por exemplo, a forma e o tamanho do aparelho podem ser adaptados a uma aplicação específica para a qual uma substância deve ser testada.

[0073] Especialmente, uma geometria do aparelho pode ser varia da. Por exemplo, compartimentos e membranas podem ser dispostos de uma forma essencialmente plana, de tal modo que o aparelho seja formado por uma pilha de compartimentos separados pelas membranas. A geometria de uma disposição pode também ter influência nos materiais utilizados no método e no aparelho de acordo com a invenção. Por exemplo, em uma configuração plana, uma substância pode proporcionar suporte suficiente para uma membrana de tal modo que, por exemplo, um primeiro suporte pode possivelmente ser omitido ou limitado a pequenas partes da borda. Além disso, o material fluido ou semifluido da matriz de gel pode ser substituído por um material sólido poroso que forma a barreira. Por exemplo, materiais de cerâmica de poros abertos ou plástico de poros abertos podem ser favoráveis quando combinados com o crescimento celular no material de barreira. Ainda adicionalmente uma membrana pode ser substituída por duas ou mais membranas apresentando os mesmos ou diferentes MWCOs.

Claims (15)

1. Método in vitro de análise do comportamento de substâncias em ambiente fisiológico do olho simulado, caracterizado pelo fato de que o método compreende as etapas de: - proporcionar um primeiro fluido (11), uma matriz de gel (21) e um segundo fluido (31); - separar o primeiro fluido e a matriz de gel por pelo menos uma primeira membrana semipermeável (4), a pelo menos uma primeira membrana semipermeável tendo uma forma côncava; - separar a matriz de gel e o segundo fluido por pelo menos uma segunda membrana semipermeável (5); - injetar uma substância no primeiro fluido (11); - deixar a substância migrar a partir do primeiro fluido por meio de pelo menos uma primeira membrana semipermeável (4), através da matriz de gel (21), por meio de pelo menos uma segunda membrana semipermeável (5) e para o segundo fluido (5); e - determinar depuração (clearance) da substância a partir do primeiro fluido (11).

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro fluido (11) é humor vítreo e o segundo fluido (31) é uma solução de tampão, preferencialmente, uma solução de tampão fisiologicamente relevante.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a etapa de determinação da depuração de uma substância a partir do primeiro fluido (11) é realizada por meio de medição de uma concentração da substância no primeiro fluido, no segundo fluido (31) ou no primeiro e no segundo fluido.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a etapa de variação do Corte do Peso Molecular MWCO(MWCO) de pe- lo menos uma primeira ou de pelo menos uma segunda membrana semipermeável (4, 5), ou variação da composição da matriz de gel (21), preferencialmente, variação de uma viscosidade da matriz de gel ou variação de uma concentração de um componente da matriz de gel.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a substância injetada compreende moléculas que apresentam um tamanho em uma faixa entre aproximadamente 100 Da e aproximadamente 400 kDa, preferencialmente, em uma faixa entre aproximadamente 1 kDa e aproximadamente 250 kDa, por exemplo, entre 4 kDa e 150 kDa.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma primeira mem-brana (4) apresenta um Corte de Peso Molecular MWCO(MWCO) substancialmente correspondente ao Limite de Exclusão Retiniana (REL).

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a etapa de injetar uma substância no primeiro fluido (11) compreende injetar uma substância via um sistema de transferência da substância para o primeiro fluido, desse modo, liberando a substância para o primeiro fluido de um modo retardado.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a substância é pelo menos uma de macromolécula (7), uma formulação de fármaco, um excipiente, uma proteína ou uma combinação dos mesmos.

9. Aparelho para análise do comportamento de moléculas em ambiente fisiológico simulado, caracterizado pelo fato de que o aparelho compreende: um primeiro compartimento (1) para receber um primeiro fluido (11), um segundo compartimento (2) para receber uma matriz de gel (21), e um terceiro compartimento (3) para receber um segundo fluido (31); o aparelho compreendendo adicionalmente; um primeiro suporte (14) para suportar pelo menos uma primeira membrana semipermeável (4), e um segundo suporte (15) para suportar pelo menos uma segunda membrana semipermeável (5), o segundo suporte sendo disposto em uma distância do primeiro suporte, em que o primeiro suporte (14) é disposto entre o primeiro compartimento (1) e o segundo compartimento, em que o segundo suporte (15) é disposto entre o segundo compartimento (2) e o terceiro compartimento (3), em que o primeiro suporte forma uma parede porosa do primeiro compartimento e do segundo compartimento, em que o segundo suporte forma uma parede porosa do segundo compartimento (2) e do terceiro compartimento (3), e em que a forma e tamanho do primeiro suporte (14) são adaptados à forma e o tamanho de uma retina, o primeiro suporte (14) tendo uma forma côncava.

10. Aparelho, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma primeira membrana semipermeá- vel (4) é disposta no primeiro suporte (14) e pelo menos uma segunda membrana semipermeável (5) é disposta no segundo suporte (15), a pelo menos uma primeira membrana semipermeável apresentando um Corte de Peso Molecular MWCO (MWCO) sendo menor que, ou igual ao Corte do Peso Molecular MWCO (MWCO) da pelo menos uma se-gunda membrana semipermeável.

11. Aparelho, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que o Corte do Peso Molecular MWCO(MWCO) de pelo menos uma primeira membrana semipermeá- vel (4) corresponde substancialmente ao Limite de Exclusão Retiniana (REL).

12. Aparelho, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo fato de que o segundo suporte (15) apresenta uma forma côncava.

13. Aparelho, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, caracterizado pelo fato de que compreende ou sendo produzido de vidro.

14. Aparelho, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 13, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma cobertura (6) para fechar uma abertura (101) do primeiro compartimento (1).

15. Uso do aparelho, como definido em qualquer uma das reivindicações 9 a 14, caracterizado pelo fato de ser para teste in vitro de uma substância para determinar dados em estabilidade ou biodis- ponibilidade da substância, preferivelmente de uma formulação de fármaco.

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