ITTO20060833A1 - Micropozzetto convesso al fine di creare una camera perimetrale di raccolta degli elementi corpuscolati - Google Patents
Micropozzetto convesso al fine di creare una camera perimetrale di raccolta degli elementi corpuscolati Download PDFInfo
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Description
<DescriPone deii'invenzione industriale dal titolo "Micqwzetb convesso al fine di>
creare una camera paimetraie di raccolta degli elementi wrpuswlati" a nome di
<Ciaiolo Carlo di nazionalità italiana e residente ad Airasca (TO) via Monirucchio no 7,>'Battaglio Silvano di nazionalità italiana e residente a TORi IVO (TO) via Genova 266, W IImvA 70Rebola MarceUa di nazionalità itaiiiana e residente ad Airasca (TO) via Monimxhio
no 7, Valerio Alessmdm di nazionalità itaiiana e residente ad Airasca (TO) via Montrucchio 6, inventori designati Cio lo Carlo, Battaglio Sivano, Rebola Martella,
<vaierio Ai-dro, depositata il 23 novembre 2006.>fO 2 0 0 6 A 0 0 0 8 3 3
Sono o d consolidati i test dialpiostici e le metodiche di coltura ceUulare in micropiastra, lo studio e la d t a cioè di cellule, umane o di origine animale in
genere, per<periodi>pih o meno lunghi, in m i m p o d<di>materiale plastico.
m e n t e in questo ambiente di coltura possono essere eseguiti test di varia natiira:
dalla stimolazione ceiiulare a prove di resistenza ai farmaci, da<reazioni>di vitalità al
dosaggio di metaboliti, e cosi via
E' possibile effettware test colorimetrici, immuwcolorimeirici, enzimatici ecc., che
prevedano un sistema riievatore basato suilo sviluppo di una colorazione.
Al fine di poter evidenzke e quantificare la reazione awenuta & indispensabile ridunr:
al minimo la presenza di elementi wrpuswlati che potrebbero interferire con il raggio
luminoso dello stnnnento di riievazione, generalmente un lettore speitmfotometriw di mimopiastre.
Particolare attenzione deve essere pertanto posta alla ceiiuiarità d e h coltura, ai numero
cioè delle cellule e d e loro dimensioni: se eccessive potrebbero wsiituire un ostacolo
al percorso del raggio luminoso. Così pure, se le ceMe in colaira derivano
-ente da un campione d c o , è importante rimuovere lutti gli altri elementi corpuscolati, quali emnzie e piastrine.
Attuaimente il fondo dei pomtti deUe micropiast~ 6 piaffo o concavo, le piastre sono infatti indicate come "a fondo piaUon, "a fondo a W' oppure "a fondo a V" esonoscelte dagli operatori in base alle diverse 6naiità: coltura celiulare, ELISA, ecc.
La particolarità di questa invenzione consiste neli'aver ideato un micropozztto convesso dennibile come micropozzetto convesso al fine di creare una camera perbehde di raccolta degli elementi corpwcolari. Tale oggeito permette, dopo una semplice cenhifugazione, di concentme sul perimetro intemo del fondo del pozzetto, lutti gli elementi corpuscolati, lasciando così libero il percorso centrale del raggio luminoso. In questo modo è possibile eseguire test dhiamente su sangue intero o in wndizioni di ceUuiarità e dimensioni celiulari critiche (es. blasti leucemici).
in Fig. 1 è rapmentata la sezione del micropometb oggetto dell'invdone: in (A) gli elementi corpuswlati (C) sono disposti udòrmemente in Mto il liquido (L), in questo
<caso>quando il raggio luminoso (R) inwntra un elemento corpuscolato viene deviato. in (B), dopo cenirifugazione, gli elementi corpuscolati sonotutti disposti sul perimelro
inferiore intemo del PopRttO, il raggio lumiaoso attraversa la parte Supenore del liquido senza subire interferenze.
in Fig. 2 è rappresentato in prospe4iiva il micropozzdio dopo centrifugepone. Con (C) sono indicati gli elementi corpwcolari, (L) rappmenta il liquido di sospensione, (R) il raggio luminoso.
Progetto e reilfFazione dei micropozmtti
il protilo ottimale del micropozzetto è stato ricercato sperimentalmente realizzando 4 stampi diversied una figura. il fondo del pozzetto presenta una<anvatura>centrale in rilevo. I ptesupposti alla base della fase di progettazione sono stati due: pih la matua è marcata, e quindi piiì il piano è inclinato, pih gli elementi coipuscolati scormno meglio durante la fase di centrifupzione, ottenendo wsl una separazione pih rapida ed efficace. il secondo presupposto 6 stato che una maggior curvaiura causa una maggior deviazione della luce, tale caratteristica, negativa, è stata valutata sperimentalmente. Sono stati pe-rtanto progettati due pronli diversi e per ognuno sono<siati>progettati due sottotipi con due diverse mature c e n a . Un profilo, definibile a "C orizzontale", con il menisco verso i'alto, copre solo una parte del fondo del pozzetto, lasciando mwra un meilo perimetrale a fondo piatto, vedi Fig. 3. Un secondo tipo di profilo, definito a "U mvesciato", copre auch'esso solo una parte del fondo del po-, l a s c i ianwra unaneilo perimetrale a fondo piatto, ma le pareti deli'U mvesciata sono peqendiwlari al piano, vedi Fig. 4. Gli anelli perimetrali hanno la timione di raccolta degli elementi corpuswlati dopo cent&Ùgazione. Nei progetti in Fig.3 e 4, la dicitura A.T. cioè Area Trasparente, significa che quella zona deve essere lavorata in modo da o- una ottimale trasparenza alla luce. In quel punto gli stampi sono siati cmmati e lucidati a specchio.IImaterialeutilizuttoper lo siampaggio è stato polistimlo iraspente (PS) conforme agli standard della Food DRUG Administration (USA), British Plastic Federation ed aUe pmcrbioni del DGSIP no 16 del 2010711994 del h4hktem della Sanità II materiale risponde anche aiie normative aniinquinamento in quanto i residui di wmbustione, se questa avviene in presenza di aria sufficiente e a ternpmtura adeguata, sono costituiti da acqua ed anidride carbonica
Esempio di una metodica che u(ilbu i oggetto del brevetto
Sono stati testati i 4 p o d realizzati wme da progetto.
Si è ipotizzato un test sulla vitalità dei l d t i , ipotizzando Ilutilizzo di un colorante specifico in grado di viraredicolore in base alla loro vitalità Si è ipotizzato cheilcolorante non agisca sugli eritrociti, ma che gli stesi eritrociti debbano essere a i i d dai pnxm del raggio ottico onde evitare interferenze. in questo caso gli eritrociti sono considerati elementi wrpuscolati di disturbo. Si è utilipato del sangue con anticoIigulante (EDTA) con concentrazione dei leuwciti a circa 5.000Ipl cioè a
5.000.000/ml. E' stata ipotbata una concentrazione ottimale di 100.000 celluldmillilitro. Per portare la co&one dei leucociti a questa cellularità è necessario eseguire una diluizione 150, cioè si deve prendere 1 pl di sangue e portarlo ad un volume finale di 50 pl con soluzione fisiologica Per stabilire il volume totale di campione dadispensarenei &pettivi pozztii si ètenutoconto della porzionedipozzeito dedicataallam l t a delle particelle corpwcolate dopo centrifugazione. Ipotizzaudo un elevato vaiore di ematowito @erte corpuscolata del sangue) si sono stabilite le diverse quantità di campioni da dispensare per ogni pozzetto. Per valutare i'effetto interferente dei globuli rossi<6 stata>eseguita una prova su p o d w n diverse caratteristiche e sisonodeterminati i valoridia s d m z a utdbado come "bianw" la soluzione fisiololgica (NaCI 09.h). Nei po& derivati daiprogetto di Fig. 3 e Fig.4
sono stati dispensati 147 pl di fisiologica e 3 pl di saugue, si 6 anche eseguita una
prova con una maggiore cellularita, dispeiisando 135 pidi fisiologica e 15 pl di saugue. Dopo aver sottoposto i pozzetti ad agitazione, si è fonnata una sospensione rosata che M e r i v a su una lettura spettrofotometrica I pozztii sono<stati>sottoposti a due wndiz.ioni di -one: a 500 g per 5minuti e a 2000 g per dieci minuti.
Tutte le prove wn bassa concentrazione di<sague>hanno raccolto sul perimetro intemo le cellule interferenti lasciando limpida la soluzione aqwsa, non si sono evi* tntcce macroscopiche di emolisi. In Fig. 5 possiamo osservare dall'alto del pozzetto l'aneilo, indicato dalla freccia, che i globuli rossi hamm formato sul fondo del podopo la centrifugazione. Le diverse<curvaftira>dei poz2etti non<sono staie detc di>
<sui risultato di sepamzione. Le diverse condizioni di ceiiulanià e di>ceri-one fanno si che l'anello di emazie precipitate possa<espere>pib o meno completo, come visibile in figura Sono<stati>testati<quattro>tipi<di>con fondi d i v d con diverso raggio di curvatura della parte convessa e con diverse dimensioni della camera di raccolta Come controllo h<stato>utilizzato un pometto a fondo piatto.
Dai valori di assorbanza ottenuti è stato possibile dimostrare che l'interferenza dei globuli rossi è eliminata dalla centrifugazione: I'twdmza elevata nelle soluzioni non centrifugate si riduce, dopo questa o p d o n e , a livelli compatib'ili con quelli dei controlli con soluzione fisiologica E' possibile inoltre evideaiare I'importaaza del volume dello spazio di raccolta: un elevato numero di emazie può non essere completamente trattenuto da questo spazio<(pozzetio>A) ed è quindi n d o ricorrere ad una piii idonea tipologia di pozzeito (C e D). D'altra patte il ricorsa a quest'ultima tipologia causa un aumento dei valori basali di assorbama, pbabiicnte a causa di un omggiore spessore di materiale plastico attraversato dal raggio luminoso, questa mat&ktica non pregiudica I ' d w e dei tests di assorbama in quanto sia il "bianco" che i "controlli" e i campioni sono posti nelle medesime condizioni di partenza, tutti cioè con la stessa tipologia di pozzetto.
Descrizione dei oggetto del brevetto
I risultati ottenuti dimostrano che un profilo composto da una protu- convessa
sui fondo del pozzetto permette di<creare>una camera perimetrale ai pozzetto, che serve a ntccogiiere eventuali particelle corpuscolate interferenti al passeggio di un raggio ottiw. Tale profilo, sulla base dei risultati, non ha una forma critica, quindi, pur mantenendo le -che principaii, può assumere diverse fame in base alle applicazioni specifiche. I p& oggetto del brevetto possono avere diversi profilistlidii per otti.mi.zzare la one degii elementi corpuscolati con una unicacentrifugtione. in Fig. 6 sono illustrati alcuni esempi, non limitativi,<di sezioni>del posrzetto:.AeB~tanopozzettiaUmvesciata,CeDaomega,E,FeGaWo V rovesciata, Haclessidra, Iacilindro, L inclinato, M multiplo, di perticolare interesse il posrzetto N il quale dispone ceniralmente di una piccola vaschetia di raccolta opportumente di~~~ensionat pae,r mg l i e r e una parte prefissata di elementi corpu3colati da a d i i e quindi permettere di scartare solo l'eccesso che v e d raccolto nel serbatoio pimetnle.
Conclusioni
Questi pozzetti permettono una notevole semplificazione di tutte le produre che richiedono un allontanamento di interferenti corjmscolati, riducendo inoltre i tempi di esecuzione. Rispetto alle mimpiastre formate dai n o d pozze#i non comportano maggiori costi produttivi in termini di impiego di materiali o di produzione distampi. I pozzetti con le relative misure riportati nellefigure hanno solo canittere esemplificativo ma non sono vincolanti. Leprocedure, i reatiivi e quant'altro descritto d o rappresentato in questo brevetto sono esempi,<-t0>non sono vincolanti o limitativi. Le misure minime e massime dellaprotuberanza variano da 0.1 pm a 10 cm. il diametro o misura in larghezza minima e massima della protuberanza variano da 0,l a 10 cm.
Claims (8)
- Rive l ld idni 1. Micropomtto dotato di una protukanza convessa sul fondo delpozzetto al finedi creare una camera perimetrale al pozze#o utile a raccogiiere eventuaii pariicelle corpuscolate interferenti al passaggio di un raggio ottico o comunque interferenti ad altre applicazioni.
- 2. R e a i i d o n e e utikxo secondo la rivendicazione 1 di un POpRttO che raccolga le particelle corpuscolate interferenti u t i l i d o la semplice fona di gnivitti o una ceneifugazione per ridurre i tempi operativi.
- 3. Real idone, secondo le rivendicazioni 1-2, di piastre a pih pozzetti.
- 4. Realizzazione, secondo la rivendicazione 3, comunque intesa come richiesta non limitativa, di piastre con numero dipozzetfi pari a 4,6,12,24, %, 384.
- 5.RealiuaPone e utibm, secondo le rivendicazione 1-4, di pozzetti o piastreperl'allontanamento delle wrpuscolate in test biologici.
- 6. Realizzazione e u t i l i i , secondo le rivendicazioni 1-5, di un po- per I'allonianamento delle pari corpuscolate del sangue intesi biologici. <
- 7. RcalizzaPone e utilipo,>secondo le rivendicazioni 14, di un pozeito che disponga, centralmente alla convessità, di una piccola vaschetta di raccolta -ente dimemionata per raccogliere una parte p r e k t a di elementi mrpuscolati da analizzare. e quindi di scartare l'eccesso che verrà raccolto dal serbatoio perimetrale.
- 8. Le procedure, i reattivi e quant'altro desmitto d o rappresentato in<questo>brevetto sono esempi, pertanto non sono vincolanti o limitativi. <2 3 NOU 2006 r>
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