ES2964769T3 - Monocapa de PBMC o células de médula ósea y usos de la misma - Google Patents

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Description

DESCRIPCIÓN
Monocapa de PBMC o células de médula ósea y usos de la misma
El alcance de la presente invención se define por las reivindicaciones adjuntas. Las realizaciones y descripciones que ya no se encuentran dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas se consideran simplemente como ejemplos adecuados para comprender la invención. La divulgación se refiere a monocapas de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y monocapas de células de médula ósea y a métodos para los cultivos correspondientes y usos correspondientes de dichas monocapas. La presente invención se refiere, en algunos aspectos, a métodos de cribado que comprenden la monocapa de PBMC o monocapa de células de médula ósea para la determinación de la respuesta o falta de respuesta de una enfermedad a un agente terapéutico y/o a métodos de cribado de fármacos. En algunos aspectos, la invención se refiere además a métodos para diagnosticar una enfermedad en un donante de PBMC o donante de células de médula ósea que comprenden las PBMC/células de médula ósea cultivadas según el método dado a conocer. Además, se dan a conocer métodos para determinar si la enfermedad es probable que responda o responde al tratamiento con un agente terapéutico. En particular, la presente divulgación proporciona una monocapa de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o monocapa de células de médula ósea producidain vitro,en la que las interacciones célula-célula que se producen de manera natural y la integridad de membrana se mantienen durante la formación de la monocapa, y una monocapa de PBMC o monocapa de células de médula ósea producidain vitromediante un método que comprende (a) aislar PBMC a partir de una muestra de sangre o células de médula ósea a partir de la médula ósea; y (b) incubar las PBMC o células de médula ósea a una densidad de aproximadamente 100 células por mm2 a aproximadamente 30000 células por mm2, en el que, durante el proceso de formación de la monocapa, la muestra no se somete a centrifugación y/o rotación.
La comprensión del comportamiento celular a escala global después de una perturbación se fomenta significativamente mediante el análisis a nivel de célula individual, incluyendo la resolución de las relaciones intercelulares y célula a célula. El campo de la obtención de imágenes de alto contenido proporciona continuamente evidencias de que la variabilidad célula a célula, y el microentorno celular, en el análisis detallado de los fenotipos de las poblaciones celulares es necesaria para la determinación de fenotipos sensibles (revisado en Snijderet al.
(2011) Nature Reviews 12, 119). Las variaciones en el fenotipo celular a nivel global se determinan en gran medida por las propiedades inherentes de las poblaciones celulares en desarrollo que crean microentornos de nicho especializados, incluyendo densidades celulares, contactos célula-célula, ubicación relativa y espacio celular. Además, a nivel de célula individual, puede caracterizarse la heterogeneidad de las respuestas celulares a la misma perturbación (Slacket al.(2008) PNAS 105(49): 19306-11). La complejidad de la heterogeneidad celular (en referencia a la investigación del grado en que reaccionan las células cancerosas con los fármacos antineoplásicos) revela una importancia funcional para el amplio efecto que los pacientes pueden tener a nivel celular durante la quimioterapia.
Sin embargo, los estudios que han sentado las bases para el análisis de las características de la población impulsado por la resolución subcelular y de célula individual se han basado en líneas celulares genéticamente idénticas, que no son fisiológicamente relevantes para la salud y la enfermedad humanas. A este respecto, los métodos de la técnica anterior comprenden separación/aislamiento de poblaciones celulares y/u otros medios que destruyen las interacciones célula-célula naturales y/o la integridad de membrana mediante la aplicación de fuerzas gravitacionales, en particular centrifugación o rotación, o lisis celular, entre otras cosas. Por consiguiente, las muestras de células y/o los métodos descritos por Douglaset al.(2001) Current Protocols in Immunology (1 de mayo de 2001), Katrien Princenet al.(2002) Cytometry Part A, 51A, n.° 1, págs. 35-45 o Peter Ambroset al.(2004) Current Protocols in Cytometry (1 de noviembre de 2004) no reflejan estados fisiológicamente relevantes y/o son incapaces de analizar muestras de células fisiológicamente relevantes. Lo mismo ocurre con respecto a los análisis con Cytospin®, que usan fuerzas gravitacionales para obtener muestras de células, en los que apenas se mantienen las interacciones célula-célula que se producen de manera natural; véase, por ejemplo, Ikedaet al.(2011) Diagnostic cytopathology 39(6), págs. 395-401. Además, la relevancia del descubrimiento de fármacos para las enfermedades humanas en líneas celulares ha sido cuestionada recientemente después de que se identificaran inconsistencias en el trabajo publicado (Haibe-Kainset al.(2013) Nature 504, 389-93).
Además, la quimioterapia predictiva para los cánceres hematopoyéticos, por ejemplo, el diagnóstico personalizado o la medicina personalizada, es un campo emergente con tecnologías en continua evolución. Hasta la fecha, tales estudios han dependido del aislamiento de poblaciones celulares específicas o de parámetros promedio de las poblaciones, por ejemplo, tamaño, viabilidad y actividad celulares, y han dependido de la clasificación por citometría de flujo de blastocitos cancerosos basada en marcadores CD de membrana, que miden únicamente la muerte celular (liberación de ATP) después de la incubación del fármaco en comparación con donantes sanos al azar (Pemovskaet al.(2013) Cancer Discov 3, 1416-29). Ningún estudio ha usado aún la potencia de las pruebas de quimioterapia de alto rendimiento con un microscopio de alto contenido para integrar la viabilidad celular (integridad de membrana), la monitorización de biomarcadores, la activación/culminación de rutas y la relación espacial de las células entre sí en el medio sanguíneo fisiológicamente relevante. Además, ninguna de las técnicas conocidas en la técnica aprovecha toda la muestra del paciente (células sanas y cancerosas, es decir, para una perspectiva global), sino que más bien usan citometría de flujo para clasificar una población únicamente de blastocitos, lo que da como resultado la pérdida celular y corre el riesgo de reducir la salud celular durante el procedimiento de clasificación. Sin embargo, se sabe que los compuestos químicos, por ejemplo, fármacos, tienen un efecto sobre las interacciones célula-célula entre las células de diferentes subconjuntos/subpoblaciones que, sin embargo, no se mantienen/pueden analizarse mediante los medios y métodos conocidos en la técnica.
Además, Richmanet al.(2001) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., presentaron un ensayo que ha demostrado ser útil como prueba de cribado inicial, que es un ensayo de inhibición del efecto citopático (CPE) del VIH en el que, como células dianas, se utilizan líneas de células T inmortalizadas (por ejemplo,<a>TH8 o MT2) que son profundamente sensibles al efecto citopático de determinadas cepas del VIH. Marie-Yvonne Akoumeet al.(2013) Journal of Visualized Experiments 80, página e50768, dan a conocer un procedimiento experimental y analítico para un ensayo basado en células desarrollado como prueba funcional para predecir el pronóstico de escoliosis idiopática en niños asintomáticos y afectados. Se ha descrito un protocolo adicional que usa la tecnología Cytospin en “Current Protocols in Cytometry”, 1 de noviembre de 2004, John Wiley & Sons, Inc.
Por tanto, existe la necesidad de medios y métodos para proporcionar sistemas que reflejen la situaciónin vivo,de manera que estos sistemas puedan usarse para que las PBMc y/o células de médula ósea reflejen la situaciónin vivoy/o una representaciónin vivode las células, de manera que los sistemas puedan usarse en métodos de diagnóstico de una enfermedad o predisposición a una enfermedad, en cribados de fármacos y en la evaluación de los resultados del tratamiento o las predisposiciones al tratamiento.
La presente divulgación se refiere a una monocapa de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o monocapa de células de médula ósea producidain vitro,en la que, en dichas monocapas, las interacciones célulacélula que se producen de manera natural y/o la integridad de membrana se mantienen durante la formación de dicha monocapa. Es decir, se da a conocer una monocapa de PBMC producidain vitroo monocapa de células de médula ósea producidain vitro,representando dicha monocapa el/un estado fisiológicamente relevante de la mayoría de las células comprendidas en dicha(s) monocapa(s). Por consiguiente, se da a conocer una monocapa de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o monocapa de células de médula ósea, en la que las interacciones célula-célula que se producen de manera natural y la integridad de membrana se mantienen durante la formación de la monocapa, medios y métodos para la producción de tales monocapas y usos de tales monocapas. Tal como evidencian los ejemplos adjuntos, las capas celulares de la técnica anterior no pueden usarse para visualizar/usar/monitorizar/evaluar las interacciones célula-célula, lo que se debe a las fuerzas gravitacionales aplicadas a la muestra (en particular durante la formación de las capas celulares de la técnica anterior), entre otras cosas. Tales fuerzas gravitacionales pueden ser, en particular centrifugación. Además, los métodos de la técnica anterior emplean técnicas que conducen a una lisis celular no deseada y similares, que destruyen la integridad de membrana y la interacción célula-célula que se produce de manera natural. En cambio, la presente invención proporciona, de manera sorprendente e inesperada, monocapas de PBMC y células de médula ósea, en las que las interacciones célula-célula y la integridad de membrana tal como se encuentran en un entorno natural se mantienen durante la formación de la monocapa de PBMC y células de médula ósea. El mantenimiento de las interacciones célula-célula y/o la integridad de membrana durante la formación de la monocapa permite que cualquier efecto basado en las interacciones célula-célula y/o la integridad de membrana pueda evaluarse/determinarse/visualizarse usando las monocapas de la presente invención. Tal como ilustran los ejemplos adjuntos, las interacciones célulacélula pueden visualizarse usando la monocapa de PBMC o células de médula ósea de la presente invención; véanse, por ejemplo, la figura 15B (imagen superior derecha) y el ejemplo 13. En cambio, los métodos de la técnica anterior, en particular Douglaset al.y Katrien Princenet al.,conducen a la aglutinación celular y son incapaces de visualizar las interacciones célula-célula que se producen de manera natural; véanse, por ejemplo, la figura 15C y el ejemplo 13.
Por ejemplo, se sabe que las células, en particular las células derivadas de células madre hematopoyéticas, en particular las PBMC o células de médula ósea, interaccionan entre sí a través de receptores de membrana y/o restos de azúcares sobre las superficies celulares, entre otras cosas. Por ejemplo, se sabe que las células T y las células dendríticas interaccionan después de una infección. Sin embargo, las células T y las células dendríticas muestran una interacción menor o sólo ligera en sujetos no enfermos.
Por consiguiente, las monocapas, en particular las monocapas de PBMC y/o monocapas de células de médula ósea, permiten la determinación de si un donante padece una enfermedad/infección y/o si un donante responde al tratamiento. Además, las monocapas, en particular las monocapas de PBMC o monocapas de médula ósea, pueden usarse en métodos de cribado de fármacos, en las que las interacciones célula-célula y/o la integridad de membrana se alteran debido a un efecto del fármaco.
El término “interacciones célula-célula”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a las interacciones directas entre las superficies celulares que desempeñan un papel crucial en el desarrollo y la función de los organismos multicelulares. Estas interacciones permiten que las células se comuniquen entre sí en respuesta a los cambios en su microentorno. Tales interacciones célula-célula pueden ser estables, tales como aquellas que se realizan a través de las uniones celulares. Estas uniones están implicadas en la comunicación y organización de las células dentro de un tejido particular. Otras son transitorias o temporales, tales como aquellas entre las células del sistema inmunitario o las interacciones implicadas en la inflamación de tejidos. Estos tipos de interacciones intercelulares se distinguen de otros tipos tales como aquellas entre las células y la matriz extracelular.
El mantenimiento de las interacciones célula-célula significa que una célula que interacciona con otra célula en un entorno natural también interaccionará con dicha otra célula o una célula del mismo tipo celular en las monocapas proporcionadas en el presente documento. Es decir, se mantienen las interacciones célula-célula globales, mientras que las células no mantienen necesariamente la interacción con la misma célula que interacciona.
Las interacciones célula-célula descritas anteriormente se mantienen durante la formación de la monocapa. Generalmente, las interacciones célula-célula se producen de manera natural en la muestra que comprende PBMC o células de médula ósea usadas para formar la monocapa de la invención. Estas interacciones célula-célula que se producen de manera natural se mantienen durante las etapas de producción posteriores de la monocapa de PBMC o monocapa de células de médula ósea producidain vitro.El experto en la técnica puede determinar si las interacciones célula-célula se producen de manera natural y se mantienen en la monocapa de PBMC y/o monocapa de células de médula ósea. En particular, el experto en la técnica puede usarse métodos bien conocidos en la técnica. En particular, las interacciones célula-célula se mantienen durante la adición de etiquetas y/o colorantes detectables, en particular un colorante de viabilidad. Después de la formación de la monocapa, las interacciones célula-célula pueden interrumpirse, por ejemplo, mediante la fijación de la monocapa antes de la obtención de imágenes.
Las interacciones célula-célula mantenidas durante la formación de la monocapa y mantenidas en los métodos de la presente invención incluyen, por ejemplo, las siguientes interacciones célula-célula indicativas de enfermedades específicas y/o indicativas de donantes sanos.
Tabla 1
Por consiguiente, las interacciones célula-célula que se producen de manera natural pueden determinarse/evaluarse/detectarse usando marcadores celulares. En particular, las interacciones célula-célula que se producen de manera natural pueden determinarse/evaluarse/detectarse usando los marcadores mostrados en la tabla anterior. Por ejemplo, las interacciones célula-célula que se producen de manera natural indicativas de un donante sano pueden detectarse usando, entre otras cosas, pares de marcadores celulares para CD11C y CD3, CD14 y CD3, CD11C y CD8, CD19 y CD3. Cuando se detectan interacciones entre células positivas para estos marcadores, el donante puede categorizarse como sano.
Cuando las células comprendidas en la monocapa de PBMC o monocapa de células de médula ósea se detectan/etiquetan usando los marcadores celulares proporcionados anteriormente indicativos de enfermedades específicas, puede diagnosticarse la enfermedad asociada en el donante de células y/o puede evaluarse el tratamiento de la enfermedad asociada. Además, cuando las células comprendidas en la monocapa de PBMC o monocapa de células de médula ósea se detectan/etiquetan usando marcadores indicativos de donantes sanos, pueden evaluarse/determinarse las interacciones célula-célula que se producen de manera natural para tales donantes sanos. A continuación se dan a conocer marcadores celulares adicionales indicativos de enfermedades.
Tal como se comentó anteriormente, el experto conoce medios y métodos para determinar/evaluar/monitorizar/verificar las interacciones célula-célula. En particular, el experto en la técnica puede distinguir entre las interacciones célula-célula que se producen de manera natural y aquellas introducidas durante la preparación de una muestra de células. Como tal, el experto entiende que las células del mismo tipo y/o las células de tipos diferentes interaccionan en un organismo vivo. La mayoría de las células comprendidas en las monocapas de la presente invención mantienen sus interacciones célula-célula que se producen de manera natural. Es decir, la mayoría de las células, en particular al menos el 50 % de las células comprendidas en las monocapas de la invención, preferiblemente el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 % o el 100 % de las células comprendidas en las monocapas de la invención interaccionan con la misma célula o una célula del mismo tipo celular quein vivo.Las interacciones célula-célula pueden verificarse/evaluarse/determinarse usando métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede usarse microscopía confocal para evaluar/determinar/verificar si las interacciones célula-célula son entre células que interaccionan en un entorno natural o entre células que no muestran ninguna interacción en un entorno natural. Tales interacciones célula-célula no naturales pueden deberse a la aglutinación celular, entre otras cosas. Tal como resulta evidente a partir de los ejemplos adjuntos, tales interacciones célula-célula que se producen de manera natural no pueden evaluarse/determinarse/verificarse usando los métodos de la técnica anterior, en particular los medios y métodos descritos por Douglaset al.o Katrien Princenet al.;véanse, por ejemplo, el ejemplo 12 y la figura 15.
Esto distingue las monocapas a partir de muestras de células conocidas que comprenden PBMC y/o células de médula ósea, que muestran interacciones célula-célula y/o interacciones de células al azar, que no se encuentran en general o no se encuentran en la misma medidain vivo,por ejemplo, la aglutinación celular. Por consiguiente, las monocapas de PBMC y monocapas de células de médula ósea reflejan un estado fisiológicamente relevante, tal como evidencia adicionalmente la razón/número de células presentes en las monocapas de PBMC y monocapas de células de médula ósea que reflejan las razones/números celulares encontradosin vivo.
Por consiguiente, se da a conocer una monocapa de PBMC fisiológicamente relevante producidain vitroy una monocapa de células de médula ósea fisiológicamente relevante producidain vitro.El término “producidain vitro’’significa que las monocapas se producen fuera de un organismo vivo, por ejemplo, en un laboratorio, es decir, fuera del contexto biológico normal de las células comprendidas en la monocapa. Generalmente, los estudiosin vitropermiten la investigación de diversas funciones biológicas, aunque es deseable asemejarse a la situaciónin vivo.
Con respecto a las células comprendidas en las monocapas, la situaciónin vivose asemeja en tal medida que permite diversas investigaciones y conclusiones, tal como se proporciona en el presente documento, que no pueden extraerse a partir de las muestras de células existentes. Como tal, el parecidoin vitroa una situaciónin vivode las PBMC o células de médula ósea, es decir, la provisión de un estado fisiológicamente relevante de tales células, proporciona diversas ventajas sobre los métodos conocidos, tal como se describe en el presente documento.
Aunque las interacciones célula-célula que se producen de manera natural se mantienen durante la formación de la monocapa, el proceso de formación también puede implicar que se mantenga la integridad de membrana. Esto significa que las membranas biológicas, tal como se producen en un entorno natural, se mantienen durante el proceso de formación de la monocapa de la invención. Muchas de las interacciones célula-célula descritas anteriormente dependen de las membranas intactas. Por tanto, en el proceso de formación de la monocapa, la integridad de membrana se mantiene preferiblemente en tal medida que permite el mantenimiento de las interacciones célula-célula tal como se presentain vivo.Esto puede lograr evitando el uso de tampones que tienen un impacto sobre la integridad de membrana, por ejemplo, tampones que interaccionan con las membranas biológicas, tales como tampones que comprenden detergentes. Por ejemplo, deben evitarse tampones que comprenden Triton o SDS. El mantenimiento de la integridad de membrana durante la formación de la monocapa conduce a la formación de una monocapa que comprende células que están en un estado fisiológicamente relevante. Una vez formada la monocapa, puede interrumpirse la integridad de membrana. La interrupción de la integridad de membrana puede permitir la accesibilidad de etiquetas específicas para una o más subpoblaciones comprendidas en las monocapas de la invención. Por ejemplo, la monocapa puede fijarse antes de la evaluación/obtención de imágenes. Los medios y métodos usados para la fijación pueden implicarse la interrupción de la integridad de membrana. Por consiguiente, se forma la monocapa en la que, durante la formación, se mantiene la integridad de membrana.
Por consiguiente, se dan a conocer monocapas de PBMC o células de médula ósea que representan una representación producidain vitrode un estado fisiológicamente relevante. El experto en la técnica conoce bien métodos para evaluar si una muestra de células como, por ejemplo, la monocapa, representa un “estado fisiológicamente relevante” de las células comprendidas en dicha muestra de células. A este respecto, el término “estado fisiológicamente relevante” o términos similares, tal como se usan en el presente documento, se refiere a un estado que se asemeja/refleja una situaciónin vivotal como se encuentra en un organismo vivo, en el que dicho organismo puede estar sano o enfermo. En particular, en un “estado fisiológicamente relevante”, las interacciones célula-célula y/o la integridad de membrana se mantienen preferiblemente comoin vivo.Por consiguiente, la mayoría de las células, en particular al menos el 50 % de las células comprendidas en las monocapas de la invención, preferiblemente el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 % o el 100 % de las células comprendidas en las monocapas de la invención, están preferiblemente en un estado que refleja la situaciónin vivocon respecto al estadio durante el ciclo de vida de las células y/o las interacciones célula-célula, tal como se describió anteriormente, y/o la representación de las subpoblaciones presentesin vivo.Como tal, el experto conoce bien que una muestra de células, en particular la monocapa, comprende células de diferentes subpoblaciones en las que cada célula de cada subpoblación puede estar en un estado de viva, muerta y/o moribunda, entre otras cosas. Es decir, en las monocapas de la presente invención, el número/razón de células en cada estado, es decir, vivas, muertas o moribundas, y cada subpoblación corresponde preferiblemente al número/razón que se encuentrain vivo.
Es decir, el estado fisiológicamente relevante en el que se encuentran las células comprendidas en la monocapa preferiblemente está desprovisto de células que se encuentran en un estado diferente, es decir, vivas, muertas o moribundas, que cuando se encuentranin vivoo pertenecen a una subpoblación diferente. Esto requiere que la preparación de la monocapa proporcionada en el presente documento no altere el número/razón de células en cada estado y/o en cada subpoblación encontradosin vivo.Por consiguiente, con el fin de mantener los números/razones de células de cada subpoblación, se prefiere que se reduzca el pipeteo. A este respecto, las muestras usadas en el presente documento comprenden células adherentes y no adherentes. Por tanto, el pipeteo del sobrenadante antes de la formación de la monocapa puede retirar preferentemente células no adherentes, cambiando así la representación global de subpoblaciones comprendidas en la muestra que va a usarse para la formación de la monocapa. Por tanto, se prefiere un volumen de partida mínimo, que evita etapas de pipeteo, en los métodos de la presente invención y/o los métodos usados para obtener la monocapa.
La muestra de referencia, denominada muestra/estado/situaciónin vivo,corresponde a una muestra obtenida a partir de un donante, en particular un donante sano o enfermo, en paralelo a la muestra usada en los métodos de la presente invención. Para diversas enfermedades, incluyendo neoplasias malignas hematológicas, los números/razones de subpoblaciones de células comprendidas en las PBMC y/o células de médula ósea están bien documentados. Por consiguiente, tales números/razones también pueden considerarse como muestra de referencia que representa la situaciónin vivo.
Con el fin de proporcionar una monocapa que refleje la situaciónin vivo,se prefiere que la fuerza gravitacional aplicada durante la preparación de la monocapa, es decir, mediante los métodos de la presente invención, no supere 1g. Esto se logra evitando el uso de centrifugación y/o rotación. Por consiguiente, los métodos de la presente invención no comprenden centrifugación y/o rotación después del aislamiento de las células. Además, se prefiere que la monocapa se mantenga en disoluciones/tampones que permiten el mantenimiento de un estado fisiológicamente relevante. Como tal, preferiblemente se mantiene la integridad de membrana en las monocapas, es decir, preferiblemente las células no experimentan lisis durante la preparación de la monocapa. En línea con lo anterior, la mayoría de las células comprendidas en las monocapas, en particular al menos el 50 % de las células comprendidas en las monocapas, preferiblemente el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95% o el 100% de las células comprendidas en las monocapas están preferiblemente en un estado fisiológicamente relevante, es decir, en el que se mantienen las interacciones célula-célula y/o se mantiene la integridad de membrana.
Por consiguiente, la presente divulgación se refiere a una monocapa de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o monocapa de células de médula ósea producidain vitro,en la que las interacciones célula-célula que se producen de manera natural y la integridad de membrana se mantienen durante la formación de la monocapa. Esto puede lograrse cuando las PBMC o células de médula ósea se mantienen/procesan/analizan a aproximadamente 1g, es decir, 9,81 m/s2, durante la formación de la monocapa. A este respecto, 1g corresponde a la gravedad convencional en el planeta Tierra, es decir, 9,81 m/s2. Esto incluye que, durante el proceso de formación de la monocapa de la invención, se evitan la centrifugación y/o rotación, es decir, la muestra no se somete a centrifugación y/o rotación. Por consiguiente, la presente divulgación proporciona una monocapa de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o monocapa de células de médula ósea producidain vitro,en la que las interacciones célula-célula que se producen de manera natural y la integridad de membrana se mantienen durante la formación de la monocapa, en la que, después del aislamiento, las PBMC o células de médula ósea se mantienen/procesan/analizan a aproximadamente 1g, es decir, 9,81 m/s2.
Lo anterior no excluye que las monocapas se procesen/mantengan/analicen en otro lugar que no sea el planeta Tierra. Por ejemplo, las monocapas pueden procesarse/mantenerse/analizarse en un lugar en el que no haya fuerza gravitacional o prácticamente no esté presente. En tales circunstancias, puede aplicarse artificialmente una fuerza gravitacional suficiente para sedimentar las células. Los ejemplos incluyen estaciones espaciales, aeronaves de gravedad reducida (maniobra de gravedad cero) o satélites naturales tales como la luna de la Tierra.
La “mayoría de las células”, tal como se usa en el presente documento, significa que al menos el 50 % de las células comprendidas en las monocapas, preferiblemente el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95% o el 100% de las células comprendidas en las monocapas se encuentran en un estado fisiológicamente relevante. Los porcentajes anteriores de células en un estado fisiológicamente relevante comprendidas en las monocapas se determinan/miden/evalúan usando métodos bien conocidos en la técnica. En particular, si una muestra de células, en particular la monocapa, comprende células encontradas en un estado fisiológicamente relevante se determina mediante la cuantificación de células comprendidas en la monocapa. Esto puede realizarse usando métodos bien conocidos en la técnica. En particular, la cuantificación puede realizarse a través de análisis de imágenes en comparación con las células en sangre periférica o médula ósea de un individuo de referencia o múltiples individuos de referencia, por ejemplo, uno o más donantes sanos en los que la muestra de PBMC o células de médula ósea se deriva de un donante enfermo. La cuantificación de células es una herramienta de diagnóstico convencional. Los umbrales de las subpoblaciones de células comprendidas en PBMC y/o células de médula ósea están bien documentados para donantes sanos y donante enfermos. Por consiguiente, basándose en las diferencias en las muestras que van a evaluarse usando los medios y métodos de la presente invención, puede determinarse la relevancia fisiológica. La documentación de las subpoblaciones de células comprendidas en las células hematopoyéticas puede encontrarse, por ejemplo, en Halleket al.(2008) Blood 111(12). Por consiguiente, la cuantificación y los medios y métodos adicionales, por ejemplo, la determinación de las interacciones célula-célula usando microscopía, permiten determinar si una muestra de células representa un estado fisiológicamente relevante.
La monocapa puede proporcionar un sistema de modelo único que puede usarse, entre otras cosas, en investigación biológica, bioquímica y biofísica. Además, la monocapa puede usarse en métodos de cribado y de diagnóstico médico, por ejemplo, en métodos de cribado y de diagnóstico médico automáticos. Determinadas monocapas de PBMC y monocapas de células de médula ósea proporcionadas en el presente documento requieren un material de donante mínimo; por tanto, pueden usarse cantidades convencionales de material de donante, por ejemplo, tal como se obtienen para protocolos de análisis de sangre rutinarios, para someter a prueba o analizar un mayor número de perturbaciones (por ejemplo, condiciones de prueba individuales) por donación de lo que es posible usando los métodos actuales conocidos en la técnica. Además, determinadas monocapas de PBMC y monocapas de células de médula ósea proporcionadas en el presente documento pueden permitir la rápida evaluación de los resultados usando análisis basado en obtención de imágenes, por ejemplo, mediante la evaluación de imágenes microscópicas de muestras teñidas (por ejemplo, tinción fluorescente mediante anticuerpos etiquetados), lo que conduce a un procesamiento automático, reduciendo sustancialmente los requisitos de mano de obra y los tiempos de procesamiento/análisis.
Las monocapas proporcionadas en diversos aspectos de la presente invención pueden permitir, entre otras cosas, el análisis por obtención de imágenes y/o microscópico de poblaciones de PBMC o poblaciones de médula ósea. Por consiguiente, la monocapa, tal como se usa en el presente documento, implica una sola capa de células encontrada predominantemente dentro del mismo plano focal del dispositivo de obtención de imágenes, por ejemplo, microscopio o cámara automática, tal como se conoce en la técnica o se describe en el presente documento. El término una sola capa se usa para significar que las células dentro de esta capa forman un cultivo que es predominantemente bidimensional, es decir, el cultivo es predominantemente una capa de células individuales. Es decir, dentro del cultivo, la mayoría de las células no se encuentran en reposo sobre o por encima de otras células, y no se encuentran en agregados (por ejemplo, que consisten en grupos de células que se extienden por encima de la capa de células individuales al comprender células que están en reposo sobre o por encima de otras células). Por tanto, la monocapa de PBMC dentro del significado de la divulgación comprende preferiblemente una capa horizontal de células PBMC que tiene un grosor de la altura de una sola PBMC. Del mismo modo, la monocapa de células de médula ósea dentro del significado de la divulgación comprende preferiblemente una capa horizontal de células de médula ósea que tiene un grosor de la altura de una sola célula de médula ósea. Tal como se usa en el presente documento, el término monocapa no excluye que dentro del recipiente de cultivo puedan encontrarse agregados de células o construcciones multicapa (es decir, áreas que tienen cultivos celulares con una altura de mayor de una célula PBMC o una célula de médula ósea, respectivamente) o áreas sin células. Más bien, el término se usa para significar que los cultivos de la invención tendrán la mayor parte de su área visible o que puede someterse a obtención de imágenes (por ejemplo, mediante métodos microscópicos) que consiste en una sola capa de células. Esto se logra más fácilmente cuando se proporciona una sola capa de células sobre una superficie de cultivo celular. Tal como se entiende en la técnica, las PBMC aisladas de muestras de sangre, o médula ósea purificada, comprenden predominantemente células no adherentes y, por tanto, típicamente no forman contactos fuertes con las superficies de cultivo celular ni contactos fuertes entre células. Por tanto, en diversos aspectos de la presente invención no se prevé que las monocapas de PBMC sean necesariamente equivalentes a las monocapas de células adherentes tal como se entiende en la técnica, es decir, que comprendan una capa de células firmemente unida, uniformemente distribuida y que cubra la mayor parte de la superficie de cultivo. Más bien, en algunas realizaciones, la monocapa de PBM<c>de la invención puede comprender cultivos de alta densidad que comprenden la mayoría de las células en contacto directo con una o más células diferentes, pero no necesariamente adheridas a la superficie de cultivo, o puede comprender cultivos de baja densidad, en los que las células están dentro de la monocapa pero no tienen contacto (físico directo) con ninguna otra célula en el cultivo. Las monocapas proporcionadas en determinados aspectos de la presente invención también pueden comprender cultivos de densidad intermedia, que tienen áreas discretas en las que las células están en contacto con una o más células y otras áreas en las que las células no tienen ningún contacto con otras células.
Debido a que las monocapas proporcionadas en el presente documento permiten por primera vez el uso de información derivada de muestras de PBMC o muestras de células de médula ósea fisiológicamente relevantes, en las que las interacciones célula-célula que se producen de manera natural y la integridad de membrana se mantienen durante la formación de las monocapas, dicha información puede usarse en diversas aplicaciones, en particular aplicaciones médicas y/o de diagnóstico.
Por tanto, entre otras cosas, la presente divulgación se refiere a una composición farmacéutica que comprende un compuesto para su uso en el tratamiento de una enfermedad, en particular una neoplasia maligna hematológica y/o una neoplasia maligna de tejido mieloide y/o linfoide de un individuo, en la que dicha composición farmacéutica se selecciona de al menos dos o más compuestos de prueba, en la que cada uno de los al menos dos o más compuestos de prueba se somete a prueba en un ensayo que comprende las etapas de (a) preparar la monocapa de células hematopoyéticas, en particular la monocapa de PBMC o células de médula ósea, de la invención usando células hematopoyéticas, en particular PBMC o células de médula ósea, de dicho individuo; (b) determinar una o más funciones biológicas de una o más subpoblaciones comprendidas en la monocapa de células hematopoyéticas, en particular la monocapa de PBMC o monocapa de células de médula ósea; (c) añadir uno de los al menos dos o más compuestos de prueba a la monocapa de células hematopoyéticas, en particular la monocapa de PBMC o monocapa de células de médula ósea; y (d) determinar/monitorizar/evaluar/verificar los cambios de dicha una o más funciones biológicas de la una o más subpoblaciones comprendidas en la monocapa hematopoyética, en particular la monocapa de PBMC o monocapa de células de médula ósea, en el que el ensayo se repite para cada uno de los al menos dos o más compuestos y en el que el compuesto que tiene el efecto más ventajoso sobre dicha una o más funciones biológicas de dicha una o más subpoblaciones se selecciona para el tratamiento de dicho individuo.
En el procedimiento anterior pueden determinarse diversas funciones biológicas. En particular, puede determinarse si las células comprendidas en la monocapa están en un estado fisiológicamente relevante. El estado fisiológicamente relevante puede estar caracterizado por las interacciones célula-célula mantenidas durante la formación de la monocapa y/o la viabilidad de las células comprendidas en la monocapa y/o la integridad de membrana mantenidas durante la formación de la monocapa. Por consiguiente, se prefiere que las funciones biológicas determinadas en el procedimiento anterior sean la viabilidad y/o las interacciones célula-célula de las células comprendidas en la monocapa.
Por tanto, la invención se refiere a un método para seleccionar una composición farmacéutica que comprende un compuesto para su uso en el tratamiento de una enfermedad, en el que la enfermedad es una neoplasia maligna hematológica y/o una neoplasia maligna de tejido mieloide y/o linfoide de un individuo, en el que dicha composición farmacéutica se selecciona de al menos dos o más compuestos de prueba, en el que cada uno de los al menos dos o más compuestos de prueba se somete a prueba en un ensayo que comprende las etapas de (a) preparar la monocapa de células hematopoyéticas, en particular la monocapa de PBMC o células de médula ósea, de la invención usando células hematopoyéticas, en particular PBMC o células de médula ósea, de dicho individuo; (b) determinar la viabilidad y/o las interacciones célula-célula de una o más subpoblaciones comprendidas en la monocapa de células hematopoyéticas, en particular la monocapa de PBMC o monocapa de células de médula ósea; (c) añadir uno de los al menos dos o más compuestos de prueba a la monocapa de células hematopoyéticas, en particular la monocapa de PBMC o monocapa de células de médula ósea; y (d) determinar/monitorizar/evaluar/verificar los cambios de viabilidad y/o interacciones célula-célula de la una o más subpoblaciones comprendidas en la monocapa hematopoyética, en particular la monocapa de PBMC o monocapa de células de médula ósea, en el que, durante el proceso de formación de la monocapa, la muestra no se somete a centrifugación y/o rotación, en el que el ensayo se repite para cada uno de los al menos dos o más compuestos y en el que el compuesto que más reduce la viabilidad/interacciones célula-célula se selecciona para el tratamiento de dicho individuo.
La viabilidad y/o las interacciones célula-célula de las células comprendidas en la monocapa pueden determinarse y/o los cambios de viabilidad y/o interacciones célula-célula pueden determinarse/evaluarse/monitorizarse/verificarse usando etiquetas/marcadores/colorantes detectables. Tales etiquetas/marcadores/colorantes pueden ser específicos para una o más subpoblaciones comprendidas en las monocapas de la invención. Cuando se usan tales etiquetas/marcadores/colorantes específicos, pueden seleccionarse para los tipos de células que desempeñan un papel en diversas enfermedades y/o se sabe que tienen una función biológica en una enfermedad, en particular una neoplasia maligna hematológica y/o una neoplasia maligna de tejido mieloide y/o linfoide.
Por consiguiente, en aspectos particulares, la divulgación se refiere a una composición farmacéutica que comprende un compuesto para su uso en el tratamiento de leucemia mieloide aguda o crónica de un individuo, en la que dicha composición farmacéutica se selecciona de al menos dos o más compuestos de prueba, en la que cada uno de los al menos dos o más compuestos de prueba se somete a prueba en un ensayo que comprende las etapas de (a) preparar la monocapa de células hematopoyéticas, en particular la monocapa de PBMC o células de médula ósea, de la invención usando células hematopoyéticas, en particular PBMC o células de médula ósea, de dicho individuo; (b) determinar la viabilidad y/o las interacciones célula-célula de las células positivas para CD117 y/o CD34 comprendidas en la monocapa de células hematopoyéticas, en particular la monocapa de PBMC o monocapa de células de médula ósea; (c) añadir uno de los al menos dos o más compuestos de prueba a la monocapa de células hematopoyéticas, en particular la monocapa de PBMC o monocapa de células de médula ósea; y (d) determinar/monitorizar/evaluar/verificar los cambios de viabilidad y/o interacciones célula-célula de las células positivas para CD117 y/o CD34 comprendidas en la monocapa hematopoyética, en particular la monocapa de PBMC o monocapa de células de médula ósea, en el que el ensayo se repite para cada uno de los al menos dos o más compuestos y en el que el compuesto que más reduce la viabilidad/interacciones célula-célula se selecciona para el tratamiento de dicho individuo. En aspectos particulares, la divulgación se refiere a una composición farmacéutica que comprende un compuesto para su uso en el tratamiento de mielofibrosis primaria de un individuo, en la que dicha composición farmacéutica se selecciona de al menos dos o más compuestos de prueba, en la que cada uno de los al menos dos o más compuestos de prueba se somete a prueba en un ensayo que comprende las etapas de (a) preparar la monocapa de células hematopoyéticas, en particular la monocapa de PBMC o células de médula ósea, de la invención usando células hematopoyéticas, en particular PBMC o células de médula ósea, de dicho individuo; (b) determinar la viabilidad y/o las interacciones célula-célula de las células positivas para CD34 y/o pSTAT5 comprendidas en la monocapa de células hematopoyéticas, en particular la monocapa de PBMC o monocapa de células de médula ósea; (c) añadir uno de los al menos dos o más compuestos de prueba a la monocapa de células hematopoyéticas, en particular la monocapa de PBMC o monocapa de células de médula ósea; y (d) determinar/monitorizar/evaluar/verificar los cambios de viabilidad y/o interacciones célula-célula de las células positivas para CD34 y/o pSTAT5 comprendidas en la monocapa hematopoyética, en particular la monocapa de PBMC o monocapa de células de médula ósea, en el que el ensayo se repite para cada uno de los al menos dos o más compuestos y en el que el compuesto que más reduce la viabilidad/interacciones célula-célula se selecciona para el tratamiento de dicho individuo.
La composición farmacéutica de la divulgación comprende un compuesto seleccionado de al menos dos o más compuestos de prueba. Los compuestos de prueba no están particularmente limitados siempre que sean adecuados para su uso como producto farmacéutico. Sin embargo, se prefiere que dichos compuestos de prueba se seleccionen de compuestos que se sabe que son eficaces en el tratamiento de una enfermedad, en particular una neoplasia maligna hematológica y/o una neoplasia maligna de tejido mieloide y/o linfoide. Los compuestos que se sabe que son eficaces en el tratamiento de tales enfermedades comprenden compuestos químicos y compuestos biológicos, tales como, por ejemplo, anticuerpos. Los ejemplos de compuestos que se sabe que son eficaces en el tratamiento de tales enfermedades incluyen, pero no se limitan a, alemtuzumab, anagrelida, trióxido de arsénico, asparaginasa, ATRA, azacitidina, bendamustina, blinatumomab, bortezomib, bosutinib, brentuximab vedotina, busulfán, Ceplene, clorambucilo, cladribina, clofarabina, ciclofosfamida, citarabina, dasatinib, daunorrubicina, decitabina, denileucina diftitox, dexametasona, doxorrubicina, duvelisib, EGCG = galato de epigalocatequina, etopósido, filgrastim, fludarabina, gemtuzumab ozogamicina, diclorhidrato de histamina, homoharringtonina, hidroxiurea, ibrutinib, idarrubicina, idelalisib, ifosfamida, imatinib, interferón alfa-2a, recombinante, interferón alfa-2b, recombinante, inmunoglobulina intravenosa, L-asparaginasa, lenalidomida, masitinib, melfalán, mercaptopurina, metotrexato, midostaurina, mitoxantrona, MK-3475 = pembrolizumab, nilotinib, pegaspargasa, peginterferón alfa-2a, plerixafor, ponatinib, prednisolona, prednisona, R115777, RAD001 (everólimus), rituximab, ruxolotinib, selinexor (KPT-330), sorafenib, sunitinib, talidomida, topotecán, tretinoína, vinblastina, vincristina, vorinostat, zoledronato, ABL001, AbT-199 = venetoclax, ABT-263 = navitoclax, ABT-510, ABT-737, ABT-869 = linifanib, AC220 = quizartinib, AE-941 = neovastat, AG-858, AGRO100, aminopterina, asparaginasa erwinia chrysanthemi, AT7519, AT9283, AVN-944, bafetinib, bectumomab, bestatina, beta-aletina, bexaroteno, BEZ235, BI 2536, buparlisib (BKM120), carfilzomib, carmustina, ceritinib, CGC-11047, CHIR-258, CHR-2797, CMC-544 = inotuzumab ozogamicina, CMLVAX100, CNF1010, CP-4055, crenolanib, crizotinib, ácido elágico, elsamitrucina, epoetina zeta, epratuzumab, FAV-201, favld, flavopiridol, G4544, galiximab, maltolato de galio, nitrato de galio, givinostat, GMX1777, GPI-0100, Grn163l, GTI 2040, IDM-4, interferón alfacon-1, IPH 1101, ISS-1018, ixabepilona, JQ1, lestaurtinib, mecloretamina, MED14736, MGCD-0103, MLN-518 = tandutinib, motexafina gadolinio, interferón alfa natural, nelarabina, obatoclax, obinutuzumab, OSI-461, panobinostat, PF-114, PI-88, butirato de pivaloiloximetilo, pixantrona, pomalidomida, PPI-2458, pralatrexato, proleucina, PU-H71, ranolazina, rebastinib, samario (153sm) lexidronam, SGN-30, radioterapia esquelética dirigida, tacedinalina, tamibaroteno, temsirólimus, tioguanina, troxacitabina, vindesina, VNP 40101M, volasertib o XL228. Los ejemplos adjuntos ilustran los efectos ventajosos de los medios y métodos dados a conocer en el presente documento. Tal como puede observarse en la figura 12, los medios y métodos proporcionados en el presente documento pueden usarse para determinar/evaluar si un tratamiento es eficaz y/o si un régimen de tratamiento es eficaz. Los métodos previos se basan en el número global de PBMC destruidas. En cambio, los medios y métodos proporcionados en el presente documento permiten la evaluación basándose en las subpoblaciones comprendidas en las monocapas de PBMC o monocapas de células de médula ósea de la invención usando, por ejemplo, marcadores específicos para tales subpoblaciones. Por tanto, puede llegarse a una decisión de tratamiento basándose en el efecto de un fármaco sobre una subpoblación o subpoblaciones particulares comprendidas en la monocapa de PBMC o monocapa de células de médula ósea de la invención. Después de someter a prueba múltiples fármacos aprobados que se usan en el tratamiento de neoplasias malignas hematológicas, se decidió alterar el régimen de tratamiento para un paciente sometido a tratamiento usando ruxolitinib. En particular, se decidió usar adicionalmente azacitidina, que redujo significativamente el número de células enfermas; véase la figura 12D. Por consiguiente, los medios y métodos proporcionados en el presente documento se han usado con éxito para diagnosticar a un paciente que tenía una enfermedad y para evaluar si dicho paciente responde al tratamiento y si dicho paciente responderá a un tratamiento alternativo.
La viabilidad de las células comprendidas en las monocapas puede determinarse/evaluarse/verificarse usando métodos bien conocidos en la técnica. Es decir, el experto conoce métodos para determinar/evaluar/verificar el estadio de una célula, por ejemplo si una célula es viable, está viva, está muerta o está experimentando un proceso que cambia su estadio, por ejemplo, muriendo como en la apoptosis o necrosis. Por consiguiente, en los métodos de la invención pueden usarse marcadores/colorantes conocidos que reconocen/etiquetan específicamente células que están en un estadio particular. Eso incluye colorantes/etiquetas que son selectivos para células con membranas no intactas o colorantes/etiquetas selectivos para la muerte celular avanzada o la apoptosis temprana. Por ejemplo, pueden usarse LIVE/DEAD Fixable Green (ThermoFisher, número de catálogo L-23101), anticuerpos contra citocromo C, determinación del recambio de ADN o la proliferación celular a través del uso de colorantes. A continuación se dan a conocer medios y métodos adicionales, conocidos por el experto, para determinar/evaluar/verificar la viabilidad de las células comprendidas en las monocapas.
Determinar/monitorizar/evaluar/verificar los cambios de viabilidad y/o interacciones célula-célula de la una o más subpoblaciones comprendidas en la monocapa hematopoyética, en particular la monocapa de PBMC o monocapa de células de médula ósea, puede realizarse usando métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, usando microscopía, los cambios pueden determinarse/monitorizarse/evaluarse/verificarse mediante percepción visual. Sin embargo, para aplicaciones de alto rendimiento, se prefiere que se use un método automático, que determina/monitoriza/evalúa/verifica los cambios de viabilidad y/o interacciones célula-célula de las subpoblaciones individuales comprendidas en las monocapas.
Un método de este tipo comprende identificar las subpoblaciones comprendidas en la monocapa, por ejemplo, mediante etiquetas detectables. Luego puede determinarse si las subpoblaciones etiquetadas/detectadas muestran interacciones célula-célula, en las que las interacciones célula-célula pueden incluir contactos directos a través de membranas plasmáticas (tal como se describió anteriormente) o contactos indirectos. Por consiguiente, se introduce un parámetro de distancia entre células etiquetadas, que determina si una célula está en contacto con otra célula o no. Posteriormente, se determina la fracción, es decir, la proporción, de células de una subpoblación que está en contacto con otra célula. El número resultante se compara con lo que se esperaría mediante una función de distribución al azar, es decir, mediante interacciones célula-célula al azar tal como se observan en muestras que muestran aglutinación. Luego puede calcularse una puntuación de interacción, que determina si la interacción es al azar o dirigida. Seguir un protocolo de este tipo antes y después de añadir una o más sustancias de prueba a la monocapa de la invención permite determinar/monitorizar/evaluar/verificar los cambios de interacciones célula-célula debidos al uno o más compuestos de prueba.
Además, la presente divulgación proporciona un método para cultivar PBMC o células de médula ósea que comprende (a) aislar PBMC a partir de una muestra de sangre o células de médula ósea a partir de la médula ósea; y (b) incubar las PBMC o células de médula ósea a una densidad de aproximadamente 100 células por mm2 a aproximadamente 30000 células por mm2.
Por consiguiente, la presente divulgación proporciona métodos para cultivar o incubar células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en forma de una monocapa que comprenden (a) aislar PBMC a partir de una muestra de sangre y (b) incubar las PBMC a una densidad específica. En particular, la densidad es aquella que mantiene el cultivo de monocapa de PBMC durante todo el tiempo de cultivo de la monocapa, por ejemplo, desde la introducción en el dispositivo de cultivo hasta el procesamiento final antes de la obtención de imágenes. Por ejemplo, la densidad máxima es de manera que el número total de células (a) introducidas en el dispositivo de cultivo o (b) que se espera que estén presentes en el dispositivo de cultivo después del cultivo y antes del procesamiento para la obtención de imágenes no supere ese número presente a la densidad máxima para la monocapa de células PBMC tal como se describe en el presente documento. Las densidades de la divulgación son típicamente más bajas que las que normalmente se sembrarían en pocillos para el cultivo de PBMC tal como se conoce en la técnica. Las PBMc pueden introducirse y/o cultivarse para tener, en el dispositivo de cultivo, una densidad de aproximadamente 100 células por mm2 de área de crecimiento a aproximadamente 30000 células por mm2 de área de crecimiento. Más preferiblemente, las PBMC se incuban a una densidad de aproximadamente 500 células por mm2 de área de crecimiento a aproximadamente 20000 células por mm2 de área de crecimiento, de aproximadamente 1000 células por mm2 de área de crecimiento a aproximadamente 10000 células por mm2 de área de crecimiento, de aproximadamente 1000 células por mm2 de área de crecimiento a aproximadamente 5000 células por mm2 de área de crecimiento o de aproximadamente 1000 células por mm2 de área de crecimiento a aproximadamente 3000 células por mm2 de área de crecimiento. Lo más preferiblemente, las PBMC se incuban a una densidad de aproximadamente 2000 células por mm2 de área de crecimiento. Por consiguiente, la presente divulgación proporciona un método para cultivar PBMC que comprende (a) aislar PBMC a partir de una muestra de sangre; y (b) incubar las PBMC a una densidad de aproximadamente 2000 células por mm2.
La presente divulgación proporciona métodos para cultivar o incubar células hematopoyéticas primarias, en particular células de médula ósea, en forma de una monocapa que comprenden (a) aislar células hematopoyéticas primarias, en particular células de médula ósea, a partir de una muestra y (b) incubar las células de médula ósea a una densidad específica. En particular, la densidad es aquella que mantiene el cultivo de monocapa de PBMC durante todo el tiempo de cultivo de la monocapa, por ejemplo, desde la introducción en el dispositivo de cultivo hasta el procesamiento final antes de la obtención de imágenes. Por ejemplo, la densidad máxima es de manera que el número total de células (a) introducidas en el dispositivo de cultivo o (b) que se espera que estén presentes en el dispositivo de cultivo después del cultivo y antes del procesamiento para la obtención de imágenes no supere ese número presente a la densidad máxima para la monocapa de células de médula ósea tal como se describe en el presente documento. Las densidades de la divulgación son típicamente más bajas que las que normalmente se sembrarían en pocillos para el cultivo de células de médula ósea tal como se conoce en la técnica. Las células de médula ósea pueden introducirse y/o cultivarse para tener, en el dispositivo de cultivo, una densidad de aproximadamente 100 células por mm2 de área de crecimiento a aproximadamente 30000 células por mm2 de área de crecimiento. Más preferiblemente, las células de médula ósea se incuban a una densidad de aproximadamente 500 células por mm2 de área de crecimiento a aproximadamente 20000 células por mm2 de área de crecimiento, de aproximadamente 1000 células por mm2 de área de crecimiento a aproximadamente 10000 células por mm2 de área de crecimiento, de aproximadamente 1000 células por mm2 de área de crecimiento a aproximadamente 5000 células por mm2 de área de crecimiento o de aproximadamente 1000 células por mm2 de área de crecimiento a aproximadamente 3000 células por mm2 de área de crecimiento. Lo más preferiblemente, las células de médula ósea se incuban a una densidad de aproximadamente 2000 células por mm2 de área de crecimiento. Por consiguiente, la presente divulgación proporciona un método para cultivar células de médula ósea que comprende (a) aislar células de médula ósea a partir de la médula ósea; y (b) incubar las células de médula ósea a una densidad de aproximadamente 2000 células por mm2.
El término “aproximadamente”, tal como se usa en el presente documento, tendrá el significado de dentro del 10 %, más preferiblemente dentro del 5 %, de un valor o intervalo dado. En particular, en algunas realizaciones, las PBMC de la invención se introducen y/o cultivan para tener, en el dispositivo de cultivo, una densidad de aproximadamente 100, es decir, desde aproximadamente 90 hasta aproximadamente 110, células por mm2 de área de crecimiento a aproximadamente 30000, es decir, desde aproximadamente 27000 hasta aproximadamente 33000, células por mm2 de área de crecimiento. Más preferiblemente, las PBMC se incuban a una densidad de aproximadamente 500, es decir, desde aproximadamente 450 hasta aproximadamente 550, células por mm2 de área de crecimiento a aproximadamente 20000, es decir, desde aproximadamente 18000 hasta aproximadamente 22000, células por mm2 de área de crecimiento, de aproximadamente 1000, es decir, desde aproximadamente 900 hasta aproximadamente 1100, células por mm2 de área de crecimiento a aproximadamente 10000, es decir, desde aproximadamente 9000 hasta aproximadamente 11000, células por mm2 de área de crecimiento, de aproximadamente 1000, es decir, desde aproximadamente 900 hasta aproximadamente 1100, células por mm2 de área de crecimiento a aproximadamente 5000, es decir, desde aproximadamente 4500 hasta aproximadamente 5500, células por mm2 de área de crecimiento o de aproximadamente 1000, es decir, desde aproximadamente 900 hasta aproximadamente 1100, células por mm2 de área de crecimiento a aproximadamente 3000, es decir, desde aproximadamente 2700 hasta aproximadamente 3300, células por mm2 de área de crecimiento. Lo más preferiblemente, las PBMC se incuban a una densidad de aproximadamente 2000, es decir, desde aproximadamente 1800 hasta aproximadamente 2200, células por mm2 de área de crecimiento.
Las células hematopoyéticas primarias, en particular las PBMC y/o células de médula ósea, para su uso según los métodos dados a conocer en el presente documento pueden aislarse a partir de una muestra obtenida de un sujeto sano, por ejemplo, que no se sospecha que padece una enfermedad o que se sospecha que tiene predisposición a una enfermedad, o pueden aislarse a partir de una muestra obtenida de un sujeto que se sabe que padece una enfermedad o que se sospecha que padece una enfermedad. El diagnóstico del estado patológico del sujeto se realiza mediante métodos convencionales realizados de manera rutinaria por los expertos en la técnica, por ejemplo, médicos. Por consiguiente, en algunas realizaciones, la divulgación proporciona una monocapa de células hematopoyéticas primarias, en particular una monocapa de PBMC o monocapa de células de médula ósea, para su uso en un método de diagnóstico para determinar si una enfermedad responderá o responde a un agente terapéutico. Las monocapas de PBMC y monocapas de células de médula ósea descritas en el presente documento permiten la visualización de la respuesta y la actividad celulares (por ejemplo, tanto a nivel macroscópico (por ejemplo, interacciones intercelulares), a nivel subcelular (por ejemplo, cambios subcelulares en la actividad) como a nivel global (por ejemplo, cambios en toda la población) y, por tanto, proporcionan sistemas únicos que permiten la evaluación de la respuesta de PBMC o respuesta de médula ósea, respectivamente, a uno o más agentes terapéuticos. Por tanto, las monocapas de PBMC o monocapas de médula ósea descritas en el presente documento pueden usarse, entre otras cosas, como modelos genéricos que permiten la evaluación de la respuesta terapéutica, o la probabilidad de respuesta terapéutica, por ejemplo, cuando las PBMC/células de médula ósea se aíslan a partir de muestras obtenida de sujetos sanos. La respuesta terapéutica de dos o más monocapas de PBMC o monocapas de células de médula ósea, respectivamente, aisladas a partir de muestras obtenidas de dos o más donantes sanos puede usarse para desarrollar una respuesta normalizada, de nivel inicial o esperada representativa de una población sana, por ejemplo, que no padece o no tiene predisposición a padecer una enfermedad. De manera similar, la respuesta terapéutica de dos o más monocapas de PBMC o monocapas de células de médula ósea, respectivamente, aisladas a partir de muestras obtenidas de dos o más donantes que padecen la misma enfermedad y/o tienen predisposición a padecer la misma enfermedad (o combinaciones de los mismos) puede usarse para desarrollar una respuesta normalizada, de nivel inicial o esperada predictiva representativa de una población que padece la enfermedad o tiene predisposición a padecer la enfermedad. De manera alternativa o adicional, la monocapa de PBMC o monocapa de células de médula ósea descrita en el presente documento puede usarse en un método de diagnóstico para predecir si el donante que proporciona la muestra a partir de la cual se aislaron las PBMC/células de médula ósea padece o tiene predisposición a una enfermedad y/o si el donante de PMBC/donante de células de médula ósea responderá o responde al tratamiento con un agente terapéutico.
El análisis de la respuesta terapéutica de la monocapa de PBMC o monocapa de células de médula ósea puede ser predictivo de la respuesta del estado patológico en el donante de PBMC o donante de células de médula ósea, respectivamente; a este respecto, los métodos proporcionados en diversos aspectos de la divulgación proporcionan ventajas con respecto a los métodos actuales disponibles en la técnica. Por ejemplo, las monocapas de PBMC descritas en el presente documento pueden estar compuestas por células normales, por ejemplo, sanas, y, cuando se aíslan a partir de una muestra obtenida de un donante que tiene una enfermedad o tiene predisposición a una enfermedad, células enfermas, por ejemplo, las células pueden tener por tanto un fenotipo o genotipo anómalo por sí mismas o ser representativas de un estado patológico (por ejemplo, tener una concentración aumentada o disminuida con respecto a las concentraciones esperadas en un individuo sano). Por tanto, las monocapas de PBMC descritas en el presente documento contienen células sanas o una población celular sana que pueden actuar como autocontrol en los métodos proporcionados en el presente documento. Es decir, la respuesta terapéutica de las células con estado patológico puede compararse directamente con la respuesta de las células sanas en la misma muestra, y sin la necesidad de comparación con las respuestas de nivel inicial y/o sin la necesidad de establecer cultivos de control independientes. Las monocapas que comprenden células sanas y, cuando se aíslan a partir de una muestra obtenida de un donante que tiene una enfermedad o tiene predisposición a una enfermedad, células enfermas también pueden usarse para determinar/visualizar/monitorizar las interacciones célula-célula entre células enfermas, células sanas o entre células enfermas y sanas. Las alteraciones de las interacciones célula-célula y/o de la viabilidad de las células después de un tratamiento o cuando se comparan con una referencia pueden ser predictivas de la capacidad de respuesta a un tratamiento o la predisposición a una enfermedad. Una referencia puede ser una segunda muestra tomada del mismo donante o una muestra tomada de un donante de referencia, por ejemplo, un donante sano, un donante que se sabe que tiene o que no tiene una predisposición o un donante enfermo.
La divulgación también se refiere a un método para diagnosticar una enfermedad o la predisposición a una enfermedad en un donante de PBMC y/o para determinar si un sujeto que padece o tiene predisposición a una enfermedad responderá o responde al tratamiento con un agente terapéutico que comprende (a) aislar PBMC a partir de una muestra de sangre obtenida de dicho sujeto/donante; (b) incubar dichas PBMC a una densidad de aproximadamente 100 células por mm2 de área de crecimiento a aproximadamente 30000 células por mm2 de área de crecimiento; (c) poner en contacto dichas PBMC con dicho agente terapéutico; y (d) evaluar la respuesta de las PBMC al agente terapéutico. Preferiblemente, las PBMC se incuban en la etapa (b) a una densidad de aproximadamente 500 células por mm2 de área de crecimiento a aproximadamente 20000 células por mm2 de área de crecimiento, más preferiblemente de aproximadamente 1000 células por mm2 de área de crecimiento a aproximadamente 10000 células por mm2 de área de crecimiento, más preferiblemente de aproximadamente 1000 células por mm2 de área de crecimiento a aproximadamente 5000 células por mm2 de área de crecimiento, más preferiblemente de aproximadamente 1000 células por mm2 de área de crecimiento a aproximadamente 3000 células por mm2 de área de crecimiento. Lo más preferiblemente, las PBMC se incuban a una densidad de aproximadamente 2000 células por mm2 de área de crecimiento. El término “aproximadamente” tendrá el significado de dentro del 10%, más preferiblemente dentro del 5%, de un valor o intervalo dado. En particular, en algunas realizaciones, las PBMC se incuban en la etapa (b) de los métodos para tener, en el dispositivo de cultivo, una densidad de aproximadamente 100, es decir, desde 90 hasta 110, células por mm2 de área de crecimiento a aproximadamente 30000, es decir, de 27000 a 33000, células por mm2 de área de crecimiento. Más preferiblemente, las PBMC se incuban a una densidad de aproximadamente 500, es decir, de 450 a 550, células por mm2 de área de crecimiento a aproximadamente 20000, es decir, de 18000 a 22000, células por mm2 de área de crecimiento, de aproximadamente 1000, es decir, de 900 a 1100, células por mm2 de área de crecimiento a aproximadamente 10000, es decir, de 9000 a 11000, células por mm2 de área de crecimiento, de aproximadamente 1000, es decir, de 900 a 1100, células por mm2 de área de crecimiento a aproximadamente 5000, es decir, de 4500 a 5500, células por mm2 de área de crecimiento o de aproximadamente 1000, es decir, de 900 a 1100, células por mm2 de área de crecimiento a aproximadamente 3000, es decir, de 2700 a 3300, células por mm2 de área de crecimiento. Lo más preferiblemente, las PBMC se incuban a una densidad de aproximadamente 2000, es decir, de 1800 a 2200, células por mm2 de área de crecimiento. Sujeto a la evaluación en la etapa (d), puede alterarse el régimen terapéutico del sujeto. Por ejemplo, puede implementarse un régimen terapéutico o puede aumentarse el régimen terapéutico cuando la respuesta es positiva; alternativamente puede rechazarse un régimen terapéutico propuesto o puede detenerse un régimen actualmente implementado cuando la evaluación demuestra la ausencia o falta de respuesta eficaz.
La divulgación también se refiere a un método para diagnosticar una enfermedad o la predisposición a una enfermedad en un donante de células de médula ósea y/o para determinar si un sujeto que padece o tiene predisposición a una enfermedad responderá o responde al tratamiento con un agente terapéutico que comprende (a) aislar células de médula ósea a partir de dicho sujeto/donante; (b) incubar dichas células de médula ósea a una densidad de aproximadamente 100 células por mm2 de área de crecimiento a aproximadamente 30000 células por mm2 de área de crecimiento; (c) poner en contacto dichas células de médula ósea con dicho agente terapéutico; y (d) evaluar la respuesta de las células de médula ósea al agente terapéutico. Preferiblemente, las células de médula ósea se incuban en la etapa (b) a una densidad de aproximadamente 500 células por mm2 de área de crecimiento a aproximadamente 20000 células por mm2 de área de crecimiento, más preferiblemente de aproximadamente 1000 células por mm2 de área de crecimiento a aproximadamente 10000 células por mm2 de área de crecimiento, más preferiblemente de aproximadamente 1000 células por mm2 de área de crecimiento a aproximadamente 5000 células por mm2 de área de crecimiento, más preferiblemente de aproximadamente 1000 células por mm2 de área de crecimiento a aproximadamente 3000 células por mm2 de área de crecimiento. Lo más preferiblemente, las células de médula ósea se incuban a una densidad de aproximadamente 2000 células por mm2 de área de crecimiento. El término “aproximadamente” tendrá el significado de dentro del 10 %, más preferiblemente dentro del 5 %, de un valor o intervalo dado. En particular, en algunas realizaciones, las células de médula ósea de la invención se incuban en la etapa (b) de los métodos de la invención para tener, en el dispositivo de cultivo, una densidad de aproximadamente 100, es decir, desde 90 hasta 110, células por mm2 de área de crecimiento a aproximadamente 30000, es decir, de 27000 a 33000, células por mm2 de área de crecimiento. Más preferiblemente, las células de médula ósea se incuban a una densidad de aproximadamente 500, es decir, de 450 a 550, células por mm2 de área de crecimiento a aproximadamente 20000, es decir, de 18000 a 22000, células por mm2 de área de crecimiento, de aproximadamente 1000, es decir, de 900 a 1100, células por mm2 de área de crecimiento a aproximadamente 10000, es decir, de 9000 a 11000, células por mm2 de área de crecimiento, de aproximadamente 1000, es decir, de 900 a 1100, células por mm2 de área de crecimiento a aproximadamente 5000, es decir, de 4500 a 5500, células por mm2 de área de crecimiento o de aproximadamente 1000, es decir, de 900 a 1100, células por mm2 de área de crecimiento a aproximadamente 3000, es decir, de 2700 a 3300, células por mm2 de área de crecimiento. Lo más preferiblemente, las células de médula ósea se incuban a una densidad de aproximadamente 2000, es decir, de 1800 a 2200, células por mm2 de área de crecimiento. Sujeto a la evaluación en la etapa (d), puede alterarse el régimen terapéutico del sujeto. Por ejemplo, puede implementarse un régimen terapéutico o puede aumentarse el régimen terapéutico cuando la respuesta es positiva; alternativamente puede rechazarse un régimen terapéutico propuesto o puede detenerse un régimen actualmente implementado cuando la evaluación demuestra la ausencia o falta de respuesta eficaz.
Por tanto, la presente divulgación proporciona métodos que usan muestras hematopoyéticas primarias, de múltiples poblaciones y fisiológicamente relevantes en estudios de obtención de imágenes para determinar con alto rendimiento: 1) los efectos de la quimioterapia sobre los biomarcadores a nivel global basándose en el análisis de células individuales, 2) la capacidad de esta técnica para proporcionar quimioterapia predictivaex vivoen muestras de pacientes y 3) la integración de muchos conjuntos de datos de pacientes a lo largo del tiempo para determinar patrones en las evaluaciones del tratamiento. Tal como conoce el experto, las muestras hematopoyéticas primarias tal como se usan en los métodos de la invención comprenden, entre otras cosas, PBMC y células de médula ósea. Por consiguiente, la monocapa de células hematopoyéticas primarias proporcionada en el presente documento puede comprender PBMC y/o células de médula ósea. Es decir, mientras que los medios y métodos proporcionados en el presente documento se describen para las PBMC, el experto entiende que se proporcionan medios y métodos idénticos para las células de médula ósea. Por consiguiente, en el presente documento se proporcionan métodos para cultivar células de médula ósea, métodos para determinar si un donante de células de médula ósea padece una enfermedad o tiene predisposición a padecer una enfermedad, métodos para diagnosticar una enfermedad o la predisposición a una enfermedad en un donante de médula ósea y métodos para determinar si un sujeto que padece o tiene predisposición a una enfermedad responderá o responde al tratamiento con un agente terapéutico que comprenden el uso de células de médula ósea. Además, para otras células hematopoyéticas, por ejemplo, células de médula ósea, también se dan a conocer métodos para el cribado de fármacos y otros métodos proporcionados en el presente documento para las PBMC.
A este respecto, la médula ósea es el tejido flexible en el interior de los huesos. En los seres humanos, los glóbulos rojos se producen por los núcleos de la médula ósea en las cabezas de los huesos largos en un proceso conocido como hematopoyesis. Pueden realizarse trasplantes de médula ósea para tratar enfermedades graves de la médula ósea, incluyendo determinadas formas de cáncer tales como la leucemia. Además, las células madre de médula ósea se han transformado con éxito en células neurales funcionales y también pueden usarse para tratar enfermedades tales como la enteropatía inflamatoria. Por consiguiente, las células de médula ósea representan una valiosa diana en el tratamiento de diversas enfermedades, por ejemplo, enfermedades cancerosas o enfermedades inflamatorias tales como la enteropatía inflamatoria. Como tal, los métodos proporcionados en el presente documento que usan muestras de médula ósea obtenidas de un donante son muy útiles en la evaluación/determinación de si un donante padece una enfermedad de este tipo o tiene predisposición a padecer una enfermedad. Además, los métodos proporcionados en el presente documento que usan células de médula ósea proporcionan diversas ventajas en el cribado de fármacos de alto rendimiento y similares.
En la actualidad, debido al dogma de requerir células adherentes (macrófagos, HeLa, etc.) para formar una monocapa que puede teñirse y que puede someterse a obtención de imágenes, los grupos de investigación han sido incapaces de implementar técnicas de cribado de células individuales basados en imágenes en muestras primarias de pacientes para la determinación de alto rendimiento de cambios moleculares (de biomarcadores) inducidos por quimioterapia y evaluaciones de viabilidad de blastocistos cancerosos, en particular cuando el estado patológico está representado o reflejado en células no adherentes, por ejemplo, en enfermedades o afecciones sanguíneas tales como linfomas y leucemias. Para resolver este problema, los inventores proporcionan medios y métodos novedosos, así como una metodología y un procedimiento de análisis de imágenes novedosos, a los que se hace referencia en el presente documento como “farmacoscopia”, que permite la visualización de células adherentes y no adherentes en una sola imagen, requiere típicamente tan sólo 1/10 del material necesario por perturbación en comparación con los métodos conocidos en la técnica y maximiza el rendimiento y la velocidad. La farmacoscopia puede proporcionar la misma información recopilada que mediante métodos conocidos, por ejemplo, citometría de flujo, pero proporciona información ventajosa adicional tal como la medición de los fenotipos subcelulares (localización/colocalización de proteínas) y la microentorno celular/relación de vecindad. Además, en determinadas realizaciones, los métodos descritos requieren menos células y, por tanto, menos material del paciente, menos volumen de líquido y prácticamente ninguna intervención humana; de este modo la farmacoscopia aumenta en gran medida el número de perturbaciones moleculares que pueden someterse a prueba en paralelo y brinda evaluaciones más detalladas. Además, sin la necesidad de clasificar las células cancerosas a partir de las poblaciones sanas inherentes, la farmacoscopia puede monitorizar los cambios de biomarcadores mediados por fármacos al tiempo que controla, en paralelo, los efectos farmacéuticos inespecíficos. Estos controles importantes se realizan monitorizando la viabilidad de las células sanas del mismo donante, presentes en el mismo pocillo y en el mismo campo de obtención de imágenes, con respecto al análisis de viabilidad y biomarcadores de las poblaciones celulares seleccionadas como diana.
Mediante la farmacoscopia, el análisis de los cambios de biomarcadores de células individuales y subcelulares inducidos por fármacos, dentro de las muestras de sangre de los pacientes, puede predecir los resultados de la terapia clínica adaptados a los pacientes individuales. La normalización, perfección y disponibilidad de esta tecnología para la investigación básica, así como para los profesionales médicos y las clínicas, es una ventaja para la medicina personalizada, la farmacología predictiva, así como el cribado de fármacos y la evaluación terapéutica, entre otras cosas.
Por consiguiente, y a diferencia de la técnica anterior, la “farmacoscopia”, tal como se proporciona en el presente documento, puede emplearse en una variedad de aplicaciones, por ejemplo, medicina personalizada, programas de cribado de fármacos, cribado de fármacos general, cribado de fármacos personalizado, evaluación de la respuesta a los fármacos, evaluación del tratamiento, verificación de la eficacia de tratamiento, predicción de la respuesta al tratamiento, respuestas (a los fármacos) de la población, y similares. Por tanto, los medios y métodos proporcionados en el presente documento, en particular la “farmacoscopia” basada en la tecnología de monocapas de PBMC, también permiten cribados de fármacos y descubrimientos de fármacos, así como cribados de fármacos y descubrimientos de fármacos personalizados (es decir, relacionados con el sujeto/paciente/individuo). Por ejemplo, en los descubrimientos de fármacos y/o cribados de fármacos generales proporcionados en el presente documento, en particular la “farmacoscopia”, pueden usarse y compararse PBMC de pacientes sanos frente a enfermos. Además, en los medios y métodos proporcionados en el presente documento pueden emplearse muestras de PBMC agrupadas como material de partida para las monocapas de la invención. En el descubrimiento de fármacos personalizado, preferiblemente, se emplean muestras de PBMC individuales de sujetos/individuos/pacientes como material de partida para las monocapas de PBMC de la invención que van a emplearse según la invención. Sin embargo, en este contexto también pueden ser útiles y valiosas las muestras de PBMc agrupadas.
Los estándares actuales del descubrimiento de fármacos para la leucemia y el linfoma implican el uso de líneas celulares cancerosas que están lejos de ser fisiológicamente relevantes, ya que en tales sistemas de modelo no existen rutas de señalización clave a través de subconjuntos de poblaciones de leucocitos. El uso de líneas celulares surge de la dificultad de aumentar de escala y optimizar los sistemas de cribado usando PBMC, especialmente cuando dependen de la obtención de imágenes para la recopilación de datos de alto contenido. En cambio, los métodos proporcionados en el presente documento pueden permitir, en diversas realizaciones, el cribado a gran escala de números mejorados de perturbaciones. Por ejemplo, usando los métodos de la invención, pueden investigarse de manera eficiente y rápida grandes números de perturbaciones usando los grandes números de monocapas de PBMC que pueden derivarse de una sola muestra obtenida de un paciente. Típicamente, puede investigarse el efecto de al menos 1000, al menos 4000, al menos 8000, al menos 12000, al menos 16000, al menos 20000, al menos 24000, al menos 50000, al menos 75000 o hasta 90000 compuestos o más en las múltiples monocapas de PBMC obtenidas de una sola muestra de este tipo. En determinadas realizaciones, las monocapas proporcionadas en el presente documento pueden someterse a obtención de imágenes y analizarse usando simultáneamente múltiples canales de datos de alto contenido. El número de canales de datos disponibles depende únicamente del software obtención de imágenes particular y de las metodologías de tinción disponibles, campo que avanza rápidamente. Las metodologías actualmente disponibles permiten la obtención de imágenes, el procesamiento y el análisis simultáneos de al menos dos canales, y más típicamente 4, 5 u 8 canales de datos de alto contenido.
Los métodos dados a conocer superan el dogma de que las PBMC y/o células de médula ósea (u otras células no adherentes) no pueden usarse en tales métodos. La divulgación proporciona, en algunos aspectos, métodos y dispositivos que permiten la formación de monocapas de PBMC o células de médula ósea que pueden teñirse y que pueden someterse a obtención de imágenes. A este respecto, los inventores hallaron sorprendentemente que incubar una densidad específica de PBMC o células de médula ósea (es decir, por área de crecimiento) conduce a la formación de una monocapa de PBMC o células de médula ósea que puede teñirse y que puede someterse a obtención de imágenes, respectivamente.
Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) son células sanguíneas que tienen un núcleo redondo (a diferencia de un núcleo lobulado). Las PBMC comprenden linfocitos (células B, células T (positivas para CD4 o CD8) y células NK), monocitos (precursores de macrófagos y células dendríticas), macrófagos y células dendríticas. Estas células sanguíneas son un componente crítico en el sistema inmunitaria para combatir la infección y adaptarse a los intrusos. En el contexto de algunas realizaciones de la presente invención, se prefiere usar PBMC purificadas por gradiente de densidad de Ficoll, preferiblemente PBMC humanas, para la creación de la monocapa de PBMC o el dispositivo de cultivo celular que comprende la monocapa de PBMC o para su uso en los métodos proporcionados en algunos aspectos de la presente invención.
Las células PBMC para su uso según los métodos descritos en el presente documento pueden aislarse a partir de sangre completa usando cualquier método adecuado conocido en la técnica o descrito en el presente documento. Por ejemplo, puede usarse el protocolo descrito por Pandaet al.(Panda, S. y Ravindran, B. (2013). Isolation of Human PBMCs. Bio-protocol 3(3): e323). Preferiblemente, para el aislamiento se usa centrifugación por gradiente de densidad. Tal centrifugación por gradiente de densidad separa la sangre completa en componentes separados por capas, por ejemplo, una capa superior de plasma, seguida de una capa de p Bm C y una fracción inferior de células polimorfonucleares (tales como neutrófilos y eosinófilos) y eritrocitos. Las células polimorfonucleares pueden aislarse adicionalmente sometiendo a lisis los glóbulos rojos, es decir, células no nucleadas. Los gradientes de densidad habituales útiles para tal centrifugación incluyen, pero no se limitan a, Ficoll (un polisacárido hidrófilo, por ejemplo, Ficoll®-Paque (GE Healthcare, Upsala, Suecia) y SepMate™ (StemCell Technologies, Inc., Colonia, Alemania).
Las células de médula ósea para su uso según los métodos descritos en el presente documento pueden aislarse a partir de la médula ósea usando cualquier método adecuado conocido en la técnica. En particular, pueden usarse perlas magnéticas para separar las células de médula ósea a partir de otros componentes de tales muestras. Por ejemplo, pueden usarse reactivos de separación celular MACS (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania).
Tal como se conoce en la técnica, tales cultivos aislados pueden contener un pequeño porcentaje de una o más poblaciones de otro tipo celular, por ejemplo, células no nucleadas tales como glóbulos rojos. Las PBMC pueden aislarse y/o purificarse adicionalmente a partir de tales otras poblaciones celulares tal como se conoce en la técnica y/o tal como se describe en el presente documento; por ejemplo, habitualmente se usan métodos de lisis de glóbulos rojos para retirar tales células a partir de las PBMC aisladas. Sin embargo, los métodos de la invención no dependen de métodos de purificación adicionales, y pueden usarse directamente las PBMC aisladas que se aíslan en el presente documento. Por consiguiente, los métodos dados a conocer en el presente documento pueden comprender o no la lisis de glóbulos rojos dentro de la muestra de PBMC aisladas. Sin embargo, cuando están presentes, se cree que la presencia de células no nucleadas, por ejemplo, glóbulos rojos, que generalmente son más pequeñas que las PBMC, se sedimentan sobre la superficie de cultivo debajo de y entre las PBMC, y posiblemente interfieren con la formación de una monocapa adecuada para la obtención de imágenes. Por tanto, se prefiere que la concentración de células no nucleadas, por ejemplo, glóbulos rojos, con respecto a las PMBC esté entre aproximadamente 500 y 1, más preferiblemente entre aproximadamente 250 y 1, lo más preferiblemente entre aproximadamente 100 y 1, siendo la concentración preferente lo más baja posible. Es decir, se prefiere más que la muestra de PBMC aislada según los métodos dados a conocer en el presente documento contenga menos de aproximadamente 100 células no nucleadas, por ejemplo, glóbulos rojos, por PBMC.
En algunas realizaciones de los métodos de la invención, las PBMC se incuban después del aislamiento a una densidad de aproximadamente 100 células por mm2 de área de crecimiento a aproximadamente 30000 células por mm2 de área de crecimiento. Preferiblemente, las PBMC se incuban a una densidad de aproximadamente 500 células por mm2 de área de crecimiento a aproximadamente 20000 células por mm2 de área de crecimiento, de aproximadamente 1000 células por mm2 de área de crecimiento a aproximadamente 10000 células por mm2 de área de crecimiento, de aproximadamente 1000 células por mm2 de área de crecimiento a aproximadamente 5000 células por mm2 de área de crecimiento o de aproximadamente 1000 células por mm2 de área de crecimiento a aproximadamente 3000 células por mm2 de área de crecimiento. Lo más preferiblemente, las PBMC se incuban a una densidad de aproximadamente 2000 células por mm2 de área de crecimiento. El término “aproximadamente” tendrá el significado de dentro del 10%, más preferiblemente dentro del 5%, de un valor o intervalo dado. Por consiguiente, en algunas realizaciones, las PBMC de la invención se incuban usando los métodos de la invención para tener, en el dispositivo de cultivo, una densidad de aproximadamente 100, es decir, desde 90 hasta 110, células por mm2 de área de crecimiento a aproximadamente 30000, es decir, de 27000 a 33000, células por mm2 de área de crecimiento. Más preferiblemente, las PBMC se incuban a una densidad de aproximadamente 500, es decir, de 450 a 550, células por mm2 de área de crecimiento a aproximadamente 20000, es decir, de 18000 a 22000, células por mm2 de área de crecimiento, de aproximadamente 1000, es decir, de 900 a 1100, células por mm2 de área de crecimiento a aproximadamente 10000, es decir, de 9000 a 11000, células por mm2 de área de crecimiento, de aproximadamente 1000, es decir, de 900 a 1100, células por mm2 de área de crecimiento a aproximadamente 5000, es decir, de 4500 a 5500, células por mm2 de área de crecimiento o de aproximadamente 1000, es decir, de 900 a 1100, células por mm2 de área de crecimiento a aproximadamente 3000, es decir, de 2700 a 3300, células por mm2 de área de crecimiento. Lo más preferiblemente, las PBMC se incuban a una densidad de aproximadamente 2000, es decir, de 1800 a 2200, células por mm2 de área de crecimiento.
El número de PBMC puede determinarse usando métodos convencionales conocidos en la técnica. En particular, el número de PBMC puede determinarse mediante recuento celular usando un hemocitómetro o el método descrito por Chanet al.(Chanet al.(2013) J. Immunol. Methods 388 (1-2), 25-32). El número de células de médula ósea también puede determinarse usando métodos bien conocidos en la técnica. En particular, las células de médula ósea pueden determinarse usando recuento celular.
La incubación se lleva a cabo en un medio de cultivo. Un experto en la técnica conoce bien métodos adecuados para mantener la viabilidad de las PBMC o células de médula ósea. Sin embargo, el medio de cultivo que va a usarse en los métodos de la invención no está particularmente limitado. A este respecto, el medio representa líquidos con nutrientes y sustancias necesarias para el cultivo de células. Los medios de cultivo líquidos para cultivar células eucariotas son conocidos por el experto en la técnica (por ejemplo, DMEM, RPMI 1640, etc.). Los medios adecuados pueden seleccionarse en función del tipo de células que van a cultivarse. Por ejemplo, las PBMC o células de médula ósea pueden cultivarse en RPMI 1640 con FCS al 10%. Puede elegirse cualquier medio adecuado, sin embargo, deben seleccionarse componentes del medio que se sabe que no incluyen artificialmente en la respuesta de PBMC y/o la respuesta de células de médula ósea. Los complementos describen sustancias que van a añadirse a los medios de cultivo con el fin de inducir o modificar la función celular (por ejemplo, citocinas, factores de crecimiento y diferenciación, mitógenos, suero). Los complementos son conocidos por el experto en la técnica. Un ejemplo de un suero habitualmente usado con células eucariotas es el suero bovino fetal. Los medios de cultivo pueden complementarse adicionalmente con antibióticos, tales como penicilina, estreptomicina, ciprofloxacina, etc. En una realización, pueden añadirse sustancias de prueba y/o agentes estimuladores al material de células vivas en cada unidad individual por separado. Las sustancias de prueba pueden ser medicamentos o componentes farmacológicos. Los estimuladores pueden comprender cualquiera de las sustancias que respaldan el mantenimiento, el crecimiento o la diferenciación de las células. En una realización particular, los estimuladores son sustancias que actúan sobre las células inmunitarias, por ejemplo, mediante la activación de las células inmunitarias. Los estimuladores para la activación de las células inmunitarias se conocen a partir de la técnica anterior. Tales agentes pueden ser polipéptidos, péptidos o anticuerpos y otros estimuladores. Por ejemplo, OKT-3, interferón-alfa, interferón-beta e interferón-gamma, oligoCPG, mitógenos (por ejemplo, PWM, PHA, LPS), etc. Las sustancias de prueba y los estimuladores pueden inyectarse en el medio de cultivo celular. Preferiblemente, las PBMC se cultivan en RPMI complementado con FBS/<f>C<s>al 10 % (que preferiblemente, pero no necesariamente, tiene índices bajos de endotoxinas para minimizar la activación). Los cultivos de PBMC pueden comprender además suero humano del donante de PBMC.
El término “área de crecimiento”, tal como se usa dentro del significado de la invención, se refiere a la superficie dentro de un dispositivo de cultivo sobre la que reposan las células. La “densidad”, tal como se usa dentro del significado de la invención, es la cantidad de células por unidad de área de la superficie dentro del dispositivo sobre la que reposan las células. El dispositivo de cultivo puede estar fabricado de cualquier material compatible con el cultivo celular, en particular, material para cultivo celular no citotóxico probado. Ejemplos para el material son materiales de plástico, por ejemplo, materiales termoplásticos o duroplásticos. Ejemplos de plásticos adecuados son polietileno, polipropileno, polisulfona, policarbonato, polieteretilcetona (PEEK) o politetrafluoretileno (PTFE). En particular, el dispositivo es adecuado para el cultivo y/o el mantenimiento de PBMC. Los dispositivos de cultivo típicos conocidos en la técnica y de uso en la invención incluyen matraces, platos, placas y placas de múltiples pocillos de cultivo. De particular uso son las placas de múltiples pocillos, que proporcionan la capacidad de mantener por separado múltiples cultivos, por ejemplo, para múltiples perturbaciones, con requisitos mínimos de material, por ejemplo, requisitos mínimos de medios. Los dispositivos de cultivo preferidos incluyen placas de 96 pocillos, placas de 384 pocillos y placas de 1536 pocillos. Tal como se conoce en la técnica en relación con el análisis de cultivos por obtención de imágenes, en particular, obtención de imágenes por fluorescencia, se prefiere particularmente usar placas de paredes negras específicamente diseñadas para la obtención de imágenes que reducen la fluorescencia de fondo/interferencia óptica de fondo con mínima dispersión de luz e interferencia reducida. El dispositivo de cultivo puede esterilizarse.
En particular, el dispositivo es de uso en análisis y sistemas de obtención de imágenes automáticos. Por tanto, se prefiere que el dispositivo/dispositivo de cultivo sea adecuado para su uso en tales sistemas. En un ejemplo no limitativo, el dispositivo de cultivo puede ser translúcido. Los platos y las placas de cultivo de uso para la obtención de imágenes, por ejemplo, obtención de imágenes por fluorescencia, son bien conocidos en la técnica y están disponibles comercialmente. Un ejemplo no limitativo de una placa de cultivo disponible comercialmente para su uso en la práctica de la invención es la placa de 384 pocillos Corning® de fondo transparente con tapa negra tratada con histocultivo (Corning Inc., Massachusetts, EE.UU.) o la placa negra de poliestireno tratada con TC de 384 pocillos Corning® de fondo transparente plano (n.° de producto 3712).
Por consiguiente, la divulgación proporciona un dispositivo, tal como se define en el párrafo inmediatamente anterior o en cualquier otra sección de esta descripción, que comprende una monocapa de PBMC o una monocapa de células de médula ósea. El dispositivo es de particular uso para los métodos de diagnóstico descritos en el presente documento. Por consiguiente, se proporciona el uso del dispositivo proporcionado en el presente documento en los métodos de la presente invención. El dispositivo usado en los métodos de la presente invención puede comprender pocillos de fondo plano. Además, el dispositivo puede comprender pocillos recubiertos, por ejemplo, pocillos recubiertos con polilisina. Aparte del área de crecimiento del dispositivo, por ejemplo, dispositivo de cultivo, plato de cultivo o pocillo, la elección del dispositivo no está particularmente limitada. Sin embargo, el dispositivo es preferiblemente un dispositivo de cultivo conocido en la técnica por ser adecuado para cultivar PBMC o células de médula ósea. Debido a que la invención descrita en el presente documento reside, en algunos aspectos, en la provisión de una monocapa de PBMC, el dispositivo debe permitir el desarrollo y el mantenimiento de una monocapa de este tipo. El dispositivo usado para cultivar las células de médula ósea debe permitir el desarrollo y el mantenimiento de las células de médula ósea y, en particular, permitir la formación de la monocapa de células de médula ósea de la invención. Por consiguiente, no se prefieren los dispositivos de cultivo de fondo redondo ni los dispositivos de cultivo de fondo en V, que permiten y/o fomentan cultivos celulares multicapa, sedimentos celulares y/o agregados celulares. Los más preferidos son los dispositivos de cultivo de fondo plano, por ejemplo, pocillos de fondo plano en una placa de múltiples pocillos, que permiten y fomentan la formación de una monocapa. El dispositivo de cultivo también debe ser adecuado para permitir el cultivo de PBMC al tiempo que mantiene una monocapa. Esto significa que los medios dentro del dispositivo de cultivo deben poder retirarse y/o reemplazarse sin o con únicamente una alteración mínima de la monocapa de células. Por tanto, se prefiere usar dispositivos de cultivo que permitan una capa de medio o disolución de 3 a 15 mm de altura por encima de la superficie de la monocapa. Al mantener una mínima capa de medio de este tipo por encima de las células, los medios pueden retirarse o reemplazarse sin la alteración de la monocapa. Para minimizar la alteración de la monocapa, deben evitarse perturbaciones innecesarias, por ejemplo, vórtices, dentro del medio. Tal como se explicó anteriormente, tales perturbaciones pueden evitarse manteniendo una distancia mínima entre la monocapa y la superficie del medio, de modo que los vórtices y/o las perturbaciones que se desarrollan en la superficie al retirar/reemplazar el medio no penetren hasta las capas de medio más bajas en la superficie de la monocapa. Los aspiradores robóticos u otros aspiradores automáticos, por ejemplo, sistemas de pipeteo, para retirar y reemplazar el medio también son de uso en la práctica de la invención, por ejemplo, para minimizar las perturbaciones del medio. También se prefieren los dispositivos de cultivo rectangulares, por ejemplo, pocillos rectangulares, para minimizar tales efectos alterantes, por ejemplo, los vórtices. El dispositivo de cultivo comprende una pluralidad de unidades de cultivo que comprende, cada una, una cámara de cultivo. No existen limitaciones particulares en cuanto a la disposición de las unidades de cultivo, y las cámaras de cultivo pueden estar en un formato miniaturizado siempre que se mantengan los requisitos para la reducción de las alteraciones del medio tal como se explica en el presente documento. Por ejemplo, tal como se reconoce en la técnica, a los pequeños volúmenes usados en las placas de múltiples pocillos, por ejemplo, placas de 384 pocillos, las perturbaciones del líquido pueden resultar de los cambios en las fuerzas de tensión superficial, por ejemplo, cambios en los meniscos. Estos cambios pueden ser el resultado de, por ejemplo, cambios en el nivel del medio debido a la evaporación, cambios que pueden resultar de causas inesperadas. Por tanto, debe evitarse o minimizarse la evaporación a partir del dispositivo de cultivo celular. Por tanto, la cámara de cultivo puede cerrarse de manera reversible en la parte superior mediante una tapa. La tapa puede ser una cubierta que cubre varias cámaras de cultivo. Alternativamente, las cámaras de cultivo individuales pueden cerrarse individualmente, por ejemplo, mediante cubreobjetos o mediante una película polimérica.
La cámara de cultivo puede ser translúcida para permitir la inspección microscópica de las células presentes en la cámara de cultivo. La cámara de cultivo puede tener un lado inferior ranurado o plano. Este último es particularmente adecuado para permitir la inspección microscópica de las células presentes en la cámara de cultivo y, por tanto, se prefiere. Tal como se conoce en la técnica en relación con el análisis de cultivos por obtención de imágenes, en particular, obtención de imágenes por fluorescencia, se prefiere particularmente usar placas de paredes negras específicamente diseñadas para la obtención de imágenes que reducen la fluorescencia de fondo/interferencia óptica de fondo con mínima dispersión de luz e interferencia reducida.
El dispositivo de cultivo (por ejemplo, incluyendo, pero sin limitarse a, cámara, matraz, plato, placa, placa de múltiples pocillos de cultivo) puede estar o no recubierta y/o tratada para fomentar la adherencia celular. Tal como se conoce en la técnica, los dispositivos de cultivo celular y/o tisular pueden tratarse de modo que una o más superficies del dispositivo fomenten la adherencia celular; de manera similar, tal como también se conoce en la técnica, el dispositivo de cultivo puede estar recubierto de manera alternativa o adicional con moléculas o compuestos que fomentan la adherencia celular a una o más superficies del dispositivo. Sin embargo, los métodos de la invención no se basan en el recubrimiento ni tratamiento del dispositivo de cultivo. Por tanto, la divulgación abarca el uso de dispositivos de cultivo celular que no están tratados ni recubiertos para fomentar la adherencia celular. La divulgación también abarca un dispositivo de cultivo celular que no está tratado ni recubierto para fomentar la adherencia celular que comprende una monocapa de PBMC. En algunas realizaciones, una monocapa de PBMC puede cultivarse sobre un dispositivo que no está tratado ni recubierto para fomentar la adherencia celular (tal como se usa en el presente documento y a lo largo de esta divulgación, el término “cultivada” en referencia a la monocapa de PBMC no implica ningún tiempo mínimo necesario; se considera que las PBMC aisladas a partir de una muestra, colocadas en un dispositivo de cultivo celular y de las que se obtienen imágenes se cultivan sobre o en el dispositivo independientemente del tiempo que las células hayan estado sobre o en el dispositivo).
No obstante, la divulgación no excluye el uso de dispositivos de cultivo que hayan sido tratados y/o recubiertos en una o más superficies para fomentar la adherencia celular. A este respecto, la divulgación también abarca el uso de dispositivos de cultivo celular que están tratados o recubiertos para fomentar la adherencia celular. La divulgación abarca además un dispositivo de cultivo celular que está o ha sido tratado o recubierto para fomentar la adherencia celular que comprende una monocapa de PBMC. La divulgación puede referirse además a una monocapa de PBMC cultivada sobre un dispositivo que está o ha sido tratado o recubierto para fomentar la adherencia celular. Los tratamientos o agentes de recubrimiento que fomentan la adherencia celular son bien conocidos en la técnica. Los ejemplos no limitativos de agentes de adherencia conocidos incluyen, pero no se limitan a, polilisina, fibronectina o gelatina. Además, el dispositivo de cultivo (por ejemplo, incluyendo, pero sin limitarse a, cámara, matraz, plato, placa, placa de múltiples pocillos de cultivo) puede ser adecuado para su uso en un método de ELISA en sándwich en el que, por ejemplo, las PBMC se adhieren a la superficie de la cámara de cultivo mediante moléculas de adherencia unidas a la superficie de la cámara de cultivo.
Se prefiere usar una placa de cultivo. Las placas de cultivo preferiblemente usadas en los métodos de la invención tienen un área de fondo para el crecimiento (“área de crecimiento”) de aproximadamente 0,32 cm2 o menos. Por tanto, las placas de cultivo típicas son placas que tienen 96 pocillos o más.
Se prefiere particularmente usar placas de pocillos con un área de crecimiento de aproximadamente 5,6 mm2 a aproximadamente 10 mm2 por pocillo. Por tanto, cualquier placa de múltiples pocillos que ofrezca una superficie de crecimiento entre estos valores también está abarcada por los métodos de la invención. Además, tal como se dio a conocer anteriormente, el número de PBMC por área de crecimiento está preferiblemente dentro del intervalo de aproximadamente 100 a aproximadamente 30000 PBMC por mm<2>de área de crecimiento, preferiblemente las PBMC se incuban a una densidad de aproximadamente 500 células por mm<2>de área de crecimiento a aproximadamente 20000 células por mm<2>de área de crecimiento, de aproximadamente 1000 células por mm<2>de área de crecimiento a aproximadamente 10000 células por mm<2>de área de crecimiento, de aproximadamente 1000 células por mm<2>de área de crecimiento a aproximadamente 5000 células por mm<2>de área de crecimiento o de aproximadamente 1000 células por mm<2>de área de crecimiento a aproximadamente 3000 células por mm<2>de área de crecimiento. Lo más preferiblemente, las PBMC se incuban a una densidad de aproximadamente 2000 células por mm<2>de área de crecimiento. El término “aproximadamente” tendrá el significado de dentro del 10%, más preferiblemente dentro del 5 %, de un valor o intervalo dado. Por consiguiente, las PBMC de la invención se incuban para tener, en el dispositivo de cultivo, una densidad de aproximadamente 100, es decir, desde 90 hasta 110, células por mm<2>de área de crecimiento a aproximadamente 30000, es decir, de 27000 a 33000, células por mm<2>de área de crecimiento. Más preferiblemente, las PBMC se incuban a una densidad de aproximadamente 500, es decir, de 450 a 550, células por mm<2>de área de crecimiento a aproximadamente 20000, es decir, de 18000 a 22000, células por mm<2>de área de crecimiento, de aproximadamente 1000, es decir, de 900 a 1100, células por mm<2>de área de crecimiento a aproximadamente 10000, es decir, de 9000 a 11000, células por mm<2>de área de crecimiento, de aproximadamente 1000, es decir, de 900 a 1100, células por mm<2>de área de crecimiento a aproximadamente 5000, es decir, de 4500 a 5500, células por mm<2>de área de crecimiento o de aproximadamente 1000, es decir, de 900 a 1100, células por mm<2>de área de crecimiento a aproximadamente 3000, es decir, de 2700 a 3300, células por mm<2>de área de crecimiento. Lo más preferiblemente, las PBMC se incuban a una densidad de aproximadamente 2000, es decir, de 1800 a 2200, células por mm<2>de área de crecimiento.
Por tanto, por ejemplo, en una célula con 10 mm<2>de área de crecimiento, es decir, una placa de 384 pocillos típica, el número de PBMC por pocillo está preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 1000 a aproximadamente 300000 PBMC, más preferiblemente de aproximadamente 5000 a aproximadamente 200000 PBMC, más preferiblemente de aproximadamente 10000 a aproximadamente 100000 PBMC, incluso más preferiblemente de aproximadamente 10000 a aproximadamente 50000 PBMC y lo más preferiblemente es de aproximadamente 20000 PBMC por pocillo. El término “aproximadamente” tendrá el significado de dentro del 10 %, más preferiblemente dentro del 5 %, de un valor o intervalo dado. Por consiguiente, el número de PBMC por pocillo está preferiblemente en el intervalo de 1000, es decir, de 900 a 1100, a 300000, es decir, de 270000 a 330000, más preferiblemente en el intervalo de 5000, es decir, de 4500 a 5500, a 200000, es decir, de 180000 a 220000, más preferiblemente en el intervalo de 10000, es decir, de 9000 a 11000, PBMC a 100000, es decir, de 90000 a 110000, PBMC, lo más preferiblemente en el intervalo de 20000, es decir, de 18000 a 22000, PBMC.
La concentración de las PBMC en disolución antes de la inoculación o siembra de los pocillos no es crítica siempre que la concentración permita la introducción del número correcto de células en el pocillo (es decir, a una densidad de superficie de crecimiento tal como se describe en el presente documento) al tiempo que mantiene la cantidad mínima de capa de líquido/medio también tal como se describe en el presente documento (es decir, una capa de entre 3 y 15 mm por encima de la superficie de la monocapa). Las concentraciones adecuadas de las disoluciones de PBMC para la inoculación incluyen, pero no se limitan a, disoluciones que contienen entre aproximadamente 20 y aproximadamente 6000 PBMC por |il de medio de crecimiento. Se prefiere que la concentración de PBMCs sea de aproximadamente 3000 PBMC por |il de medio de crecimiento, más preferiblemente 1500 PBMC por |il, más preferiblemente 1000 PBMC por |il. Lo más preferido es una concentración de aproximadamente 400 PBMC por |il de medio de crecimiento.
La “incubación” de las PBMC dentro del significado de la presente invención se realiza mediante métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede usarse el método descrito por Pandaet al.(Panda, S. y Ravindran, B. (2013).In vitroCulture of Human PBMCs. Bio-protocol 3(3): e322). Las condiciones de cultivo se definen por los medios de cultivo, los complementos, las matrices, el microentorno técnicamente soportado y el suministro de gas. Las unidades de cultivo individuales pueden proporcionar condiciones comparables. Las condiciones de cultivo pueden elegirse según el tipo de células. Por ejemplo, las células pueden incubarse a 37 °C, el 5% de CO<2>y el 20 % de oxígeno. Puede proporcionarse gas a las células cultivadas a través de una membrana permeable a los gases que sella al menos un lado de la cámara de cultivo.
Preferiblemente, las PBMC se incuban a 37 °C en una incubadora de CO<2>con el 5 % de CO<2>. Se prefiere usar RPMI como medio de cultivo. La duración de la etapa de incubación de los métodos de la invención no está particularmente limitada. Sin embargo, tal como se reconoce en la técnica, las PBMC aisladas representan una población celular frágil que es difícil de mantener a largo plazo; es probable que tiempos de cultivo de más de 36 horas den como resultado el comienzo de la muerte celular. Por consiguiente, cuando deben usarse tiempos de incubación de más de 36 horas, debe monitorizarse la salud del cultivo para garantizar que las monocapas permanecen viables. Típicamente, los cultivos se cultivan durante entre 1 y 24 horas (por ejemplo, durante la noche), lo que garantiza que las monocapas de PBMC permanecen viables. Sin embargo, la formación de una monocapa de PBMC que puede someterse a obtención de imágenes, que puede estar teñida o no según los métodos conocidos en la técnica y/o descritos en el presente documento (que comprende subpoblaciones de PBMC tanto adherentes como no adherentes), se logra típicamente después de una incubación corta, por ejemplo, menos de 1 hora. Cuando las monocapas de PBMC se usan en métodos de la invención que comprenden la evaluación de la respuesta a un agente terapéutico, pueden requerirse periodos de incubación más prolongados para permitir que el agente ejerza su actividad y/o para lograr un efecto observable (sin embargo, las células deben permanecer viables durante esta incubación, y, tal como se explica en el presente documento, estos periodos de incubación más prolongados son típicamente de como máximo 24 horas). Además, la monocapa de PBMC comprende células tanto sanas como enfermas que posteriormente pueden usarse para el análisis adicional.
Con el fin de aumentar la estabilidad de la monocapa de PBMC o monocapa de células de médula ósea después del cultivo para el análisis adicional, la práctica de la invención puede comprender una etapa de fijar las PBMC o células de médula ósea en la que las monocapas se tiñen y/o posteriormente se someten a obtención de imágenes. La fijación puede realizarse mediante medios y métodos bien conocidos por un experto en la técnica. Por ejemplo, la monocapa de PBMC puede fijarse sobre el área de fondo del dispositivo de cultivo usando formaldehído u otros agentes de fijación conocidos. Normalmente, la fijación se realiza inmediatamente antes de la adición del medio para visualizar las células, los componentes celulares y/o las proteínas celulares. Si se desea, puede añadirse un detergente para la permeabilización celular. Un detergente a modo de ejemplo para la permeabilización es Triton X-114. Debido a que la invención, en parte, se basa en una monocapa de PBMC, la fijación y/o permeabilización deben implementarse para no destruir la monocapa. A este respecto, las prácticas descritas para retirar y/o reemplazar el medio también pueden implementarse para su uso de agentes de fijación y/o permeabilizadores. Tal como aprecia el experto, después de la fijación, la monocapa será más robusta, es decir, resistente a la alteración, por ejemplo, frente a las fuerzas líquidas. Por consiguiente, la presente invención proporciona un método para cultivar PBMC o células de médula ósea que comprende (a) aislar PBMC a partir de una muestra de sangre o células de médula ósea a partir de la médula ósea; (b) incubar las PBMC o células de médula ósea a una densidad de aproximadamente 100 células por mm2 a aproximadamente 30000 células por mm2; y (c) fijar dichas PBMC o células de médula ósea.
Los métodos de la invención pueden comprender además una etapa de añadir un colorante antes de la fijación, por ejemplo, un colorante de viabilidad. Esto puede realizarse con el fin de verificar que las células en la monocapa de PBMC o monocapa de células de médula ósea son viables. La adición de un colorante, por ejemplo, un colorante de viabilidad, puede realizarse, por ejemplo, retirando parcialmente el sobrenadante y añadiendo un colorante, por ejemplo, un colorante de viabilidad, que se sabe que es adecuado para visualizar la viabilidad de las PBMC o células de médula ósea. En particular, puede añadirse un colorante de viabilidad que puede distinguir entre PBMC o células de médula ósea vivas y muertas para determinar la viabilidad de las células antes de la fijación y/o permeabilización requeridas para la tinción intracelular con anticuerpos opcional o antes de la eliminación de materiales biopeligrosos usando fijación con formaldehído. La tinción de viabilidad se basa en la incorporación dinámica del colorante como agente de etiquetado en la membrana celular o los orgánulos celulares, o la conversión de un precursor de colorante mediante enzimas celulares o mediante la detección de productos intermedios de la cadena respiratoria, o mediante la intercalación en ADN o ARN. Un experto en la técnica conoce bien que también pueden usarse colorantes adecuados para visualizar PBMC o células de médula ósea fijadas. Los colorantes adecuados y sus protocolos de aplicación son conocidos por el experto y están documentados, por ejemplo, en Molecular Probes Handbook, A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. Como ejemplo no limitativo, el colorante de viabilidad puede añadirse en una mezcla 1:1000 disuelta en una disolución isotónica, por ejemplo, PBS. A este respecto, el colorante LIVE/DEAD Fixable 488 de Invitrogen es particularmente útil. Por consiguiente, la presente invención proporciona un método para cultivar PBMC o células de médula ósea que comprende (a) aislar PBMC a partir de una muestra de sangre o células de médula ósea a partir de la médula ósea; (b) incubar las PBMC o células de médula ósea a una densidad de aproximadamente 100 células por mm2 a aproximadamente 30000 células por mm2; y (c) añadir un colorante de viabilidad a dichas PBMC o células de médula ósea.
Las monocapas pueden someterse a obtención de imágenes según cualquier método conocido en la técnica y/o descrito en el presente documento. El método de obtención de imágenes particular no es crítico y puede decidirse según el conocimiento del experto en la técnica. La obtención de imágenes puede requerir o no el uso de un colorante o tinte, puede comprender obtención de imágenes de componentes tanto teñidos como no teñidos y/o puede comprender obtención de imágenes en condiciones en las que el tinte es visible o no (por ejemplo, obtención de imágenes en campo brillante (en la que un tinte fluorescente no sería visible) y bajo luz UV (en la que un tinte fluorescente sería visible), o combinaciones de las mismas. La obtención de imágenes en condiciones de campo brillante es bien conocida y se usa de manera rutinaria en la técnica, y puede realizarse según métodos convencionales y/o tal como se describe en el presente documento. De manera adicional o alternativa, puede usarse cualquier otra obtención de imágenes sin etiquetas según la invención. Tales métodos sin etiquetas son conocidos e incluyen, por ejemplo, obtención de imágenes PhaseFocus (Phase Focus Ltd, Sheffield, R.U.).
La práctica de la invención también puede comprender la adición de una etiqueta detectable a las monocapas de PBMC (o bien en conexión con métodos sin etiquetas o bien independientemente), etiqueta que puede detectarse usando métodos microscópicos. Las etiquetas detectables pueden etiquetar estructuras, componentes o proteínas celulares discretos tal como se conoce en la técnica. La etiqueta también puede unirse a anticuerpos para etiquetar específicamente y permitir la detección del antígeno de anticuerpo. En una realización preferida, la etiqueta detectable permite la visualización de la etiqueta bajo luz visible o ultravioleta. Por tanto, la etiqueta detectable puede ser fluorescente. En la técnica se conocen una multitud de etiquetas visuales y son adecuadas para la invención. Las etiquetas pueden ser detectable sin ninguna acción adicional, o pueden llegar a ser detectables únicamente después de la realización de una etapa secundaria, por ejemplo, la adición de un sustrato, la exposición a reacciones enzimáticas o la exposición a longitudes de onda de luz específicas.
Las subpoblaciones de PBMC (células diana) o subpoblaciones de células de médula ósea pueden identificarse mediante etiquetas detectables a través de la expresión de uno o más marcadores sobre la superficie de la célula diana o en el interior de la célula. De manera alternativa o adicional, las subpoblaciones de las células PBMC pueden definirse por la falta de expresión de uno o más marcadores sobre la superficie de la célula diana o en el interior de la célula diana. Puede ser deseable someter a prueba la expresión o falta de expresión de uno o más marcadores (por ejemplo, dos marcadores, tres marcadores, cuatro marcadores, etc.) para proporcionar una garantía adicional de que una célula que expresa o que no expresa un marcador es, de hecho, una célula diana, por ejemplo, un miembro de la subclase deseada de célula PBMC. Por ejemplo, un “cóctel” de anticuerpos contra marcadores diferentes puede acoplarse (ya sea directa o indirectamente) a la misma etiqueta o a etiquetas diferentes. Como ejemplo, un cóctel de anticuerpos contra marcadores diferentes puede contener un motivo de unión que se une a la misma etiqueta (por ejemplo, cada uno puede contener un Fc de la misma especie que es reconocido por el mismo anticuerpo secundario, o cada uno puede estar biotinilado y específicamente unido por la misma etiqueta acoplada a avidina). Opcionalmente, pueden utilizarse dos o más anticuerpos o cócteles de anticuerpos diferentes. Preferiblemente, las células se tiñen usando al menos dos etiquetas que pueden distinguirse entre sí, permitiendo de ese modo la identificación de células que expresan al menos dos marcadores diferentes de los tipos de célula diana. Las células también pueden teñirse usando al menos tres, cuatro, cinco o más etiquetas diferentes que pueden distinguirse entre sí, permitiendo de ese modo la detección de células que expresan mayores números de marcadores del tipo de célula diana. Opcionalmente, una célula puede identificarse como célula del tipo diana si expresa un número preseleccionado de marcadores o determinadas combinaciones preseleccionadas de marcadores, o una célula puede identificarse como célula del tipo diana si no expresa un marcador preseleccionado. Además, no es necesario que el/los marcador(es) del tipo de célula diana sea(n) único(s) para las células diana, siempre que permitan la distinción de las células diana de otras células en la población. Las principales poblaciones de células PBMC están representadas por CD11C para las células dendríticas, CD14 para los macrófagos, CD3 (CD4 o CD8 con CD3) para las células T y CD19 para las células B. Aunque los marcadores anteriores se solapan en subconjuntos de estas principales clases de PBMC, la tinción con estos marcadores para identificar las subpoblaciones de PBMC está ampliamente aceptada en el campo. Pueden encontrarse marcadores adicionales adecuados para su uso en los métodos de la presente divulgación en el Manual de marcadores CD (Becton, Dickinson and Co. 2010, CA, EE.UU.). Las principales subpoblaciones de células comprendidas en las células de médula ósea son metamielocitos neutrofílicos, mielocitos neutrofílicos, neutrófilos segmentados, normoblastos y linfocitos.
Se prefiere usar anticuerpos conjugados con etiquetas detectables en la práctica de la invención. Tales anticuerpos permiten la selección como diana de estructuras celulares discretas y, por tanto, pueden usarse cócteles de tales anticuerpos (que portan, cada uno, una etiqueta diferente) para visualizar simultáneamente múltiples dianas/estructuras celulares/componentes celulares. Nuevamente, debido a que la invención se basa en una monocapa de PBMC, debe tenerse cuidado durante la tinción para evitar la alteración de la monocapa. Tal como aprecia el experto, esto es particularmente problemático con el uso de etiquetas basadas en anticuerpos, ya que su uso requiere normalmente una o más etapas de lavado para eliminar la etiqueta no unida que interferiría con una visualización precisa, es decir, daría como resultado una tinción no específica y/o “ruido” de ensayo. Por consiguiente, la invención abarca métodos para la tinción de monocapas de PBMC con una etiqueta detectable, en particular, una etiqueta basada en anticuerpos, que minimiza o elimina los requisitos de lavado después de la tinción. Los métodos de la invención pueden comprender añadir la(s) etiqueta(s) detectable(s) a concentraciones que evitan la generación de señal de ruido en ausencia de lavado, lo que puede determinarse mediante los métodos bien conocidos en la técnica y/o descritos en el presente documento. Por tanto, la invención abarca el uso de anticuerpos etiquetados a concentraciones superiores o inferiores a las recomendadas por los fabricantes de anticuerpo.
Por consiguiente, la presente divulgación proporciona un método para cultivar PBMC o células de médula ósea que comprende (a) aislar PBMC a partir de una muestra de sangre o células de médula ósea a partir de la médula ósea; (b) incubar las PBMC o células de médula ósea a una densidad de aproximadamente 100 células por mm2 a aproximadamente 30000 células por mm2; (c) fijar dichas PBMC o células de médula ósea, y (d) añadir una etiqueta detectable a las PBMC/células de médula ósea fijadas. Preferiblemente, la etiqueta detectable usada en la etapa (d) es un anticuerpo.
Para algunos tipos celulares a modo de ejemplo, las células sólo pueden considerarse positivas para un marcador dado si ese marcador presenta una localización o un patrón característico dentro de la célula. Por ejemplo, una célula puede considerarse “positiva” si un marcador citoesquelético está presente en el citoesqueleto y “negativa” si existe cierta tinción citoplásmica difusa. En un caso de este tipo, las células pueden cultivarse en condiciones adecuadas (por ejemplo, como cultivos adherentes) para establecer la localización o el patrón característico dentro de la célula. Los expertos habituales en la técnica determinan fácilmente las condiciones y el tiempo de cultivo adecuados para el ensamblaje del citoesqueleto (u otros procesos para establecer la organización subcelular) que pueden ser necesarios para la detección robusta de un marcador dado. Además, pueden elegirse fácilmente marcadores que disminuyen o eliminan la necesidad de un cultivo adherente como condición previa para la tinción robusta.
Los colorantes útiles en el mareaje de proteínas son conocidos en la técnica. En general, un colorante es una molécula, un compuesto o una sustancia que puede proporcionar una señal ópticamente detectable, tal como una señal colorimétrica, luminiscente, bioluminiscente, quimioluminiscente, fosforescente o fluorescente. En una realización preferida de la invención, el colorante es un colorante fluorescente. Los ejemplos no limitativos de colorantes, algunos de los cuales están disponibles comercialmente, incluyen colorantes CF (Biotium, Inc.), colorantes Alexa Fluor (Invitrogen), colorantes Dylight (Thermo Fisher), colorantes Cy (GE Healthscience), IRDyes (Li-Cor Biosciences, Inc.) y colorantes HiLyte (Anaspec, Inc.). En algunas realizaciones, las longitudes de onda de excitación y/o emisión del colorante están entre 350 nm y 900 nm, o entre 400 nm y 700 nm, o entre 450-650 nm.
Por ejemplo, la tinción puede comprender usar múltiples etiquetas detectables, por ejemplo, anticuerpos, autoanticuerpos o suero del paciente. Un tinte puede observarse bajo luz visible y bajo luz ultravioleta. Un tinte puede comprender un anticuerpo acoplado directa o indirectamente a un reactivo coloreado o una enzima capaz de producir un reactivo coloreado. Cuando se usan anticuerpos como componente de un tinte, un marcador puede acoplarse directa o indirectamente al anticuerpo. los ejemplos de acoplamiento indirecto incluyen acoplamiento de avidina/biotina, acoplamiento a través de un anticuerpo secundario, y combinaciones de los mismos. Por ejemplo, las células pueden teñirse con un anticuerpo primario que se une a un antígeno específico de diana, y un anticuerpo secundario que se une al anticuerpo primario o a una molécula acoplada al anticuerpo primario puede acoplarse a un marcador detectable. El uso de acoplamiento indirecto puede mejorar la relación de señal con respecto a ruido, por ejemplo, reduciendo la unión de fondo y/o proporcionando una amplificación de señal.
El tinte también puede comprender un anticuerpo primario o secundario acoplado directa o indirectamente (tal como se explicó anteriormente) a una etiqueta fluorescente. La etiqueta fluorescente puede seleccionarse del grupo que consiste en: Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 405, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 514, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 555, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 610, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 635, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680, Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 750 y Alexa Fluor 790, isotiocianato de fluoresceína (FITC), Texas Red, SYBR Green, Dylight Fluors, proteína fluorescente verde (GFP), TRIT (tetrametil rodamina isotiol), NBD (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol), colorante Texas Red, ácido ftálico, ácido tereftálico, ácido isoftálico, Cresyl Fast Violet, Cresyl Blue Violet, Brilliant Cresyl Blue, ácido para-aminobenzoico, eritrosina, biotina, digoxigenina, 5-carboxi-4',5'-dicloro-2',7'-dimetoxifluoresceína, TET (6-carboxi-2',4,7,7'-tetraclorofluoresceína), HEX (6-carboxi-2',4,4',5',7,7'-hexaclorofluoresceína), Joe (6-carboxi-4',5'-dicloro-2',7'-dimetoxifluoresceína) 5-carboxi-2',4',5',7'-tetraclorofluoresceína, 5-carboxifluoresceína, 5-carboxilrrodamina, Tamra (tetrametilrrodamina), 6-carboxirrodamina, Rox (carboxi-X-rodamina), R6G (rodamina 6G), ftalocianinas, azometinas, cianinas (por ejemplo, Cy3, Cy3.5, Cy5), xantinas, succinilfluoresceínas, N,N-dietil-4-(5'-azobenzotriazolil)-fenilamina, aminoacridina y puntos cuánticos.
Realizaciones a modo de ejemplo adicionales del presente método utilizan anticuerpos acoplados directa o indirectamente a una molécula fluorescente, tal como bromuro de etidio, SYBR Green, isotiocianato de fluoresceína (FITC), Dylight Fluors, proteína fluorescente verde (GFP), TRIT (tetrametil rodamina isotiol), NBD (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol), colorante Texas Red, ácido ftálico, ácido tereftálico, ácido isoftálico, Cresyl Fast Violet, Cresyl Blue Violet, Brilliant Cresyl Blue, ácido para-aminobenzoico, eritrosina, biotina, digoxigenina, 5-carboxi-4',5'-dicloro-2',7'-dimetoxifluoresceína, TET (6-carboxi-2',4,7,7'-tetraclorofluoresceína), HEX (6-carboxi-2',4,4',5',7,7'-hexaclorofluoresceína), Joe (6-carboxi-4',5'-dicloro-2',7'-dimetoxifluoresceína) 5-carboxi-2',4',5',7'-tetraclorofluoresceína, 5-carboxifluoresceína, 5-carboxilrrodamina, Tamra (tetrametilrrodamina), 6-carboxirrodamina, Rox (carboxi-X-rodamina), R6G (rodamina 6G), ftalocianinas, azometinas, cianinas (por ejemplo, Cy3, Cy3.5, Cy5), xantinas, succinilfluoresceínas, N,N-dietil-4-(5'-azobenzotriazolil)-fenilamina y aminoacridina. Otras moléculas fluorescentes a modo de ejemplo incluyen puntos cuánticos, que se describen en la bibliografía de patentes [véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 6.207.299, 6.322.901, 6.576.291, 6.649.138 (métodos de modificación superficial en los que agentes de transferencia de polímeros hidrófobos/hidrófilos mixtos se unen a la superficie de los puntos cuánticos), las patentes estadounidenses n.os 6.682.596, 6.815.064 (para cubiertas aleadas o mixtas))], y en la bibliografía técnica [tal como “Alternative Routes toward High Quality CdSe Nanocrystals” (Quet al.,Nano Lett., 1(6):333-337 (2001)]. Los puntos cuánticos que tienen diversas químicas de superficie y características de fluorescencia están disponibles comercialmente de Invitrogen Corporation, Eugene, Oreg., Evident Technologies (Troy, N.Y.), y Quantum Dot Corporation (Hayward, Calif ), entre otros. “Punto cuántico” también incluye puntos cuánticos aleados, tales como ZnSSe, ZnSeTe, ZnSTe, CdSSe, CdSeTe, ScSTe, HgSSe, HgSeTe, HgSTe, ZnCdS, ZnCdSe, ZnCdTe, ZnHgS, ZnHgSe, ZnHgTe, CdHgS, CdHgSe, CdHgTe, ZnCdSSe, ZnHgSSe, ZnCdSeTe, ZnHgSeTe, CdHgSSe, CdHgSeTe, InGaAs, GaAlAs e InGaN. Los puntos cuánticos aleados y los métodos para prepararlos se dan a conocer, por ejemplo, en la publicación de solicitud estadounidense n.° 2005/0012182 y en la publicación PCT WO 2005/001889.
Después de etiquetar la monocapa de PBMC o monocapa de células de médula ósea, el método puede comprender además detectar la señal de la etiqueta detectable. En función de la clase de señal emitida por la etiqueta detectable, el método de detección puede adaptarse de manera apropiada. Se prefiere usar un método de detección adecuado para detectar etiquetas emisoras de luz fluorescente. El método de detección también puede ser automático según los métodos convencionales conocidos en la técnica. Por ejemplo, existen diversos métodos computacionales que permite a un experto en la técnica analizar e interpretar las imágenes de microscopía de las PBMC o células de médula ósea obtenidas mediante farmacos
análisis. Para el análisis de imágenes primario, incluyendo la corrección del sesgo de iluminación en las imágenes de microscopía, la identificación de células individuales a partir de las imágenes de microscopía y la medición de las intensidades y texturas de los marcadores, así como los parámetros de forma y tamaño nucleares y celulares, puede usarse el software de código abierto CellProfiler (por ejemplo, versión 2.1.1). La identificación de células positivas para el marcador (tales como células progenitoras CD34+ o células positivas para el colorante de viabilidad) puede realizarse mediante aprendizaje automático usando el software de código abierto CellProfiler Analyst (por ejemplo, versión 2.0), y las células doble o triplemente positivas pueden identificarse mediante una estrategia de activación secuencial. Las perspectivas generales de la placa para el análisis adicional y la selección de resultados positivos también pueden crearse usando CellProfiler Analyst.
El paquete cellHTS en Bioconductor (por ejemplo, versión 2.14), o Pipeline Pilot (por ejemplo, versión 9.0; Accelrys), pueden usarse ambos para el análisis de datos después del análisis de imágenes primario, incluyendo la normalización del efecto de la placa, la normalización basada en el control y la selección de resultados positivos. También pueden usarse sistemas de microscopía automáticos comerciales en la práctica de la invención, por ejemplo, el microscopio automático PerkinElmer Operetta (PerkinElmer Technologies GmbH & Co. KG, Walluf, Alemania), sistemas que pueden incluir el software de análisis de imágenes correspondientes, por ejemplo, el software Harmony de PerkinElmer (por ejemplo, versión 3.1.1). Tales sistemas automáticos y/o comerciales pueden usarse para realizar el análisis de imágenes primario, la selección de células positivas y la selección de resultados positivos a partir de las imágenes microscópicas según los métodos de la invención.
La invención proporciona además un usoin vitrode una monocapa de PBMC producidain vitropara determinar si el donante de PBMC padece una enfermedad.
Una ventaja sorprendente de la monocapa de PBMC y los métodos que usan la misma dados a conocer es que en la monocapa están comprendidas PBMC tanto sanas como enfermas. Las “PBMC enfermas” dentro del significado de la invención se refieren a PBMC que están afectadas por una enfermedad y, por tanto, pueden distinguirse de las PBMC sanas. En particular, en algunas realizaciones, una PBMC enferma mostrará expresión diferencial de moléculas marcadoras que permitirán su detección específica usando los métodos de la presente invención. Por ejemplo, una PBMC enferma puede mostrar expresión de marcadores de cáncer conocidos, en particular marcadores para linfoma o leucemia, que permiten su detección y discriminación a partir de las PBMC sanas.
La invención proporciona además un usoin vitrode una monocapa de células de médula ósea producidain vitropara determinar si el donante de células de médula ósea padece una enfermedad.
En algunas realizaciones, además de PBMC sanas y enfermas o células de médula ósea sanas y enfermas, en las monocapas están presentas células tanto adherentes como no adherentes. Por tanto, los métodos de la invención pueden proporcionar ventajas únicas con respecto a los métodos conocidos en la técnica, al permitir obtener una visión general total del estado real con respecto a la presencia o ausencia de subpoblaciones de PBMC o células de médula ósea y/o la distribución de diferentes subpoblaciones en la sangre del donante de PBMC o donante de células de médula ósea. En cambio, los métodos conocidos en la técnica se basan en el aislamiento previo de las subpoblaciones, descuidando de ese modo la información contenida en las interacciones célula-célula entre las diferentes subpoblaciones. Por tanto, la monocapa de PBMC y, por ejemplo, la producida mediante los métodos de la invención, puede usarse en algunas realizaciones para determinar si el donante de PBMC padece una enfermedad al añadir una etiqueta detectable a la monocapa de PBMC que es específica para un tipo celular indicativo de la presencia de una enfermedad o al determinar proporciones alteradas entre las diversas subpoblaciones de las células PBMC, proporciones que son indicativas de la enfermedad. Por consiguiente, en algunos aspectos, la presente invención también proporciona un método para diagnosticar una enfermedad en un donante de PBMC que comprende las PBMC cultivadas según cualquiera de los métodos de la invención. Por tanto, la monocapa de PBMC y los métodos de la invención también pueden usarse para seguir el transcurso de una enfermedad durante el tratamiento de una enfermedad o en ausencia de tratamiento.
Por tanto, la monocapa de células de médula ósea y, por ejemplo, la producida mediante los métodos de la invención, puede usarse en algunas realizaciones para determinar si el donante de células de médula ósea padece una enfermedad o tiene predisposición a una enfermedad al añadir una etiqueta detectable a la monocapa de células de médula ósea que es específica para un tipo celular indicativo de la presencia de una enfermedad o al determinar proporciones alteradas entre las diversas subpoblaciones de las células de médula ósea, proporciones que son indicativas de la enfermedad. Por consiguiente, en algunos aspectos, la presente invención también proporciona un método para diagnosticar una enfermedad en un donante de células de médula ósea que comprende las células de médula ósea cultivadas según cualquiera de los métodos de la invención. Por tanto, la monocapa de células de médula ósea y los métodos de la invención también pueden usarse para seguir el transcurso de una enfermedad durante el tratamiento de una enfermedad o en ausencia de tratamiento.
El método incluye aislar las PBMC o células de médula ósea a partir de un sujeto tratado previa o actualmente de una enfermedad inmunomediada, estimular las PBMC o células de médula ósea, identificar las subpoblaciones de PBMC o células de médula ósea, comparar los datos de las subpoblaciones de PBMC o subpoblaciones de células de médula ósea con la respuesta de un sujeto al producto terapéutico y seleccionar un perfil de marcadores característico relacionado con una respuesta positiva al producto terapéutico, monitorizando de ese modo el transcurso de la terapia.
Las enfermedades inmunomediadas pueden dividirse en varias categorías incluyendo enfermedades por inmunodeficiencia, enfermedades autoinmunitarias y enfermedades por hipersensibilidad. Las enfermedades por inmunodeficiencia se producen cuando parte del sistema inmunitario deja de funcionar de manera apropiada. Las enfermedades autoinmunitarias son el resultado de que el sistema inmunitario ataca al cuerpo en lugar de a los patógenos. Las enfermedades por hipersensibilidad se producen cuando el sistema inmunitario reacciona de forma excesiva y da como resultado el daño al cuerpo.
La enfermedad que va a diagnosticarse usando la monocapa de PBMC o la monocapa de células de médula ósea o los métodos de la invención no está particularmente limitada siempre que pueda diagnosticarse usando las PBMC o células de médula ósea, respectivamente, es decir, un sujeto que tiene la enfermedad que va a diagnosticarse muestra un patrón celular alterado de las PBMC o células de médula ósea que puede estar asociado con la enfermedad, por ejemplo, proporciones de subpoblaciones de PBMC o subpoblaciones de células de médula ósea que están alteradas con respecto a las esperadas en un donante sano, en la que las enfermedades que pueden diagnosticarse usando las monocapas y/o los métodos de la invención son neoplasias malignas hematológicas y/o una neoplasia maligna de tejido mieloide y/o linfoide. En particular, las enfermedades que pueden diagnosticarse y/o predecirse mediante la monocapa de PBMC o monocapa de células de médula ósea de la invención y los métodos de la invención incluyen, pero no se limitan a, trastornos mieloproliferativos (o cánceres hemáticos generales), trastornos inflamatorios, infecciones por virus latente, trastornos del crecimiento celular, trastornos de la quimiotaxia celular, trastornos metabólicos, trastornos autoinmunitarios (por ejemplo, tinción con ligando o suero del paciente propio para anticuerpos clonales o reconocimiento de autoantígenos). Además, la monocapa de PBMC y los métodos de la invención pueden usarse para diagnosticar leucemia (crónica y aguda), linfoma (de células B maduras, de células T maduras y de células NK, linfoma de Hodgkin), VIH, gota, colapso cardiovascular y similares.
La presente divulgación proporciona además métodos para determinar si un sujeto que padece o tiene predisposición a una enfermedad responderá o responde al tratamiento con un agente terapéutico. Según la presente divulgación, el método puede comprender las etapas de (a) aislar las PBMC a partir de una muestra de sangre obtenida de dicho sujeto; (b) incubar dichas PBMC a una densidad de aproximadamente 100 células por mm2 a aproximadamente 30000 células por mm2; (c) poner en contacto dichas PBMc con dicho agente terapéutico; y (d) evaluar la respuesta de las PBMC al agente terapéutico. Preferiblemente, las PBMC se incuban en la etapa (b) a una densidad de aproximadamente 500 células por mm2 de área de crecimiento a aproximadamente 20000 células por mm2 de área de crecimiento, de aproximadamente 1000 células por mm2 de área de crecimiento a aproximadamente 10000 células por mm2 de área de crecimiento, de aproximadamente 1000 células por mm2 de área de crecimiento a aproximadamente 5000 células por mm2 de área de crecimiento o de aproximadamente 1000 células por mm2 de área de crecimiento a aproximadamente 3000 células por mm2 de área de crecimiento. Lo más preferiblemente, las PBMC se incuban a una densidad de aproximadamente 2000 células por mm2 de área de crecimiento. El término “aproximadamente” tendrá el significado de dentro del 10%, más preferiblemente dentro del 5 %, de un valor o intervalo dado. Por consiguiente, en algunas realizaciones, las PBMC se incuban en los métodos de la invención para tener, en el dispositivo de cultivo, una densidad de aproximadamente 100, es decir, desde 90 hasta 110, células por mm2 de área de crecimiento a aproximadamente 30000, es decir, de 27000 a 33000, células por mm2 de área de crecimiento. Más preferiblemente, las PBMC se incuban a una densidad de aproximadamente 500, es decir, de 450 a 550, células por mm2 de área de crecimiento a aproximadamente 20000, es decir, de 18000 a 22000, células por mm2 de área de crecimiento, de aproximadamente 1000, es decir, de 900 a 1100, células por mm2 de área de crecimiento a aproximadamente 10000, es decir, de 9000 a 11000, células por mm2 de área de crecimiento, de aproximadamente 1000, es decir, de 900 a 1100, células por mm2 de área de crecimiento a aproximadamente 5000, es decir, de 4500 a 5500, células por mm2 de área de crecimiento o de aproximadamente 1000, es decir, de 900 a 1100, células por mm2 de área de crecimiento a aproximadamente 3000, es decir, de 2700 a 3300, células por mm2 de área de crecimiento. Lo más preferiblemente, las PBMC se incuban a una densidad de aproximadamente 2000, es decir, de 1800 a 2200, células por mm2 de área de crecimiento.
“Tratamiento” o “tratar” se refiere tanto a tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas, en el que el objetivo es prevenir, mejorar o ralentizar (reducir) el trastorno o estado patológico objetivo, o uno o más de los síntomas asociados con el mismo. De manera similar, “responde a” o “responde” y términos análogos se refieren a indicaciones de que se previene, mejora o reduce el estado patológico objetivo, o uno o más de los síntomas asociados con el mismo. Los términos también se usan en el presente documento para indicar el retardo de la aparición de, la inhibición (por ejemplo, reducción o detención del crecimiento de), el alivio de los efectos de o la prolongación de la vida de un paciente que padece una enfermedad, en particular una enfermedad mieloproliferativa, o indicaciones de que se han logrado tales marcadores. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen aquellos diagnosticados con el trastorno, aquellos que se sospecha que tienen el trastorno, aquellos con predisposición a tener el trastorno, así como aquellos en los que debe prevenirse el trastorno. Por tanto, puede haberse diagnosticado que el mamífero que va a tratarse en el presente documento tiene el trastorno o puede tener predisposición o ser susceptible al trastorno.
“Respuesta” o “que responde” se refiere a una PBMC o a un sujeto que muestra al menos una característica alterada después del tratamiento. La característica alterada del sujeto puede ser la mejora o ralentización del trastorno o estado patológico objetivo.
Tal como se usa en el presente documento, los términos “prevenir”, “que previene” y “prevención” se refieren a la prevención de la aparición y/o recaída o inicio de uno o más de los síntomas de una enfermedad cancerosa en un sujeto que resulta de la administración de un agente profiláctico o terapéutico.
Los medios y métodos proporcionados en el presente documento se describen para las células hematopoyéticas primarias. Tal como entiende el experto, las células hematopoyéticas primarias comprenden, entre otras cosas, PBMC y células de médula ósea. Por consiguiente, los medios y métodos proporcionados en el presente documento, que se describen para las PBMC, también se dan a conocer para las células de médula ósea.
A este respecto, la presente invención puede ofrecer, en diversas realizaciones, múltiples ventajas con respecto a los métodos de la técnica anterior. En particular, las muestras de sangre se tratan preferiblemente poco después del aislamiento, lo que tiene varias ventajas: la especificidad del fármaco y la toxicidad a, por ejemplo, las células cancerosas se comparan directamente con las de las células sanas del paciente, y pueden medirse aspectos complejos de las respuestas a los fármacos que surgen de las interacciones célula-célula presentes en la sangre humana. Este análisisex vivoes un fuerte predictor de la respuesta clínica del paciente, especialmente en acervos génicos complejos, mejorando los beneficios terapéuticos a largo plazo. Por ejemplo, pueden evaluarse las respuestas a los fármacos de los pacientes con neoplasias malignas mieloproliferativas (MPN) a tratamientos individuales y combinatorios de agentes antineoplásicos actuales y prometedores. Además, mediante los métodos de la invención pueden evaluarse la medición simultánea de biomarcadores específicos de MPN, tales como la expresión y la localización de pSTAT5, y la viabilidad de progenitores CD34+ en la periferia. Además, es posible que los futuros pacientes tengan sus respuestas a los fármacos caracterizadas en varios estadios durante el transcurso de una enfermedad. Por consiguiente, en algunos aspectos, la presente divulgación también proporciona una monocapa de PMBC para su uso en un método de diagnóstico para determinar si un sujeto que padece o tiene predisposición a una enfermedad responderá o responde al tratamiento con un agente terapéutico.
Los “agentes terapéuticos” dentro del significado de la divulgación son moléculas que incluyen, sin limitación, polipéptidos, péptidos, glicoproteínas, ácidos nucleicos, fármacos sintéticos y naturales, peptoides, polienos, macrociclos, glicósidos, terpenos, terpenoides, compuestos alifáticos y aromáticos, y sus derivados. En una realización preferida, el agente terapéutico es un compuesto químico tal como un fármaco sintético y natural. En otra realización preferida, el agente terapéutico produce la mejora y/o cura de una enfermedad, un trastorno, una patología y/o los síntomas asociados con los mismos. Los polímeros pueden encapsular uno o más agentes terapéuticos.
Los agentes terapéuticos adecuados incluyen, sin limitación, aquellos presentados en The Pharmacological Basis of Therapeutics de Goodman y Oilman (por ejemplo, 9a ed.) o The Merck Index (por ejemplo, 12a ed.). Los géneros de los agentes terapéuticos incluyen, sin limitación, fármacos que influyen en las respuestas inflamatorias, fármacos que afectan a la composición de los fluidos corporales, fármacos que afectan al metabolismo de electrolitos, agentes quimioterápicos (por ejemplo, para enfermedades hiperproliferativas, particularmente cáncer, para infecciones parasitarias y para enfermedades microbianas), agentes antineoplásicos, agentes inmunodepresores, fármacos que afectan a la sangre y a los órganos hematopoyéticos, hormonas y antagonistas hormonales , vitaminas y nutrientes, vacunas, oligonucleótidos y terapias génicas. Se entenderá que las composiciones que comprenden combinaciones, por ejemplo, mezclas o mixturas, de dos o más agentes activos, tal como dos fármacos, también están abarcadas por la invención.
En una realización, el agente terapéutico puede ser un fármaco o profármaco, un anticuerpo o una vacuna. El método de la divulgación puede usarse para evaluar si la administración de un agente terapéutico a un paciente desencadena una respuesta al agente terapéutico, o a un componente de un vehículo de administración, excipiente, portador, etc., administrado con el agente terapéutico.
La naturaleza precisa del agente terapéutico no limita la invención. En realizaciones no limitativas, el método de la divulgación puede usarse para evaluar la respuesta a moléculas pequeñas sintéticas, sustancias que se producen de manera natural, agentes biológicos que se producen de manera natural o que se producen de manera sintética, o cualquier combinación de dos o más de los anteriores, opcionalmente en combinación con excipientes, portadores o vehículos de administración.
El término “diagnóstico” (junto con las variaciones gramaticales del mismo tales como “diagnosticar” o “de diagnóstico”) se refiere a la identificación de una afección, una enfermedad o un estado molecular o patológico, tal como la identificación de cáncer, o se refiere a la identificación de un paciente con cáncer que puede beneficiarse de un régimen de tratamiento particular. El término “pronóstico” (y las variaciones gramaticales del mismo tales como “pronosticar” o “de pronóstico”) se refiere a la predicción de la probabilidad de beneficiarse de un tratamiento, tal como una terapia contra el cáncer.
El término “predicción” o “predecir” se usa en el presente documento para referirse a la probabilidad de que un paciente responda o bien de manera favorable o bien de manera desfavorable a un agente terapéutico particular. En una realización, predicción o predecir se refiere al alcance de esas respuestas. En una realización, predicción o predecir se refiere a si un paciente sobrevive o mejora y/o a la probabilidad de que un paciente sobreviva o mejore tras el tratamiento, por ejemplo, el tratamiento con un agente terapéutico particular, y durante un determinado periodo de tiempo sin progresión de la enfermedad.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende habitualmente un experto habitual en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o las pruebas de la presente invención, a continuación se describen métodos y materiales adecuados. En caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos son ilustrativos únicamente y no se pretende que sean limitativos.
Los métodos y las técnicas generales descritos en el presente documento pueden realizarse según métodos convencionales bien conocidos en la técnica y tal como se describe en diversas referencias generales y más específicas que se citan y comentan a lo largo de la presente memoria descriptiva, a menos que se indique lo contrario. Véanse, por ejemplo, Sambrooket al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) y Ausubelet al.,Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), y Harlow y Lane Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990).
Aunque en los dibujos y la descripción anterior se ilustran y describen en detalle aspectos de la invención, tal ilustración y descripción deben considerarse ilustrativas o a modo de ejemplo y no restrictivas.
Además, en las reivindicaciones, la expresión “que comprende” no excluye otros elementos o etapas, y el artículo indefinido “un” o “una” no excluye una pluralidad. Una sola unidad puede cumplir las funciones de varias características recitadas en las reivindicaciones. Los términos “esencialmente”, “aproximadamente”, “de manera aproximada” y similares, particularmente en relación con un atributo o un valor, también definen exactamente el atributo o exactamente el valor, respectivamente. Cualquier signo de referencia en las reivindicaciones no debe interpretarse como limitativo del alcance.
La presente invención también se ilustra en algunos aspectos mediante las siguientes figuras.
Figura 1: Ejemplo de imagen a tres colores, 10x, de la monocapa de PBMC a partir de una placa de 384 pocillos, dividida en tres canales.
Figura 2: Monitorización de población de PBMC de un donante tal como se analiza mediante (A) citometría de flujo o (B) citometría de imagen.
Figura 3: Resultados de cribado de viabilidad a gran escala en PBMC; compuestos clasificados según la reducción del número de células y la “puntuación de especificidad”. Los compuestos resaltados son tratamientos antineoplásicos candidatos clave.
Figura 4: Gráficos de barras que muestran la citotoxicidad específica de población celular inducida por fármaco de dos fármacos antineoplásicos diferentes.
Figura 5: Gráfico cromático de los mejores HDACi y su especificidad de población.
Figura 6: Resultados de cribado de quimioterapia personalizada a gran escala en PBMC de un paciente que padece un trastorno mieloproliferativo. Compuestos representados gráficamente frente al porcentaje de células positivas viables que expresan dos biomarcadores específicos de MPN. Los compuestos resaltados son tratamientos antineoplásicos clave.
Figura 7: Curva de titulación del mejor fármaco anti-MPN novedoso en ensayo clínico actualmente para la terapia de combinación con un inhibidor de JAK, a la que está sometiéndose este paciente en la actualidad. La curva de titulación del fármaco inferior se compara directamente con la de DMSO a nivel de célula individual controlado con células sanas que no expresan CD34.
Figura 8: Ilustración y diagramas de flujo de realizaciones y realizaciones específicas como tinción ejemplificada (anti-CD3/CD19; CD14/CD11; pSTAT5/CD34) y resultados esquemáticos correspondientes para el descubrimiento de fármacos personalizado ejemplificado.
Figura 9: Resultados de farmacoscopia de cuatro pacientes. Estos cuatro pacientes padecen mielofibrosis primaria temprana (MFP) o mielofibrosis primaria que se han cribado mediante 265 compuestos únicos aprobados por la FDA. Los compuestos resaltados para cada paciente reducen el porcentaje de células viables que expresan biomarcadores que pueden monitorizarse (o bien CD34 o bien pSTAT5, indicativos de MFP) con respecto a compuestos de control con DMSO. Se resaltan fármacos antineoplásicos conocidos, que se conoce en la técnica que son adecuados para el tratamiento de cáncer hemático.
Figura 10: Resultados para dos pacientes con MFP temprana o MFP, ambos tratados con el inhibidor de JAK ruxolitinib en el momento de la farmacoscopia. El mejor fármaco o el fármaco altamente enriquecido es la azacitidina, que se encuentra en ensayos clínicos para el tratamiento de enfermedades mieloproliferativas en combinación con ruxolitinib. Además, el médico supervisor de la farmacoscopia ha usado azacitidina para tratar a dos pacientes con mielofibrosis primaria (MFP), que ya estaban tomando ruxolitinib (nombre comercial: Jakavi), que están respondiendo bien. En conclusión, estos datos que se presentan en la figura 10 confirman el uso exitoso de los aspectos de los métodos de la presente invención basándose en la tecnología de monocapa de PBMC/farmacoscopia. Pueden generarse datos e información valiosos y pueden obtenerse y proporcionarse ventajas técnicas así como médicas. En particular, estos datos confirman los resultados que se obtienen en paralelo en ensayos clínicos laboriosos y que se obtienen a partir de datos de respuesta del paciente existentes (control). La tecnología de monocapa de p Bm C óptica/con capacidad de obtención de imágenes/con capacidad de tinción, tal como se proporciona en el presente documento, confirma el uso exitoso de un tratamiento combinatorio predicho tal como se usa actualmente en ensayos clínicos. Por consiguiente, en algunas realizaciones, la tecnología de monocapa de PBMC óptica/con capacidad de obtención de imágenes/con capacidad de tinción de la presente invención puede ser altamente predictiva en cribados de fármacos y/o métodos de protocolo de tratamiento personalizados, tal como se ejemplifica en el presente documento para el tratamiento de MFP con azacitidina y ruxolitinib.
Figura 11: Diagrama de flujo general para los métodos proporcionados en el presente documento (“farmacoscopia”). El método proporcionado en el presente documento es de manera que se extrae sangre o médula ósea nueva de un individuo y se purifican las células mononucleares a partir de la muestra mediante un gradiente, o se recogen muestras congeladas a partir de la purificación previa. Las células se diluyen hasta la densidad apropiada en medio de cultivo celular y se siembran en placas de 384 pocillos que contienen los fármacos. Las células se incuban a 37 °C con el 5 % de CO2 durante el tiempo indicado. Luego se añade el colorante de viabilidad, si es necesario, y luego se fijan y permeabilizan las células. Luego se añaden los anticuerpos conjugados con marcadores fluorescentes, junto con DAPI, para la detección nuclear. Se obtienen imágenes de las placas en un microscopio automático.
Figura 12: Datos de pacientes. (A) Viabilidad de células CD34+ o pSTAT5+ de un paciente con mielofibrosis primaria después de la incubación con 265 compuestos diversos aprobados por la FDA. Las líneas de trazos de color gris representan los promedios de población; los compuestos resaltados tienen propiedades antineoplásicas conocidas. (B) Viabilidad de todas las células CD34+ después del tratamiento con (C) azacitidina o (D) DMSO; la esquina inferior derecha de los gráficos son las células progenitoras hematopoyéticas viables restantes después del tratamiento. (C) PBMC viables totales sólo después del tratamiento con cada fármaco cribado en (B), que muestran que, sin el uso de farmacoscopia, el mejor fármaco no es el mismo independientemente del análisis de células individuales. (D) El paciente de (A) en tratamiento de combinación identificado mediante farmacoscopia (izquierda) o tratamiento convencional inicial (derecha).
Figura 13: Método computacional. (Izquierda) Imagen de ejemplo con tipos de células vecinas en círculos. (Centro) Creación de una puntuación de interacción para determinar los contactos célula-célula y las vecindades celulares. (Derecha) Ejemplo de uso de puntuación de interacción después de la activación de PBMC con VSV o bien solo o bien con un anticuerpo bloqueante contra CMH-II. CMH-II bloquea la relación entre células positivas para CD11C y CD3.
Figura 14: Imágenes de monocapas de células de médula ósea. Tinción nuclear de médula ósea humana y tinción del estado de viabilidad a un aumento de 10x (figura 14A) y 20x (figura 14B). El recuadro en las imágenes indica ejemplos de células vivas dentro de la monocapa que se produce mediante este método.
Figura 15: Imágenes de muestras de células preparadas usando los métodos de la técnica anterior. La figura A (izquierda) muestra la monocapa cuando se añaden fuerzas centrífugas adicionales a la monocapa: pérdida de interacciones célula-célula que se producen de manera natural a medida que se fuerzan la adherencia y la relación con otras células. En la parte derecha se presenta el método en este caso en el que las células se encuentran únicamente bajo la fuerza natural de la gravedad que se distribuye por el menisco. La figura B representa el método en este caso (SLP) frente al método en Douglaset al.en la que se añaden 1x106 células a cada pocillo, que es 50x mayor de lo recomendado por el protocolo presentado en el presente documento. Las flechas apuntan hacia la aglutinación en el pocillo sobrecargado, que no existen en SLP ya que no están sobrecargados, y las cabezas de flecha apuntan hacia las características morfológicas mostradas por las células que no están presentes en el pocillo sobreactuado y, por tanto, no pueden monitorizarse usando ningún método excepto el presentado en este caso. (C) Representa el protocolo en Katrien Princenet al.en comparación con el método de la invención en el que se le aplica una ligera rotación a la placa y se usan 5x105 células/pocillo. La rotación, incluso a una menor densidad celular, crea aglutinación dentro del pocillo que no se produce en el presente método, y además no pueden medirse las relaciones célula-célula debido a la fuerza externa adicional.
Figura 16: Comparación de poblaciones usando el método previo (citometría de flujo) y el método proporcionado en el presente documento en cada pocillo. Las células dentro de la monocapa siguen el mismo patrón fisiológicamente relevante tal como se mide mediante citometría de flujo y análisis de imágenes de la monocapa. Estos números son convencionales para adultos humanos y se usan habitualmente con fines de diagnóstico.
Figura 17: La sobrecarga del pocillo crea una monocapa no fisiológicamente relevante. Las células sembradas tal como se describe en Douglaset al.(2x106/pocillo) aumentan el número de células adherentes, bloqueando así la colocación de células no adherentes (en este caso: células T). Tras la retirada de los medios, las células no adherentes se retiran del pocilio y no se depositan, dejando así al pocilio con un número desproporcionado de células (fila superior, no hay células T presentes donde habitualmente las células T constituyen >75 % de la monocapa y también están presentes como el 75 % de la población de PBMC dentro de la sangre periférica de adulto sano). En la parte inferior, se usa el método SLP que conserva números proporcionados de células T.
Se describen adicionalmente aspectos de la presente invención a modo de los siguientes ejemplos ilustrativos no limitativos que proporcionan una mejor comprensión de las realizaciones de la presente invención y de sus muchas ventajas. Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar realizaciones preferidas de la invención. Los expertos en la técnica deben apreciar que las técnicas dadas a conocer en los ejemplos a continuación representan técnicas usadas en la presente invención para funcionar bien en la práctica de la invención y, por tanto, puede considerarse que constituyen modos preferidos para su práctica.
A menos que se indique lo contrario, se usaron métodos establecidos de tecnología génica recombinante tal como se describe, por ejemplo, en Sambrook, Russell “Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001).
Ejemplo 1
Experimento: establecer un protocolo de cultivo de PBMC de donantes o pacientes sanos que da como resultado una monocapa que puede teñirse (campo que puede someterse a obtención de imágenes/plano de obtención de imágenes único) para la obtención de imágenes en placas de 384 pocillos.
Método: se cultivaron PBMC según el protocolo inventado para la farmacoscopia. En una primera etapa, se recoge sangre de un(os) probando(s) o paciente(s) sano(s). Típicamente, el volumen es de entre 9 y 500 ml y la sangre se almacena en un recipiente apropiado que contiene EDT<a>o heparina. Luego se mezcla la muestra de sangre a una proporción 1:1 con tampón PBS. Se colocan en capas 30 ml de la mezcla sangre/PBS a lo largo de un gradiente de densidad de Lymphoprep de 15 ml en tubos de 50 ml para la purificación. Los tubos se centrifugan a 2000 rpm durante 30 min a temperatura ambiente sin interrupción (sin interrupción de la centrífuga). Se retira la capa leucoplaquetaria por encima del gradiente de densidad y por debajo del plasma y se coloca en otro tubo de 50 ml. Habitualmente, el volumen retirado varía entre 10 y 15 ml. Luego se llena el tubo con PBS hasta un volumen final de 50 ml y se centrifuga nuevamente a 2000 rpm durante 5 min con interrupción de la centrífuga. Se retira el sobrenadante y se suspende el sedimento en RPMI con 20 ml de FCS al 10% y antibióticos apropiados. El sedimento debe tener una banda de RBC de no más de 5 mm de grosor. Luego se cuentan las células hasta 4*105/ml y se siembran 50 |il a una densidad de 20000 células/pocillo en placas de obtención de imágenes Corning de 384 pocillos con paredes negras. Las células se dejan a temperatura ambiente durante de 10 a 15 min para su sedimentación y luego se colocan en una incubadora a 37 °C el 5 % de CO2. Luego se incuban las placas durante un tiempo determinado, idealmente no más que durante la noche. Si se añade un colorante de viabilidad, se retiran con cuidado 30 |il del sobrenadante manualmente o con un robot y se añaden 30 |il de una mezcla 1:1000 en PBS de colorante LIVE/DEAD Fixable 488 de Invitrogen durante 30 min a temperatura ambiente. Se retira el colorante de viabilidad como sobrenadante inicial con pipeta o robot automático. Debe evitarse la perturbación de la monocapa en esta etapa. Si no se añade colorante de viabilidad o inmediatamente después de añadirlo, se añaden 30 |il de formaldehído al 2 % con Triton X-114 al 0,1 % y se incuban las placas a temperatura ambiente durante 15 min. Se retira el sobrenadante (la totalidad) mediante sacudidas. Debido a que la monocapa ya está fijada en esta etapa, esto no alterará la monocapa. Para la tinción, se añaden 30 |il de tinción de anticuerpo. Los cócteles sometidos a prueba son una dilución 1:300 de anticuerpos etiquetados con GFP, PE o APC usados para citometría de flujo. La dilución permite evitar etapas de lavado. Las placas se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente. Se retira el anticuerpo mediante sacudidas tal como antes y se añade una dilución 1:100 de DAPI en PBS en 50 |il. Se almacenan las placas a 4 °C hasta la obtención de imágenes. La obtención de imágenes se realiza a temperatura ambiente usando un microscopio confocal automático (PerkenElmer Operetta) con 4 canales no solapantes y los datos se exportan para su análisis.
Resultados: después de cultivar las PBMC utilizando el presente protocolo novedoso, las PBMC adherentes y no adherentes formaron una monocapa de la que pudieron obtenerse imágenes en un único plano de visión, utilizando un microscopio confocal automático, lo que permitió el cribado de fármacos automático minimizado en placas de 384 pocillos. La microscopía confirmó que pudieron obtenerse imágenes de 20.000 células (±5 %) usando el método recién desarrollado, denominado farmacoscopia.
Ejemplo 2
Experimento: usando el protocolo desarrollado en el experimento 1, se tiñeron los principales antígenos presentes en grandes poblaciones de PBMC usando anticuerpos etiquetas con fluorocromo (CD11C-APC, CD14-PE, CD19-APC y CD3-PE), colorante de viabilidad para determinar la estabilidad de membrana y colorante de unión a ADN para la contratinción del núcleo (DAPI). Este experimento determinó si con este método podría obtenerse imágenes de las principales poblaciones importantes de PBMC, muchas de las cuales no son adherentes en condiciones de cultivo normales.
Método: las PBMC se cultivaron, fijaron y tiñeron según el protocolo indicado. Se obtuvieron imágenes de las placas de 384 pocilios usando obtención de imágenes mediante microscopio confocal automático en 4 canales independientes. Las combinaciones de tinción fueron: CD11C/CD14, CD3/CD19, CD11C/CD3, CD14/CD19, todas ellas con marcadores de viabilidad y tinción nuclear.
Resultados: se obtuvieron imágenes de las principales poblaciones de células, incluyendo células no adherentes (células B CD19+ y células T CD3+), junto con el marcador de viabilidad y la tinción nuclear, usando un microscopio confocal automático. La visualización específica de las poblaciones no adherentes fue importante para determinar si este método podría monitorizar poblaciones que normalmente no forman monocapas individuales que pueden someterse a obtención de imágenes, de las que, según el conocimiento de los inventores, no podían someterse a obtención de imágenes antes del desarrollo de la presente invención. Las imágenes de células teñidas CD19+ y CD3+ se muestran en la figura 1.
Ejemplo 3
Experimento: la citometría de flujo es un método de menor rendimiento y ampliamente usado para determinar poblaciones de PBMC. Para resolver si las poblaciones visualizadas y calculadas mediante farmacoscopia eran iguales a las de citometría de flujo, se compararon las dos tecnologías.
Métodos: las PBMC se cultivaron, fijaron y tiñeron con el protocolo de farmacoscopia descrito en el ejemplo 1. Se obtuvieron imágenes de las placas de 384 pocillos usando obtención de imágenes con microscopio confocal automático en 4 canales independientes. Las combinaciones de tinción fueron: CD11C/CD14, CD3/CD19, CD11C/CD3, CD14/CD19 y todos los tintes individuales (CD11C, CD14, CD3, CD19). También se tiñeron células del mismo donante para citometría de flujo usando técnicas convencionales. La citometría de flujo permite la cuantificación de poblaciones, y es la tecnología convencional actual para el análisis de células no adherentes. Resultados: tal como se muestra en la figura 2, los porcentajes de las poblaciones de todos los tintes fueron comparables independientemente de si el análisis se realizó mediante citometría de flujo (parte superior) o mediante farmacoscopia (parte inferior).
Ejemplo 4
Experimento: a continuación se estableció que los medios y métodos proporcionados en el presente documento, también denominados “farmacoscopia”, podrían detectar relaciones espaciales de células, podrían detectar los estados de activación de cada población mediante tinción para la activación de la ruta proinflamatoria con resolución intracelular y podrían detectar modificaciones en cuanto a tamaño/forma/textura celulares y nucleares, a lo largo de una gran selección de fármacos antiinflamatorios (100) en diversos puntos de tiempo. Se estimularon células de donantes sanos con un virus que expresa GFP y se monitorizó la activación de NF-kB con un anticuerpo específico para fosfo-p65 y se monitorizó el tipo celular, la viabilidad y la tinción y localización subcelular de fosfo-p65 (que, tras la fosforilación, se activa y transloca al núcleo, dando como resultado una fuerte respuesta inflamatoria).
Método: las PBMC se cultivaron, fijaron y tiñeron con el protocolo de farmacoscopia. Se obtuvieron imágenes de las placas de 384 pocillos usando obtención de imágenes con microscopio confocal automático en 4 canales independientes. Las combinaciones de tinción fueron: CD11C/fosfo-p65, CD14/fosfo-p65, CD3/fosfo-p65, CD19/fosfo-p65, GFP de expresión en virus y marcadores nucleares. Las células se dejaron sin tratar o se estimularon con VSV a una multiplicidad de infección de 10 durante 30 minutos, 1 hora, 6 horas y 12 horas.
Resultados: las células tratadas con virus tenían significativamente más “aglutinación” que los cultivos no tratados, lo que significa 1) un mayor estado de activación y 2) que el análisis por farmacoscopia puede determinar interacciones especiales en los cultivos (midiendo la distancia entre células y tipos celulares en función de los estímulos). Además, esto también indica fuertemente que los cultivos pueden migrar a la monocapa antes de la fijación y que la etapa de fijación de la farmacoscopia es el momento final del movimiento. Además, la farmacoscopia puede monitorizar los cambios en una población específica; cambios tales como el tamaño celular, la morfología nuclear y la textura a lo largo de un periodo de tiempo con estimulación o tratamiento farmacológico, lo que permite confirmar aún otra fuente de información paralela a través de las imágenes de la novedosa monocapa de PBMC.
Conclusión de los experimentos 1-4: la creación de un protocolo para el cultivo, la fijación, la tinción y la obtención de imágenes de PBMC principalmente no adherentes en una monocapa que puede someterse a obtención de imágenes representa un avance fundamental de la capacidad de los presentes inventores para realizar cribado de fármacos de alto rendimiento y alto contenido directamente en un sistema fisiológicamente relevante. La farmacoscopia permite el descifrado sistemático de numerosas líneas paralelas de datos previamente inalcanzables. Líneas de datos tales como 1) detección de múltiples poblaciones de células no adherentes y adherentes en el mismo cultivo sin la necesidad de rotación, quelación por digestión enzimática o rascado celular, 2) morfología nuclear, 3) relaciones célula-célula en imágenes de alto rendimiento, 4) recapitulación y visualización de la activación de rutas a lo largo de tipos celulares relevantes, 5) localización de proteínas subcelulares y/o colocalización proteína/proteína, y más. Además, la farmacoscopia usa sistemas de automatización convencionales y sólo necesita material de donante limitado (casi 1/10 menos que los métodos de la competencia).
Usando los medios y métodos proporcionados en el presente documento, es posible el cribado automático para productos farmacéuticos tales como compuestos antineoplásicos. Además, los medios y métodos proporcionados en el presente documento pueden usarse en diagnóstico, como en la evaluación de opciones de tratamiento y similares o quimioterapia predictiva, y/o en la monitorización de diversos biomarcadores. Los medios y métodos proporcionados en el presente documento también permiten el análisis de alto rendimiento de cientos de compuestos simultáneamente. Además, los medios y métodos proporcionados en el presente documento permiten diagnosticar una enfermedad o la predisposición a una enfermedad en un donante de PBMC/donante de células de médula ósea que comprende la monocapa de la invención o PBMC/células de médula ósea cultivadas según los métodos de la invención. Además, los medios y métodos proporcionados en el presente documento pueden usarse para determinar si un sujeto que padece o tiene predisposición a una enfermedad responderá o responde al tratamiento con un agente terapéutico.
Ejemplo 5
Experimento: los medios y métodos proporcionados en el presente documento, en particular la monocapa de la invención y/o una monocapa formada mediante los métodos de la invención, se usaron para descubrir fármacos antineoplásicos, que se dirigen específicamente a enfermedades hematopoyéticas, en un sistema fisiológicamente relevante. Las líneas celulares de la técnica anterior están lejos de ser relevantes ya que no se tienen en cuenta las interacciones de los diversos tipos celulares que están presentesin vivo.El cribado de PBMC, usando los medios y métodos proporcionados en el presente documento, en particular usando análisis de alto contenido usando los medios y métodos proporcionados en el presente documento, permite una descripción mucho más detallada de los eventos. Además, muchas opciones de quimioterapia son citotóxicas hasta el punto de dejar a un paciente sin un sistema inmunitario funcional; el presente método de cribado determinaría los efectos específicos de población de los fármacos.
Se distribuyó en puntos por duplicado una selección de 1500 compuestos pequeños en placas de 384 pocillos y se tiñeron combinaciones de subconjuntos de PBMC, como en el experimento 2, junto con tinte de viabilidad (integridad de membrana) y nuclear (DAPI). El objetivo era determinar la perspectiva global de los cambios de viabilidad de las PMBC. Por tanto, se centró en cada población individual para descifrar el direccionamiento específico. Este cribado se realizó a lo largo de 3000 pocillos en más de diez placas de 384 pocillos de manera automática mientras se determinaban las poblaciones adherentes y no adherentes, a nivel de célula individual.
Método: las PBMC se cultivaron, fijaron y tiñeron usando los métodos de la presente invención, en particular tal como se describió en los ejemplos anteriores. Se distribuyeron en puntos 1500 compuestos seleccionados al azar a partir de la biblioteca de compuestos de los presentes inventores en 5 nl en placas de 384 pocillos. Se incubaron las células a 37 °C con el 5% de CO2 durante 36 horas. Después de 36 horas, se añadió el marcador de viabilidad según el protocolo de farmacoscopia. Se obtuvieron imágenes de las placas de 384 pocillos usando obtención de imágenes con microscopio confocal automático en 4 canales independientes. Las combinaciones de tinción fueron: CD11C/CD14 y CD3/CD19. Cada combinación de tinción también se tiñó con el marcador de viabilidad y DAPI. Resultados: este cribado produjo un conjunto principal de datos que se dividió en tres visualizaciones: 1) una medición del cambio global de viabilidad celular, que se normalizó con respecto a la capacidad del fármaco para seleccionar como diana específicamente una población teñida individual (figura 3). La figura 3 muestra la totalidad de los 1500 compuestos, cada uno de ellos representado por un punto, comparando el número total de PBMC destruidas con la “especificidad” de la capacidad del compuesto para seleccionar como diana uno o más tipos celulares específicos presentes en la tinción. Los mejores compuestos seleccionados, indicados con los nombres en color negro, representan un enriquecimiento significativo de los fármacos recetados para los cánceres hematológicos. 2) A partir de la determinación de la citotoxicidad específica de población, puede determinarse, y se determinó, la posible reutilización de los fármacos (fármacos que se administran para un cáncer pero que pueden ser más adecuados, o también usarse para dirigirse a, otras poblaciones). Dos ejemplos de reutilización o direccionamiento de fármacos se muestran en la figura 4. Mientras que el givinostat (figura 4, parte superior) se encuentra en ensayos clínicos para el tratamiento de leucemias y mielomas recidivantes, basándose en los resultados proporcionados, puede no ser eficaz para los cánceres derivados de células B tales como la leucemia linfoblástica crónica de células B (B-LLC). Además, la citarabina (figura 4, parte inferior), un fármaco aprobado por la FDA, puede funcionar como agente antineoplásico de amplio espectro; sin embargo, podría ser más eficaz contra cánceres de origen mieloide, en lugar de linfoide, por su mejor capacidad para seleccionar como diana macrófagos y células dendríticas, y células B en menor medida.
Aunque este cribado conceptual a gran escala inicial se realizó en sangre de donante sano, todavía puede dilucidar ambos compuestos antineoplásicos novedosos y también especificar células diana. La figura 5, por ejemplo, indica los inhibidores de HDAC que se recuperaron a partir del cribado de viabilidad (es decir, tenían altas puntuaciones de especificidad) y las subpoblaciones de leucocitos afectadas después de 36 horas de incubación. En esta lista también se incluyen dos inhibidores de HDAC recientemente sintetizados con dianas desconocidas, indicados como “CMP_A” y “CMP_B”. Usando su patrón de destrucción específica de células en este cribado particular, junto con la quimioproteómica interna de los presentes inventores, pueden determinarse los mecanismos y las dianas moleculares para fármacos novedosos tales como éstos directamente en la población celular afectada.
Conclusión: los estudios que han sentado las bases para el análisis de características de población impulsado por la resolución subcelular y de célula individual se han basado en líneas celulares genéticamente idénticas, que no son fisiológicamente relevantes para la salud y la enfermedad humanas. Además, la relevancia del descubrimiento de fármacos para las enfermedades humanas en líneas celulares ha sido cuestionada recientemente después de que se identificaran inconsistencias en el trabajo publicado (Haibe-Kainset al.,2013). En este caso, se ha descrito un sistema para la detección de la selección de compuestos que selecciona como diana específicamente diversas subpoblaciones de PBMC, incluso usando un donante sano, lo que abre la puerta a la capacidad para comenzar el cribado de aún más bibliotecas para fármacos dirigidos a la población incluso más específicos. Por consiguiente, los medios y métodos proporcionados en el presente documento pueden usarse en cribados de fármacos y/o métodos para determinar si un donante padece una enfermedad y/o si un donante responderá/responde al tratamiento usando compuestos conocidos en la técnica y/o los compuestos descubiertos usando los métodos de la presente invención.
Ejemplo 6
Experimento: basándose en la formación de la metodología tal como se indica en los experimentos 1-4, es decir, usando las monocapas de la presente invención, y también en los resultados del presente cribado de compuestos novedoso en el experimento 5, se implementó la quimioterapia predictiva mediante la monitorización de biomarcadores detallados a nivel de célula individual y a nivel global de más de 350 fármacos usando los medios y métodos de la presente invención. Específicamente, se monitorizaron las mejores opciones de quimioterapia en pacientes que padecen neoplasias malignas mieloproliferativas basándose en la viabilidad de células progenitoras mieloides CD34+ y células que contienen la fosforilación de STAT5; ambos tintes se conocen como biomarcadores generales para múltiples tipos de MPN incluyendo mielofibrosis primaria temprana y policitemia vera.
Método: las PBMC se cultivaron, fijaron y tiñeron según el protocolo indicado en los ejemplos anteriores. Se obtuvieron imágenes de las placas de 384 pocillos usando un microscopio confocal automático en 4 canales independientes. Se tiñeron CD34-APC, pSTAT5-PE, marcador de viabilidad de GFP y un tinte nuclear de unión a ADN. Se cultivo el material del paciente con fármacos durante 18 horas antes de la adición del marcador de viabilidad. Estas imágenes contenían tanto blastocitos clonales (prácticamente la totalidad de células CD34+ que están presentes en la sangre periférica), células activadas (células pSTAT5+), así como células inherentemente sanas del mismo donante. De manera excepcional, la farmacoscopia, a nivel de célula individual, pudo controlar los efectos farmacéuticos sobre el cáncer del paciente al permitir directamente comparaciones controladas con las poblaciones celulares sanas en las mismas imágenes.
Resultados: se determinó la viabilidad de células que se tiñeron específicamente o bien para CD34 o bien para pSTAT5. De los aproximadamente 350 compuestos cribados al azar, los mejores compuestos, que disminuyeron la viabilidad de células que expresan los biomarcadores (figura 6, resaltados), se administran regularmente para el cáncer y algunos específicamente para MPN u otros mielomas. Un fármaco, especialmente la azacitidina, está demostrando éxito en la actualidad en un ensayo clínico para el tratamiento de MFP temprana en combinación con inhibidores de JAK, con los cuales este paciente ya está tratándose. Además, tras la titulación de azacitidina en el mismo paciente, mientras se monitorizaba la viabilidad de células CD34+ en comparación con células sanas y en comparación con DMSO, se observaron efectos dependientes de la concentración (figura 7). Los resultados de este experimento también se ilustran en la figura 12.
Conclusión: el análisis de células individuales usando la monocapa de PBMC de la invención en pacientes que padecen cánceres hemáticos dio lugar a elecciones de quimioterapia de gran éxito, lo que conduce a tratamientos mejores y más dirigidos. Aunque la secuenciación y la proteómica ofrecen una medicina personalizada predictiva, los medios y métodos proporcionados en el presente documento ofrecen la medición directa de la monitorización de fenotipoex vivo,que se ha demostrado que se relaciona directamente con la respuesta al fármacoin vivo.
Ejemplo 7
Experimento: las PBMC se han preparado usando los métodos de la técnica anterior y el método de la presente invención. En particular, se han seguido el método descrito por Douglaset al.(2001) Current Protocols in Immunology (publicado el 1 de mayo de 2001) y el método descrito por Katrien Princenet al.(2002) Cytometry Part A, vol. 51A, n.° 1, págs. 35-45. Es decir, las monocapas de PBM<c>se prepararon sembrando las células a la densidad indicada en la etapa 15 pág. 12.9.8 de Douglaset al.,que está fuera del intervalo máximo necesario para la creación de la monocapa de PBMC/células de médula ósea tal como se reivindica. Se formó una segunda capa usando el protocolo descrito por Katrien Princenet al.,en el que se aplica una etapa de centrifugación a “baja velocidad” (es decir, 500 rpm) con baja aceleración y sin interrupción.
Resultados: las capas de PBMC preparadas se analizaron mediante microscopía. Las imágenes de las monocapas celulares comparando los métodos proporcionados en el presente documento con los métodos en Douglaset al.y Katrien Princenet al.,respectivamente, se muestran en la figura 15.
Luego se aplica el uso de una técnica que aplica más fuerza gravitacional, como la gravedad centrífuga, a las células en los métodos de la invención, por ejemplo, tal como se describió en el ejemplo 1 (fuerzas gravitacionales normales y fuerzas de menisco, si las hay), que altera el procedimiento de siembra y crea una monocapa que se acumula sobre sí misma y que no puede someterse a obtención de imágenes por completo; además, la acción de centrifugación altera los contactos célula-célula que se forman de manera natural usando el protocolo indicado para el ejemplo 1. Una vez que se aplica la fuerza o las células son tan densas que no pueden moverse libremente a su alrededor, entonces no puede medirse la relación de las células entre sí, o su medición no tiene consecuencias sobre la relevancia en una persona. Como comparación, se prepararon monocapas de PBMC tal como se describió en el ejemplo 1. En los métodos de la invención, las células se depositan sin fuerzas adicionales a las que están presentes en el pocillo, de manera que son fisiológicamente relevantes la totalidad de las interacciones célula-célula, las ubicaciones y las vecindades (tal como aparecen en el sistema humano) y, por tanto, cómo se alteran en presencia de los fármacos. En cambio, los métodos de Douglaset al.y Katrien Princenet al.usan fuerza gravitacional o lisis celular, respectivamente, lo que altera las interacciones célula-célula que se producen de manera natural y/o la integridad de membrana.
Ejemplo 8
Se recogió médula ósea a través de una aspiración de médula ósea/punción de médula ósea de un paciente y se purificaron las células con un gradiente de densidad de Ficoll tal como se describió anteriormente siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células se sembraron según el protocolo en esta solicitud en placas de obtención de imágenes de plástico negras de 384 pocillos (Corning) que no contenían nada. Las células se sembraron a 20.000 células/pocillo en 50 ul de RPMI complementado con FCS al 5%, pen./estrep. al 0,1 %. Las células se incubaron durante la noche y se les añadió un colorante de viabilidad (LIVE/DEAD Fixable Green, Invitrogen, siguiendo las instrucciones del fabricante). Las células se fijaron y permeabilizaron en PBS que contenía formaldehído al 2 % con Tween-x114 al 0,1 % durante 10 minutos a temperatura ambiente. Luego se reemplazó la disolución con PBS que contenía DAPI a la concentración recomendada por el fabricante. Se obtuvieron imágenes de las placas a 10x en un microscopio confocal automático Operetta (PE) en dos canales usando separación de luz con filtros de paso de banda (DAPI, GFP). Las células en la monocapa se tiñeron usando DAPI (un agente de unión a ADN) para analizar el número y la existencia de células y colorante LIVE/DEAD Fixable Green de Invitrogen para determinar la viabilidad en la monocapa. Tal como se muestra en la figura 14, las monocapas de células de médula ósea humanas que se prepararon mediante los métodos de la presente invención comprenden células viables en un estado fisiológicamente relevante.
Ejemplo 9
Se purificaron PBMC de sangre periférica de un paciente al que se le diagnosticó mielofibrosis primaria mediante un gradiente de densidad de Ficoll tal como se describió anteriormente siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células se sembraron según el protocolo en esta solicitud en placas de obtención de imágenes de plástico negras de 384 pocillos (Corning) que contenían 350 fármacos aprobados por la FDA en DMSO a 10 uM. Las células se sembraron a 20.000 células/pocillo en 50 ul de RPMI complementado con FCS al 5%, pen./estrep. al 0,1 %. Las células se incubaron durante la noche y se les añadió un colorante de viabilidad (LIVE/DEAD Fixable Green, Invitrogen, siguiendo las instrucciones del fabricante). Las células se fijaron y permeabilizaron en PBS que contenía formaldehído al 2 % con Tween-x114 al 0,1 % durante 10 minutos a temperatura ambiente. Luego se reemplazó la disolución con PBS que contenía anticuerpo contra CD34 y pSTAT5 (BD biosciences) durante 1 hora. Luego se reemplazó la disolución con PBS que contenía DAPI a la concentración recomendada por el fabricante. Se obtuvieron imágenes de las placas a 10x en un microscopio confocal automático Operetta (PE) en cuatro canales usando separación de luz con filtros de paso de banda (DAPI, GFP, PE, APC). Usando un procedimiento de análisis de imágenes, se comparó la sensibilidad de las células cancerosas (positivas para CD34 y pSTAT5) de cada fármaco con la sensibilidad en las células sanas (no positivas para CD34 y pSTAT5). Todos los resultados se normalizaron con respecto al control, DMSO solo. La figura 12A muestra los resultados, siendo cada punto un fármaco, los fármacos resaltados seleccionan como diana las células específicas dentro de la monocapa que son positivas para el “marcador de diagnóstico” (es decir, etiquetadas con anticuerpos específicos). Estos resultados se comparan con el efecto de las células sanas (es decir, negativas para el marcador) dentro de la monocapa. Los datos para un fármaco se extrajeron en la figura 12B y resaltan el fenotipo por célula del tratamiento con un solo fármaco (derecha) frente al control (izquierda) a partir de una monocapa tratada (agotamiento específico de células CD34). Usando el mismo método tal como se describió anteriormente, pero sólo contando el número de células, la figura 12C determina el efecto farmacéutico según la “técnica anterior” de contar únicamente la muerte celular general después de la incubación con fármacos (por tanto, no hay comparación con lo que está enfermo o lo que está sano). Si sólo se determina la muerte celular/número de células, entonces el fármaco más importante (resaltado en 12A, 12B izquierda y 12D) no aparece (fuera del umbral de la línea de puntos). La figura 12D son los datos clínicos obtenidos usando protocolos hospitalarios normalizados basados en sangre y técnicas de laboratorio en el hospital a partir del paciente después del tratamiento con el compuesto que aparece en las figuras 12A y 12B.
Ejemplo 10
Se purificaron PBMC a partir de sangre periférica de un donante humano sano mediante un gradiente de densidad de Ficoll tal como se describió anteriormente siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células se sembraron según el protocolo en esta solicitud en placas de obtención de imágenes de plástico negras de 384 pocillos (Corning) que contenían 1500 fármacos aprobados por la FDA en DMSO a 10 uM, por duplicado en un cribado completo. Las células se sembraron a 20.000 células/pocillo en 50 ul de RPMI complementado con FCS al 5%, pen./estrep. al 0,1 %. Las células se incubaron durante tres horas y luego se les añadió un virus. El virus de la estomatitis vesicular (VSV) actúa como inmunoestimulante y expresa GFP en las células tras la infección, y se añadió a 10 UFC. Después de una incubación durante la noche, las células se fijaron y permeabilizaron en PBS que contenía formaldehído al 2% con Tween-x114 al 0,1 % durante 10 minutos a temperatura ambiente. Luego se reemplazó la disolución con PBS que contenía anticuerpo contra CD11C, CD14, CD3 y/o CD19 (BD biosciences) durante 1 hora. Luego se reemplazó la disolución con<p>B<s>que contenía DAPI a la concentración recomendada por el fabricante. Se obtuvieron imágenes de las placas a 10x en un microscopio confocal automático Operetta (PE) en cuatro canales usando separación de luz con filtros de paso de banda (DAPI, GFP, PE, APC). Usando un procedimiento de análisis de imágenes, se determinó la relación de vecindad de cada célula con las demás células. Esto se determinó en cada pocillo, y se midió el efecto de los fármacos sobre esta relación célula-célula en comparación con el control, DMSO. Los resultados se representan gráficamente en este caso como resultados de anotaciones de fármacos agrupados a partir de un cribado de fármacos a gran escala en el que se determinaron las interacciones célula-célula o las células “vecinas más próximas” con alto rendimiento. Los recuadros más oscuros representan las relaciones ganadas o perdidas en comparación con el pocillo de control (DMSO). Por tanto, se monitorizan los fármacos y se organizan las bibliotecas de cribado de fármacos basándose en su capacidad para aumentar o recelar estas interacciones usando el método indicado en el ejemplo 1.
Ejemplo 11
Se tomaron muestras de un individuo, o bien de sangre periférica o bien de médula ósea, y se purificaron las células mononucleares mediante un gradiente de densidad de Ficoll, siguiendo los protocolos del fabricante. Luego se colocaron las células en placas de obtención de imágenes de múltiples pocillos de fondo transparente/negro de 384 pocillos (Corning), conteniendo cada pocillo fármacos o controles o bien positivos o bien negativos. Se incubaron las células y luego se les añadió un colorante para determinar la viabilidad de todas las células. El colorante usado puede cambiar en función del estado de viabilidad u otra propiedad que vaya a determinarse, o el colorante puede reemplazarse por un anticuerpo después de la siguiente etapa. Luego se fijó y permeabilizó la capa celular usando formaldehído al 2 % con 0,1 % triton-X114 en PBS. Luego se tiñeron las monocapas con anticuerpos dirigidos contra los antígenos de diagnóstico usados en cánceres hematopoyéticos o contra otros antígenos de interés. Luego se tiñeron las células con DAPI para la visualización nuclear, todo ellos siguiendo los protocolos anteriores. Se obtuvieron imágenes de las placas a 10x en un microscopio confocal automático Operetta (PE) en cuatro canales usando separación de luz con filtros de paso de banda (DAPI, GFP, PE, APC). Usando un procedimiento de análisis de imágenes, la viabilidad de la célula en este caso puede monitorizarse a medida que 1) se vuelven positivas para la viabilidad o 2) ya no están en la imagen en comparación con DMSO (control).
Los marcadores (colorante anticuerpo fluorescente o sólo anticuerpos fluorescentes) no deben solapar los canales, y si lo hacen, los canales deben compensarse usando técnicas convencionales de compensación de excitación/emisión. Un diseño general para canales no solapantes es DAPI, GFP, PE y APC. Puede usarse otros. Por consiguiente, usando los medios y métodos de la presente invención, pueden evaluarse las células positivas para múltiples biomarcadores y/o múltiples células positivas para diferentes biomarcadores.
Ejemplo 12
La figura 13 representa un esquema de cómo se determinan las interacciones celulares usando una “puntuación de interacción”, y luego se aplica la puntuación de interacción a un ejemplo. La figura izquierda se obtuvo recogiendo PBMC a partir de sangre periférica de un donante humano sano, que se purificaron mediante un gradiente de densidad de Ficoll tal como se describió anteriormente siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células se sembraron según el protocolo en esta solicitud en placas de obtención de imágenes de plástico negras de 384 pocillos (Corning). Las células se sembraron a 20.000 células/pocillo en 50 ul de RPMI complementado con FCS al 5 %, pen./estrep. al 0,1 %. Las células se incubaron durante tres horas y luego se les añadió un virus. Después de una incubación durante la noche, las células se fijaron y permeabilizaron en PBS que contenía formaldehído al 2 % con Tween-x114 al 0,1 % durante 10 minutos a temperatura ambiente. Luego se reemplazó la disolución con PBS que contenía anticuerpo contra CD11C, CD14, CD3 o CD19 (BD biosciences) durante 1 hora. Luego se reemplazó la disolución con PBS que contenía DAPI a la concentración recomendada por el fabricante. Se obtuvieron imágenes de las placas a 10x en un microscopio confocal automático Operetta (PE) en cuatro canales usando separación de luz con filtros de paso de banda (DAPI, GFP, PE, APC). Los círculos proporcionan un ejemplo de interacciones celulares, o bien juntas o bien por triplicado. En dos ejemplos las células están tocándose, y en un ejemplo dos células monitorizadas están separadas a una distancia de una célula. El panel central describe el cálculo de la “puntuación de interacción” desarrollada por los presentes inventores para monitorizar las relaciones celulares entre sí que se producen en las monocapas que se crean mediante el protocolo en el ejemplo 1 únicamente.
Las interacciones que son relevantes dado un escenario específico pueden monitorizarse usando los métodos de la invención. Para ello, se purificaron PBMC a partir de sangre periférica de un donante humano sano mediante un gradiente de densidad de Ficoll tal como se describió anteriormente siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células se sembraron según el protocolo en esta solicitud en placas de obtención de imágenes de plástico negras de 384 pocillos (Corning) que no contenían nada o que contenían un anticuerpo contra CMH-II humano (NA/LE, anticuerpo de ratón anti-HLA-DR humano purificado, clon G46-6, BD biosciences). Las células se sembraron a 20.000 células/pocillo en 50 ul de RPMI complementado con FCS al 5%, pen./estrep. al 0,1 %. Las células se incubaron durante tres horas y luego se les añadió un virus. El virus de la estomatitis vesicular (VSV) actúa como inmunoestimulante y expresa GFP en las células tras la infección, y se añadió a 10 UFC. Después de una incubación durante la noche, las células se fijaron y permeabilizaron en PBS que contenía formaldehído al 2 % con Tween-x114 al 0,1 % durante 10 minutos a temperatura ambiente. Luego se reemplazó la disolución con PBS que contenía anticuerpo contra CD11C y CD3 (BD biosciences) durante 1 hora. Luego se reemplazó la disolución con PBS que contenía DAPI a la concentración recomendada por el fabricante. Se obtuvieron imágenes de las placas a 10x en un microscopio confocal automático Operetta (PE) en cuatro canales usando separación de luz con filtros de paso de banda (DAPI, GFP, PE, APC). Usando un procedimiento de análisis de imágenes, se determinaron los contactos célula-célula de las células CD3-CD11C.
Por ejemplo, durante una infección con virus (indicada como “+estimulante”), las células dendríticas presentan péptidos virales a través del receptor CMH-II a las células T (Boeset al.(2002) Nature 418, 983-8). Esta interacción puede monitorizarse usando los métodos de la invención (-), y puede probarse que esta interacción es real en los medios y métodos de la presente invención al incluir un anticuerpo contra CMH-II que bloquea la unión al receptor (+) (Peiseret al.(2007) Allergy 62(7)). Este experimento es una prueba sencilla de que pueden determinarse interacciones celulares fisiológicamente relevantes mediante los métodos de la invención y usarse para el cribado de fármacos novedoso.
La monitorización de los cambios se realiza usando un software interno. Las interacciones célula-célula se miden analizando la frecuencia de interacción entre dos tipos celulares en el plano 2D que se mide a partir de las imágenes, con respecto a la totalidad de las células presentes en el pocillo. Una “interacción” puede ser un contacto directo célula-célula (es decir, dos células vecinas que se tocan entre sí con sus membranas plasmáticas) o cuando las dos células están dentro de una determinada distancia máxima entre sí, etc.
En la figura 13 (izquierda), cada célula se tiñe mediante el tinte nuclear DAPI, y el tipo celular A se tiñe mediante un conjunto de marcadores (por ejemplo, CD11c) y el tipo celular B se tiñe mediante otro marcador (por ejemplo, CD3). Para medir la afinidad de interacción entre estos dos tipos celulares, en primer lugar, se calcula la fracción de A que están en contacto (es decir, están dentro de una determinada distancia máxima entre sus centroides ponderados de sus áreas nucleares) con células de tipo B en función de la totalidad de células A+. Esto se denomina fracción observada (“obs”) de células de tipo A que interaccionan con células de tipo B (recuadro azul en la figura 2C).
obs= n.° de células A+ vecinas con respecto a células B+/n.° de la totalidad de células A+
Luego, se normaliza este número (“obs”) con respecto a aquella fracción de A que interaccionan con B que se esperaría al azar. El determinante más importante de cuántas interacciones pueden esperarse al azar es el número total de células por pocillo o el número de células por área. Se encuentra empíricamente que esto determina la fracción total de células que interaccionan (entre cualquier tipo celular, que se denomina “Fi”).
Fi= n.° de células con al menos una célula vecina/n.° de la totalidad de células
Por tanto, la fracción de células de tipo A que interaccionan con células de tipo B (es decir, “E’) viene dada por la probabilidad de que se encuentren al azar, que se calcula como “fracción de células de tipo A con respecto a la totalidad de células” (“Fa”) * “fracción de células de tipo B con respecto a la totalidad de células”(“Fb”)* “fracción total de células que interaccionan con respecto a la totalidad de células” (“Fi”). Nota
Fa= n.° de células A+/n.° de la totalidad de células
Fb= # n.° de células B+/n.° de la totalidad de células
Por tanto, la fracción esperada de células A+ con respecto a la totalidad de células A+ que se observaría que interaccionan con células B+ suponiendo datos al azar es
E=Fa*Fb*Fi.
Finalmente, se calcula la puntuación de interacción como cambio en veces transformado a log2 de“obs’TE ’,de manera que puntuaciones de interacción negativas indican una frecuencia de interacción menor que la que se esperaría al azar (indicativas de afinidades de interacciones de repulsión o fuertemente competitivas con otros tipos celulares), mientras que una puntuación de interacción positiva indica una frecuencia de interacción mayor que la que se esperaría al azar (indicativa de la afinidad entre células).
Obsérvese que una interacción puede producirse menos de lo que se esperaría al azar, pero que las desviaciones (aumentos o disminuciones) de esa puntuación de interacción negativa todavía indican cambios en la afinidad celular.
Obsérvese que las interacciones celulares pueden medirse de diversos modos, tal como se comentó anteriormente. Por ejemplo, observando si se tocan las membranas plasmáticas de las células, o de manera aproximada midiendo si los núcleos de dos células están lo suficientemente cerca entre sí. Se usa la aproximación basada en la distancia nuclear ya que estas imágenes particulares no tienen una tinción fiel de la membrana plasmática para todas las células.
Ejemplo 13
Se purificaron PBMC a partir de sangre periférica de un donante humano sano mediante un gradiente de densidad de Ficoll tal como se describió anteriormente siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células se sembraron según el protocolo en esta solicitud en placas de obtención de imágenes de plástico negras de 384 pocillos (Corning) que no contenían nada. Las células se sembraron a 20.000 células/pocillo en 50 ul de RPMI complementado con FCS al 5%, pen./estrep. al 0,1 %. Se obtuvieron imágenes de las placas a 10x en un microscopio confocal automático Operetta (PE) usando microscopía de campo brillante. Las células en la figura 15A (panel derecho) son libres de moverse e interaccionar con sus células homólogas sin interferencia física, propagando así rutas durante situaciones fisiológicamente relevantes comoin vivo.En la figura 15B (parte inferior), se purificaron PBMC a partir de sangre periférica de un donante humano sano mediante un gradiente de densidad de Ficoll tal como se describió anteriormente siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células se sembraron según el protocolo en esta solicitud en placas de obtención de imágenes de plástico negras de 384 pocillos (Corning) que no contenían nada. Las células se sembraron según Douglaset al.:a 1x106 células/pocillo en 50 ul de RPMI complementado con FCS al 5%, pen./estrep. al 0,1 %. Se obtuvieron imágenes de las placas a 10x en un microscopio confocal automático Operetta (PE) usando microscopía de campo brillante. En la técnica anterior tal como Douglaset al.y Katrien Princenet al.,las fuerzas físicas o bien de 1) demasiadas células o bien de 2) presión adicional por rotación produce un número desproporcionado de interacciones que luego no son relevantes y no se producen en la naturaleza, o no tienen relevancia sobre el efecto farmacéutico. Flecha = ejemplo de tipo celular 1, cabeza de flecha = ejemplo de tipo celular 2. Donde los ejemplos de tipo celular 1 y 2 en la izquierda tienen espacio para moverse libremente, pero en la imagen derecha nunca podrán interaccionar debido a la interferencia física de las demás células o a la rotación. La sobrecarga de los pocillos también se muestra en la figura 17. La sobrecarga del pocillo crea una monocapa no fisiológicamente relevante. Las células sembradas tal como se describe en Douglaset al.(2x106/pocillo) aumentan el número de células adherentes, bloqueando así la colocación de células no adherentes (en este caso: células T). Tras la retirada de los medios, se retiran las células no adherentes del pocillo y no se depositan, dejando así al pocillo con un número desproporcionado de células (fila superior, no hay células T presentes donde habitualmente las células T constituyen >75 % de la monocapa y también están presentes como el 75 % de la población de PBMC dentro de sangre periférica de adulto sano). En la parte inferior, se usa el método SLP que conserva números proporcionados de células T.
Ejemplo 14
Comparación de cuatro poblaciones diferentes en PBMC tal como se mide mediante citometría de flujo o el método proporcionado en el presente documento (análisis de imágenes del pocillo de farmacoscopia). Se purificaron PBMC a partir de sangre periférica de un donante humano sano mediante un gradiente de densidad de Ficoll tal como se describió anteriormente siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células para citometría de flujo se sembraron a 1x106/pocillo en una placa de fondo en V de 96 pocillos en 50 ul. Los pocillos se tiñeron con 1:1000 de anticuerpo contra CD11C, CD14, CD3 o CD19 (BD biosciences) durante una hora en hielo. Las células se lavaron con PBS con FCS al 2 % y se centrifugaron a 2000 rpm durante 5 minutos, se repitió dos veces, y luego se fijaron con PBS que contenía formaldehído al 2% y luego se lavaron una vez más. Las poblaciones resultantes se midieron en un citómetro de flujo (BD facsaria) y los resultados se analizaron usando FlowJo. Las poblaciones de comparación para el análisis de imágenes usando farmacoscopia se realizaron colocando las PBMC en placas de obtención de imágenes de plástico negras de 384 pocillos (Corning) que no contenían nada a 20.000 células/pocillo. Las células se sembraron en 50 ul de RPMI complementado con FCS al 5 %, pen./estrep. al 0,1 %. Después de una incubación durante la noche, se retiraron los medios de todos los pocillos y se fijaron y permeabilizaron las células en PBS que contenía formaldehído al 2% con Tween-x114 al 0,1 % durante 10 minutos a temperatura ambiente. Luego se reemplazó la disolución con PBS que contenía anticuerpo contra CD11C, CD14, CD3 o CD19 (BD biosciences) durante 1 hora. Luego se reemplazó la disolución con PBS que contenía DAPI a la concentración recomendada por el fabricante. Se obtuvieron imágenes de las placas a 10x en un microscopio confocal automático Operetta (PE) en cuatro canales usando separación de luz con filtros de paso de banda (DAPI, GFP, PE, APC). Las monocapas se cuantificaron usando un procedimiento de análisis de imágenes y se compararon los números usando<m>A<t>LAB dando un valor de coloración de 0,98. Tal como puede observarse, las subpoblaciones comprendidas en la monocapa de la invención son comparables a las subpoblaciones presentes en muestras de PBMC tal como se determina mediante citometría de flujo. Por consiguiente, la monocapa de la presente invención se asemeja a un estado fisiológicamente relevante de células hematopoyéticas tales como PBMC o células de médula ósea.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    Un usoin vitrode una monocapa de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o monocapa de células de médula ósea producidain vitro,producida mediante un método que comprende
    (a) aislar PBMC a partir de una muestra de sangre o células de médula ósea a partir de la médula ósea; y (b) incubar las PBMC o células de médula ósea a una densidad de aproximadamente 100 células por mm2 a aproximadamente 30000 células por mm2
    para determinar si el donante de PBMC/donante de células de médula ósea padece una enfermedad, en el que, durante el proceso de formación de la monocapa, la muestra no se somete a centrifugación y/o rotación, en el que la enfermedad es una neoplasia maligna hematológica o una neoplasia maligna de tejido mieloide y/o linfoide; o en el que la enfermedad es un trastorno mieloproliferativo, un trastorno inflamatorio, una infección por virus latente, un trastorno del crecimiento celular, un trastorno de la quimiotaxia celular, un trastorno metabólico o un trastorno autoinmunitario.
    Un métodoin vitropara diagnosticar una enfermedad en un donante de PBMC/donante de células de médula ósea que comprende el uso de una monocapa de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o monocapa de células de médula ósea producidain vitro,producida mediante un método que comprende
    (a) aislar PBMC a partir de una muestra de sangre o células de médula ósea a partir de la médula ósea; y (b) incubar las PBMC o células de médula ósea a una densidad de aproximadamente 100 células por mm2 a aproximadamente 30000 células por mm2,
    en el que, durante el proceso de formación de la monocapa, la muestra no se somete a centrifugación y/o rotación, en el que la enfermedad es una neoplasia maligna hematológica o una neoplasia maligna de tejido mieloide y/o linfoide; o en el que la enfermedad es un trastorno mieloproliferativo, un trastorno inflamatorio, una infección por virus latente, un trastorno del crecimiento celular, un trastorno de la quimiotaxia celular, un trastorno metabólico o un trastorno autoinmunitario, preferiblemente en el que la enfermedad es leucemia o linfoma.
    Un método para seleccionar una composición farmacéutica que comprende un compuesto para su uso en el tratamiento de una enfermedad de un individuo que tiene dicha enfermedad, en el que dicha composición farmacéutica se selecciona de al menos dos o más compuestos de prueba que se sabe que son eficaces en el tratamiento de una neoplasia maligna hematológica y/o una neoplasia maligna de tejido mieloide y/o linfoide, en el que cada uno de los al menos dos o más compuestos de prueba se somete a prueba en un ensayo que comprende las etapas de:
    (a) preparar una monocapa de PBMC o monocapa de células de médula ósea mediante un método que comprende
    (i) aislar PBMC a partir de una muestra de sangre o células de médula ósea a partir de la médula ósea; y (ii) incubar las PBMC o células de médula ósea a una densidad de aproximadamente 100 células por mm2 a aproximadamente 30000 células por mm2 usando PBMC o células de médula ósea de dicho individuo; (b) determinar la viabilidad y/o las interacciones célula-célula de una o más subpoblaciones comprendidas en la monocapa de PBMC o monocapa de células de médula ósea;
    (c) añadir uno de los al menos dos o más compuestos de prueba a la monocapa de células hematopoyéticas; y
    (d) determinar/monitorizar/evaluar/verificar los cambios de viabilidad y/o interacciones célula-célula de la una o más subpoblaciones comprendidas en la monocapa de PBMC o monocapa de células de médula ósea,
    en el que, durante el proceso de formación de la monocapa, la muestra no se somete a centrifugación y/o rotación,
    en el que el ensayo se repite para cada uno de los al menos dos o más compuestos y en el que el compuesto que más reduce la viabilidad/interacciones célula-célula se selecciona para el tratamiento de dicho individuo, en el que la enfermedad es una neoplasia maligna hematológica o una neoplasia maligna de tejido mieloide y/o linfoide.
    El uso según la reivindicación 1, o el método según las reivindicaciones 2 o 3, en el que las PBMC o células de médula ósea se incuban a una densidad de aproximadamente 2000 células por mm2.
    5. El uso según las reivindicaciones 1o 4, o el método según las reivindicaciones 2, 3 o 4, en el que las PBMC o células de médula ósea se aíslan a partir de células no nucleadas, en el que la muestra de PBMC o muestra de células de médula ósea que va a incubarse contiene menos de aproximadamente 100 células no nucleadas por PBMC/célula de médula ósea.
    6. El uso según las reivindicaciones 1, 4 o 5, o el método según las reivindicaciones 2, 3, 4 o 5, en el que la monocapa se obtiene mediante un método que comprende además o en el que el método comprende además una etapa (c)/(iii), fijar dichas PBMC o células de médula ósea y/o fijar la monocapa de PBMC o monocapa de células de médula ósea formada.
    7. El uso o el método según la reivindicación 6, en el que la monocapa se obtiene mediante un método que comprende además o en el que el método comprende además, después de la etapa (c)/(iii), una etapa (d)/(iv) que comprende añadir una etiqueta detectable a las PBMC/células de médula ósea fijadas.
    8. El uso según las reivindicaciones 1, 4, 5 o 7, o el método según las reivindicaciones 2, 3, 4, 6 o 7, en el que la monocapa se obtiene mediante un método que comprende además o en el que el método comprende además una etapa de añadir un colorante de viabilidad.
    9. El uso o el método según la reivindicación 8, en el que la adición de un colorante de viabilidad se produce antes de la fijación de la monocapa de PBMC o monocapa de células de médula ósea formada.
    10. El uso según las reivindicaciones 1, 4, 5 o 7, 8 o 9, o el método según las reivindicaciones 2, 3, 4, 6, 7, 8 o 9, en el que, después del aislamiento, las PBMC o células de médula ósea se mantienen/procesan/analizan a aproximadamente 1g, es decir, 9,81 m/s2.
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