ITFI20110078A1 - Metodo per la determinazione di analiti nel plasma diluito ottenuto da sangue intero, e dispositivo atto a realizzarlo - Google Patents

Description

METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANALITI NEL PLASMA DILUITO

OTTENUTO DA SANGUE INTERO, E DISPOSITIVO ATTO A REALIZZARLO Campo dell'Invenzione

La presente invenzione si riferisce ad un metodo per la determinazione di analiti nel plasma diluito ottenuto per separazione degli elementi corpuscolati del sangue intero, capillare o venoso; e ad un dispositivo atto a realizzarlo.

Stato dell'Arte

Il sangue umano ha una composizione estremamente complessa, la cui valutazione à ̈ d'altra parte il mezzo più semplice ed efficace per l'identificazione ed il monitoraggio delle patologie più svariate. I campioni di sangue prelevati ai pazienti per le analisi sono costituiti dal cosiddetto "sangue intero", in cui una parte corpuscolata à ̈ sospesa nel plasma, che ne costituisce circa il 55%, mentre il restante volume à ̈ occupato da elementi corpuscolati che includono globuli rossi, globuli bianchi e piastrine. Il plasma à ̈ composto per circa il 90% di acqua e per la restante parte di metaboliti, ormoni, elettroliti inorganici e proteine, tra cui albumina, globuline che includono anticorpi, fibrinogeno, trombina ed altri fattori della coagulazione.

Ad oggi, i metodi comunemente impiegati per la separazione degli elementi corpuscolati dal plasma si basano sulla centrifugazione o sulla filtrazione. Nella pratica clinica i campioni di sangue venoso prelevati ai pazienti per via venosa vengono raccolti in provette contenenti anticoagulanti dove, per centrifugazione, si ottiene la separazione del plasma dagli elementi corpuscolati. Alternativamente, il sangue viene fatto coagulare ed il siero viene separato dal coagulo. Il plasma o il siero così ottenuti vengono quindi utilizzati per effettuare analisi biochimiche, immunochimiche e di altro tipo, con ricerca ed analisi quantitativa di metaboliti, ormoni, ed altri componenti.

La centrifugazione à ̈ il metodo usato correntemente per la separazione del sangue intero in plasma ed elementi corpuscolati quando vengono impiegati metodi di analisi tradizionali. In questi casi, il volume di sangue venoso prelevato con l'apposita siringa varia tra uno e svariati millilitri, essendo tipicamente compresi tra 5 e centinaia di microlitri i volumi di plasma necessari per ciascuna singola analisi di laboratorio.

La centrifugazione presenta, tuttavia, alcuni svantaggi che ne condizionano l’impiego. In primo luogo à ̈ un metodo non rapido, in quanto la separazione completa delle due componenti del sangue richiede accelerazioni di gravità di 1000 – 1500 g, ed un tempo compreso tra 10 e 3 minuti. Inoltre con questo metodo non à ̈ praticamente possibile recuperare tutto il volume di plasma disponibile; la separazione fisica del plasma dal sedimento costituito dalle componenti particolate viene infatti tipicamente effettuata per aspirazione o per decantazione e si ferma quando sia stato allontanato circa il 70% del plasma, poiché il recupero del volume restante comporterebbe il rischio di parziale risospensione del sedimento, in particolare dei trombociti, con conseguente inquinamento del plasma raccolto.

Anche l’impiego di gel separatori risolve solo in parte questo problema, in quanto una frazione significativa di plasma, variabile a seconda dell'ematocrito del campione, rimane intrappolato all’interno del gel. Inoltre, anche in questo caso, nei sistemi automatici di separazione, l’ago di aspirazione viene arrestato a qualche millimetro dall'interfaccia gel/plasma per evitare la contaminazione di quest’ultimo con il gel stesso. Anche nel caso in cui il sangue venga lasciato coagulare allo scopo di ottenerne il siero su cui condurre le analisi, la centrifugazione presenta svantaggi analoghi a quelli descritti.

Un altro aspetto critico da considerare, quando venga impiegata la centrifugazione allo scopo di separare il plasma dal sangue intero, à ̈ la possibile alterazione della composizione del plasma provocata dall'attività metabolica delle cellule ematiche, che rimangono in contatto con il plasma anche dopo il termine della centrifugazione. Un esempio molto noto a questo riguardo à ̈ l'alterazione della glicemia che, in assenza di inibitori della glicolisi, tende a diminuire anche successivamente alla centrifugazione a causa del metabolismo eritrocitario.

Questo effetto indesiderato rende necessario l’allontanamento immediato del plasma dal sedimento al termine della centrifugazione, oppure il mantenimento a basse temperature (4-5°C) del sangue centrifugato nei tubi da centrifuga per ridurre al minimo l’attività metabolica cellulare. Tale inconveniente non si riscontra invece nei processi separativi basati sulla filtrazione, poiché in questo caso la separazione del plasma dagli elementi figurati si accompagna, contestualmente, alla perdita di contatto fisico tra loro; la filtrazione, come spiegato in dettaglio più avanti, presenta tuttavia altri svantaggi.

Gli inconvenienti della centrifugazione assumono una rilevanza molto maggiore nel caso di prelievi di sangue capillare (da digitopuntura, da lobo auricolare, dalla cute del piede, ecc.), in cui il volume di sangue ottenibile varia da pochi microlitri a qualche centinaio di microlitri. In queste condizioni, il volume di plasma ottenibile dopo centrifugazione si riduce molto rapidamente al diminuire del volume del campione, fino a diventare nullo per volumi di sangue di pochi microlitri. Emerge quindi una ulteriore criticità, connessa alla difficoltà di suddividere in modo accurato i piccoli volumi di plasma separato in tante frazioni quante sono le analisi da effettuare sul campione.

Un altro metodo teoricamente applicabile per la separazione del plasma dal sangue intero à ̈ la filtrazione. In effetti numerosi metodi sono stati proposti, che utilizzano mezzi filtranti e procedure differenti. Tutti i metodi proposti fino ad oggi, presentano tuttavia gli svantaggi di essere costosi e richiedere molto tempo, oltre che di consentire solo la separazione di una piccola percentuale del plasma disponibile e di obbligare quindi al prelievo di un volume proporzionalmente maggiore di sangue. Inoltre, in determinate condizioni, la filtrazione può comportare il rischio di lisi delle cellule rosse (emolisi) che causa l'alterazione della composizione biochimica del plasma, e quindi dei risultati delle analisi di laboratorio.

Questi inconvenienti sono causati prevalentemente dalla elevata viscosità del sangue e dall’effetto di ostruzione dei pori dei mezzi filtranti da parte delle cellule del sangue durante il processo di filtrazione. Per questi motivi, la filtrazione non si à ̈ affermata fino ad oggi come metodo di separazione del plasma dal sangue intero nella pratica delle analisi chimico-cliniche.

Nessuno dei metodi attualmente impiegati per separare il sangue intero nelle sue componenti, consente pertanto di ottenere da un campione di sangue capillare, tipicamente variabile tra pochi microlitri e 200/300 microlitri, o da un piccolo campione di sangue venoso, un volume di plasma utile per l'effettuazione di un insieme completo di indagini biochimiche.

E' pertanto sentito i l problema tecnico di disporre di un metodo di separazione degli elementi corpuscolati che consenta di ottenere, anche da piccole quantità di sangue, quali quelle che tipicamente si ottengono da digitopuntura, dai neonati o da piccoli animali, un volume di plasma sufficiente per l'effettuazione delle analisi chimico-cliniche ed immunochimiche, e che non presenti gli inconvenienti messi in evidenza sopra per i metodi noti.

Sommario dell'Invenzione

Ora il Richiedente ha messo a punto un metodo ed un dispositivo per la determinazione di analiti nel plasma, ottenuto in modo veloce ed accurato per separazione degli elementi corpuscolati da sangue intero.

Con questo metodo ed il relativo dispositivo à ̈ inoltre possibile ottenere quantità di plasma molto maggiori rispetto ai metodi noti, a partire dalle stesse quantità di sangue intero prelevato al paziente. L’utilizzo del metodo dell’invenzione rende pertanto realizzabile l’effettuazione di analisi complete sul plasma anche a partire da piccole quantità di sangue intero ottenute da microprelievi, ad esempio da digitopuntura.

Oggetto dell'invenzione à ̈ pertanto un metodo per la determinazione di analiti nel sangue intero, venoso o capillare, comprendente i seguenti stadi:

i) diluizione di sangue intero in una soluzione iso-osmolare comprendente uno o più anticoagulanti ed almeno un tracciante fotometrico, detta soluzione avente assorbanza nota;

ii) filtrazione del sangue intero diluito proveniente dallo stadio i), mediante applicazione di una differenza di pressione idrostatica, attraverso una membrana microporosa idrofilica, in cui gli elementi corpuscolati del sangue sono ritenuti da detta membrana mentre il filtrato, comprendente plasma diluito e tracciante fotometrico, attraversa la membrana;

iii) recupero del filtrato proveniente dallo stadio ii) e misurazione per via fotometrica dell’assorbanza del filtrato;

iv) determinazione degli analiti di interesse, in cui la concentrazione misurata per ciascun analita à ̈ moltiplicata per un fattore di diluizione Fdcalcolato in base alla seguente formula:

Fd= (Ai/Ad)/[(Ai/Ad)-1],

dove Aià ̈ l’assorbanza del tracciante fotometrico in detta soluzione iso-osmolare; e Adà ̈ l’assorbanza del tracciante in detto filtrato, per ottenere la concentrazione degli stessi analiti nel sangue intero di partenza.

Ulteriore oggetto dell'invenzione à ̈ un dispositivo per l'attuazione del suddetto metodo caratterizzato dal fatto di comprendere un recipiente atto a contenere un determinato volume di soluzione iso-osmolare ed effettuare la diluizione del sangue intero; un elemento filtrante comprendente una membrana microporosa idrofilica ed una apertura per la fuoriuscita del plasma; e mezzi per generare una differenza di pressione idrostatica tra i due lati di detta membrana. Ulteriore oggetto dell’invenzione à ̈ l’uso del suddetto dispositivo per l’ottenimento di plasma diluito a partire da sangue intero, capillare o venoso.

Ulteriori importanti caratteristiche del metodo e del dispositivo dell'invenzione sono riportate nella seguente descrizione dettagliata.

Breve descrizione delle Figure

Altre caratteristiche e vantaggi dell’invenzione risulteranno più chiaramente dalla descrizione che segue di sue forme realizzative fatte a titolo esemplificativo e non limitativo con riferimento alle figure allegate, in cui:

- la Figura 1 rappresenta una vista della sezione longitudinale del dispositivo dell’invenzione;

- la Figura 2 rappresenta una vista della sezione longitudinale del dispositivo di Figura 1 nelle diverse configurazioni assunte durante l'applicazione del metodo dell'invenzione, ed indicate in figura con le lettere dell’alfabeto da “a†fino a “g†. In corrispondenza delle frecce à ̈ esercitata una pressione.

Descrizione dettagliata dell'Invenzione

Il metodo dell'invenzione può essere applicato a qualsiasi campione di sangue, sia umano sia animale, per la separazione degli elementi corpuscolati del sangue dal plasma, e successiva determinazione di analiti, usando il dispositivo rappresentato nelle figure.

Con riferimento alla Figura 1, il dispositivo 1 dell’invenzione comprende almeno due componenti A e B, costituiti da materiale plastico, metallico, composito o altro materiale adatto, uguale o diverso tra loro. Il componente A ha funzione di contenitore e diluitore, ed à ̈ formato da un recipiente munito di un’apertura 2 per l’entrata del sangue intero da diluire ed al cui interno può scorrere un pistone 3, posto all’estremità inferiore del recipiente A.

Il componente B ha invece la funzione di elemento filtrante, e comprende una membrana microporosa 4, un setto poroso 5, una o più guarnizioni 6 per sigillare ermeticamente la zona sottostante la membrana 4, ed un’apertura 7 per la fuoriuscita del plasma filtrato; il componente B à ̈, per dimensioni e forma, costruito in modo da connettersi alla parte superiore del componente A. In Figura 1 à ̈ inoltre rappresentato un ulteriore componente, indicato con C ed eventualmente compreso nel presente dispositivo; il componente C ha la funzione di tappo del componente A, e comprende per questo una o più guarnizioni 8 che assicurano che il componente A possa venir sigillato ermeticamente quando necessario.

La forma e la struttura del dispositivo come sopra descritte possono essere variate restando comunque nell’ambito dell’invenzione, purché vengano mantenute due aperture, una per l’entrata del sangue intero da diluire ed una per la fuoriuscita del plasma filtrato, una membrana microporosa ed un recipiente atto a contenere la soluzione iso-osmolare ed effettuare la diluizione del sangue intero. Il dispositivo può ad esempio avere la configurazione di un adatto contenitore con filtro da siringa o punte filtranti da pipetta o filtri a trottola.

Alternativamente, i componenti B e C del dispositivo di Figura 1 possono essere sostituiti da una piastra di copertura destinata ad impegnarsi con il componente A, e munita di almeno un’apertura per l’ingresso del sangue intero nel contenitore A ed almeno un elemento filtrante con le medesime caratteristiche descritte sopra per il componente B. Grazie alla possibilità di scorrimento della piastra di copertura su apposite slitte, eventualmente comandato da adatti sistemi di automazione, le fasi di immissione del sangue intero nel contenitore A e di filtrazione possono essere automatizzate.

In Figura 2 à ̈ rappresentato lo stesso dispositivo di Figura 1, nelle diverse configurazioni di utilizzo ed applicazione del metodo dell’invenzione, indicate con le lettere da “a†fino a “g†.

Nella configurazione a, il pistone 3 si trova in posizione di riposo, ed il tappo C viene rimosso dal recipiente A, liberando l’apertura 2 per l’introduzione della soluzione iso-osmolare 9. In alternativa, il recipiente A può essere già pre-riempito, in fase di produzione, con un volume determinato di soluzione iso-osmolare.

Nella configurazione b, il sangue intero 10 à ̈ introdotto nel recipiente A attraverso l’apertura 2, e nella configurazione c, il sangue intero viene diluito nella soluzione iso-osmolare ottenendo una sospensione 11.

La diluizione del sangue intero (stadio i) del presente processo) può essere ad esempio realizzata con una quantità di soluzione iso-osmolare tale da raggiungere ad esempio un rapporto in volume tra sangue intero e soluzione isoosmolare compreso tra 1/1,2 e 1/120, preferibilmente compreso tra 1/5 e 1/30, e più preferibilmente pari a 1/20. Preferibilmente il volume di soluzione iso-osmolare impiegato à ̈ compreso tra 100 e 1000 Î1⁄4L.

Per “soluzione iso-osmolare†, o “soluzione isotonica†, si intende una soluzione avente la stessa osmolarità del plasma; una soluzione di cloruro di sodio in acqua purificata e sterilizzata, avente la stessa osmolarità del plasma, può essere utilizzata per gli scopi dell’invenzione.

La soluzione iso-osmolare utilizzata comprende uno o più anticoagulanti, scelti ad esempio tra eparina, sodio etilendiamminotetraacetato (EDTA), citrato di sodio, e loro miscele; qualsiasi ulteriore agente anticoagulante comunemente usato e adatto ad evitare la formazione di coaguli nel plasma può essere utilizzato allo stesso modo.

La soluzione iso-osmolare secondo l’invenzione comprende inoltre almeno un adatto tracciante fotometrico, che funziona da standard di riferimento interno per le analisi a cui sarà sottoposto il plasma diluito e filtrato; la presenza del tracciante fotometrico consente in altre parole la normalizzazione della diluizione del sangue in modo non dipendente dal volume del sangue stesso. Ovviamente il tracciante fotometrico che viene aggiunto alla soluzione non dovrà avere nessuna attività lisante, o comunque favorente la lisi, degli elementi corpuscolati del sangue, né causare alterazioni della loro membrana cellulare che potrebbe provocare la fuoriuscita di materiale intracellulare. Inoltre, traccianti adatti al presente uso sono quelli che non interferiscono, né come attivatori né come inibitori, con il complesso di reazioni biochimiche, immunochimiche, genetiche o di altra natura, che verranno condotte sul plasma filtrato.

Traccianti fotometrici con un elevato coefficiente di estinzione molare ad almeno una lunghezza d’onda della luce visibile o ultravioletta o infrarossa, sono particolarmente adatti all’uso nella presente invenzione. Secondo una forma di realizzazione preferita dell’invenzione, il tracciante fotometrico presenta un valore massimo di assorbimento fotometrico superiore a 10<2>L·mol<-1>·cm<-1>nella regione dello spettro visibile compresa tra 560 nm e 2000 nm, preferibilmente tra 600 e 740 nm, più preferibilmente tra 625 e 700 nm.

Caratteristica adeguata per i traccianti fotometrici dell’invenzione à ̈ inoltre la stabilità nel tempo del loro spettro di assorbimento; preferibilmente i presenti traccianti presentano, nell’arco di 12 mesi e alla lunghezza d’onda impiegata, una variazione dell’assorbanza ottica inferiore al 5%. La natura del tracciante à ̈ inoltre tale da non interferire con le analisi biochimiche o immunochimiche o di altra natura che sono da effettuare sul campione.

Traccianti fotometrici adatti per l’utilizzo nel presente metodo possono essere perciò scelti ad esempio tra le sostanze organiche colorate impiegate come pigmenti, per la preparazione di inchiostri, vernici, coloranti, e simili; e preferibilmente sono scelti nel gruppo consistente di blu di metile (sale disodico dell’acido [[4-[bis[4-[(sulfonatofenil)ammino]fenil]metilen] cicloesa-2,5-dien-1-iliden] ammino] benzensolfonico, violetto di metile (cloruro di esametile pararosanilina), blu di metilene (cloruro di 3,7-bis(dimetilammino)fenazationio), indaco carminio (sale disodico del l ’acido 2,2’-bis(2,3-diidro-3-ossi-indolen)-5,5’-disolfonico), antocianine quali le antocianine estratte dai fiori della pianta denominata Butterfly pea, e il cosiddetto Brilliant Blue FCF (sale interno disodico di N-etil-N-[4-[[4-[etil[(3-sulfofenil)metil]ammino]fenil](2-sulfofenil)metilen]-2,5-cicloesadien-1-iliden]-3-sulfobenzenmetanamminio idrossido). I traccianti fotometrici sopra riportati hanno solo valore di esempio, potendosi impiegare allo scopo qualsiasi sostanza che risponda alle caratteristiche sopra descritte.

La concentrazione del tracciante fotometrico nella soluzione iso-osmolare può variare tra 10<-9>M e 10<-1>M, e preferibilmente varia tra 10<-6>e 10<-3>M.

La soluzione iso-osmolare dell'invenzione può inoltre comprendere una o più sostanze capaci di provocare l'agglutinazione degli eritrociti, allo scopo di facilitarne la filtrazione. Tra tali sostanze preferite sono le fitoemoagglutinine, o lectine, come ad esempio la Concanavalina A, e gli anticorpi agglutinanti o agglutinine.

Una volta diluito con la soluzione iso-osmolare, il sangue intero viene sottoposto a filtrazione (stadio ii) del presente processo) attraverso una membrana microporosa in materiali idrofilici, o prevalentemente idrofilici, o comunque trattati superficialmente in modo da risultare idrofilici, ad esempio in acciaio o altri materiali metallici, in fibra di vetro, in tessuto naturale o sintetico, oppure in materie plastiche, ad esempio resine poliestere, polimetacrilati, poliammidi, polivinilpirrolidone, polisulfone e loro miscele. L’uso nelle presenti membrane di materiali idrofobici, quali ad esempio il polisulfone, sarà combinato all’uso di polimeri idrofilici così che la membrana risulti idrofilica, oppure a trattamenti fisici, quali ad esempio il trattamento al plasma, allo scopo di impartire alla membrana le caratteristiche di idrofilicità volute.

Secondo l'invenzione con il termine "membrana microporosa" si intende una pellicola di spessore compreso tra 0,001 e 5 mm, avente pori con diametro medio di dimensioni micrometriche, compreso ad esempio tra 0,1 e 50 Î1⁄4m; e preferibilmente compreso tra 0,2 e 10 Î1⁄4m. Particolarmente vantaggioso à ̈ l’uso di membrane con un diametro medio dei pori compreso tra 0,45 e 5 Î1⁄4m. Il termine “membrana microporosa†secondo l’invenzione à ̈ da intendersi inclusivo anche di filtri in fibra di vetro, come ad esempio quelli commercializzati da Pall Gelman con il nome di “glass fiber media†.

Secondo una forma di realizzazione preferita del presente dispositivo, la membrana microporosa 3 à ̈ inoltre “asimmetrica†, intendendo con tale termine l’asimmetria nella distribuzione delle dimensioni medie dei pori della membrana passando da un lato all’altro della membrana stessa; a titolo esemplificativo, i pori con diametro medio maggiore, che si trovano sul lato della membrana che viene in contatto con il sangue intero, hanno un diametro medio compreso tra 1 e 50 Î1⁄4m, e preferibilmente tra 5 e 20 Î1⁄4m, mentre i pori con diametro medio inferiore, che si trovano sul lato opposto, hanno un diametro compreso tra 0,1 e 5 Î1⁄4m, e preferibilmente tra 0,45 e 3 Î1⁄4m.

Membrana particolarmente preferita secondo l’invenzione à ̈ una membrana microporosa asimmetrica costituita da un copolimero polisulfone/polivinilpirrolidone, quale ad esempio la membrana descritta nel brevetto Europeo N. EP 0336483.

In Figura 2 la configurazione d del dispositivo mostra l’inizio dello stadio di filtrazione del presente metodo, in cui il componente filtrante B viene alloggiato sul recipiente A esercitando una pressione dall’alto fino a chiudere ermeticamente lo spazio sottostante la membrana, come rappresentato nella configurazione e, della stessa Figura 2.

Nel dispositivo dell’invenzione, il componente filtrante B, oltre alla membrana microporosa 4, può comprendere il setto poroso 5, un mezzo macroporoso che ha funzione di porta-filtro, e sostiene meccanicamente la membrana nel momento in cui si va ad esercitare su di essa una pressione. Qualsiasi materiale solido macroporoso insolubile può essere utilizzato per preparare un setto poroso adatto al presente dispositivo; può essere ad esempio una rete metallica, un reticolo in materiale plastico, un setto in vetro sinterizzato, un tessuto, e simili.

Le dimensioni della membrana microporosa 4 sono ad esempio comprese tra 5 e 500 mm<2>, mentre quelle del setto poroso 5 possono essere uguali a quelle della membrana o di poco superiori.

La filtrazione attraverso la membrana microporosa 4 à ̈ condotta esercitando una differenza di pressione idrostatica tra le sue superfici, superiore ed inferiore. In Figura 2 la configurazione f rappresenta la fase del metodo dell’invenzione in cui una pressione viene esercitata sulla membrana per mezzo del pistone 3, che à ̈ fatto scorrere lungo il recipiente A, riducendone il volume interno a disposizione e forzando il sangue diluito a passare attraverso la membrana.

Nella successiva configurazione g della stessa Figura 2 il plasma diluito 12 esce dall’apertura 7. Altri mezzi, manuali o elettromeccanici, possono essere usati in alternativa al pistone 3, per creare la differenza di pressione idrostatica desiderata. Allo stesso scopo, può anche essere introdotto nel recipiente A un fluido immiscibile con il sangue diluito in esso contenuto, oppure può essere esercitata una depressione attraverso l’apertura 7 per provocare la fuoriuscita del plasma, oppure il dispositivo può essere sottoposto a centrifugazione in modo da generare una opportuna differenza di pressione tra i due lati della membrana microporosa, tale da provocare la filtrazione del sangue diluito attraverso la membrana stessa.

Il filtrato recuperato dopo il passaggio del sangue intero attraverso la membrana à ̈ costituito da plasma diluito in cui i diversi analiti possono essere determinati, sia qualitativamente sia quantitativamente, per via fotometrica, fluorimetrica, o con altre tecniche note; la concentrazione degli analiti nel plasma filtrato verrà calcolata tenendo conto del fattore di diluizione, Fd, determinato per via fotometrica in base al rapporto di diluizione del tracciante fotometrico, che quindi svolge la funzione di standard di riferimento interno. In termini quantitativi:

Fd= (Ai/Ad)/[(Ai/Ad)-1],

dove Ai= assorbanza della soluzione iso-osmotica; Ad= assorbanza del plasma diluito dopo filtrazione.

E’ noto agli esperti nell’arte che, affinché la relazione sopra descritta possa fornire un valore corretto del fattore di diluizione, occorre che le due assorbanze vengano determinate alla stessa lunghezza d'onda.

Il presente dispositivo si presta ad essere azionato sia manualmente sia automaticamente, mediante sistemi di azionamento e controllo automatici, e comprenderà adeguati mezzi per la determinazione degli analiti secondo metodi noti e per la misura delle assorbanze.

Grazie al metodo e al dispositivo dell'invenzione come sopra descritti à ̈ possibile realizzare una separazione accurata del sangue intero in plasma ed elementi corpuscolati, limitando inoltre i rischi di contaminazione sia del plasma sia dell'operatore che manipola i campioni. Inoltre, grazie alla diluizione del campione di sangue intero, e alla possibilità di determinare accuratamente il fattore di diluizione per via fotometrica, si possono effettuare, e ripetere più volte sullo stesso campione, analisi complete anche a partire da quantità esigue di sangue come quelle ottenute con i microprelievi.

Il presente metodo à ̈ particolarmente vantaggioso quando il campione di sangue intero a disposizione per le analisi ha un volume inferiore ai 500 Î1⁄4L, o addirittura inferiore ai 100 Î1⁄4L, come accade generalmente nel caso dei prelievi capillari.

Il dispositivo dell’invenzione potrà essere utilizzato per ottenere plasma diluito a partire da sangue intero, anche per usi diversi da quelli della determinazione di analiti nel sangue.

I seguenti esempi sono forniti allo scopo di illustrare la presente invenzione senza tuttavia costituirne una limitazione.

Esempio 1

Un contenitore con le caratteristiche del contenitore-diluitore “A†di Figura 1 ed avente una capacità di 1000 µL à ̈ stato pre-riempito con 600 µL di una soluzione così composta: tampone fosfato 20 mM, pH 7,4; NaCl 128 mM; Concanavalina A 1 mg/ml; blu metile 10 Î1⁄4M.

Una membrana microporosa asimmetrica costituita da un disco di 10 mm di diametro di un copolimero polisulfone-polivinilpirrolidone e con porosità media pari a 2 Î1⁄4m, prodotta da Spectral Diagnostics Inc. (Canada), à ̈ stata montata su un setto poroso, in modo tale che il lato con i pori più larghi sia orientato verso il recipientediluitore, mentre il lato con i pori più piccoli sia in contratto con il setto poroso.

Esempio 2

Sono state condotte prove comparative, usando come confronto due metodi noti di separazione, la centrifugazione e la filtrazione, ed il metodo oggetto della presente invenzione attuato usando il dispositivo e la soluzione iso-osmolare descritti nell'Esempio 1.

Volumi variabili, compresi tra 5 e 500 µL, di sangue capillare sono stati sottoposti a centrifugazione a temperatura ambiente, su provette tipo “Eppendorf†a fondo conico da 1 ml usando una centrifuga Stat-spin, con accelerazione di gravità di 1500 g.

Uguali volumi di sangue capillare dallo stesso individuo sono stati sottoposti a filtrazione a temperatura ambiente, con una membrana filtrante microporosa asimmetrica polisulfone / polivinilpirrolidone avente diametro medio di 10 mm e porosità media di 2 Î1⁄4m; la pressione di filtrazione esercitata era di 20 mBar.

Per valutare il metodo oggetto della presente invenzione rispetto ai suddetti due metodi di confronto, un volume variabile, compreso tra 5 e 500 µL, di sangue capillare dallo stesso individuo à ̈ stato aggiunto e miscelato con 600 µL di soluzione iso-osmotica contenuta nel diluitore A del dispositivo dell’invenzione.

Il sangue così diluito à ̈ stato quindi filtrato a temperatura ambiente, mediante applicazione di una forza di intensità adeguata al pistone (elemento 3 in figura 1) tale da ottenere una pressione di filtrazione pari a 20 mBar, con un elemento B del dispositivo munito di membrana filtrante microporosa asimmetrica polisulfone / polivinilpirrolidone avente diametro medio di 10 mm e porosità media di 2 Î1⁄4m.

Nella seguente Tabella 1 nella seconda colonna sono riportati i valori del volume di plasma stimato nel campione, pari al volume di sangue prelevato per l’ematocrito / 100, mentre nella quarta colonna sono riportati i valori del volume di plasma ottenuto con i tre metodi, applicati a campioni di sangue capillare prelevati dallo stesso individuo.

Tabella 1

Volume sangue, µl Volume plasma Metodo di Max. volume di Tempo (ematocrito = 43) µl separazione plasma ottenibile µl (s)

5 2,15 centrifugazione 0 180

5 2,15 filtrazione 0 20

5 2,15 presente metodo 1,5 3

20 8,6 centrifugazione 3 180

20 8,6 filtrazione 0 57

20 8,6 presente metodo 6 5

50 21,5 centrifugazione 10 180

50 21,5 filtrazione 7 83

50 21,5 presente metodo 20 10

200 86 centrifugazione 50 180

200 86 filtrazione 20 114

200 86 presente metodo 83 15

500 215 centrifugazione 180 180

500 215 filtrazione 50 144

500 215 presente metodo 210 26

I risultati riportati sopra in Tabella 1 mostrano come il metodo dell’invenzione sia vantaggioso rispetto ai metodi noti presi in considerazione, sia in termini di quantità di plasma ottenuto sia in termini di tempi necessari ad ottenerlo.

Come si può vedere in Tabella 1, con i metodi noti non si riesce addirittura ad ottenere alcunché di plasma quando si parte da quantità di sangue pari a 20 Î1⁄4L o inferiori.

Esempio 3

Le prove sperimentali e di confronto descritte sopra nell'Esempio 2 sono state ripetute in condizioni equivalenti, tranne per la natura della membrana microporosa usata per la filtrazione ed il presente metodo, costituita ora da una membrana idrofilica in nylon microporoso, avente una porosità media di 0,8 Î1⁄4m.

Anche la pressione di filtrazione à ̈ stata cambiata, essendo ora pari a 40 mBar.

Nella seguente Tabella 2 sono riportati i valori ottenuti con i tre metodi, applicati a campioni di sangue capillare ottenuti dallo stesso individuo.

Tabella 2

Volume sangue, µl Volume plasma, Metodo di Max. volume di Tempo (s) (ematocrito = 45,3) µl separazione plasma ottenibile µl

5 2,3 centrifugazione 0 180 5 2,3 filtrazione 0 30 5 2,3 presente metodo 1,9 5

20 9,1 centrifugazione 3 180 20 9,1 filtrazione 0 66 20 9,1 presente metodo 8 7

50 22,7 centrifugazione 8 180 50 22,7 filtrazione 5 94 50 22,7 presente metodo 18 11

200 90,6 centrifugazione 47 180 200 90,6 filtrazione 15 122 200 90,6 presente metodo 86 17

500 226,5 centrifugazione 191 180 500 226,5 filtrazione 65 160 500 226,5 presente metodo 215 28

I risultati degli esperimenti descritti sopra negli Esempi 1 e 2 dimostrano come il metodo oggetto della presente invenzione consenta di ottenere un volume di plasma nettamente maggiore rispetto ai metodi noti di separazione del sangue intero, sufficiente per l'esecuzione di numerosi test biochimico - clinici, e in un tempo nettamente inferiore rispetto ai metodi noti presi qui come confronto. Come si può vedere nelle Tabelle 1 e 2, con i metodi noti non si riesce addirittura ad ottenere alcunché di plasma quando si parte da quantità di sangue pari a 20 Î1⁄4L o inferiori.

Esempio 4

Sui campioni di plasma ottenuti con i tre metodi di separazione descritti sopra nell’Esempio 2 sono stati condotti dosaggi di glucosio e di aspartato amminotransferasi (AST) usando un sistema Hitachi 911.

Nella seguente Tabella 3 sono riportati i risultati delle due analisi quantitative condotte sui campioni di plasma ottenuti con i tre metodi di separazione descritti sopra nell’Esempio 2, applicati a campioni di sangue capillare ottenuti da cinque diversi individui, distinti con le lettere A, B, C, D ed E.

Tabella 3

Campione Volume sangue, µl Metodo di [Glucosio], C.V. (N= 15)<3>AST, U I<2>/ l C.V.

(ematocrito= 43) separazione/analisi mg/100ml (N= 15)<3>A 5centrifugazioneNA NA

filtrazioneNA NA

presente metodo 88 2,8 15 6,520<centrifugazione 1>95 7,9<1>50 14,5filtrazioneNA NA

presente metodo 89 2,2 21 4,050centrifugazione96 3,0 19 3,2<filtrazione 1>98 5,2<1>26 8,3presente metodo 96 1,8 17 2,2200centrifugazione95 2,7 16 3,7<filtrazione 1>102 2,6<1>28 3,1presente metodo 90 1,0 19 2,2500centrifugazione88 1,6 14 2,3filtrazione96 2,2 19 4,1presente metodo 92 1,1 17 1,8 Metodo di riferimento93 1,5 16 3,1 B 5centrifugazioneNA NA

filtrazioneNA NA

presente metodo 102 3,2 25 3,720<centrifugazione 1>100 8,1<1>54 7,5filtrazioneNA NA

presente metodo 98 1,9 28 2,550centrifugazione99 2,2 27 4,9<filtrazione 1>106 4,3<1>45 5,1presente metodo 96 1,2 20 2,0200centrifugazione95 1,8 22 1,9filtrazione102 2,8 30 3,1presente metodo 97 2,3 24 2,4500centrifugazione99 3,5 25 3,0filtrazione99 2,9 27 2,6presente metodo 95 1,9 23 1,2 Metodo di riferimento97 0,8 23 2,6 C 5centrifugazioneNA NA

filtrazioneNA NA

presente metodo 110 2,1 12 3,020<centrifugazione 1>115 7,3<1>28 13,5filtrazioneNA NA

presente metodo 112 1,8 15 1,550centrifugazione105 3,1 14 4,1<filtrazione 1>113 6,0<1>27 7,0presente metodo 110 2,5 10 2,1200centrifugazione112 2,0 11 1,4filtrazione117 1,8 12 1,4presente metodo 106 1,3 15 1,8500centrifugazione107 1,2 16 3,0filtrazione110 1,4 13 2,0presente metodo 108 1,4 12 1,5 Metodo di riferimento108 1,4 12 2,5Campione Volume sangue, µl Metodo di [Glucosio], C.V. (N= 15)<3>AST, U I /l C.V. (ematocrito= 43) separazione/analisi mg/100ml (N= 15)<3>

D 5centrifugazioneNA NA

filtrazioneNA NA

presente metodo 76 1,6 30 2,220<centrifugazione 1>82 7,5<1>38 9,4filtrazioneNA NA

presente metodo 78 1,8 30 4,150centrifugazione77 0,8 27 3,8<filtrazione 1>83 5,3<1>38 7,1presente metodo 80 2,1 32 2,0200centrifugazione82 1,7 26 1,8filtrazione76 0,8 29 2,9presente metodo 76 1,0 30 2,0500centrifugazione73 1,8 33 3,1filtrazione76 1,0 35 1,9presente metodo 78 1,1 35 1,8 Metodo di riferimento78 0,9 32 2,2

E 5centrifugazioneNA NA

filtrazioneNA NA

presente metodo 90 1,9 20 3,020<centrifugazione 1>90 8,5<1>32 13,0filtrazioneNA NA

presente metodo 90 1,7 19 2,050<centrifugazione 1>93 1,8<1>34 4,1filtrazione85 5,3 28 7,2presente metodo 84 2,5 19 1,9200centrifugazione87 2,7 23 1,1filtrazione89 1,8 25 1,2presente metodo 88 1,0 22 1,4500centrifugazione84 2,0 26 3,0filtrazione86 2,1 24 2,6presente metodo 88 1,0 20 1,6 Metodo di riferimento88 1,5 23 2,2

<1>Campioni con evidente emolisi.

<2>UI / l = Unità Internazionali per litro.

<3>C.V. = Coefficiente di variazione, indice statistico che indica la precisione di una misura, ovvero la dispersione delle misure intorno alla media. N=15 indica che sono state effettuate 15 misure

Nella suddetta Tabella 3 con “NA†si intende “NON APPLICABILE†, poiché il volume di plasma ottenuto era insufficiente per eseguire l'analisi; mentre per “Metodo di riferimento†si intende un metodo tradizionale di prelievo venoso in presenza di anticoagulante, con separazione del plasma per centrifugazione ed analisi su sistema Hitachi 911.

E’ evidente dai risultati degli esperimenti condotti, sopra illustrati, come sia possibile ottenere, con il metodo oggetto della presente invenzione, risultati accurati e precisi anche con volumi di sangue intero inferiori a 50 µL.

Al contrario, risulta invece evidente come i valori degli analiti risultino inaccurati ed imprecisi sia quando à ̈ impiegato come metodo di separazione dal plasma la filtrazione, a causa della emolisi del campione, sia quando viene impiegata la centrifugazione, a causa della presenza di eritrociti nel plasma.

Esempio 5

Su campioni A di sangue capillare da 30 Î1⁄4L ciascuno à ̈ stata effettuata una separazione con recupero del plasma come descritto in Esempio 3, con il presente metodo e con i due metodi di confronto della centrifugazione e della filtrazione tradizionale, andando poi a determinare la quantità di glucosio e di AST.

Nella seguente Tabella 4 sono riportati i parametri utilizzati per calcolare la concentrazione effettiva nel campione di due analiti, glucosio e AST, sulla base del fattore di diluizione Fddeterminato come descritto sopra. In particolare, sono stati misurati i valori di assorbanza a 37°C e 630 nm di lunghezza d’onda, per la soluzione iso-osmolare (ABS diluente) e per il plasma diluito filtrato (ABS filtrato).

Le “concentrazioni misurate†riportate nella Tabella 4 sono le concentrazioni rilevate nel plasma, mentre le “concentrazioni calcolate†sono le concentrazioni ottenute moltiplicando per il fattore di diluizione le concentrazioni misurate sul plasma diluito ottenuto con il presente metodo.

Tabella 4

Sangue Metodo di ABS ABS Fattore di Glucosio, Glucosio, AST, AST, capillare separazione/ diluente, filtrato diluizione, Concentrazione Concentrazione Concentrazione Concentrazione 30 µL analisi 37°C, 37°C, Fdmisurata, mM calcolata, mM misurata, IU/l calcolata, IU/l 630nm 630nm

Acentrifugazione- - - 5,7 - 32 -Afiltrazione- - - NA - NA -A<presente metodo>1800 1742 31,04 0,19 5,9 0,81 25Ametodo di - - - 5,9 24

riferimento

Come in Tabella 3, anche nella suddetta Tabella 4, con “NA†si intende “NON APPLICABILE†, poiché il volume di plasma ottenuto era insufficiente per eseguire l'analisi. Come si può vedere in Tabella 4, con la filtrazione tradizionale non à ̈ stato possibile ottenere una quantità di plasma sufficiente ad eseguire l’analisi, mentre con la centrifugazione le quantità di analiti misurate si sono rivelate meno accurate di quelle misurate con il presente metodo, rispetto ai valori determinati con il metodo di riferimento, definito come sopra nell’Esempio 4.

Gli esempi qui riportati hanno un mero significato dimostrativo e non sono limitativi, né esaustivi della presente invenzione.

Claims (14)

1. RIVENDICAZIONI 1. Un metodo per la determinazione di analiti nel sangue intero, capillare o venoso, comprendente i seguenti stadi: i) diluizione di detto sangue intero in una soluzione iso-osmolare comprendente uno o più anticoagulanti ed almeno un tracciante fotometrico, detta soluzione avente assorbanza nota ad una certa lunghezza d’onda; ii) filtrazione del sangue intero diluito proveniente dallo stadio i), mediante applicazione di una differenza di pressione idrostatica, attraverso una membrana microporosa idrofilica, in cui gli elementi corpuscolati del sangue sono ritenuti da detta membrana mentre il filtrato comprendente plasma diluito e tracciante fotometrico, attraversa la membrana; iii) recupero del filtrato proveniente dallo stadio ii) e misurazione per via fotometrica dell’assorbanza del filtrato alla stessa lunghezza d’onda dello stadio i); iv) determinazione della concentrazione degli analiti di interesse nel filtrato proveniente dallo stadio iii) e moltiplicazione del valore di concentrazione misurato per un fattore di diluizione Fdcalcolato in base alla seguente formula: Fd= (Ai/Ad)/[(Ai/Ad)-1], dove Aià ̈ l’assorbanza del tracciante fotometrico in detta soluzione iso-osmolare; e Adà ̈ l’assorbanza del tracciante in detto filtrato, per ottenere la concentrazione degli stessi analiti nel sangue intero di partenza.
2. 2. Il metodo secondo la rivendicazione 1, in cui la diluizione del sangue intero allo stadio i) Ã ̈ realizzata aggiungendo al sangue intero un volume di detta soluzione iso-osmolare compreso tra 100 e 1000 Î1⁄4l, fino ad ottenere un rapporto in volume tra sangue intero e soluzione iso-osmolare compreso tra 1/1,2 e 1/120.
3. 3. Il metodo secondo la rivendicazione 2, in cui detto rapporto in volume tra sangue intero e soluzione iso-osmolare à ̈ compreso tra 1/5 e 1/30.
4. 4. Il metodo secondo la rivendicazione 3, in cui detto rapporto in volume tra sangue intero e soluzione iso-osmolare à ̈ pari a 1/20.
5. 5. Il metodo secondo la rivendicazione 1, in cui detto tracciante fotometrico presenta un massimo di assorbimento della luce ad una lunghezza d’onda compresa tra 560 e 2000 nm, ed à ̈ scelto nel gruppo consistente di blu di metile, violetto di metile, blu di metilene, indaco carminio, antocianine e Brilliant Blue FCF.
6. 6. Il metodo secondo la rivendicazione 1, in cui la concentrazione di detto tracciante fotometrico in detta soluzione iso-osmolare à ̈ compresa tra 10<-9>M e 10<-1>M, e preferibilmente à ̈ compresa tra 10<-6>e 10<-3>M.
7. 7. Il metodo secondo la rivendicazione 1, in cui detta membrana microporosa idrofilica ha il diametro medio dei pori compreso tra 0,45 e 5 Î1⁄4m.
8. 8. Il metodo secondo la rivendicazione 1, in cui detta membrana microporosa idrofilica à ̈ asimmetrica nella distribuzione del diametro medio dei pori tra i due lati della membrana stessa.
9. 9. Il metodo secondo la rivendicazione 1, in cui detta membrana microporosa idrofilica à ̈ una membrana costituita da polisulfone idrofilico, o da un copolimero idrofilico polivinilpirrolidone / polisulfone.
10. 10. Il metodo secondo la rivendicazione 1, in cui detto sangue intero di partenza ha volume inferiore ai 500 Î1⁄4L.
11. 11. Il metodo secondo la rivendicazione 10, in cui detto sangue intero di partenza ha volume inferiore ai 100 Î1⁄4L.
12. 12. Il metodo secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, in cui detto sangue intero à ̈ sangue intero capillare.
13. 13. Un dispositivo per la determinazione di analiti nel plasma ottenuto da sangue intero, capillare o venoso, comprendente un recipiente atto a contenere un determinato volume di soluzione iso-osmolare ed effettuare la diluizione di detto sangue intero; un elemento filtrante comprendente una membrana microporosa idrofilica ed una apertura per la fuoriuscita del plasma filtrato; e mezzi per generare una differenza di pressione idrostatica tra i due lati di detta membrana.
14. 14. Uso del dispositivo come descritto nella rivendicazione 13, per l’ottenimento di plasma diluito a partire da sangue intero, capillare o venoso.