KR102149318B1 - 소량 응집 검정 - Google Patents

소량 응집 검정 Download PDF

Info

Publication number
KR102149318B1
KR102149318B1 KR1020157004309A KR20157004309A KR102149318B1 KR 102149318 B1 KR102149318 B1 KR 102149318B1 KR 1020157004309 A KR1020157004309 A KR 1020157004309A KR 20157004309 A KR20157004309 A KR 20157004309A KR 102149318 B1 KR102149318 B1 KR 102149318B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
delete delete
sample
coagulation
time
assay
Prior art date
Application number
KR1020157004309A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20150034793A (ko
Inventor
마크 다얄
사마르타 앤칼
폴 파텔
이안 깁슨스
엘리자베스 홈즈
Original Assignee
테라노스, 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 테라노스, 인코포레이티드 filed Critical 테라노스, 인코포레이티드
Publication of KR20150034793A publication Critical patent/KR20150034793A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102149318B1 publication Critical patent/KR102149318B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/84—Systems specially adapted for particular applications
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/49—Blood
    • G01N33/4905—Determining clotting time of blood
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/745—Assays involving non-enzymic blood coagulation factors
    • G01N2333/75—Fibrin; Fibrinogen

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Ecology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

소량의 혈액을 사용하여 응고 변수를 측정하기 위한 구성물 및 방법을 제시한다. 본서가 기술하는 방법은 한 방울의 혈액으로 수행할 수 있는 이점이 있으며 선택적으로, 다중 형태를 지닌 다른 측정을 수행하기에 충분한 샘플을 일반적으로 남길 수 있다. 이 방법 및 장치는 숙련된 분석가가 필요하지 않으며 혈액 응고 질환 및 치료를 관리할 수 있는 중요한 특성이 되는, 서비스 포인트에서 수행할 수 있다.

Description

소량 응집 검정{LOW-VOLUME COAGULATION ASSAY}
상호 참조
본 출원은 2012년 7월 18일에 출원되었으며, 본서에 그 전문이 참고문헌으로 통합된 미국 가출원 제 61/673,227호의 이익을 청구한다.
배경
응집은 혈액 또는 혈장이 혈병을 형성하는 복잡한 과정이다. 이는 항상성의 중요한 부분이며, 손상된 혈관으로부터 출혈을 멈추게 하는데, 이 경우 출혈을 멈추고 손상된 혈관의 복구를 시작하기 위해 혈소판 및 피브린-함유 혈병이 손상된 혈관벽을 덮는다. 불충분한 응집은 출혈의 위험(출혈)을 증가시킬 수 있으며 과도한 응고는 폐쇄성 응고(혈전증)을 유발할 수 있으므로, 응집 과정은 생물학에 걸쳐 엄격하게 제어되고 고도로 보존되어야 한다.
혈액 응집 장애는 매우 위험하며, 이를 다루며 응고를 제어하는 치료 수단은 관리하기 어렵고 또한 위험하다. 또한, 많은 환자들이 심장 판막 대치술을 받은 후 와파린과 같은 항응고제 약물로 임상치료를 받고 있으며 모니터할 필요가 있다.바이오마커 및 다른 치료제를 측정하는 프로그램을 모니터링하는 보다 종합적인 보건 및 치료의 부분으로 응집 매개변수, 특히 프로트롬빈 시간("PT", 이는 또한 수학적 변환, 국제 정규화 비율 "INR"로 표현된다), 및 활성화 부분 트롬보플라시틴 시간("aPTT")을 모니터할 수 있다면 매우 유리하다. 상대적으로 많은 용량의 혈액 및 혈장을 요구하는 기존의 방법을 사용하는, 전형적으로 정량 진공 튜브에 5 ml를 채취하는, 임상 실험실에서 PT, INR 및 aPTT를 측정할 수 있다. 환자 혈액 응집 매개변수의 모니터링을 향상시키기 위해, 응집 검정을 수행하고 응집 매개변수를 측정하는 데 개선할 필요가 있다.
본 발명은 아주 소량의 혈액 샘플을 사용하여 응고 매개변수를 측정하는 문제를 해결할 필요성을 인식하였고 이의 해결책을 제시한다. 본서가 기술하는 방법은 한 방울의 혈액(약 20 ㎕)에서 유래하는 소량의 혈액 또는 혈장으로 유리하게 수행될 수 있으며, 일반적으로 다른 측정을 실행하기에 충분한 샘플이, 선택적인 다중 형식으로 남게 된다. 이 방법과 장치에 숙련된 실험자가 필요하지 않으며 서비스 장소에서 실행될 수 있고, 이는 약물의 용량 및 빈도를 조정하는 데 유용한 정보를 제공하여 혈액 응고 장애 및 치료를 관리할 수 있는 중요한 특성이 된다.
일부 실시 예로, 응집을 검정하기 위한 방법은 다음을 포함한다. A) 아주 소량의 혈액 샘플(예: 20 l 이하)에서 응집의 모니터링, 및/또는 B) 샘플 혈액의 전부 또는 일부를 희석사고 검정에 희석을 샘플을 사용하여, 검정에 사용되는 샘플의 총량을 감소시킨다.
한 측면으로, 희석된 또는 희석되지 않은 샘플로 응집 검정을 수행하기 위해 다양한 기술을 제시한다. 한 실시 예로, 용기의 표면에 초기 혈병이 부착하는 것을 돕는 용적비가 높은 표면을 함유하는 소량의 용기에서 응고 검정을 수행한다. 다른 실시 예로, 혈병의 강도 및/또는 응고 과정에서 생성된 탁도(광 산란에 의한)를 증가시키는 외인성 물질(예를 들어, 피브리노겐)을 샘플에 첨가한다. 다른 실시 예로, 작은 구슬을 혈액 샘플에 첨가하고, 중력에 의해 침전하는 구슬의 움직임을 추적하고 혈병의 형성 움직임을 감소 또는 중지시키기 위해 비디오 이미지를 사용한다.다른 실시 예로, 혈액 샘플에 소형 형광 구슬을 첨가하고, 구슬이 브라운 운동, 대류 및/또는 기류에 의해 움직일 때 구슬의 움직임을 추적하고 혈병의 형성 움직임을 감소 또는 중지시키기 위해 형광 현미경을 사용한다. 다른 실시 예로, 혈액 샘플을 용기를 통해 강제로 진행시키고, 이 샘플의 움직임을 추적하며 용기에서 혈병을 형성하는 샘플의 움직임을 감소 또는 감소시키는 데 비디오 이미지를 사용한다.
한 측면에서, 본서는 대상의 혈액 샘플에 대한 응집 시간을 측정하기 위한 방법을 제시한다. 이 방법은 (a) 대상의 혈액 샘플에 있어 응집 반응을 개시하고, (b) 응집 반응의 이미지 세트를 획득하며, (c) 혈액 샘플의 응집 시간을 측정하기 위해 이미지 세트를 분석하는 것을 포함한다.
일면으로, 본서는 대상의 혈액 샘플이 응집하는 시간을 측정하기 위한 방법을 제시한다. 이 방법은 (a) 비-정맥 경로를 통해 대상으로부터 획득한 혈액 샘플의 채취, (b) 혈액 샘플의 응고 반응을 개시, (c) 응고 반응의 이미지 세트를 획득, 및 (d) 혈액 샘플의 응집 시간을 측정하기 위한 이미지 세트를 분석하는 것을 포함하며, 이 경우 단계 (a)에서 (d)까지 수행 시간이 한 시간 또는 그 이하이다. 일례로, 단계 (a)에서 (d)까지 수행 시간이 30분 또는 그 이하이다. 일례로, 단계 (a)에서 (d)까지 수행 시간이 10분 또는 그 이하이다.
일례로, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 ㎕ 이하의 혈액 샘플을 응집 검정에 사용할 수 있다.
일례로, 응집 반응의 양은 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 ㎕ 이하이다.
일례로, 이미지 세트의 개별 이미지는 화소 단위화되고 최소 1, 10, 100, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 또는 10,000 화소를 포함한다.
일례로, 이 방법은 희석한 후 샘플의 응고 시간이 30초에서 10분 사이가 되도록 혈액 샘플의 희석을 추가로 포함한다.
일례로, 이 방법은 응집 반응에 피브리노겐의 첨가하는 것을 추가로 포함한다.
일례로, 개시 단계는 혈액 샘플에 응집 개시 시약을 첨가하는 것을 포함한다.
일례로, 혈액 샘플은 혈장 샘플이다.
일례로, 혈액 샘플은 손가락 채혈을 사용하여 채취될 수 있다.
일례로, 이미지는 응집 반응의 광 산란 이미지이다.
일례로, 응집 시간을 산란된 빛의 강도의 전이를 기초로 측정한다.
일례로, 이 방법은 이미지 세트를 획득하기 전에 구슬들을 혈액 샘플에 첨가하는 것을 추가로 포함한다. 예를 들어 최소 2, 3, 4, 5, 10, 100, 또는1000개의 구슬을 혈액 샘플에 첨가할 수 있다.
일례로, 구슬들은 적어도 두 개의 다른 크기의 구슬을 포함한다.
일례로, 구슬들은 약 1 ㎛에서 5 ㎛ 크기이다.
일례로, 구슬들의 크기는 5 ㎛에서 50 ㎛이다.
일례로, 구슬들은 하나 이상의 폴리스티렌, 라텍스, 아크릴, 또는 유리를 포함한다. 특정 측정으로, 구슬들은 반응 매질과 다른 굴절률을 가질 수 있으며(예: 1, 2, 3, 4, 5, 8, 10, 15, 16, 20, 25, 30, 35, 40, 또는 50% 이상이거나 이하), 또는 불투명일 수 있다. 나아가, 구슬들은 반응 매질과 다른 밀도를 가질 수 있다(예: 1, 2, 3, 4, 5, 8, 10, 15, 16, 20, 25, 30, 35, 40, 또는 50% 이상이거나 이하). 일부 분석에서, 반응 매질은 약 1.01 g/cc의 밀도를 가질 수 있다.
일례로, 이미지 세트를 분석하는 단계는 구슬이 실질적으로 움직이지 않는 시점을 탐색하는 것을 포함한다.
일례로, 이미지 세트를 분석하는 단계는 구슬의 움직임이 변화되는 시점을 탐색하는 것을 포함한다.
일례로, 구슬 움직임의 변화는 응집 반응에 있는 구슬의 침전이 감속하는 것으로 입증될 수 있다.
일례로, 이미지 세트의 분석 단계는 구슬의 움직임을 측정하기 위한 이미지 세트에서 두 개의 이미지를 분석하는 것을 포함한다.
일례로, 두 개의 이미지가 실질적으로 동일한 경우 구슬이 실질적으로 움직이지 않는다.
일례로, 구슬은 표지된다.
일례로, 구슬은 형광 라벨로 표지된다.
다른 예로, 대상에서 채취한 혈액 샘플에 대해 다수의 응집 매개변수를 측정하기 위한 방법을 제시한다. 이 방법은 (a) 대상에서 혈액 샘플을 채취하고, 이 경우 혈액 샘플은 50 ㎕ 이하이며, (b) 혈액 샘플로부터 혈장 샘플을 제조하며, (c) 응집 매개 변수들을 측정하기 위해 혈장 샘플을 사용하여 여러 검정을 수행하고, 이 경우 매개 변수들 중 최소 한 개는 응집 시간이다.
일례로, 응집 변수들 중 하나는 다음 그룹에서 선택한다. 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT), 프로트롬빈 시간(PT), 국제 정상화 비율(INR), 출혈 시간, 응고 인자, 항-인지질 항체, 희석 러셀 살무사 독액 시간(dRVVT), 및 혈소판 기능, 혈액 응고 기능 항진(TEG 또는 소노클롯), 및 유글로불린 용해시간(ELT).
일례로, 10 ㎕ 이하의 혈장 샘플이 다수의 검정에서 개별 검정을 위해 사용된다. 일례로, 2 ㎕의 혈장 샘플이 다수의 검정에서 개별 검정을 위해 사용된다.
일례로, 일부 또는 각 검정들의 반응 용량은 6 ㎕ 이하이다. 일례로, 일부 또는 각 검정들의 반응 용량은 10 ㎕ 이하이다.
일례로, 응집 시간을 측정하기 위해 수행하는 검정 시간은 약 1시간, 30분, 10분, 5분, 또는 1분 이하이다.
일례로, 응집 반응에서 이미지 세트를 채취하는 것은 (i) 검정들 중 최소 한 개의 이미지 세트를 채취하고, (b) 응집 시간을 측정하기 위해 이미지 세트를 분석하는 것을 포함한다.
일면으로, 대상에서 채취한 혈액 샘플의 응집 시간을 측정하기 위한 장치를 제시한다. 이 장치는 (a) 응고 반응이 시작되는 혈병을 형성하기에 적합한 조건에서 대상으로부터 채취한 혈액 샘플에 응고 저해 시약을 첨가하기 위해 설정된 구성물, (b) 응고 반응의 이미지 세트를 얻을 수 있도록 설정된 구성물, 및 (c) 혈액 샘플의 응고 시간을 측정하기 위해 이미지 세트를 분석하는 구성물을 포함한다.
일면으로, 대상자로부터 채취한 혈액 샘플의 응고 시간을 측정하기 위한 시스템을 제시한다. 이 시스템은 (a) 응고 반응이 시작되는 혈병을 형성하기에 적합한 조건에서 대상자로부터 채취한 혈액 샘플에 응고 저해 시약을 첨가하도록 설정된 장치, (b) 응고 반응의 이미지 세트를 획득하는 카메라, 및 (c) 혈액 샘플의 응고 시간을 측정하기 위해 이미지 세트를 분석하는 컴퓨터를 포함한다.
일면으로, 응집된 혈액 샘플을 본서가 제시하는 검정법 중 하나와 사용할 수 있다. 응집 검정법에 사용하기 위해 항응고 처리된 혈액 샘플을 제조하기 위해, 항응고제의 효과를 반전시키는 시약을 항응고제를 초과하여 첨가한다. 항응고제 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 구염산염, 및 옥살산에 대해 적합한 시약은 칼슘(Ca2+)이고, 항응고제 헤파린에 대해 적합한 시약은 폴리브렌이다.
일례로, 본서는 응집에 대한 혼합물 검정 방법을 제시하며, 이는 다음을 포함한다. 다량의 원본 생물학적 샘플을 포함하는 혼합물에서 응집 반응의 개시하고, 이 경우 혼합물은 i) 500밀리리터 이하의 총량을 가지고, ii) 50 밀리리터의 원본 생물학적 샘플 이상을 포함하지 않으며, iii) 95% 이하의 원본 생물학적 샘플 용량을 포함하며, 혼합물에 조명을 비추어 혼합물에서 나오는 빛을 검출하고, 혼합물에서 나오는 빛의 분석에 기초하여 혼합물의 응집을 분석한다.
실시 예로, 다량의 원본 생물학적 샘플을 함유하는 혼합물을 포함하는 본서가 제시하는 방법에서, 이 혼합물은 500, 400, 300, 200, 100 75, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0.5, 또는 0.1 마이크로리터 이하의 총량을 갖는다.
실시 예로, 다량의 원본 생물학적 샘플을 함유하는 혼합물을 포함하는 본서가 제시하는 방법에서, 이 혼합물은 50, 40, 30, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0.5, 또는 0.1 마이크로리터 이하의 원본 생물학적 샘플을 갖는다.
실시 예로, 다량의 원본 생물학적 샘플을 함유하는 혼합물을 포함하는 본서가 제시하는 방법에서, 이 혼합물을 95%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 또는 0.1% 용량 이하의 원본 생물학적 샘플을 갖는다.
실시 예로, 혼합물에서 빛을 검출하는 수행을 포함하는 본서가 제시하는 방법에서, 이 혼합물에서 나오는 빛을 검출하는 수행은 이 혼합물의 이미지를 채취하는 것을 포함한다.
실시 예로, 이 혼합물의 이미지를 채취하는 수행을 포함하는 본서가 제시하는 방법에서, 또한 이 방법은 이미지의 관심 영역(ROI)을 식별하기 위해 이미지를 분석하는 수행을 포함하며, 이 경우 이미지의 관심 영역은 이 혼합물의 이미지화된 정보를 포함한다.
실시 예로, 이미지에서 ROI를 식별하는 수행을 포함하는 본서가 제시하는 방법에서, 이 방법은 또한 ROI에서 평균 광 강도를 판단하기 위해 이미지의 ROI를 분석하는 수행을 포함한다.
실시 예로, 이 혼합물의 이미지를 채취하는 수행을 포함하는 본서가 제시하는 방법에서, 이 방법은 일정 시간 동안 이 혼합물의 최소 제1 이미지 및 제2 이미지를 채취하는 수행을 포함하고, 이 경우 이 혼합물의 응집 시간은 제1 이미지의 ROI 및 제2 이미지의 ROI에 있는 광 강도의 차이를 판단하는 수행을 포함하는 분석에 기초하여 결정한다.
실시 예로, 혼합물의 이미지를 채취하는 수행을 포함하는 본서가 제시하는 방법에서, 이 혼합물의 이미지는 CCD 또는 CMOS 센서를 사용하여 획득한다.
실시 예로, 혼합물의 이미지를 채취하는 수행을 포함하는 본서가 제시하는 방법에서, 이 혼합물의 이미지 채취는 이 이미지의 비디오 채취를 포함한다.
실시 예로, 혼합물에서 나온 빛을 측정하는 수행을 포함하는 본서가 제시하는 방법에서, 이 혼합물에서 나오는 빛의 측정하는 수행은 이 혼합물을 투과한 광을 검출하는 것을 포함한다.
실시 예로, 혼합물을 투과한 광을 검출하는 수행을 포함하는 본서가 제시하는 방법에서, 이 혼합물을 투과한 빛은 일정 시간 동안 검출된다.
실시 예로, 혼합물을 투과한 빛을 검출하는 수행을 포함하는 본서가 제시하는 방법에서, 혼합물을 투과한 빛의 강도가 혼합물의 투과한 빛의 기준과 비교하여 선택한 강도보다 줄어든 경우 이 혼합물의 응집 시간은 시간을 결정하는 수행을 포함하는 분석에 기초하여 식별된다.
실시 예로, 혼합물을 투과한 빛을 검출하는 수행을 포함하는 본서가 제시한 방법에서, 이 혼합물을 투과한 빛의 강도가 이 혼합물을 투과한 빛의 기준 강도와 비교하여 20% 이상 감소한 경우 이 혼합물의 응집 시간은 시간을 결정하는 수행을 포함하는 분석에 기초하여 식별된다.
실시 예로, 혼합물에서 나온 빛을 검출하는 수행을 포함하는 본서가 제시하는 방법에서, 이 혼합물에서 나온 빛의 검출은 이 혼합물에 의해 산란된 빛을 검출하는 수행을 포함한다.
실시 예로, 이 혼합물에 의해 산란된 빛을 검출하는 수행을 포함하는 본서가 제시하는 방법에서, 이 혼합물에서 산란된 빛은 일정 시간 동안 검출된다.
실시 예로, 이 혼합물에 의해 산란된 빛을 검출하는 수행을 포함하는 본서가 제시하는 방법에서, 이 혼합물에 의해 산란된 빛의 강도가 이 혼합물에 의해 산란된 빛의 기준 강도와 비교하여 선택한 강도보다 증가한 경우 이 혼합물의 응고 시간은 시간을 결정하는 수행을 포함하는 분석에 기초하여 식별된다.
실시 예로, 이 혼합물에 의해 산란된 빛을 검출하는 수행을 포함하는 본서가 제시하는 방법에서, 이 혼합물에 의해 산란된 빛의 강도가 이 혼합물에 의해 산란된 기준 강도와 비교하여 20% 이하로 감소된 경우, 이 혼합물의 응집 시간은 시간을 결정하는 수행을 포함하는 분석에 기초하여 식별된다.
실시 예로, 이 혼합물을 투과하거나 산란된 빛을 검출하는 수행을 포함하여 본서가 제시하는 방법에서, 이 혼합물을 투과하거나 산란된 빛은 CCD 센서, CMOS 센서, 광 다이오드, 또는 광전자 증배관(PMT)를 사용하여 검출한다.
실시 예로, 대량의 원본 생물학적 샘플을 함유하는 혼합물에서 일어나는 응집 반응을 포함하여 본서가 제사하는 방법에서, 이 혼합물은 외인성 피브리노겐을 포함한다. 실시 예로, 외인성 피브리노겐은 이 혼합물에서 최소 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 또는 150 mg/ml의 농도이다. 실시 예로, 외인성 피브리노겐은 이 혼합물에서 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 또는 200 mg/ml 이하의 농도이다. 외인성 피브리노겐은 이 혼합물에서 최소 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 또는 150 mg/ml의 농도이고, 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 또는 200 mg/ml 이하의 농도이다.
실시 예로, 대량의 원본 생물학적 샘플을 함유하는 혼합물에서 일어나는 응집 반응의 수행을 포함하여 본서가 제시하는 방법에서, 이 원본 생물학적 샘플은 전혈이다. 실시 예로, 원본 생물학적 샘플은 대상자로부터 전혈을 추출한 후 임의의 액체를 첨가하여 희석된 대상자로부터 얻어진 전혈이 될 수 있다.
실시 예로, 대량의 원본 생물학적 샘플을 함유하는 혼합물에서 일어나는 응집 반응의 수행을 포함하여 본서가 제시하는 방법에서, 이 원본 생물학적 샘플은 혈장이다. 실시 예로, 이 원본 생물학적 샘플은 대상자로부터 혈장을 추출한 후 임의의 액체를 첨가하여 희석한 대상자에서 얻어진 혈장이 될 수 있다.
실시 예로, 대량의 원본 생물학적 샘플을 함유하는 혼합물에서 일어나는 응집 반응의 수행을 포함하여 본서가 제시하는 방법에서, 이 혼합물에 백색광원의 빛을 비춘다.
실시 예로, 대량의 원본 생물학적 샘플을 함유하는 혼합물에서 일어나는 응집 반응의 수행을 포함하여 본서가 제시하는 방법에서, 이 혼합물에 하나 이상의 선택된 파장을 가진 빛을 비춘다.
실시 예로, 대량의 원본 생물학적 샘플을 함유하는 혼합물에서 일어나는 응집 반응의 수행을 포함하여 본서가 제시하는 방법에서, 이 혼합물에 발광 다이오드(LED)의 빛을 비춘다.
실시 예로, 본서가 개시하는 광학 신호는 빛이다. 실시 예로, 본서가 개시하는 광학 신호는 시각 스펙트럼 외부의 전자기파 방사이다.
하기의 상세한 설명에 추가로 기술된 개념을 선택하여 간략한 형태로 소개하기 위해 본 요약을 제시한다.
참고문헌으로 통합
개별 공보 또는 특허 출원이 참고문헌으로 결합되어 기술된 경우 본 명세서에서 언급한 모든 공보 및 특허 출원은 동일 범위에서 본서에 참고문서로 통합된다. 통합된 공보는 미국 특허 공보 제 2010/0081144 A1호, 미국 특허 제 7,888,125호, 미국 특허 공보 제 2011/0093249 A1호, 미국 특허 공보 제 2009/0318775 A1호, 미국 특허 제 7,291,497호, 미국 특허 제 8,012,744호, 미국 특허 공보 제 2006/0264783 A1호, 미국 특허 공보 제 2007/0224084 A1호, 및 미국 출원 제 13/244,947호를 포함한다.
도면에서,
도면 1은 산란된 빛이 혈장 샘플의 응집 전(좌측 용기)에서 응집 후(우측 용기)로 증가함을 보여준다.
도면 2는 혈장 샘플이 응고하는 동안 평균 광 산란 신호 대비 시간의 도표를 보여준다.
도면 3은 4개 매개변수 로그-로그 함수 진행 곡선에 맞추기 위해 평균 광 산란 신호 대비 시간의 도표를 보여준다.
도면 4는 RSNR 방법에 의해 분석한 대표적인 반응 시간 추이를 보여준다.
도면 5는 구슬 침전 실시 예의 개략도를 보여준다.
도면 6은 형광 현미경 실시 예의 개략도를 보여준다.
도면 7은 현미경 실시 예에 적합한 큐벳의 개략도를 보여준다.
도면 8은 혈장 샘플의 PT 활성 인자를 측정하기 위해 시간의 함수로서 연관 인자의 도표를 보여준다.
도면 9는 비디오 이미지에서 배경을 제외하는 방법을 보여준다.
도면 10은 광 산란에 의해 예시적으로PT를 측정한 결과를 보여준다
도면 11은 광 산란에 의해 예시적으로 aPTT를 측정한 결과를 보여준다.
도면 12는 구슬 정착에 의해 예시적으로 PT를 측정한 결과를 보여준다.
도면 13은 구슬 정착에 의해 예시적으로 aPTT를 측정한 결과를 보여준다.
도면 14는 형광 현미경 실시 예로 얻어진 이미지를 보여준다.
도면 15는 형광 현미경에 의해 예시적으로 PT를 측정한 결과를 보여준다.
도면 16은 광 산란으로 측정한 응집 시간에 대해 인간 혈장 샘플에 헤파린을 첨가한 효과의 예시적인 결과를 보여준다.
도면 17은 도면 16의 결과에 기초하여 헤파린에 대해 보정된 aPTT 정량-반응을 보여준다.
도면 18은 광 산란으로 인간 혈장 샘플(정상 대상자 및 와파린 치료 중인 대상자)에 있는 PT를 예시적으로 측정한 보여준다.
도면 19는 응집 검정에 대해 이중 선형 곡선에 맞춘 평균 광 산란 신호 대비 시간의 도표를 보여준다.
본 발명의 실시 예를 기술하기 전에, 이 실시 예들은 단지 예로서 제시되었으며 본서에 기술한 발명을 구현하는 다양한 대안으로 본 발명을 실행할 수 있음을 이해해야 한다. 이제 다수의 변형, 변경 및 치환을 본 발명을 벗어나지 않고 업계의 숙련된 분석가들이 수행할 것이다.
달리 정의되지 않는 한, 본서에서 사용하는 모든 기술적 과학적 용어는 본 발명이 속해 있는 업계의 통상적인 기술을 지닌 기술자가 일반적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 가진다. 본서가 기술하는 것과 유사하거나 동일한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용되지만, 적합한 방법 및 물질을 하기에 기술한다. 상충이 발생하는 경우, 정의를 포함하는 본 발명의 명세서를 따른다. 또한, 물질, 방법 및 예들은 단지 예시적인 것이며 여기에 제한하지 않는다. 이제 다수의 변형, 변경 및 치환을 본 발명에서 벗어나지 않으며 업계의 숙련된 분석가가 수행할 것이다.
정의
관사 "a", "an" 및 "the"는 비한정적이다. 예를 들어, "the method"는 하나 이상의 방법이 될 수 있는 어구의 어미에서 광범위한 정의를 지닌다.
"대상"은 인간 또는 동물일 수 있다. 이 대상은 살아 있거나 죽어 있을 수 있다. 이 대상은 환자, 임상 대상 또는 전-임상 대상일 수 있다. 대상이 진단, 치료 및/또는 질병 예방 중일 수 있다. 이 대상은 보건 전문가의 관리를 받을 수도 있고 아닐 수도 있다.
"혈액 샘플"은 혈액 또는 임의의 혈액의 일부, 혈액 유도물 등이다. 혈장은 혈액 일부의 한 예이다. 이 혈액 샘플은 임의의 적절한 용량을 가질 수 있고, 임의의 적절한 방법으로 획득할 수 있고, 임의의 시간에 대성의 임의의 부분에서 채취할 수 있으며, 임의의 적절한 용기로 채취 등을 할 수 있다. 혈액은 영양분 및 산소 등의 필요 물질을 세포에 전달하며 동일 세포에서 신진대사 폐기물을 이송하는 동물(인간을 포함하여)에 있는 특별한 체액이다. 혈액 샘플에 임의의 적절한 물질을 첨가할 수 있으며, 선택적으로 하나 이상의 항 응고제를 첨가할 수 있다. "혈액 샘플"은 희석된 혈액 샘플도 포함한다.
"혈장"은 전혈에 있는 혈액 세포가 일반적으로 현탁되어 있는 혈액의 액체 성분이다. 이는 세포 외액(세포의 외부에 있는 모든 체액)의 혈관 내 유체이다. 이는 대부분 물(약 93%의 용량)이고 용해된 단백질, 글루코스, 응고 인자. 미네랄 이온, 호르몬 및 이산화 탄소(혈장은 배설물 수송에 대한 주요 매체이다)를 함유할 수 있다. 혈장은 혈액 세포가 튜브의 바닥까지 침전할 때까지 원심분리기에서 항-응고제를 함유하는 혈액 튜브를 회전(원심분리)하여 제조할 수 있다. 다음, 이 혈장을 흡입하거나 뽑아 낸다.
"혈청"은 피브린, 피브리노겐 또는 기타 응고 인자가 없는 혈장이다(즉, 전혈에서 세포 및 응고 인자를 제외)
혈액 샘플은 "비-정맥 경로" 통해 채취할 수 있으며, 이는 혈액이 바늘을 통해 신체의 정맥 및 동맥으로부터 채취하지 않음을 의미한다. 비-정맥 경로는 정맥 혈액(탈산소 혈액) 또는 동맥 혈액(산소 혈액) 중 한쪽의 혈액 샘플로 제한하지 않는다. 정맥 혈액 및 동맥 혈액 둘 다 적합하다. 신체의 모세혈관에서 혈액을 채취하는 수행은 비-정맥 경로의 한 예이다.
"손가락 채혈", "손가락침" 또는 유사한 방법은 비-정맥 경로를 통해 혈액 샘플을 채취하는 적합한 방법의 일례이다. 여기에서, 날카로운 끝 또는 모서리가 손가락의 피부(또는 신체의 다른 부위)를 뚫는 데 사용되며, 신체에서 출혈을 유발한다. 또한, 손침은 예를 들어 아기의 뒤꿈치 등 선택적으로 뒤꿈치에 실시할 수 있다. 혈액은 모세관, 피펫, 면봉, 또는 기타 업계에 알려진 기술을 사용하여 채취할 수 있다.
용어 "응고" 및 "응집"은, 관련 문법적 변형을 포함하여 상호 교환적으로 사용된다. 이들은 유체 또는 유체의 일부가 고체화되고 및/또는 고 점성이 되는 임의의 과정을 지칭한다. 일반적으로 본서에서 사용된 "응고" 및 "응집"은 혈액이 상기에 기술한 혈병을 형성하는 생물학적 과정을 지칭한다.
"응고 반응"은 혈액이 응고하는 모든 과정을 포함하여 유체가 응고하는 모든 과정이다. 응고 반응은 자연적, 변형되지 않거나, 또는 본서에 기술하는 바와 같이 변형되거나, 조작되거나, 제어 등으로 수행될 수 있다.
"응고 개시 시약"은 응고 반응을 시작하는 혈액 샘플에 첨가되는 임의의 물질이다. 본서에 기술된 바와 같이, 예시적인 응고 개시 시약은 트롬보플라스틴 및 칼슘 첨가 트롬보플라스틴을 포함한다.
"응고 시간"은 응고 개시 시약의 첨가 등 개시 사건과 혈병의 형성 간에 경과한 시간의 양이다. 본서에서 기술한 바와 같이, 혈병의 형성 검정의 일면을 구슬을 첨가하고 구슬이 실질적으로 움직이지 않고 및/또는 움직임에 전이가 발생하는 경우를 관찰하여 검출할 수 있다.
용어 "구슬" 및 "입자"는 본서에서 기술한 이미지화에 적합한 작고(본서가 기술한 바와 같이), 단단한 재질의 구성물을 의미하는 것으로 상호 교환하여 사용될 수 있다.
"실질적으로 움직이지 않는"은 구슬 등의 대상물이 응집 반응 매체와 관련된 임의의 방향에서 움직이는 않는 것을 의미한다(즉, 반응 매질에서 현탁된). 응고 시간 이전에 구슬이 0.01%, 0.1%, 1% 등의 이동 속도로 움직일 수 있다.
또한, 응고 시간은 개시 사건에서 구슬의 "이동 전이"까지 확장될 수 있으며, 이는 일반적으로 구슬의 움직임이 감속됨을 의미한다.
"응고 변수"는 응고 반응에서 임의의 특성을 임의의 정량적 또는 정성적으로 수행한 측정이다.
"이미지"는 예를 들어 어떤 물리적 대상물에 유사한 외형을 가진 2차원 사진, 사진의 집합, 또는 비디오 등 임의의 인공산물이다.
이미지는 "화소화"될 수 있으며, 이는 화소를 포함한다는 의미이다.
본서에 사용되는, "서비스 포인트" 장소는 대상자가 서비스를 받은 장소(예: 테스트, 모니터링, 치료, 진료, 지도, 샘플 채취, ID 확인, 의료 서비스, 비-의료 서비스 등), 및 대상자의 집, 대상자의 직장, 의료보건 공급자(예: 의사)의 장소, 병원, 응급실, 실험실, 소매점[예: 조제실(소매 조제실, 임상 제조실, 병원 조제실), 약국, 슈퍼마켓, 식료품점 등], 수송 차량(예: 차, 보트, 트럭, 버스, 비행기, 오토바이, 구급차. 이동 기구, 소방차/트럭, 긴급 차량, 법 진행 차량, 경찰차, 또는 대상자를 한 장소에서 다른 곳으로 이동하도록 구성된 기타 차량 등), 이동 의료 보건 장치, 이동 장치, 학교, 보건 센터, 보안 검색 위치, 전투 장소, 보건 생활 지원 주택, 관공서, 사무실, 텐트, 체액 샘플 수집 장소(예: 혈액 채취 센터), 대상자가 원하는 장소의 입구 또는 근방의 장소, 대상자는 원하는 장치 또는 근방(예: 대상자가 컴퓨터로 접속하기 원하는 경우 컴퓨터), 샘플 처리 장치가 샘플을 수취하는 장소, 또는 기타 본서의 다른 곳에서 기술하는 서비스 장소를 포함할 수 있다. 일례로, 서비스 포인트는 관리 위치이다. 본서에서 사용하는 바와 같이, "관리 위치"는 대상자가 의료-관련 관리(예: 치료, 테스트, 모니터링, 진단, 상당, 샘플 채취 등)를 받는 임의의 장소 또는 근방(예: 대상자의 집 또는 직장, 식료품점, 약국, 의료 클리닉, 병원, 학교 등)을 지칭한다.
"비디오" 이미지는 일정 시간 동안 순차적으로 수집된 일련의 이미지이다. 비디오 이미지는 예를 들어, 최소 1프레임/분, 최소 1프레임/10초, 최소 1프레임/초, 최소 10프레임/초, 최소 20 프레임/초, 최소 30프레임/초, 최소 40프레임/초, 최소 50프레임/초, 최소 100프레임/초, 최소 200프레임/초로 수집될 수 있다.
응고 변수
응고는 생물학 전반 걸쳐 잘 보존된다. 포유류에서, 일반적으로 응고는 세포(혈소판) 및 단백질(응고 인자) 성분(비록 일부 환경에서 혈장은 혈소판이 존재하지 않아도 응고가 가능하다)을 모두 포함한다. 인간이 가진 시스템은 가장 광범위하게 연구되었으며 이에 가장 잘 이해된다.
응고는 혈관의 부상이 혈관의 내피 내벽을 손상된 후 거의 즉시 시작된다. 혈액이 조직 인자 등 분자에 노출되면 혈소판 및 응고 인자인 혈장 단백질 피브리노겐의 변화를 개시한다. 혈소판은 즉시 손상 부위에 플러그를 생성한다. 이는 일반적으로 1차 지혈로 지칭된다. 통상 두 번째 지혈이 동시에 발생한다. 응고 인자 또는 응집 인자 등 혈장에 있는 단백질은 혈소판 플러그를 강화시키는 피브린 가닥을 형성하는 복잡한 다단계에 반응한다. 이 다단계는 약 13개의 응고 인자를 포함하며, 이 인자 중 하나의 결함은 응고 장애를 유발할 수 있다. 또한, 응고 다단계는 조직 인자 경로 (외인성 경로라고도 하는) 및 접촉 활성화 경로 ( 내인성 경로라고도 하는)를 포함한다. 임상 시험은 종종 기본 응고 과정의 복잡성을 제거하고 하나의 쉽게 이용할 수 있는 변수를 보고하도록 설계된다.
일반적으로, 응고 변소는 응고 사건의 개시와 혈병의 형성 간 시간인 "응고 시간"을 측정하여 판단한다. 응고 변수는 측정된 응고 시간을 포함한다. 일부 경우, 응고 변수는 특정한 변수가 존재하고, 특정 온도 등에서의 응고 시간이다.
다수의 시험 및/또는 검정이 응고 시스템의 기능을 평가하기 위해 개발되었으며, 이 중 임의의 방법이 본서가 기술한 방법에서 사용되는 측정에 적합할 수 있다. 공통 응고 변수 검정은 상기에 소개되며 하기에 보다 상세히 기술되는 aPTT, PT 및 INR을 포함한다. 통상적으로 업계에 알려진 다른 응고 변수 검정은 피브리노겐 시험을 포함하며, 이는 종종 클라우스(Clauss) 방법, 혈소판 계수 검정, 및 Siemens Corporation 제품 PFA-100TM 분석기로 종종 수행되는 혈소판 기능 시험에 의해 수행된다. 업계에 알려진 추가적인 응고 검정 및/또는 임상 과정은 트롬빈 응고 시간(TCT) 시험, 출혈 시간 검정, 혼합 시험 (환자의 혈장이 정상 혈장과 혼합된 경우에 발생하는 이상을 교정하는지 여부에 상관없이), 응고 인자 검정, 항인지질 항체 검점, D-다이머 시험, 유전자 검사(예: 인자 V 라이덴, 프로트롬빈 돌연변이 G20210A), 희석 러셀 살무사 독액 시간(dRVVT) 검정, 기타 혈소판 기능 시험, 혈액응고기능항진 검정(TEG 또는 소노클롯) 및 유글로불린 용해 시간 검정(ELT)을 포함한다.
접촉 활성화(내인성) 경로는 혈장의 "접촉 인자"의 활성화로 개시되며, 활성화 부분 트롬보플라시틴 시간(aPTT) 시험(이전에 카올린 세파린 응고 시간, "KccT"로 불린)에 의해 측정될 수 있다. 역사적으로 이 방법은 칼슘과 결합하여 응고를 저지하기 위해 옥살산 및 구염산이 든 용기에 혈액을 채취하는 수행을 포함한다. 내인성 경로는 옥살산 또는 구염산의 효과를 역전하기 위해 인지질, 활성제(실리카, 셀라이트, 카올린, 엘라그산) 및 칼슘을 첨가하여 활성화한다.
특정 실시 예로, 본 방법은 응고 시간을 연장할 수 있는 샘플의 희석을 포함한다. 실시 예에서, 샘플의 희석에 의해 예를 들어, 샘플의 응고 이전에 샘플의 응고 반응 개시 시간을 연장하기 위해 샘플의 응고 시간을 증가할 수 있는 장점이 있다. 이는 예를 들어, 응고를 광 검출기로 이동시키거나 그 반대의 과정에 대해 더 많은 시간을 허용할 수 있는 장점이 된다. 다른 예로, 검정의 응고 시간이 정밀하게 측정되는 동안 더 큰 시간 프레임을 제공하기 위해 샘플의 희석에 의해 샘플의 응고 시간을 증가시키는 장점이 된다. 실시 예로, 희석된 샘플은 희석되지 않은 샘플과 측정 곡선을 그려서 비교할 수 있다.
비정상 aPTT 시간은 응고 저해제의 존재 또는 특정 응고 인자의 양 또는 기능의 결함으로 나타날 수 있다. 이 경우를 구별할 수 있는 시험을 수행할 수 있고, 이 경우 샘플은 일반 혈장으로 희석된다(초기에 약 50:50). 비정상이 나타나지 않을 경우, 이 샘플은 헤파린, 항인지질 항체 또는 응고 인자 특이 항체 등 저해제를 함유할 수 있다. 비정상 aPTT가 교정된 경우, VIII, IX, XI, XII 인자 및/또는 본 빌레브란트 인자에 결함일 수 있다. 본 발명은 aPTT 측정 및 aPTT 측정을 함유하는 혼합 시험을 모두 포함한다.
조직 인자(외인성) 경로는 조직 인자(특정 세포 지질단백질)를 방출함으로써 개시되며, 프로트롬빈 시간(PT) 시험에 의해 측정될 수 있다. PT 결과는 와파린, 간 손상 표시 또는 비타민 K 상태의 표시 등 경구 항응고제의 투여를 검측하기 위해 비율(INR 값)로서 종종 보고된다. PT는 응고 인자 I, II, V, VII 및 X를 측정한다. 역사적으로 이 방법은 구연산을 든 용기에 혈액을 채취하고 혈장에서 혈액 세포를 분리하기 위해 원심 분리하는 과정을 포함한다. 통상적으로, 과잉 칼슘이 EDTA/구연산/옥살산 항-응고 혈장에 첨가되고, 조직 인자(III 인자로도 알려진)를 첨가하며, 샘플이 혈병을 형성하는 시간을 관측한다. 응고 시간은 사용된 분석 시스템 및 시험을 수행하는 데 사용된 제조자의 조직 인자의 다른 배치들 간의 다양성에 따라 실질적으로 변할 수 있다. INR은 결과를 표준화하기 위해 고안되었다. 식 1에 보여지는 바와 같이, INR은 ISI에 의해 제곱된 프로트롬빈 비율(평균 정상 대조군 혈장으로 환자에 대한 프로프롬빈 시간을 나눈)이다. ISI(국제 감도 지수)는 조직 인자의 특정 배치를 국제 기준 조직 인자와 비교하는 방법을 나타낸다. ISI는 보통 1.0에서 2.0 사이이고 조직 인자의 제조자에 의해 제시된다.
Figure 112015016716898-pct00001
(식 1)
5.0 등 고 INR 레벨은 출혈의 가능성이 높다는 것을 표시한다. 0.5 등 저 INR 레벨은 혈병을 형성할 가능성이 높다는 것을 표시한다. 건강한 사람의 정상 범위는 보통 0.9에서 1.3 사이이다. 와파린 치료를 받는 사람의 정상 범위는 2.0에서 3.0 사이이며, 반면 예를 들어 기계 심장 판막을 가진 사람들에 대한 목표 INR이 더 높을 수 있다.
피브린 결함을 지닌 환자의 정량적 및 정성적 검색은 트롬빈 응고 시간(TCT)을 측정하여 달성할 수 있다. 혈액에 존재하는 피브리노겐의 정확한 양을 측정하는 수행은 일반적으로 피브리노겐 시험을 위한 클라우스 방법을 사용할 수 있다. 많은 분석가들이 프로트롬빈 시간 혈장의 그래프로부터 "파생된 피브리노겐"을 측정할 수 있다. 유사하게 본서가 기술하는 방법 및 장치를 피브리노겐의 양 및/또는 질을 측정하는데 사용할 수 있다.
응고 인자는 접촉 활성 또는 조직 인자 경로의 일부이며, 이 인자의 결함은 모든 응고 변수 시험에 반드시 영향을 미치는 것은 아니다. 예를 들어, 혈우병 A는 접촉 활성 경로의 일부인 인자 VIII의 결함이다. 그러므로 혈우병 A는 일반 PT 시험이 아닌 비정상 연장 aPTT 시험의 결과이다. 본서가 기술하는 방법 및 장치는 다중적이고 쉬운 사용 형식으로 한 방울의 혈액에서 다양한 응고 시험을 하는 등 다수의 시험을 수행할 수 있는 이점이 있다.
응고 측정 방법, 장치 및 시스템
본서가 기술하는 방법, 장치 및 시스템을 상기에 관련한 임의의 응고 변수를 측정하고 및/또는 항-응고제를 처방을 받는 사람에서 약물 투여의 효과를 모니터하는 데 사용할 수 있다. 항-응고제는 응고를 저해하고 혈액이 응고하는 시간을 증가시키며, 트롬빈 결함에 대한 처방 또는 의학적 장치에 사용될 수 있다.예시적인 항응고제는 와파린, 이세노쿠마롤, 펜프로쿠몬 및 펜인디온 등 쿠마딘, 헤파린과 저분자량 헤파린 등 그 유도물, 폰다파리녹스 및 이드라파리녹스 등 인자 Xa의 합성 오당류 저해제, 아르가트로반, 레피루딘, 비발리루딘, 지멜아가트란 및 다비가트란을 포함하는 트롬빈 직접 저해제, 리바로자반 및 아피자반 등 인자 Xa 직접 저해제, 및 바트로조빈 및 헤메틴 등 기타 형태이다.
일례로, 본서는 대상의 혈액 샘플에서 응고 시간을 측정하기 위해 방법, 장치 및 시스템을 제시한다. 일례로, 이 방법은 혈병 형성에 적합한 조건하에 대상자로부터 채취한 혈액 샘플에 응고 개시 시약을 첨가하여 응고 반응을 개시하고, 응고 반응의 이미지 집합을 획득하고, 혈액 샘플의 응고 시간을 측정하기 위해 이미지 집합을 분석하는 수행을 포함한다. 일례로, 이 방법은 비-정맥 경로로 통해 대상에서 채취한 혈액 샘플을 획득하는 과정을 추가로 포함한다.
한 실시 예로, 장치는 혈병 형성에 적합한 조건하에 대상자로부터 채취한 혈액 샘플에 응고 저해 시약을 첨가하여 응고 반응을 개시할 수 있는 구성물, 응고 반응의 이미지 집합을 획득할 수 있는 구성물, 및 혈액 샘플의 응고 시간을 측정하기 위해 이미지 집합을 분석할 수 있는 구성물을 포함한다. 혈액 샘플의 응고 시간을 측정하기 위해 이미지 집합을 분석할 수 있는 구성물은 응고 반응에서 하나 이상의 이미지를 획득하기 위해 설정된 구성물로서 장치 내에 동일 기구의 일부일 수 있다. 혈액 샘플에서 응고 시간을 측정하기 위해 이미지 집합을 분석할 수 있는 구성물은 장치에 내장될 수 있다. 혈액 샘플에서 응고 시간을 측정하기 위해 이미지 집합을 분석할 수 있는 구성물은 다양한 분석 형태를 수행하도록 설정될 수 있고 및/또는 장치가 다양한 응용을 수행하는 데 사용될 수 있다. 혈액 샘플에서 응고 시간을 측정하기 위해 이미지 집합을 분석할 수 있는 구성물은 장치로부터 원거리에 위치할 수 있다. 혈액 샘플에서 응고 시간을 측정하기 위해 이미지 집합을 분석할 수 있는 구성물은 클라우드 컴퓨터 인프라에 위치할 수 있다. 혈액 샘플에서 응고 시간을 측정하기 위해 이미지 집합을 분석할 수 있는 구성물은 이 클라우드에 위치할 수 있고, 이 장치를 클라우드가 역학적으로 제어하도록 설정할 수 있다. 일례로, 장치는 응고 검정 분석의 결과를 기초로 두 번째 과정에 영향을 미치도록 설정할 수 있다. 일례로, 본서에 기술된 바와 같이 응집 검정을 수행할 수 있는 장치를 예를 들어, 본서에 전문이 참고문헌으로 통합된 미국 일련 번호 13/244,947에 기술된 장치로써 설정될 수 있다.
대상 시스템은 혈병 형성에 적합한 조건하에 대상자로부터 채취한 혈액 샘플에 응고 개시 시약을 첨가하여 응고 반응을 개시하는 장치, 응고 반응의 이미지 집합을 획득할 수 있는 카메라, 혈액 샘플의 응고 시간을 측정하기 위해 이미지 집합을 분석할 수 있는 컴퓨터를 포함한다. 혈액 샘플의 응고시간을 분석하기 위해 이미지 집합을 분석할 수 있도록 설정된 컴퓨터는 응고 반응의 하나 이상의 이미지 집합을 획득하도록 구성된 카메라로 시스템 내에 동일 기구의 일부일 수 있다. 혈액 샘플의 응고 시간을 측정하기 위해 이미지 집합을 분석하기 위해 구성된 컴퓨터는 시스템에 내장될 수 있다. 혈액 샘플의 응고 시간을 측정하기 위해 이미지 집합을 분석하기 위해 구성된 컴퓨터는 다수의 분석 형태를 수행하도록 구성될 수 있으며 및/또는 시스템 내에서 다수의 응용에 사용할 수 있다. 혈액 샘플의 응고 시간을 측정하기 위해 이미지 집합을 분석하기 위해 구성된 컴퓨터는 응고 반응의 하나 이상의 이미지 집합을 획득하도록 구성된 카메라에서 원거리에 위치할 수 있다. 혈액 샘플의 응고 시간을 측정하기 위해 이미지 집합을 분석하기 위해 구성된 컴퓨터는 클라우드에 위치할 수 있다. 혈액 샘플의 응고 시간을 측정하기 위해 이미지 집합을 분석하기 위해 구성된 컴퓨터는 클라이드에 위치할 수 있고, 이 시스템을 클라우드에서 동적으로 제어하도록 구성할 수 있다. 이 시스템은 응고 검정 분석의 결과에 기초하여 두 번째 과정에 영향을 미치도록 구성될 수 있다. 일례로, 본서가 기술하는 응집 검정을 수행할 수 있는 시스템은 예를 들어, 본서에 그 전문이 참고문헌으로 통합된 미국 일련 번호 13/244,947에 기술된 시스템으로 구성될 수 있다.
일면으로, 본서에 기술된 방법, 장치 및 시스템은 소량 용량의 혈액 또는 혈장을 사용하여 응고 시간을 측정한다. 혈액은 손가락-채혈을 통해 획득할 수 있고, 이 경우 일반적으로 한 방울의 용량은 약 20 ㎕로 채취될 수 있다. 본서에 기술한 응고 측정 방법은 전량을 사용할 수 있다 (또는 약 2, 3, 4 방울을 포함하는 20 ㎕ 이상). 이 방법은 혈액을 한 방울 이하로 사용할 수 있다. 일례로, 혈액 한 방울을 선택적으로, 다중 형식에 의해 다수의 측정, 응고 또는 기타 시험에 사용할 수 있다.
본서가 기술하는 방법, 장치 및 시스템에서 사용되는 혈액 또는 혈장의 용량은 임의의 적합한 양이다. 일례로, 용량은 약 1 ml, 약 500 ㎕, 약 400 ㎕, 약 300 ㎕, 약 200 ㎕, 약 100 ㎕, 약 75 ㎕, 약 50 ㎕, 약 40 ㎕, 약 20 ㎕, 약 10 ㎕, 약 9 ㎕, 약 8 ㎕, 약 7 ㎕, 약 6 ㎕, 약 5 ㎕, 약 4 ㎕, 약 3 ㎕, 약 2 ㎕, 약 1 ㎕, 약 0.8 ㎕, 약 0.6 ㎕, 약 0.4 ㎕, 약 0.2 ㎕, 약 0.1 ㎕, 약 0.05 ㎕, 약 0.01 ㎕ 등이다. 일례로, 용량은 최대 1 ml, 최대 500 ㎕, at most about 400 ㎕, 최대 300 ㎕, 최대 200 ㎕, 최대 100 ㎕, 최대 75 ㎕, 최대 50 ㎕, 최대 40 ㎕, 최대 20 ㎕, 최대 10 ㎕, 최대 9 ㎕, 최대 8 ㎕, 최대 7 ㎕, 최대 6 ㎕, 최대 5 ㎕, 최대 4 ㎕, 최대 3 ㎕, 최대 2 ㎕, 최대 1 ㎕, 최대 0.8 ㎕, 최대 0.6 ㎕, 최대 0.4 ㎕, 최대 0.2 ㎕, 최대 0.1 ㎕, 최대 0.05 ㎕, 최대 0.01 ㎕ 등이다. 일례로, 200 ㎕, 100 ㎕, 75 ㎕, 50 ㎕, 40 ㎕, 20 ㎕, 10 ㎕, 9 ㎕, 8 ㎕, 7 ㎕, 6 ㎕, 5 ㎕, 4 ㎕, 3 ㎕, 2 ㎕, 1 ㎕, 0.8 ㎕, 0.6 ㎕, 0.4 ㎕, 0.2 ㎕, 0.1 ㎕, 0.05 ㎕, 0.01 ㎕, 0.005 ㎕, 또는 0.001 ㎕ 이하의 원본(희석되지 않은) 샘플을 이 방법을 수행하기 위해 사용하는 경우 본서에서 제시한 방법을 수행할 수 있다.
이런 실시 예에서, 본서가 제시하는 방법은 소량의 총 반응 혼합물로 수행될 수 있다. 예를 들어, 본서가 제시하는 방법은 반응 혼합물의 총량이 200 ㎕, 100 ㎕, 75 ㎕, 50 ㎕, 40 ㎕, 20 ㎕, 10 ㎕, 9 ㎕, 8 ㎕, 7 ㎕, 6 ㎕, 5 ㎕, 4 ㎕, 3 ㎕, 2 ㎕, 1 ㎕, 0.8 ㎕, 0.6 ㎕, 0.4 ㎕, 0.2 ㎕, 0.1 ㎕, 0.05 ㎕, 0.01 ㎕, 0.005 ㎕, 또는 0.001 ㎕인 경우 수행할 수 있다. 반응 혼합물의 총량 내에서, 검정을 수행하기에 적합하게 본서가 개시하는 원본(희석하지 않은) 샘플 중 임의의 양(예: 200 ㎕, 100 ㎕ 이하 등)이 존재할 수 있다.
일례로, 장치 또는 시스템은 현미경 및/또는 카메라를 포함한다. 카메라는 비디오 카메라일 수 있다 현미경은 명 시야, 암 시야 또는 형광 현미경 관찰로 구성될 수 있다. 장치 또는 시스템은 카트리지를 수용하도록 구성될 수 있다. 카트리지는 응고 검정을 수행하기 위해 혈액 샘플 및/또는 시약을 포함할 수 있다. 장치 또는 시스템은 통합 샘플 처리 기구를 함유할 수 있고 및/또는 장치 또는 시스템은 자동화된 샘플 처리 기구를 가질 수 있다. 일례로, 장치 또는 시스템이 혈액 샘플을 함유하는 카트리지를 수용하고 자동화 응고 검정을 수행하기 위해 구성될 수 있다.
일례로, 사용자는 대상에서 채취한 혈액 샘플의 일정량을 카트리지로 투여할 수 있다. 혈액의 용량은 1 ml 이하, 500 ㎕ 이하, 400 ㎕ 이하, 300 ㎕ 이하, 200 ㎕ 이하, 100 ㎕ 이하, 75 ㎕ 이하, 50 ㎕ 이하, 40 ㎕ 이하, 30 ㎕ 이하, 20 ㎕ 이하, 15 ㎕ 이하, 10 ㎕ 이하, 9 ㎕ 이하, 8 ㎕ 이하, 7 ㎕ 이하, 6 ㎕ 이하, 5 ㎕ 이하, 4 ㎕ 이하, 3 ㎕ 이하, 2 ㎕ 이하, 1 ㎕ 이하, 0.8 ㎕ 이하, 0.6 ㎕ 이하, 0.5 ㎕ 이하, 0.4 ㎕ 이하, 0.3 ㎕ 이하, 0.2 ㎕ 이하, 0.1 ㎕ 이하 등 소량일 수 있다. 카트리지는 혈액 샘플에 혼합된 항응고제를 포함할 수 있다. 카트리지는 장치에 도입될 수 있다. 실시 예로, 혈액 샘플을 카트리지로 도입하기 전에 항응고제를 혈액 샘플과 혼합할 수 있다. 카트리지 내 또는 장치 내에서, 혈액 샘플이 혈장 부분과 적혈 세포를 함유하여 뭉쳐진 부분으로 분리할 수 있다. 대신, 혈액 샘플이 전혈로 남을 수 있다. 혈액 샘플은 하나 이상의 다른 검정 단위의 장치로 배분될 수 있고, 하나 이상의 검정을 위해 사용될 수 있다. 혈액 샘플은 유체 이송 장치에 의해 장치 내로 배분될 수 있다. 혈액 샘플은 희석될 수 있다. 혈액 샘플이 하나 이상의 시약과 혼합될 수 있다. 시약은 하나 이상의 다음 기능을 수행할 수 있다. A) 항응고제의 효과를 역전시킨다 (예를 들어, EDTA를 함유하는 샘플에 칼슘 이온을 첨가하면 EDTA의 항응고 효과를 역전시킬 수 있다). B) 샘플의 응고를 촉진시킨다 (예를 들어, 인지질 실리카, 셀라이트, 카올린, 엘라그산 등). C) 응고 반응의 시각화를 용이하게 한다 (예를 들어, 관찰될 수 있는 소규모 구슬 또는 기타 입자). D) 응고 혈병의 강도를 증가 및/또는 질량을 증가시킨다 (예를 들어 피브리노겐). E) 반응 용기에서 혈액 샘플의 분석물의 비특이적 결합을 감소시킨다 (예를 들어, 계면 활성제 또는 단백질). 시약은 추가적인 기능도 수행할 수 있다. 시약은 액체 또는 건조 형태일 수 있다. 자당, 트레할로스, 폴리에틸렌 글리콜 또는 알부민 등 시약은 신속한 용해를 위해 부식성 필름으로 제제되는 등 다양한 건조 형태 중 하나로 제제될 수 있다혈액 샘플을 시약과 혼합물은 응고 반응과 연관된 하나 이상의 이미지를 획득할 수 있는 임의 장치로 관찰될 수 있다. 비디오 이미지를 획득할 수 있다. 응고 반응의 이미지는 반응의 응고 시간을 결정하기 위해 분석될 수 있다. 응고 반응의 분석은 장치의 컴퓨터 또는 기타 구성물의 도움으로 수행될 수 있다. 다음, 반응의 응고 시간을 대상의 의료 상태를 분석하는 데 사용할 수 있다. 이 방법에서 하나 이상의 단계가 관리 장소의 서비스 또는 위치에서 수행될 수 있다. 관리 장소에서 본서가 개시한 방법을 수행하면 의료인이 특정 대상과 관련한 검정 데이터에 기초하여 대상에 대한 신속한 치료 결정을 가능하게 한다.
샘플 조작 및 반응 챔버
본서가 기술하는 샘플, 시약 및 응고 검정은 다양한 용기 형태로 조작되고 수용될 수 있다. 샘플 조작 장치 및 반응 용기는 예를 들어, 용기, 튜브, 개방형 팁 또는 큐벳, 또는 직사각형 또는 정사각형 단면 모세관일 수 있다. 본서에 사용된 바와 같이, 또한 팁은 샘플 팁, 큐벳 팁, 반응 용기, 큐벳, 모세관, 샘플 조작 장치, 또는 샘플 이송 장치를 지칭할 수 있다. 샘플은 원본에서 팁 또는 튜브로 채취될 수 있다. 팁은 밀봉될 수 있다. 이러한 밀봉은 영구적이거나 가역적일 수 있다. 일단 검정에 대한 판독이 준비되면, 응고 반응은 이미지 분석을 위해 광학 장치 또는 기타 판독 형태로 제공된다. 다수의 검정을 병행하여 처리할 수 있다. 일례로, 반응 용기는 다수의 상이한 검정 반응 혼합물을 동일 반응 용기에 담는 등 다수의 별도로 유체적으로 격리된 공동을 가질 수 있다. 검정 판독은 검정 프로토콜 및/또는 배양 시간에 따라 순차적으로 또는 동시에 수행할 수 있다. 변화율의 측정을 포함하는 검정에 대해, 검정 구성물을 하나 이상의 상이한 시간으로 광학 시스템에 공급할 수 있다.
유체 및 재료 조작 장치
유체 전달 기구는 장치의 일부분이 될 수 있다. 유체 전달 장치는 시스템의 일부일 수 있다. 유체 전달 장치 또는 기구는 여러 헤드를 가질 수 있다. 임의의 개수의 헤드가 유체 전달 장치의 일부일 수 있다. 예에서, 유체 전달 장치는 일렬로 장착되며 일정 거리가 떨어진 약 8개의 헤드를 가진다. 실시 예에서, 헤드는 다양한 팁에 눌러 맞출 수 있도록 뽀족한 노즐을 갖는다. 팁은 기기에 의해 자동으로 제거되고 사용 후 장치의 하우징에 배치할 수 있는 기능을 가질 수 있다. 실시 예로, 검정 팁은 맑고 투명하며 검정을 실행하는 큐벳과 유사하며 광 증배관 또는 카메라 센서 등 광학 검출기로 검출할 수 있다.
예로서, 프로그램 가능한 시스템의 프로세서는 지시 또는 명령을 포함할 수 있고, 흡입(액체를 뽑기 위해서) 또는 공기가 밀폐된 공간으로 피스톤을 확장(액체를 배출하기 위해서)하여 액체 샘플을 전송하도록 하는 지시에 따라 유체 전송 장치를 조작할 수 있다. 공기 이동량 및 이동속도는 예를 들어, 프로그램 가능한 프로세서에 의해 정밀하게 제어될 수 있다.
희석액(또는 기타 시약)으로 샘플(또는 시약)을 혼합하는 수행은 공통 튜브로 혼합된 흡입 구성물에 의해 이루어 질 수 있으며 이어서 결합된 액체 용적의 상하단의 중요 부분을 팁으로 반복하여 흡입한다. 건조한 시약을 튜브에 용해시켜 유사한 방식을 수행할 수 있다. 샘플 및 시약의 제거는 저장조에 액체를 배출하거나 장치의 흡수 패드를 이용하여 실행할 수 있다. 다음, 다른 시약이 프로그램 가능한 프로세서의 지시 또는 프로토콜에 따라 팁으로 흡입될 수 있다.
시스템은 검정 기구 또는 팁을 이동시키기 위해 홀더 또는 결합기를 포함할 수 있다. 결합기는 검정 기구 팁의 양각에 딱 맞도록 설계되어진 진공 조립체 또는 조립체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 팁을 이동시키는 방법은 유체 전달 장치 헤드와 유사한 방식으로 이동시킬 수 있다.
실시 예로, 팁을 이동하기 위한 기기는 본서가 기술하는 유체 전달 장치 등 샘플의 일정 부피를 이동시키는 기기와 동일하다. 예를 들어, 샘플 수집 팁은 수집 팁의 양각에 따라 피펫 헤드에 정착할 수 있다. 다음, 수집 팁은 장치 및 시스템에 걸쳐 액체를 분배하기 위해 사용할 수 있다. 액체를 분배한 후, 수집 팁이 배치되고 피펫 헤드가 검정 기구의 양각에 따라 검정 기구에 정착될 수 있다. 다음, 검정 기구 팁은 시약 기구에서 시약 기구로 이동할 수 있고, 시약이 피펫 헤드에 의해 제시되는 흡입 또는 피펫-형태 동작에 따라 검정 기구로 분배될 수 있다. 또한, 피펫 헤드는 흡입 또는 흡입기-형태 작동으로 수집 팁, 검정 팁 또는 시약 기구 내에서 혼합을 수행할 수 있다.
다른 실시 예로, 응고 검정을 포함하는 액체를 함유하는 팁은 기구 또는 일회용 기구에서 피펫 장치 및 특정 위치에 정착되어 분리할 수 있다필요하면, 팁은 액체가 배수되지 않도록 밀봉하여 씌울 수 있다. 일례로, 이 밀봉은 비닐 밀봉일 수 있다. 본서에 개시되거나 본서에 그 전문이 결합된 미국 일련 번호 13/244,947 또는 미국 특허 제 8,088,593호에 기술된 된 유체 및 재료 조작 장치에 임의의 변형을 채용할 수 있다.
예시적인 샘플 팁
다양한 모양의 용기가 샘플 팁, 반응 챔버, 모세관 및 큐벳으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 큐벳은 유체 샘플을 담을 수 있는 원형, 원통형, 정사각형, 직사각형, 입방체, 원추형, 피라미드형 등 상이한 모양일 될 수 있다. 빛 줄기가 큐벳 표면에 직각으로 입사하거나 또는 다른 각도(0도가 아닌)로 입사하는 직각 큐벳을 사용할 수 있다이러한 직각 큐벳에서, 빛이 비추어지는 액체 샘플도 직각형이며 큐벳의 윤곽을 갖는다. 원형 단면을 가진 큐벳도 사용할 수 있다.
다양한 경로 길이의 큐벳이 검정 반응을 최적하하고 확장하며 검정을 측정하는 데 필요한 샘플량을 최소화하기 위해 사용될 수 있다. 큐벳은 최소 하나의 영역에서 자신의 단면보다 더 길어질 수 있다.
일례로, 검정 큐벳의 한 형태는 빛 줄기의 방향에서 원형 단면을 가질 수 있다. 원형 단면을 가진 큐벳의 사용은 다음과 같이 여러 가지 장점을 제한 없이 가질 수 있다.
1. 광학 경로 길이를 정밀하게 정의할 수 있다. 사출-성형 부품의 치수 정밀도는 1~2%의 변이 계수(CV)보다 좋을 것으로 밝혀졌다. 기존의 마이크로 적정판에서 자발적인 액체 매니스커스는 경로 길이의 부정확도를 유발할 수 있다.
2. 팁의 개방형 특징 및 원형 부분은 액체를 매우 정밀하게 흡입할 수 있도록 우수한 액체 처리 특성을 부여한다.
3. 팁의 광학 이미지는 액체 컬럼의 위치 및 경계를 식별하고 신호가 최대인 경우 팁의 중심을 매우 정밀하게 찾을 수 있도록 한다.
4. 하나 이상의 액체 샘플을 동일 팁에서 배양 및 분석할 수 있다. 이는 팁의 좁은 부위에서 액체의 근처 "슬러그" 간에 물질 이동(축 “‡향으로)이 극히 드물게 발생하기 때문이다.
본서가 개시하거나 본서에 전문이 통합된 미국 일련 제 13/355,458호에 기술된 큐벳, 또는 이미지 시스템 또는 방법의 임의의 변형을 차용할 수 있다.
예시적 팁은 다음과 같은 일반적인 특성을 가질 수 있다.
팁 길이: 0.5 ~ 4 cm.
팁 외경: 0.2 ~ 1.0 cm.
팁 내경: 0.1 ~ 0.5 cm.
팁의 액체 용량: 0.5 ~ 50 uL.
팁 치수 정밀도: 일반적으로 2% 또는 +/- 0.001 cm보다 정밀.
팁 구성: 팁의 일반적인 특성은 유체를 기밀하게 밀봉할 수 있는 피펫(원통형)을 채택하는 것이다. 팁에는 일반적으로 이미지화에 이용할 수 있는 원통형 또는 원추형 영역이 있다. 팁의 하단부 끝은 중력에 수직인 액체 컬럼에 담을 수 있도록 통상적으로 좁아진다.
팁 재료: 투명한 플라스틱 선호(폴리스티렌, 폴리프로필렌 등)(예를 들어 가시 광선을 > 80, 60, 40, 20% 통과하는 재료). 기타 적절한 재료를 배제하지 않는다.
일례로, 실린더의 상단 끝은 실린더에 유체적으로 연결되며 피펫터의 가늘어지는 특성을 이용할 수 있도록 채택한 절두 원형 "보스"이다. 팁의 하단 끝은 피펫터에 수직방향이며 부착되지 않은 경우 액체 내용물을 팁이 유지하는 특성을 제공하도록 좁아진다. 또한, 일반적인 팁의 하부 말단의 외형은 팁 말단을 눌려 맞출 수 있는 유연한(비닐류) 캡으로 유동적으로 밀봉될 수 있도록 원통형 샤프트의 주요 부분에서 말단 방향으로 직경이 감소하는 약간 뾰족한 모양이다. 팁은 보통 성형 플라스틱으로 제조된다(폴리스티렌, 폴리프로필렌 등). 팁은 샘플에 대한 정보를 이미지화하여 얻을 수 있도록 투명하거나 반투명할 수 있다.
일례로, 팁은 (1) 피펫 뚜껑으로 기밀하게 밀봉할 수 있는 상단 특징, (2) 기본적으로 원통형(또는 아주 작은 구배각을 가진 원뿔형) 샤프트와 좁고 뾰족한 하단 팁으로 구성된다. 이 팁은 뚜껑을 사용하여 액밀하게 봉합될 수 있다. 뾰족한 모양은 적당한 힘에서 뚜껑과 잘 일치하도록 돕는다. 팁의 재료는 사출 성형 폴리스티렌일 수 있다.
z-방향에 있는 기구 스테이지가 움직여서 생성된 힘을 사용하여 샘플 수납 도구의 좁은 말단에 쉽게 눌러서 맞출 수 있는 비닐 또는 기타 재료로 제조된 뚜껑을 사용하여 밀봉할 수 있다.
시약 및 반응
임의의 사용자가 본서에 기술된 방법을 수행할 수 있다. 이 사용자는 대상자 자신일 수 있다. 이 사용자는 의사 또는 간호사 등 의학적으로 훈련된 사람일 수 있다. 그러나 반드시 필요한 것은 아니다. 이 사용자는 본서가 기술하는 방법을 수행하기 위해 일반적인 또는 특별한 기술 교육을 받을 수 있다. 그러나 반드시 필요한 것을 아니다. 또한, 이 방법은 한 명 이상의 사용자가 수행할 수 있으며, 예를 들어 다양한 사용자가 다양한 단계를 수행할 수 있다.
본서가 기술하는 이 방법은 사전에 채취된 혈액 및/또는 혈장 샘플을 가지고 개시할 수 있다. 이런 실시 예로, 이 샘플에 종종 EDTA 등 항응고제를 첨가할 수 있다. 또한, 본서가 기술하는 이 방법은 대상에서 혈액을 채취함으로 개시할 수 있다. 이 혈액은 비-정맥 경로로 채취할 수 있다(예: 모세혈관, 예: 바늘을 이용하지 않는). 이 혈액은 예를 들어 손가락-채혈을 통해 채취할 수 있다. 이 혈액은 임의의 적당한 용기로 수집될 수 있다. 일례로, 이 혈액은 카트리지에 수집될 수 있다. 이 용기 및/또는 수집 카트리지는 EDTA 등 항응고제를 함유할 수 있다. 항응고제를 혈액 샘플에 자발적으로 혼합하거나 및/또는 용해시킬 수 있다.
일례로, 이 샘플(일반적으로 항응고제를 함유하는)을 원심분리한다. 원심분리는 혈액을 뭉쳐진 성분과 혈장으로 분리할 수 있는 시간 및 원심력의 임의의 적합한 조합으로 수행될 수 있다. 통상, 형성된 성분은 적혈 세포로 주로 구성되며 통상적으로 혈장은 세포를 실질적으로 포함하지 않는다. 원심 분리가 항상 필요한 것은 아니다. 일례로 전혈을 이용하여 수행할 수 있다. 전혈은 희석될 수 있다. 일례로 샘플에 있는 적혈세포를 응집시킬 수 있는 시약을 첨가하는 등 원심분리를 하지 않고 혈액에서 혈청을 제조할 수 있다.
혈청의 전부 또는 일부가 검정에 사용될 수 있다. 또한, 이 혈청을 다중 형식으로 다수의 검정에 분배되어 사용할 수 있다. 소량 혈청의 적절하게 피펫하는 방법을 예를 들어 미국 일련 번호 13/244,947 및 미국 특허 제 8,088,59호에 개시되어 있다. 일례로, 이 혈청은 하기에 기술한 바와 같이 희석될 수 있다. 이 혈청은 임의의 적절한 용액으로 희석할 수 있다. 예시적인 용액은 헤페스 완충 식염수(HBS), 인산염 완충 식염수(PBS), 트리스 완충 식염수(TBS) 및 이미다졸, 에틸렌디아만, N-에틸 모르폴린, 트리에탈올아민, 또는 기타 완충제가 중성(즉, 약pH 5~9)으로 함유된 용액이다. 혈장 및/또는 혈장 샘플은 다중 형식의 검정에서 응집 변수의 측정 및/또는 혈장을 배분하는 이전, 동안, 또는 이후 중 하나 이상에서 희석될 수 있다.
다음, 소량의 희석 샘플이 특정 시약과 선택적으로 혼합된다. 이 혼합은 약 10초 이하, 약 5초 이하, 약 1초 이하로 일반적으로 빠르게 수행된다. 이 시약은 (a) 해당하는 경우, 항-응고제의 효능을 역전시키는 시약, (b) 응고를 촉진하는 시약, (c) 희석된 샘플을 위한 피브리노겐, 또는 하기에 기술하는 단백질 등 하나 이상의 보조적인 시약을 일반적으로 포함한다. 일부 경우에, 형광물질 또는 기타 입자의 분산이 하기와 기술하는 이미지화에 의한 응고 시간의 결정을 위해 첨가될 수 있다.
항-응고제의 효능을 역전시키는 시약은 임의의 적절한 시약이 될 수 있다. 예를 들어, 칼슘 이온을 EDTA의 효능을 역전시키기 위해 첨가할 수 있다. 선택적으로 CaCl2형태의 칼슘이온을 초과로 첨가할 수 있다. 실시 예로, 반응에서 칼슘이온(Ca2+)의 최종 농도가 최소 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 또는 100 mg/ml이고, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 또는 100 mg/ml 이하, 또는0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75 mg/ml 및 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100 mg/ml 사이가 되도록 본서에 제시하는 응고 반응에 칼슘을 첨가한다.
응고를 촉진하는 시약("응고 개시 시약")은 측정된 응고 변수에 따라 변할 수 있다. 상기에 기술된 바와 같이, PT 및/또는 INR의 측정은 조직 인자 또는 지질을 함유하는 프로트롬빈 시약을 첨가하는 과정을 포함한다. aPTT 검정은 인지질에 실리카, 셀라이트, 고령토 또는 엘라그산 등의 활성제를 부가하여 사용한다.
일례로, 하나 이상의 시약이 농축되거나 건조된 형태로 제공된다. 농축된 시약은 샘플 희석량을 감소시킨다. 건조된 시약 관련하여, 건조된 시약과 샘플을 혼합하면 샘플에 시약이 빠르게 용해 및/또는 분산된다. 건조 시약은 반복 흡입 또는 기타 혼합 방법에 의해 샘플에 용해 및/또는 분산된다. 시약이 농축 또는 건조형태에서 안정한 경우, 임의의 시약을 농축 또는 건조할 수 있다. 실지로, 일부 시약은 건조 형태에서 안정성이 증가하며 잠재적인 냉장, 방부제 등의 사용을 피할 수 있다. 특히, PT 시약, aPTT 시약 및/또는 CaCl2는 농축 및/또는 건조될 수 있다. 모든 시약은 하나의 건조 시약과 결합될 수 있다. 예를 들어, 시약은 신속한 용해를 위해 자당, 트레할로오스, 폴리에틸렌 글리콜, 알부민 등과 함께 배합된 용해질 필름이 코팅된 형태일 수 있다. PT 및/또는 INR 측정에 적합한 건조 시약의 한 가지 제형이 미국 특허 제5,164,598호에 밝혀져 있다.
일례로, 혈장이 시약과 혼합된 후 일반적으로 제어 온도에서 배양될 수 있다. 일례로, 이 온도는 약 15 ℃, 약 20 ℃, 약 25 ℃, 약 30 ℃, 약 35 ℃, 약 40 ℃, 약 45 ℃, 약 50 ℃ 등이다. 일례로 이 온도는 15℃ 와 50℃ 사이, 30℃와 40℃ 사이 등이다. 일부 경우, 배양 과정을 생략할 수 있다. 예를 들어, aPTT 검정은 배양하지 않을 수 있다.
희석 방법
일례로, 혈액 또는 혈장 샘플을 희석한다. 샘플의 희석은 최소 세 가지 잠재적인 이점을 부여할 수 있다. 첫 째, 희석은 필요한 샘플의 양을 감소시킨다. 일례로, 일단 희석된 혈장의 일부 샘플을 응고 변수의 측정을 위해 보존한 후, 나머지는 다른 검정을 위해 사용할 수 있다. 예를 들어, 10배 희석 샘플은 10배로 적은 샘플을 사용하는 방법을 가능하게 한다. 두 번째, 희석은 리포산 샘플(고 지방을 가진 샘플로 백색 우유처럼 보인다)에서 광 산란을 감소시킨다. 세 번째, 희석은 응고 시간을 증가시킨다. 이는 검정에서 시간-민감도를 감소시키는 이점이 된다. 즉, 샘플을 시약과 혼합하거나 카메라로 옮기는 과정을 아주 빠르게 수행할 필요가 없다. 소량의 샘플로 유체가 층류인 경우, 카메라를 소량에 대해 정렬해야 하는 등을 수행하는 단계가 특히 어렵다.
응고 시간은 모든 적절한 시간이 될 수 있으며, 이는 선택적으로 분석과정을 시간에 덜 민감하게 하고 더 정밀하게 및/또는 정확하게 하는 충분히 긴 시간, 또는 선택적으로 관리 지점에서 수행되고 거의 실시간 결과를 도출하기에 충분히 짧은 시간일 수 있다.
일례로, 희석되거나 희석되지 않은 샘플을 사용하는 응고 시간은 약 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 6분, 7분, 8분, 9분, 10분, 15분, 20분, 25분, 30분 등이다. 일례로, 희석되거나 희석되지 않은 샘플을 사용하는 응고 시간은 약 1분 이하, 2분 이하, 3분 이하, 4분 이하, 5분 이하, 6분 이하, 7분 이하, 8분 이하, 9분 이하, 10분 이하, 15분 이하, 20분 이하, 25분 이하, 30분 이하 등이다. 일례로, 희석되거나 희석되지 않은 샘플을 사용하는 응고 시간은 1분에서 2분 사이, 1분에서 5분 사이, 2분에서 10분 사이, 5분에서 8분 사이 등 이다.
샘플은 모든 적절한 응고 시간을 달성하기 위해 선택적으로 희석된 모든 적절한 정도로 희석될 수 있다. 일례로, 샘플을 약 1.2배, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 7.5배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 100배 희석할 수 있다. 일례로, 샘플을 최소 1.2배, 최소 1.5배, 최소 2배, 최소 3배, 최소 4배, 최소 5배, 최소 7.5배, 최소 10배, 최소 20배, 최소 30배, 최소 40배, 최소 50배, 최소 100배 희석할 수 있다. 일례로, 샘플을 최대 1.2배, 최대 1.5배, 최대 2배, 최대 3배, 최대 4배, 최대 5배, 최대 7.5배, 최대 10배, 최대 20배, 최대 30배, 최대 40배, 최대 50배, 최대 100배 희석할 수 있다. 일례로, 샘플을 1.2배에서 2배 사이, 2배에서 5배 사이, 5배에서 20배 사이, 5배에서 50배 사이에서 희석할 수 있다. 실시 예로, 원본 샘플의 90% 이하, 80% 이하, 70% 이하, 60% 이하, 50% 이하, 40% 이하, 30% 이하, 20% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하, 0.5% 이하, 0.1% 이하, 0.05% 이하, 0.01% 이하, 0.005% 이하, 0.001% 이하의 농도로 희석할 수 있다(즉, 본서에서 사용된 바와 같이, 80% 이하의 농도로 원본 샘플을 함유하는 희석 샘플은 예를 들어 희석 샘플의 총량 100 ul에 원본(희석되지 않은) 샘플 80 ul이하이고, 이와 유사하게 2% 이하의 농도로 원본 샘플을 함유하는 희석 샘플은 예를 들어 희석 샘플의 총량 100 ul에 원본(희석되지 않은) 샘플 2 ul이하이다). The original sample may be, for example, neat whole blood or plasma. 원본 샘플은 예를 들어 무첨가 전혈 또는 혈장이다. 실시 예로, 응고 반응은 반응에서 원본 샘플의 최종 농도(부피로)가 90% 이하, 80% 이하, 70% 이하, 60% 이하, 50% 이하, 40% 이하, 30% 이하, 20% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하, 0.5% 이하, 0.1% 이하, 0.05% 이하, 0.01% 이하, 0.005% 이하, 0.001% 이하인 희석 샘플을 포함할 수 있다(즉, 80% 이하의 농도로 원본 샘플을 함유하는 응고 반응은 예를 들어 희석 샘플의 총량 100 ul에 원본(희석되지 않은) 샘플 80 ul이하이고, 이와 유사하게 2% 이하의 농도로 원본 샘플을 함유하는 응고 반응은 예를 들어 희석 샘플의 총량 100 ul에 원본(희석되지 않은) 샘플 2 ul이하이다).
일례로, 짧은 시간에 전체 응고 검정의 완료가 필요할 수 있으며, 예를 들어 관리 지점에서 수행하는 검정은 거의 실시간 결과를 얻기 위해 짧은 시간을 요구한다. 선택적으로 총 검정 시간은 손가락-채혈에 의한 혈액 채취에서 시작하여 특정 시약의 첨가, 이미지 캡처, 이미지 분석, 응고 변수의 통보까지의 범위를 갖는다. 또한, 총 검정 시간은 환자에게 필요한 항-응고제의 정량을 계산 및/또는 투여하기 위해 기 보고된 응고 변수를 사용하는 수행으로 확장될 수 있다. 일례로, 총 검정 시간은 약 1분, 3분, 5분, 10분, 15분, 20분, 30분 등이다. 일례로, 총 검정 시간은 약 1분 이하, 3분 이하, 5분 이하, 10분 이하, 15분 이하, 20분 이하, 30분 이하 등이다.
일례로, 특정 조건하에서 샘플의 희석은 응고시 샘플의 혈병 및/또는 현탁도의 기계적 강도를 감소시킨다. 특정 경우에 이는 응고가 발생하는 시간을 판단하는 수행을 어렵게 만드는 혈병 강도가 약해진 경우에 이점이 된다. 본 발명은 희석에 대해 몇 가지 선택적인 보상 방법을 포함한다.
일례로, 이 방법은 용적 비율에서 높은 표면 영역을 가진 소규모 용기 및/또는 용기에서 수행될 수 있다. 이는 용기의 표면에 초기 혈병의 부착을 돕는다. 용기의 크기 및/또는 표면 영역은 응집시간을 하기에 기술한 대량 왕복 운동의 이미지화를 통해 결정하는 경우의 실시 예에서 고려될 수 있다. 용적 비율에 대한 용기의 용적 및/또는 표면 영역은 본서가 기술하는 방법을 확실하고 정확하게 수행할 수 있도록 임의의 적절한 값이 된다.
일례로, 보조 시약이 소규모 입자, 피브리노겐, 계면 활성제, 및/또는 단백질 등으로 첨가된다. 이러한 보조 시약은 강한 혈병의 형성을 지원하고 및/또는 응고시 샘플 탁도를 증가시킨다.
일례로, 작은 입자를 샘플 비중에서 변화를 시각화하기 위해 샘플에 첨가될 수 있다. 작은 입자의 움직임이 감소되는 것은 샘플 비중의 증가와 연관되며, 샘플 응고의 표지가 될 수 있다.
임의의 특정 이론으로 지지되지 않더라도, 현재 방법의 많은 버전에서 일단 응고가 발생하면 입자의 움직임에 대한 점성 저항을 극복하기에 비록 희석 샘플에서 응고가 일어나더라 중력이 너무 약하다. 입자의 이미지화는 본서에 기술된 응고 시간을 결정하는 수행에 사용될 수 있다.
일례로, 피브리노겐이 샘플에 첨가될 수 있다. 추가 피브리노겐은 혈병이 형성되는 경우 더 실질적인 혈병을 만들고 탁도를 증가시킬 수 있다. 피브리노겐은 동물에서 선택적으로 유래될 수 있고, 선택적으로 소 피브리노겐일 수 있다. 첨가되는 피브리노겐의 양은 적절한 기계적 강도 및/또는 탁도의 혈병을 형성할 수 있도록 임의의 양이 될 수 있다. 다양한 실시 예로, 희석된 샘플에 약 1 mg/mL, 약 2 mg/mL, 약 3 mg/mL, 약 4 mg/mL, 약 5 mg/mL, 또는 약 10 mg/mL의 피브리겐을 보충할 수 있다. 다양한 실시 예로, 희석된 샘플에 최소 1 mg/mL, 최소 2 mg/mL, 최소 3 mg/mL, 최소 4 mg/mL, 최소 5 mg/mL, 또는 최소 10 mg/mL의 피브리겐을 보충할 수 있다. 실시 예로, 본서가 제시하는 응고 반응은 응고 반응에서 외인성 피브리노겐의 최종 농도가 최소 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100 mg/ml이고, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100 mg/ml 이하, 또는 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50, or 75 mg/ml 및 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100 mg/ml 사이가 되도록 외인성 피브리노겐을 보충할 수 있다.
실시 예로, 응고 반응은 반응에서 원본 샘플(즉, 무첨가 혈장 또는 전혈)의 최종 농도가 80% or less, 70% 이하, 60% 이하, 50% 이하, 40% 이하, 30% 이하, 20% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하, 0.5% 이하, 0.1% 이하, 0.05% 이하, 0.01% 이하, 0.005% 이하, 0.001% 이하가 되도록 희석 샘플을 포함하며, 응고 반응은 응고 반응에서 외인성 피브리겐의 최종 농도가 최소 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100 mg/ml이고, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100 mg/ml 이하, 또는 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50, or 75 mg/ml와 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100 mg/ml 사이가 되도록 외인성 피브리노겐을 추가로 포함할 수 있다.
희석을 보상하기 위해 다른 방법의 사용 및/또는 본서가 기술하는 방법을 서로 조합하거나 다른 방법과 조합하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 희석된 샘플에서 응고 시간의 결정을 돕기 위해서 피브리노겐 및 입자들 첨가할 수 있다. 실시 예로 본서의 다른 곳에서 논의된 바와 같이, 응고 검정에서 희석 샘플을 사용하여 다양한 이점을 부여할 수 있다. 따라서, 샘플의 희석을 보상하기 위해 피브리노겐 또는 기타 시약을 첨가하면 희석된 샘플에서 효과적이며 측정 가능한 응고를 여전히 달성하면서 응고 검정에서 희석 샘플의 사용과 연관된 이점이 될 수 있다.
일부 경우, 혈액 및/또는 혈장 샘플의 희석은 예를 들어 튜브 또는 피펫 팁 등 표면에 흡착에 의한 샘플로부터 응고 인자를 손실을 유발할 수 있다. 일례로, 계면활성제 및/또는 단백질을 응고 인자의 손실을 방지 및/또는 감소하기 위해 샘플에 첨가할 수 있다.이 목적에 적합한 예시적 계면활성제는 트리톤 X-100이다. 이 목적에 적합한 예시적인 단백질은 소 혈청 알부민(BSA)이다. 계면활성제 및/또는 단백질의 농도는 응고 인자 손실이 수용 가능한 임의의 레벨로 감소될 수 있도록 임의의 적합한 농도가 될 수 있다.
이미지
본서가 기술한 장치 및 시스템은 카메라, CCD 센서-함유 장치, CMOS 센서-함유 장치 또는 기타 핸드홀드 벤치탑, 또는 촬영 기능을 갖춘 대형 장치 등 임의의 촬영 장치를 포함한다. 본사가 기술하는 방법은 응고 변수를 측정하기 위해 광학 방법을 사용할 수 있다. 일례로, 샘플의 응고는 샘플의 탁도 및 광 산란을 증가시킨다. 피브리노겐의 첨가는 본서에 기술한 바와 같이 검출할 수 있도록 혈병의 탁도 및 광 산란을 증가시키기 위한 한 방법이다.
다른 실시 예로, 종종 개별적으로는 육안으로 보이지 않지만 대량 사용으로 혼탁을 유발하는 현탁 입자를 첨가하여 샘플이 초기에 탁하거나 초기에 탁하게 된다. 초기 현탁 샘플이 입자가 대량 유체에서 침강함으로 시간에 지남에 따라 탁도가 감소하는 반면, 샘플의 응고는 입자의 침강을 정지시키거나 실질적으로 느리게 하여 및/또는 탁도를 감소시킨다. 일례로, 응고 시간은 샘플의 대량 탁도가 감소하는 속도를 중지 또는 감속에 의해 측정할 수 있다. 탁도에 의한 응고 시간의 측정은 광학 기술(빛을 포함하여)이며 이미지의 캡처를 포함할 수 있고, 반면 이미지의 사용은 필수적이지 않다. 예를 들어, 실시 예로 탁도는 샘플에 발생하는 광 흡수 또는 광 산란을 광증배관 또는 광 다이오드 등으로 감지하여 측정할 수 있다. 일례로, 본서의 방법으로 획득한 이미지는 광산란 이미지이며 선택적으로 화소화하지 않는다. 빛을 긴 경로를 거쳐 샘플을 통과시키거나 샘플의 경로 길이를 증가시키는 수행은 탁도의 변화를 포함하여 측정의 감도를 증가시키는 한 방법이다.
본서에 기술된 방법은 응고 변수를 측정하기 위해 이미지를 사용할 수 있다. 이 이미지는 비디오 이미지 또는 사진 이미지의 시간 세트가 될 수 있다. 이 이미지를 카메라, 거울, 렌즈, 현미경 등 광학 장치를 사용하여 캡처할 수 있다. 이 이미지는 2차원 또는 3차원일 수 있다. 이 이미지는 흑백, 회색 스케일 또는 컬러일 수 있다. 이 이미지는 아날로그 이미지의 디지털화를 포함하여 디지털 또는 아날로그일 수 있다. 이 이미지는 화소화될 수 있으며, 이는 다양한 분광기 형태를 포함하여 다른 광학적 현상과 이미지를 구별할 수 있는 화소들을 포함한다는 의미이다. 2차원 이미지는 복수의 행 및 열로 분할하여 화소화할 수 있으며, 이 경우 각 요소(행 및 열의 위치)가 화소를 정의한다.
이미지는 적절한 개수의 화소로 화소화될 수 있다. 한 실시 예로, 이미지는 512행 및 512열로 분할되어, 262,144 화소를 정의한다. 일례로, 이미지는 약 10,000 화소, 약 50,000 화소, 약 60,000 화소, 약 100,000 화소, 약 200,000 화소, 약 500,000 화소, 약 1,000,000 화소, 약 5,000,000 화소, 약 10,000,000 화소, 약 50,000,000 화소를 포함한다. 일례로, 이미지는 최소 10,000 화소, 최소 50,000 화소, 최소 60,000 화소, 최소 100,000 화소, 최소 200,000 화소, 최소 500,000 화소, 최소 1,000,000 화소, 최소 5,000,000 화소, 최소 10,000,000 화소, 최소 50,000,000 화소를 포함한다. 일례로, 화소 밀도 및/또는 해상도는 소정의 영역이 특정 개수의 화소를 포함하는 것으로 보고된다.
일면으로, 이 방법은 일련의 시간에 대한 이미지를 사용하여 응고 시간을 결정하는 수행을 설명한다. 이미지는 임의의 적당한 속도로 캡처할 수 있다. 속도는 일정하거나 응고의 시간 경과에 따라 변할 수 있고, 선택적으로 샘플에서 혈병이 형성될 경우 시간 근방에서 다수의 이미지를 캡처할 수 있다. 일부 실시 예로, 이미지를 초당 약 1 프레임, 초당 약 5 프레임, 초당 약 10 프레임, 초당 약 15 프레임, 초당 약 20 프레임, 초당 약 30 프레임, 초당 약 50 프레임, 초당 약 100 프레임, 초당 약 500 프레임 등의 속도로 캡처할 수 있다. 일부 실시 예로, 이미지를 초당 최소1 프레임, 초당 최소 5 프레임, 초당 최소 10 프레임, 초당 최소 15 프레임, 초당 최소 20 프레임, 초당 최소30 프레임, 초당 최소 50 프레임, 초당 최소 100 프레임, 초당 최소 500 프레임 등의 속도로 캡처할 수 있다. 일례로, 내삽법을 프레임 캡처 사이에 해당하는 응집 시간을 추정하기 위해 사용할 수 있다.
이미지는 컴퓨터 판독 가능 매체에 저장될 수 있다. 이미지는 실시간 또는 나중에 처리될 수 있다. 이미지는 수동으로 또는 컴퓨터에 의해 구현된 방법으로 처리할 수 있다.
응고 분석을 위한 광학 장치
응집 분석은 광학 장치를 사용하여 수행될 수 있다. 광학장치는 광원 및 광 검출기를 제한 없이 포함할 수 있다. 통상, 광원은 응고 반응에 비춰지는 빛을 제공하고, 검출기는 반응에서 나오는 빛(예: 반응에서 산란된, 반사된, 투과된 빛)을 검출한다.
예를 들어, 광원은 하나 이상의 백색 광원, 단색 LED, 형광 램프 또는 LED에서 나오는 광폭 주파수 광, LED 집합체, 적, 녹, 청 광원의 혼합체, LED에 의해 활성화된 형광체, 형광 램프, 백열등, 또는 플래시 튜브 등 아크 광원일 수 있다.
다양한 광 검출기를 본서에서 제시하는 방법 및 시스템을 사용할 수 있다. 실시 예로, CCD 센서 또는 CMOS 센서 등 이미지 센서를 사용할 수 있다. 이미지 센서는 카메라의 일부로 제공될 수 있다. 카메라는 개구 또는 렌즈를 포함할 수 있다. 실시 예로, 카메라의 렌즈는 35 mm를 포함해서 5~100 mm 사이의 초점 거리를 가질 수 있다. 렌즈는 표준 대물 거리를 지닌 유리 또는 웹캠 렌즈일 수 있다. 실시 예로, 광 검출기는 광 증배기(PMT) 또는 광다이오드(예를 들어 애버랜치 광다이오드, 광범위 광다이오드, 핀 광다이오드 및 단일 주파수 광다이오드를 포함하여) 등 광자 카운터/검출기일 수 있다. 일례로 핀 다이오드는 PMT와 필적하는 감도의 검출 장치로 만들기 위해 증폭기와 결합할 수 있다. 또한, 검출기는 전 또는 발광 다이오드(LED) 등 광원을 포함할 수 있다. 광원은 결과를 검출하기 위해 검정물을 비출 수 있다. 또한, 검출기는 광원에서 검정물로 빛로 전달하는 렌즈 또는 광섬유 등 광학기를 포함할 수 있다.
광원 및 검출기는 서로 그리고 응고 반응 지원기구(예: 용기, 표면, 튜브, 팁 등) 관련하여 다양한 구성을 가질 수 있다. 예를 들어, 광원 및 검출기는 모두 반응 지원기구와 일렬로 있거나, 또는 하나 또는 모든 광원 및 검출기가 반응 지원기구 또는 서로에 대해 비스듬히 있을 수 있다. 한 예에서, 광원은 응고 반응 지원기에 일렬이며, 검출기는 반응 지원기에 대해 90도이다. 광원 또는 반응 지원기 및 검출기 간에 개구가 있을 수 있다. 광원에서 나온 빛이 반응물에 도달하고 반응물에서 나온 빛이 검출기에 도달하도록, 반응 지원기를 광학 경로로 이동시키는 경우 반응의 이미지를 얻을 수 있다. 실시 예로, 반응 지원기는 임의의 모든 x, y 또는 z 공간에서 이동하여 광학 경로로 또는 경로로부터 이동할 수 있다. 실시 예로, 응고 반응 지원기는 광원 및/또는 검출기와 통신하여 이동할 수 있다. 실시 예로, 광원 및/또는 검출기가 응고 반응 지원기와 통신하여 이동할 수 있다. 실시 예로, 하나, 둘, 또는 모두 세 개의 응고 반응 지원기, 광원, 및 검출기는 다른 것 중 최소 하나에 대해 이동할 수 있다. 실시 예로, 하나 이상의 광 섬유 케이블은 광 검출기로부터 적어도 다소 떨어진 위치에서 광 검출기로 빛을 비추기 위해 CCD 센서 또는 PMT 등 광 검출기와 연결될 수 있다.
반응 지원기/샘플 용기에 배경 조명, 전면 조명, 또는 경사(측면) 조명을 비출 수 있다. 광학 배열은 넓은 균일한 조명 배경 영역 및 대상에 의해 차단되는 특정 형태의 빛줄기를 형성하도록 할 수 있다. 전면 점등 조명 역시 사용할 수 있다.
일례로, 이미지 응집에 대한 광학 기구를 산란광을 측정하기 위해 구성할 수 있다. 일면에서, 산란된 빛을 측정하기 위한 기구는 광원 및 검출기를 포함한다. 광원은 확산광으로 제공할 수 있다. 샘플은 광학적으로 투명한 팁 또는 기타 지원기 등 용기의 내부에 담긴다. 용기는 폴리스티렌 또는 아크릴 등 투명한 재료로 제조할 수 있다. 용기의 광 경로(내부 직경)은 예를 들어, 0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25밀리미터, 또는 그 이상이 될 수 있다. 용기는 검출기 전면에 배치되며, 일반적으로 검출기로부터 약 20~50 밀리미터의 공간을 둔다. 검출기는 본서의 다른 곳에서 기술하는 임의의 검출기가 될 수 있다.
검출기는 렌즈 및 필터 등 광학적 구성물을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 필터는 주변에서 어떤 미광을 제거하여 배경을 감소시키는 데 사용된다. 샘플에 검출기와 직각으로 빛을 비출 수 있다..광원은 측면(검출기로부터 약 90도), 상단에서, 또는 샘플 지원기에 대한 다른 위치에 배항될 수 있다. 광원은 임의의 광원, 확산 또는 비-확산, 및 임의의 파장 또는 파장의 조합일 수 있다. 광원의 파장은 검출기의 최대 분광 감도와 일치하도록 선택될 수 있다.
형광 여기에서, 대상체는 형광 여기를 위해 전면에서 빛을 비출 수 있다. 광원이 LED 또는 레이저 등 단색일 수 있다. 또한, 사각광이 형광 여기에 사용될 수 있다. 대상체는 방출된 광자가 나타나는 90도의 각도로 종종 여기될 수 있다. 이러한 형태의 광은 형광 발광이 측면에서 여기될 뿐만 아니라 대상체의 뒤(역광)에서 직접적으로 분산 검출을 할 수 있게 한다.
일례로, 형광 발광은 여기 빛줄기에 90도에서 이미지화 된다. 일례로, 일반적으로 고-강도 LED인 광자 근원이 시준되거나 점진적으로 발산하는 여기 빛줄기를 생성하며 빔 산광기 및 형상 렌즈를 통과한다. 여기 빛줄기가 대역 필터를 통과하여 형광-라벨 샘플을 가진 용액을 함유하는 용기(튜브, 큐벳, 또는 피펫 팁)로 구성되는 샘플로 조명된다. 등방성 발광 형광이 스톡스-이동 형광을 통과하기에 적합한 장역 또는 대역 필터로 여기광과 분광적으로 분리된다. 다음, 빛이 렌즈를 통해 디지털 카메라 또는 기타 검출기로 이미지화 된다. 형광 강도는 이미지 분석을 통해 결과 이미지에서 추출된다.
다른 실시 예로, 투과된 빛이 여진 파장에서 빛을 제거하기 위해 광학적 필터링 후 이미지화 된다. 일례로, 일반적으로 고강도 LED인 광자 근원은 서서히 발산, 타원형 여기 빛줄기를 생성하며 빔 산란기 및 형상 렌즈를 통과한다. 여기 빔은 대역 필터를 통과하고 각각 형광-라벨 물질을 가진 용액을 함유하는 하나 이상의 용기(튜브, 큐벳, 또는 피펫 팁)으로 공급되어 샘플을 조명한다. 등방성-발광 형광은 스톡스 이동 형광을 통과하기에 적합한 장역 또는 대역 필터로 여기 광을 분광학적으로 분리된다. 다음, 빛이 카메라 렌즈를 통과하여 디지털 카메라에서 이미지화된다. 형광 강도는 이미지 분석을 통해 결과 이미지로부터 추출된다. 광학적 기구를 동시에 다수 튜브의 이미지 배열을 생성하는 데 사용할 수 있다.
일례로, 이미지화는 형광, 암시야 조명 또는 명시야 조명을 사용하여 수행할 수 있다.
명시야 조명은 환형광원(샘플의 상부 또는 하부에 위치하는), 암시야 아베 집광 렌즈, 도넛형 거울, 대물 렌즈 주위의 슬리브에 내장된 에피-암시야 집광기, 또는 암 스톱에 장착된 스테이지 집광기와 환형광원의 조합을 사용하여 달성할 수 있다. 기본적으로, 이러한 광학 구성물은 사용하는 대상물의 개구수(NA)보다 큰 개구수의 광원뿔을 생성한다. 조명 방식의 선택은 필요한 배율, 기계적 설계 고려요소, 촬영 센서의 크기 등 고려요소의 개수에 의존한다. 조명 방식에 기초한 환형조명은 일반적으로 넓은 영역에 걸쳐 균일한 암시야 조명을 제공하며 동시에 전체 시스템의 기계적인 설계에서 충분한 유연성을 제공한다.
명시야 조명은 쾰러 조명을 생성하기 위해 스테이지-집광기와 함께 백색광원을 사용하여 달성할 수 있다.
일례로, 자동 필터 휠을 사용할 수 있다. 자동 필터 휠은 동일 시야에 다수의 형광소를 이미지화할 수 있도록 촬영 광학 경로의 제어할 수 있다.
일례로, 자동 초점 기반의 이미지를 얻을 수 있다. 이미지-기반 알고리즘이 자동-초점을 달성하기 위해 대물렌즈의 z-위치(즉, 수직 위치) (즉, 샘플로부터의 거리)를 제어하는 데 사용될 수 있다. 간략하게, 작은 이미지(예를 들어, 128 x 128 화소)가 예를 들어, 암시야, 염시야 또는 기타 조명 형태를 사용하여 빠른 속도로 챕처될 수 있다. 이 이미지는 이미지 선명도를 측정하는 자동-초점 기능을 파생시켜서 분석할 수 있다. 신속 검색 알고리즘이 기반하여 대상렌즈의 다음 z-위치를 계산할 수 있다. 대상렌즈는 새로운 z-위치로 이동되면 다른 작은 이미지를 캡처할 수 있다. 이 폐회로 시스템은 초점을 맞추기 위한 다른 하드웨어를 사용할 필요가 없다. 현미경 스테이지는 X 및 Y 방향에서 판별할 수 있도록 컴퓨터 제어 스테퍼 모터에 연결할 수 있다. 모든 위치에서, 원하는 이미지 개수를 캡처하고 스테이지를 다음 XY 위치로 이동한다.
CCD, EMCCD, CMOD를 가진 카메라 또는 일부 경우 광 증배관이 신호를 검출하는 데 사용될 수 있다.
광 산란 방법
일례로, 응집 시간은 광 산란에 의해 측정될 수 있다. 반응 혼합물을 모세관 힘 또는 흡입으로 피펫 팁 또는 모세관으로 흡입할 수 있다. 유리 또는 폴리스티렌 또는 폴리메틸메타크릴산(아크릴) 등 투명한 플라스틱을 제한 없이 포함하여 광학적으로 투명한 임의의 재료를 이용하여 팁 또는 모세관을 제조할 수 있다. 일례로, 피펫 팁 또는 모세관은 길고 가늘다. 예를 들어, 1 ㎕의 반응 혼합물을 0.5 mm 직경의 모세관으로 흡입할 경우, 5.1 mm의 액체 컬럼을 생성한다.
피펫 팁 또는 모세관은 검정하는 동안 증발하는 것을 막기 위해 선택적으로 밀봉되거나 뚜껑을 씌울 수 있다. 팁 또는 모세관을 밀봉하는 하나의 적합한 방법은 소량의 미네랄 오일을 추가로 흡입하는 것이다. 또한, 피펫팁 또는 모세관이 팁의 표면에서 빛이 산란되는 것을 감소시켜 이미지화를 향상시키기 위해 오일로 코팅할 수 있다.
다음에, 피펫 팁 또는 모세관을 어두운 배경 앞에 세우고 빛을 비출 수 있다. 일반적으로, 조명의 방향은 빛이 카메라 또는 기타 광도 검출기로 들어가지 않도록 팁 또는 모세관을 비출 수 있도록 한다. 예를 들어, 카메라가 팁 또는 모세관의 전면에 있을 경우, 빛은 측면에서 비춰질 수 있다.
팁 및 모세관을 광학적으로 모니터링 한다. 광 다이오드 또는 PMT 등 단순한 광도 검출기를 사용한다. 또한 카메라를 사용할 수 있으며, 비디오 카메라도 선택적으로 사용할 수 있다. 예를 들어, 카메라는 CCD 또는 CMOS 센서를 가질 수 있다. 이미지 처리에 의해 샘플의 위치를 측정하도록 하고, 이로써 피펫 오차 및 샘플의 위치에 덜 민감한 방법을 가능한 일례에서 카메라를 사용하는 수행이 유리할 수 있다.
응집이 발생하는 경우, 피브리노겐이 중합되고 샘플의 탁도가 증가한다. 추가되는 빛이 반응 혼합물에서 산란되며, 이는 검출기로 산란된 조명광이 증가함으로써 카메라 또는 광도 검출기에 의해 기록된다. 도면 1은 반응 혼합물의 응집 100 이전 및 응집 105 이후를 보여준다. 명시된 100에서 105 위치로 탁도가 증감함에 주목한다. 또한, 도면 1에서 팁 101의 하단부는 오일로 코팅되었지만, 팁의 상단부는 오일로 코팅되지 않았다. 오일이 코팅되지 않은 팁 102의 부분과 대비하여 오일이 코팅된 팁 101의 부분에 의해 산란된 빛의 양이 낮음에 주목한다.
이미지 분석은 검정 혼합물을 통과하는 빛에 의해서만 분석하는 수행을 가능하게 하며, 이는 특히 극소량의 검정물과 관련된다. 예를 들어, 이미지 분석을 사용하는 경우, 용기의 벽에서 반사되거나 산란된 빛은 분석에서 제외한다. 다른 예로, 이미지 분석을 사용하는 경우, 검정 혼합물을 함유하는 이미지 영역의 크기를 결정할 수 있고, 이어서 용기에 있는 응집 분석물의 양을 결정하는 데 사용할 수 있다. 예로서, 이는 다른 용량의 검정 혼합물에 걸쳐 신호의 정규화를 가능하게 한다. 다른 실시 예에서, 이미지 분석을 사용하여 검정 혼합물을 함유하는 용기의 위치 또는 용기에서 검정 혼합물의 위치를 측정할 수 있다. 비록 검정 혼합물을 함유하는 용기의 위치 또는 용기에서 검정 혼합물의 위치가 동일 광학적 설정에서 실행된 다른 검정에서 때때로 변하더라도, 이 방법은 검정 혼합물에 나오는 빛의 정확한 측정을 가능하게 한다. 일반적으로, 이미지 분석은 분석을 위한 이미지 관심 영역(ROI)의 식별을 가능하게 한다. 통상적으로, 이미지의 ROI는 검정 혼합물의 이미지를 함유하는 전체 이미지의 일부이다. 선택적으로, ROI를 이미지에서 식별할 수 있으며, 해당 ROI에서 빛/신호의 강도를 측정할 수 있다. 다수의 이미지를 획득할 수 있는 소정의 검정 혼합물에 대해, 동일 검정 혼합물의 다수의 이미지에 걸친 ROI에서 신호의 강도를 측정하고 분석할 수 있으며, 응집 혼합물에서 응집 시간을 결정하는 데 사용할 수 있다. 일반적으로, 검정 혼합물의 응집 상태가 변하면 ROI에서 나오는 신호를 변화시킨다.
광 산란의 증가가 시작하는 시간은 희석된 샘플에 대한 응집 시간이 되고 적절하게 변환하여 응집 변수를 구할 수 있다. 희석된 응집 시간을 응집 변수로 변환하는 수행은 독립적으로 특징된 샘플을 가진 시스템 보정을 통해 이루어질 수 있다.
광 산란 데이터의 분석
실시 예에서 산란된 빛이 상기에 기술한 바와 같이 측정된 경우, 도면 2에 보여지는 형태의 데이터를 얻을 수 있다. 이 경우 시간은 수평축에 있고 우측에 있는 범위는 정확히 50초 이상에서 300초 이하이다. 주 신호가 수직축에 도시되어 있고 그 범위는 반응의 개시점에서 정확히 평균 0.2 강도 단위 이하이고 종점에서 정확히 0.45 단위 이하이다. 도면 3은 4개의 변수 로그-대수 진행 곡선에 맞춘 도면 2의 데이터를 보여준다.
일례로, 응집 시간을 도면 2에 도시된 데이터 및/또는 도면 3에 나타난 진행 곡선에서 정의된 임의의 부분으로 추정할 수 있다. 예를 들어, 응집 시간은 광 산란이 최대 광 산란의 약 10%, 약 50%, 약 80% 등에 도달하는 경우로 정의될 수 있다. 사용하는 임상 관심 범위에 걸친 응집 변수값으로 임상 샘플에 대해 기타 인정되어 서술된 방법의 결과와의 상관관계에 의해 결정될 수 있다.
일례로, 산란 광 강도 데이터가 도면 19에 나타난 곡선에 맞을 수 있다. 이 경우, 시간은 수평축에 있으며 평균 신호 강도는 수직축에 도시되어 있다. 도면 19에서, S자형 곡선은 평균 광 강도 데이터이고, 이중선형 곡선에 맞춰져 있다. 일례로, 응집 시간은 도면 19에 도시된 바와 같이, 이중선형에 맞춰서 정의된 임의의 부분으로 추정할 수 있다. 예를 들어, 응집 시간은 광 산란 신호가 광 산란의 기준 레벨에 최소 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 이상에 도달한 경우로 정의될 수 있다.
실시 예로, 응집 반응에 의한 광 산란을 분석하는 수행을 포함하는 방법은 응집 반응을 투과한 광량을 측정할 수 있다. 샘플 응집물이 더 불투명할수록, 더 많은 빛을 산란하고, 더 적은 빛을 투과시킨다. 실시 예로, 응고 반응을 투과한 빛을 측정하는 검정의 응고 시간은 응고 반응을 투고한 광량이 광 기준 레벨의10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%로 감소할 때 시점으로 정의할 수 있다.
입자 구슬 침강 방법
일례로, 응고 시간은 혈병 형성으로 샘플에서 있는 미세 입자 또는 구슬의 침강 속도가 정지 또는 감속하는 것을 관찰하여 결정할 수 있다. 구슬은 응고 이전에 임의의 시간에 임의의 적절한 농도로 샘플에 첨가될 수 있다. 일례로, 구슬은 샘플에 혼합되고, 현탁되고 및/또는 용해되고 재-현탁된 시약을 농축하거나 건조한 혼합물의 일부일 수 있다.
도면 5를 참조하면, 이 방법은 구슬 500을 함유하는 샘플을 모세관 또는 피펫 팁 505 등 투명한 용기로 도입하는 수행을 포함한다. 모세관 또는 피펫 형태는 선택적이며 약 0.5 mm의 좁은 직경을 가질 수 있다. 모세관은 구슬이 팁 또는 모세관의 긴 방향으로 중력에 의해 침강할 수 있도록 통상적으로 수직으로 세운다. 구슬의 침강은 카메라 510에 의해 일정 시간 동안 이미지화 된다. 이 카메라는 비디오 카메라 및/또는 입자를 이미지화할 수 있는 현미경과 결합될 수 있다. 일례로, 시각화 방법은 비디오 현미경이다. 일례로. 이 카메라는 웹캠이다. 일례로, 이 웹캠은 모세관 또는 팁으로부터 10 mm 위에 설치되어 있다.
용어 "구슬" 및 "입자"는 상호 교환되어 사용될 수 있다. 이 구슬은 응집하면서 감속하거나 정지하기에 적절한 속도로 침강하도록 임의의 크기를 가질 수 있다. 일례로, 구슬은 약 5 ㎛, 약 10 ㎛, 약 20 ㎛, 약 25 ㎛, 약 30 ㎛, 약 35 ㎛, 약 40 ㎛, 약 45 ㎛, 약 50 ㎛, 약 60 ㎛, 또는 약 100 ㎛의 직경이다. 일례로, 구슬의 직경은 최대 약 5 ㎛, 최대 약 10 ㎛, 최대 약 20 ㎛, 최대 약 25 ㎛, 최대 약 30 ㎛, 최대 약 35 ㎛, 최대 약 40 ㎛, 최대 약 45 ㎛, 최대 약 50 ㎛, 최대 약 60 ㎛, 또는 최대 약 100 ㎛이다. 일례로, 구슬의 직경은 약 5 ㎛에서 100 ㎛ 사이, 약 20 ㎛에서 60 ㎛사이, 또는 약 25 ㎛에서 40 ㎛사이이다. 이 구슬들은 폴리스틸렌 또는 라텍스 등 임의의 적절한 물질로 만들 수 있으며, 구형 등 임의의 모양이 될 수 있으며, 임의의 밀도를 가질 수 있다.
다양한 크기, 다양한 모양, 다양한 밀도를 지니고 다양한 물질 등으로 만들어진 구슬은 상이한 속도로 침강할 수 있고 다양한 범위에서 혈병에 함유될 수 있다. 일례로, 다수의 상이한 크기를 가진 구슬 혼합물이 사용될 수 있다. 도면 5에서 보여지듯이, 직경 25 ㎛를 가진 구슬 515 및 직경 45 ㎛ 를 가진 구슬 520의 혼합물을 사용할 수 있다. 또한, 다양한 모양, 다양한 밀도를 가지며 다양한 물질 등으로 제조된 구슬의 혼합물을 사용할 수 있다. 일면으로, 구슬의 혼합물을 사용할 수 있다. 구슬의 혼합물은 방법의 감도, 방법의 재현성, 방법에 측정 가능한 응고 시간의 범위 등을 향상시킬 수 있는 다수의 침강 시간 및/또는 혈병 유지성을 제공할 수 있다.
시간이 흐르면서, 구슬이 도면 5의 표시 525 에 도시된 바와 같이 중력에 의해 침강될 것이다. 일례로, 대류, 기류, 자기장, 브라운 운동 등 임의의 다른 적절한 힘이 중력과 선택적으로 결합하여 구슬을 움직일 수 있다. 또한, 구슬의 밀도가 매질보다 낮을 경우, 구슬은 중력하에서 매체에 떠 있을 수 있다. 임의의 특별한 이론에 의하지 않더라도, 희석 혈장에 잇는 약한 혈병이라도 중력 등 약력을 극복하고 구슬의 이동을 억제하기에 일반적으로 충분하다. 일례로, 혈병의 강도는 상기에 기술한 바와 같이 외인성 피브리노겐을 첨가하여 강해질 수 있다. 일례로, 구슬 침강 방법은 광 산란 방법보다 적은 외인성 피브리노겐을 사용한다. 응고 시간은 약력에 의해 구슬의 움직임이 정지하는 경우의 시간 및/또는 약력에 의해 움직이는 속도가 실질적으로 감소하는 경우의 시간이 될 수 있다.
일례로, 응고 시간은 구슬의 움직임을 정지하는 경우를 측정하여 이미지를 분석하여 결정할 수 있다. 일례로, 이미지 분석은 선택적으로 임의의 적합한 알고리즘으로 자동화될 수 있다. 예를 들어, 비디오의 각 프레임 또는 최종 프레임의 각 화소 간의 평균 제곱 차이 등 다른 변수를 계산할 수 있다. 응고가 발생하고 구슬의 움직임이 정지한 경우, 비디오의 최종 프레임은 응고 및 비디오의 종점 간의 모든 프레임을 대략 유사할 것이다. 이 예에서, 다른 변수는 응고가 발생하자마자 영점으로 떨어질 것이다. 이러한 하락의 시작 시간은 응고 시간을 표시하며, 적절하게 응고 변수로 변환될 수 있다.
다른 실시 예로, 최대 신호 대 잡음 비율("PSNR")은 응고 시간을 결정하는 데 사용할 수 있다. PSNR는 식 2에 정의된 바와 같이 평균 제곱 오차에 의해 이미지 "I" 및 "K " 간의 차이를 평가할 수 있다
Figure 112015016716898-pct00002
(식 2)
이 경우 PSNR은 식 3으로 정의된다
Figure 112015016716898-pct00003
(식 3)
여기서 MAXI는 이미지의 최대 강도이고, "m" 및 "n"은 화소에서 이미지 차원이다(길이 분의 폭)
도면 4는 RSNR 방법에 의해 분석된 대표적인 반응 시간 전개를 보여준다. PSNR 진행 곡선은 상단 15에서 35 바로 위로 펼쳐진 수직 눈금에 따른 RSNR 값을 보여준다. 이 시간은 우측 50초 바로 아래에서 3500초 바로 위로 뻗어진 수직축에 보여진다. 일례로, PSNR 데이터는 선형 또는 이차 함수 및 증가의 중점 등 단순한 함수에 맞춰져 있다.
일례로, 응고 시간은 현미경에 의해 결정될 수 있다. 한 실시 예에서, 전혈의 응고는 현미경으로 적혈 세포의 움직임을 관찰함으로써 측정될 수 있다. 전혈 샘플은 희석될 수 있다. 적혈 세포를 함유하는 검정에서, 적혈 세포는 상기의 구슬 침강 방법에서 기술한 구슬과 유사한 역할을 수행할 수 있다.
형광 현미경 방법
일례로, 응고 시간은 형광 현미경에 의한 형광 구슬의 움직임을 관찰하여 결정할 수 있다. 적합한 형광 구슬은 카르복실화-변형 미세구를 포함한다. 적합한 카르복실화-변형 미세구는 상표명 FluoSpheres, 카탈로그 #F-8816을 가진 Life Technologies Inc., Carlsbad California 제품이 될 수 있다. 이 형광 구슬은 스펙트럼의 진홍색 부분을 포함하여 임의의 적합한 파장의 형광이 될 수 있다. 형광 구슬은 임의의 적합한 크기를 가질 수 있다. 일례로, 구슬은 반응 매체에서 중력에 의해 침강하지 않거나 중력에 의해 서서히 침강하고, 샘플 응고가 발생하면 움직임이 정지하도록 하는 크기이다. 실시 예로, 형광 구슬의 직경은 1 ㎛ 이다.
상기에 기술된 구슬 침강 방법에서와 같이, 형광 구슬은 다른 건조 시약 등이 첨가된 임의의 적합한 농도에 있을 수 있다. 도면 6에 도시된 바와 같이, 샘플 600은 모세관 또는 피펫 팁으로 흡입할 필요가 없으며 슬라이드 605에 방울로 배치될 수 있다. 형광 구슬 610을 함유하는 샘플은 약 2 ㎕ 등 임의의 적합한 용량이 될 수 있다. 현미경 대물렌즈 부품 615는 초점면620에서 샘플의 이미지를 채취한다. 현미경 대물렌즈 부픔 615와 관련한 슬라이드 605의 위치는 촛점면 620의 깊이를 변화시키며 및/또는 샘플의 다양한 영역을 이미지화 하도록 변할 수 있다. 일례로, 검정 반응물 내에서 여러 관찰 영역이 캡처할 수 있도록 현미경 대상렌즈 부품 관련하여 슬라이드를 체계적으로 이동할 수 있다. 또한 슬라이드의 연관 위치 및 현미경 대상렌즈 부품은 배경 영역이 아닌 샘플만 시각화됨을 확인할 수 있다.
일례로, 샘플이 큐벳에 위치한다. 큐벳은 현미경 대상렌즈 615 관련하여 배치되어 이미지화될 수 있거나, 큐벳은 슬라이드 605에 배치될 수 있다. 도면 7은 상단 그림 700 및 측면 그림 705에 있는 예시적인 큐벳을 도시한다. 상층 710은 아크릴 공간확보 물질일 수 있고, 하층 715는 표준 유리 커버 슬립일 수 있다. 상층은 약 80 ㎛를 포함하는 임의의 적합한 두께를 가진다. 또한 상층에는 포트 720이 있으며, 선택적인 직경은 2 mm이고, 선택적인 레이저 커터로 제조될 수 있다. 상층 710을 함유하는 아크릴 재료는 하층 715에 부착되는 접착면을 가질 수 있다. 상층과 하층은 약 0.25 ㎕의 샘플을 담을 수 있는 2 mm 직경 및 80 ㎛ 깊이를 갖는 샘플 용기 720을 제조하기 위해 조립된다.
일례로, 큐벳은 샘플 지탱을 위해 기계화된 포트와 투광성 아크릴의 얇은 슬라브로 만든다. 일례로, 큐벳은 큐벳을 친수성으로 만들기 위해 플라즈마 에칭된 표면과 사출 성형된 플라스틱으로 만든다.
형광 구슬의 이동은 기류(도면 6, 표시 625), 대류 및 브라운 운동의 혼합으로 유발된다. 일례로, 샘플은 형광 구슬의 여기된 파장으로 비춰진다. 일례로, 샘플은 크세논 아크 램프로 비춰진다. 형광 구슬은 현미경에 의해 관찰할 수 있는 발광 파장에서 발광한다. 일례로, 현미경은 현미경 대물렌즈 615가 샘플 600 하단인 경우 형광 현미경으로 반전될 수 있다. 현미경은 형광 구슬이 이미지화 되고 그 움직임을 분석할 수 있도록 임의의 적합한 배율을 지닐 수 있다. 한 실시 예로, 20x 대물 렌즈를 사용할 수 있다. 구슬의 움직임은 카메라에 의해 녹화될 수 있다. 카메라는 냉각 CCD 카메라일 수 있다. 이미지는 초당 약 5프레임의 속도를 포함하여 임의의 적절한 속도로 얻을 수 있다. 일례로, 이미지는 형광 구슬의 발광 파장에서 얻어진다.
응고 시간은 형광 구슬의 움직임이 멈춘 경우 판단하기 위한 녹화된 이미지를 분석하여 측정할 수 있다. 일례로, 100에서 200개의 이미지를 얻을 수 있다. 이미지는 본서가 기술하는 응고 변수를 측정하는 것에 연관이 되는 응고 시간을 결정하기 위해 본서가 기술하는 바와 같이 분석할 수 있다.
한 실시 예로, 전혈의 응고는 현미경하에서 적혈 세포의 움직임을 관찰하여 측정할 수 있다. 전혈은 희석될 수 있다. 일례로, 적혈 세포는 형광적으로 표지될 수 있다. 적혈 세포는 일반적인 현미경 또는 형광적으로 표지된 경우 형광 현미경에 의해 관찰될 수 있다. 적혈 세포를 함유하는 검정에서, 적혈 세포는 상기의 형광 현미경 방법에서 기술한 구슬과 유사한 기능을 수행한다.
강제 액주 방법
일례로, 응고 시간은 샘플이 대량 유동의 이미지화에 의해 측정할 수 있다. 이 방법은, 응고된 샘플이 모세관 내부 등 용기의 내부에 부착하고 다음 응고로 이동하기 위해 중단된다. 샘플은 공압식 방식을 포함하여 임의의 방법으로 움직일 수 있다.
유동은 왕복운동, 원형 등을 포함하여 임의의 방식이 될 수 있다. 유동은 규칙적 또는 불규칙적이며 임의의 적절한 거리를 돌아다닐 수 있다. 일례로, 대규모 유동은 약 1 mm, 약 2 mm, 약 4 mm, 약 6 mm, 약 8 mm, 약 10 mm, 약 20 mm, 또는 약 30 mm 등 몇 밀리미터의 자리수이다. 일례로, 대량 유동은 최소 1 mm, 최소 2 mm, 최소 4 mm, 최소 6 mm, 최소 8 mm, 최소 10 mm, 최소 20 mm, 최소 30 mm이다. 일례로, 대량 유동은 최대 1 mm, 최대 2 mm, 최대 4 mm, 최대 6 mm, 최대 8 mm, 최대 10 mm, 최대 20 mm, 최대 30 mm이다
유동은 임의의 적절한 빈도를 가지거나 임의의 적절한 시간 단위에서 발생한다. 일례로, 대량 유동은 약 0.5 s, 약 1 s, 약 2 s, 약 4 s, 약 6 s, 약 8 s, 약 10 s 등 몇 자리의 초이다. 일례로, 대량 유동은 최대 0.5 s, 최대 1 s, 최대 2 s, 최대 4 s, 최대 6 s, 최대 8 s, 최대 10 s의 시간 범위이다.
샘플은 혈액 또는 혈장일 수 있다. 강제 액주 방법에서, 현미경 촬영이 필요하지 않다. 일반적으로 관련 이미지는 모세 용기와 연관된 대량 유체 샘플의 위치이다. 일반적으로 용기는 투명하므로, 혈액의 경우 샘플은 적색에 의해 쉽게 구별할 수 있다. 일반적으로 혈장은 투명하므로, 대량 혈장 샘플의 관측이 일례에서 더 어려울 수 있다. 일례로, 혈장 샘플은 모세관 튜브에 있는 샘플의 말단에서 액체-공기 매니스커스로부터 빛의 굴절로 인해 이미지화될 수 있다. 매니스커스가 특정 실시 예에서 형상화에 의해 찾기 어려운 경우, 염료 또는 기타 적합한 물질이 매니스커스의 시각화를 향상하기 위해 샘플에 첨가될 수 있다. 다른 예로, 초기에 볼 수 없는 경우라고 메니스커스는 일단 응고가 발생하면 광 산란에 의해 볼 수 있다.
샘플은 희석되거나 희석되지 않을 수 있다. 잠재적으로 희석된 혈장을 이용하는 예를 포함하여, 일부 예시에서 적절히 강력한 혈병을 형성할 수 없다. 그러나, 혈병은 외인성 피브리노겐 또는 대량의 중성 부력 구슬을 첨가하여 적합한 강도로 보강할 수 있다. 이론에 제한되지 않고도, 구슬은 시약 및 샘플 혼합물의 점성을 증대 효과를 강화 또는 증가시키고 형성된 혈병이 모세관에 부착되고 유동을 정지하도록 하는 초기 혈병에 대해 결합할 수 있는 표면적을 증가시킨다. 용적 분획은 혈병이 모세관에 부착하도록 임의의 적합한 분획이 될 수 있다. 일례로 검정 용적의 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%가 구슬이 되도록 검정물을 제조한다. 일례로 검정 용적의 최소 20%, 최소 30%, 최소 40%, 최소 50%, 최소 60%, 최소 70%, 최소 80%, 최소 90%가 구슬이 되도록 검정물을 제조한다. 구슬은 예를 들어 직경 10 ㎛ 등 강제 액주법에서 더 큰 크기를 갖는다. 구슬의 첨가는 효과적인 샘플 용량을 증가시키고 샘플의 희석에 의하지 않고 소량 샘플의 시각화를 도울 수 있는 다른 이로운 효과를 가질 수 있다.
이미지 처리 및 분석
이미지는 본서가 기술하는 소량 응고 측정법에 의해 얻어질 수 있다. 일반적으로, 통상 응고 시간보다 긴 일정 시간 동안 이미지를 획득한다. 캡처된 마지막 이미지는 일반적으로 응고된 샘플의 이미지이다.
화소의 예시적 개수를 포함하는 이미지의 화소화는 상기에 기술되어 있다. 일례로, 각 이미지는 512 x 512 배열(총 262,1422 화소)을 포함한다. 각 이미지는 512 x 32(행 x 열, 또는 열 x 행) 크기의 16겹으로 분할할 수 있다. 다음, 각 겹은 퓨리에-변환 이미지로 변환할 수 있고 퓨리어-변환 겹으로 변형된 512 x 512 이미지를 형성하기 위해 재 구성될 수 있다. 일례로, 참고 이미지는 획득한 최종 이미지를 가지고 동일 방식으로 변환하여 생성된다.
일례로, 입자 구슬 침강법 및 형광 현미경법(상기에 기술한)의 분석 등 분석은 변환된 참고 이미지의 열에 대응하는 각 변환된 이미지의 열의 상관 계수를 결산하는 수행을 포함한다. 상관 계수는 식 4에 의해 계산할 수 있다.
Figure 112015016716898-pct00004
(식 4)
여기에서 xi 및 xi ref 는 각각 이미지 열의 ith 요소 및 참조 이미지이다. 상관 인자의 값은 0에서 1까지 변한다. 최종 이미지의 상관 인자(자체와 상관된)는 1.0이다.
상관 인자는 각 컬럼에 대해 얻을 수 있으며, 두 이미지의 전체 상관은 전체 컬럼에 대해 계산된 상관 인자의 중간값이다. 그러므로, 모든 이미지에 대해 참조 이미지로 상관을 정량화하는 단일값을 계산할 수 있다.
일례로, 상관 인자가 도면 8에 나타난 바와 같이 시간의 함수로 도시되어 있다. 혈장 샘플에 있는 PT의 측정을 위한 이 예에서, 상관 인자는 수직축이며 상단으로 0.0에서 1.0까지 범위이다. 시간은 수평축이며 우측으로 0에서 100초까지 범위를 갖는다. 응고 시간 이하의 시간에서 이미지는 대류 및 브라운 확산력에 의한 입자의 잠재적인 유동으로 인해 최종 이미지와 약한 상관을 갖는다. 응고가 개시될 때, 젤 및 입자로 유체의 전이가 제자리에 고정된다. 도면 8에 나타난 바와 같이, 이 위상 전이는 응고 이후에 입자 위치가 크게 변하지 않으며 따라서 최종 이미지와 강하게 연관되어 있음으로 계산된 상관 인자의 급격한 상승을 보여준다. 이 예에서 응고 시간은 약 40초로 보여진다. 자동 설정 S자형 곡선은 응고 시간을 나타내는 변곡점을 추정하기 위해 데이터에 맞춰질 수 있다.
일례로, 희석 샘플에 대해 측정된 응고 시간은 희석 샘플을 사용하지 않은 다른 방법으로 획득한 시간보다 길다. 희석 샘플의 결과는 다른 방법의 결과와 연관하며 비-희석 샘플에 대한 방법으로 얻어진 결과와 동일한 희석 샘플로부터 얻어진 소정의 결과를 위해 설계되어진 수학적 보정을 가하여 비-희석 샘플의 결과를 부합하도록 할 수 있다.
비디오 촬영의 고려사항
일례로 비디오 영상화가 응고 시간을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 입자의 침강 또는 산란광의 변화를 측정하는 경우에, 모든 배경을 실질적으로 배제하면서 반응의 중요 분획을 이미지화 할 필요가 있다. 이 목적은 특성 인식 소프트웨어로 달성할 수 있다.
도면 9를 참조하면, 검정 큐벳 900의 이미지를 얻는다. 큐벳의 벽은 굴절률 차이 905로 식별할 수 있으며 이미지 910에서 제외한다. 반응 체적의 매니스커스 역시 915로 식별되면 이미지 920에서 제외한다. 최종 절단 이미지 920을 이미지 분석을 위해 사용할 수 있다. 실시 예로, 절단 이미지는 이미지의 관심 영역(ROI)이다. 실시 예로, 또한 절단 이미지에 대한 본서가 제시하는 과정은 정지 이미지를 가지고 사용할 수 있다.
응고 인자의 측정
또한, 본서는 농도 및/또는 응고 인자의 활성을 측정하기 위한 방법, 장치 및 시스템을 제시한다. 농도 및/또는 응고 인자의 활성을 측정하기 위한 방법을 다수의 검정을 혈액 한 방울로 수행하는 경우 선택적으로 다중화 방식 또는 다중화 분석을 할 수 있는 장치 또는 시스템을 수행할 수 있다. 일면에서, 하나 이상의 응고 시간 검정을 대상에서 채취한 혈액 샘플로 수행하며, 농도 및/또는 응고 인자의 기능에 맞추어진 하나 이상의 검정 역시 수행할 수 있다. 일면으로, 대상에서 채취한 혈액 샘플의 응고 시간이 특정 범위 이외인 경우, 또한 대상에서 채취한 혈액 샘플을 농도 및/또는 응고 인자의 기능에 대해 분석할 수 있다. 이 과정은 혈액 샘플이 특정 응고 시간을 가질 경우 응고 인자에 대해 검정을 수행하기 위해 프로그램되어진 시스템 또는 장치로 수행할 수 있다. 또한, 시스템 또는 장치를 클라우드-컴퓨팅 인프라 등 원격으로 프로그램할 수 있다.
특정 응고 변수를 응고 시간 이외의 방법을 측정할 수 있다. 예를 들어, 본서는 임의의 응고 인자 및/또는 조정자의 농도 및/또는 기능을 측정하기 위해 방법, 장치 및 시스템을 제시한다. 응고 예시적인 인자 및/또는 조정자는 폰 빌레브란트 인자, 인자 I (피브리노겐), 인자 Ia (피브린), 인자 II (프로트롬빈), 인자 IIa (트롬빈), 인자 V, 인자 Va, 인자 VII, 인자 VIIa, 인자 VIII, 인자 VIIIa, 인자 IX, 인자 IXa, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 XIa, 인자 XII, 인자 XIIa, 인자 XIII, 인자 XIIIa, 콜라겐, 혈소판, 혈소판-활성 인자, 혈소판 인자 4, 트롬복산 A2, 단백질 키나아제 C, 포스포리파아제 A2, 조직 인자, 고분라량 키니노겐, 프리칼리크레인, 칼리크레인, 단백질 C, 트롬보모듈린, 칼슘, 비타민 K, 단백질 S, 항트롬빈, 외인계 응고억제제(TFPI), 플라스민, 조직 플라스미노겐 활성화 인자 (t-PA), 프로시스타클린 등을 포함한다. 응고 인자 명칭에서 소문자 "a"는 활성 형태를 나타낸다. 예를 들어 인자 XIIa는 인자 XII의 활성화 형태이다. 일례로, 본서가 기술하는 방법은 응고 인자의 활성화 및 비활성화 형태를 구분한다.
일례로, 응고 인자의 농도 및/또는 활성되는 효소-결합 면역흡착 검사(ELISA)에 의해 측정될 수 있다. 이 수행은 특정 항원(예: 응고 인자)에 특이성을 가진 최소 한 개의 항체를 포함한다미지의 분량의 항원을 가진 샘플이 비-특이적(표면에 흡착하여) 또는 특이적으로 (“샌드위치” ELISA에서 동일 항원에 특이적인 다른 항체로 포획을 통해) 고체 지지체에서 고정화된다. 항원이 고정화된 후, 검출 항체를 첨가하여 항원과 복합물을 형성한다. 항체의 검출은 효소에 공유 결합될 수 있으며, 또는 바이오변형을 통해 효소와 결합하는 2차 항체에 의해 자체적으로 검출될 수 있다. 각 단계 사이에 일반적으로 정착된 물질은 비 특이적으로 결합한 임의의 단백질 또는 항체를 제거하기 위해 중성 세제로 세척한다. 최종 세척 단계 후, 플레이트 샘플에 있는 항원의 양을 나타내는 가시적인 신호를 형성하기 위해 효소 기질을 첨가하여 현상한다. 소량으로 하는 ELISA 반응의 수행을 위한 방법이 예를 들어, 모든 목적에 대해 그 전문에 본서에 참고문헌으로 결합되는 미국 8,088,593호에 기술되어 있다. 상기 특허에 기술된 바와 같이, ELISA 등 비색법은 소량으로 수행하는 경우 다색 이미지 및 다중 광 경로에서 이점이 있다.
다색 이미지 및 다중 광 경로
본서가 기술하는 한면으로 이미지-기반 분석을 사용하는 응고 분석을 제시한다. 이 시스템은 하나 이상의 검출 스펙트럼 영역을 사용하는 광학 신호를 측정할 수 있는 카메라를 포함한다. 예를 들어, 카메라는 적색, 녹색 및 청색 검출 스펙트럼 영역을 사용하는 광학 신호를 측정할 수 있다. 측정된 신호는 본서가 기술하는 하나 이상의 알고리즘을 사용하여 해석될 수 있는 세 가지 측정된 값을 포함한다. 하나 이상의 검출 스펙트럼 영역의 사용은 검정의 동적 범위를 증가시키며 단일 검출 스펙트럼 영역을 사용하는 측정과 비교하여 측정의 정확도를 증가시킬 수 있다.
또한 본서는 각각 별개의 경로 길이들을 가진 반응 챔버에 담겨진 샘플 및 검정 반응물에 대해 광학적 측정을 수행하는 시스템, 장치 및 방법을 제시한다. 반응 챔버는 높거나 낮은 흡광을 관찰할 수 있도록 별개의 경로 길이들을 가질 수 있다. 별개의 경로 길이들은 선택된 검정 프로토콜의 동적 영역을 증가시킬 수 있다. 반응 챔버의 이미지는 샘플 또는 검정 반응물에서 정보를 얻기 위해 본서가 기술하는 바에 따라 분석할 수 있다. 단일 반응 챔버에서 가능한 경로 길이들을 조합하여 사용하며 세 가지 채널 검출 스펙트럼 영역의 사용은 소정의 검정에서 동적 범위를 강화한다.
컴퓨터 구현
본서가 기술하는 방법, 장치 및 시스템은 프로그램 가능한 컴퓨터의 도움으로 구현할 수 있다. 예를 들어, 이미지 화소화, 산란광 데이터의 분석, 이미지 처리 및 분석, 비디오 이미지 처리 방법 등은 컴퓨터에 프로그램 될 수 있으며 또는 프로그램 된 컴퓨터로 수행할 수 있다. 컴퓨터 지원은 신속하며 자동화된 방법, 장치 또는 시스템을 달성하는 데 선호된다.
예를 들어, 샘플에 존재하는 것으로 의심되는 검체를 특성화하기 위해 컴퓨터-지원 방법을 사용할 수 있다. 컴퓨터-지원법은 디지털 이미지가 최소 2차원의 화소 배열을 함유하는 경우 그리고 각 화소가 복수의 강도값을 함유하며 각각은 별개의 검출 스펙트럼 영역에 해당하는 경우에 샘플의 디지털 이미지의 획득, 프로그램 가능한 장치의 도움으로 각 검출 스펙트럼 영역의 동적 범위를 정의하는 소정의 값들의 집합으로 획득된 강도값들과 연관성, 소정의 값의 집합으로 획득된 강도값들의 연관을 기준하여 샘플에 있는 검체의 존재 및/또는 양을 예측하는 수행을 포함한다.
추가 검정
본서가 기술하는 방법, 장치 및 시스템을 샘플의 점성 또는 고체/액체 상태의 변화를 유발하는 모든 검정을 분석하기 위해 사용할 수 있다. 예를 들어, 본서가 기술하는 바와 같이 샘플의 점성 또는 고체/액체 상태의 변화를 유발하는 모든 검정에 구슬을 첨가할 수 있으며, 구슬 유동의 이미지 분석이 샘플의 점성 또는 고체/액체 상태의 변화 시간을 결정하는 데 사용될 수 있다. 다른 예로, 본서가 기술하는 바와 같이 샘플의 탁도 변화가 광 산란에 의해 모니터링될 수 있다. 샘플의 점성 또는 고체/액체 상태의 변화 및/또는 광 산란에서 변화를 유발하는 임의의 검정이 본서가 제시하는 방법으로 모니터링될 수 있다. 다른 예로, 본서가 기술하는 바와 같이 샘플의 점성 또는 고체/액체 상태의 변화를 컬럼에 통한 샘플의 유동을 이미지화하여 모니터링할 수 있다. 본서가 제시하는 방법에 의해 분석하는 검정은 검정이 샘플의 점성 또는 고체/액체 상태의 변화를 유발하는 한 혈액 응고 인자를 함유하지 않는 검정을 포함한다. 예를 들어, 일례로 응고 검정은 본서가 제시하는 방법으로 분석할 수 있다. 본서가 제시하는 방법에 의해 분석되는 다른 검정의 예시는 (1) 혈소판 응집 분석, (2) 비탁 면역검정, (3) 입자-강화 비탁 면역 검정, (4) 혼탁도 면역검정, (4) 라텍스 응고 면역 검정 및 (5) 리물루스 아메보사이트 라이세이트(LAL) 시험(예를 들어, 박테리아 내독소 및 박테리아 질환을 검출하기 위해)을 포함한다.
예시
예시 1 - 광 산란에 의한 PT 측정
광 산란에 의한 PT 응집 변수를 측정하는 수행은 다음의 재료를 이용한다.
·혈장 샘플: QuikCoagTM 대조군 레벨 1(일반 응고 혈장 대조), QuikCoagTM 대조군 레벨 2(저 비정상 응집 혈장 대조), 및 QuikCoagTM 대조군 레벨 3(고 비정상 응집 혈장 대조)(각각은 BioMedica Diagnostics Inc., Nova Scotia, Canada 제품)
·헤페스 완충 식염수(HBS) pH 7.4에 담긴 소 피브리노겐(Sigma-Aldrich) 10mg/ml
·재구성된 PT 시약(칼슘이 첨가된 QuikCoagTM PT, BioMedica Diagnostics Inc., Nova Scotia, Canada 제품)
·1 x 헤페스 완충 식염수(HBS)
·0.02 M CaCl2
이 재료들을 광 산란을 이용하여 PT 응집 변수를 측정하기 위해 다음 단계에 사용하였다. 모든 단계는 상온에서 자동화 액체 핸들러를 사용하여 수행하였다.
1) PBS에 피브리노겐 2.5 mg/ml를 용해시켰다(용액 A)
2) 각 혈장 샘플 0.2부피를 용액 A 0.8부피와 혼합하였다(즉, 각 혈장 샘플을 5배 희석)
3) t=0 에서, 희석 혈장 1 부피를 PT 1부피와 혼합하고 팁으로 혼합물 2 ㎕를 흡입하였다.
4) 1 ㎕의 미네랄 오일을 흡입하여, 관찰 영역을 덮을 정도로 팁에 오일에 깊이 담갔다
5) 카메라/광검출기로 이동시키고 비디오 녹화를 시작하였다
6) 응고가 발생한 후 녹화를 중지하였다(통상 < 10분)
7) 3 ~ 6 단계를 네 번 반복하였다
예시적 결과가 도면 10에 보여진다. 여기에서 응고 시간은 수직축에 도시되었고 0에서 120초의 범위를 가진다. 수평축의 레벨 1,2,3은 QuikCoagTM 대조군 레벨 1,2,3 샘플을 각각 지칭한다. 각 레벨에서 다섯 개의 다른 점은 각 레벌 1,2,3 혈장 샘플에 대해 복제 검정을 수행한 별도의 결과를 보여준다. 그래프에 제시된 평균값은 각 레벨 1,2,3 혈장 샘플로 수행한 다섯 개의 검정에 대해 초 단위 응고 시간의 평균을 나타낸다. PT 응고 변수를 광 산란에 의해 측정하였다. 간략하게, 응고 변수를 측정하기 위해 비디오 녹화에서 자동 처리를 수행하였고, 이에 따라 반응 혼합물만 함유하는 관심 영역(ROI)를 정하였다. 각 팁의 관심 영역은 팁의 벽 사이 그리고 팁에 있는 반응 혼합물의 메니스커스 사이의 영역으로 정의 되었다. 상부 메니스커스는 공기/반응 혼합물 접속부이고, 하부 메니스커스는 반응 혼합물/오일 접속부이다. 관심 영역을 정한 후, 비디오 녹화의 각 프레임에 대해 ROI의 평균 광 강도를 측정하기 위한 분석 알고리즘을 결정하였다. 응고 시간은 ROI의 평균 광 강도가 기준 레벨을 상회하기 시작한 경우의 시간으로 응집 시간을 정하였다.
예시 2 - 광 산란에 의한 aPTT 측정
광 산란에 의한 aPTT 응집 변수를 측정하는 수행은 다음 재료를 이용하여 이루어졌다.
·QuikCoagTM 대조군 레벨 1(정상 응집 혈장 대조) 및 QuikCoagTM 대조군 레벨 3(고 비정상 응집 혈장 대조)(각각BioMedica Diagnostics Inc., Nova Scotia, Canada 제품)
·헤페스 완충 식염수(HBS) pH 7.4에 담긴 소 피브리노겐(Sigma-Aldrich) 10mg/ml
·재구성된 aPTT 시약(QuikCoagTM APTT, BioMedica Diagnostics Inc., Nova Scotia, Canada 제품)
·1x 헤페스 완충 식염수 (HBS)
·0.02 M CaCl2
이 재료들은 광 산란에 의해 aPTT 응집 변수를 측정하는 다음 단계에 사용하였다. 모든 단계는 실온에서 자동화 액체 핸들러를 이용하여 수행하였다.
1) PBS에 피브리노겐 5 mg/ml 를 용해시켰다(용액 A)
2) 각 혈장 샘플 0.2 부피를 용액 A 0.8 부피와 혼합시켰다(즉, 혈장 샘플을 5배 희석)
3) 희석 혈장 1 부피를 aPTT 시약 1 부피를 혼합하여 3분 동안 배양하였다.
4) t=0에서 혼합물 1 ㎕을 0.2M CaCl2 1 ㎕와 혼합하고 팁으로 흡입하였다.
5) 미네랄 오일 1 ㎕를 흡입하였고, 관찰 영역을 덮을 정도로 오일 깊이 팁을 담갔다
6) 카메라/광 검출기로 이동시켰고 비디오 녹화를 개시하였다.
7) 응고가 발생한 후 녹화를 중지하였다(통상 < 10분)
8) 3 ~ 7 단계를 두 번(레벨 3 샘플) 또는 네 번(레벨 1 샘플) 더 반복하였다.
예시적 결과가 도면 11에 보여진다. 여기에서, 응고 시간은 수직축에 도시되고 0에서 6:29까지 범위를 가진다. 수평축에 있는 레벨 1 및 3은 QuikCoagTM 대조군 레벨 1 및 3을 각각 지칭한다. aPTT 응집 변수를 예시 1에 기술한 바와 같이 광 산란으로 측정하였다.
예시 3 -구슬 정착에 의한 PT 측정
구슬 정착에 의한 PT 응집 변수의 측정이 다음 재료를 이용하여 수행되었다.
·혈장 샘플: QuikCoagTM 대조군 레벨 1 (일반 응집 혈장 대조), QuikCoagTM 대조군 레벨 2 (저 비정상 응집 혈장 대조), 및 QuikCoagTM 대조군 레벨 3 (고 비정상 응집 혈장 대조)(각각BioMedica Diagnostics Inc., Nova Scotia, Canada 제품)
·재구성된 PT reagent (칼슘을 첨가한 QuikCoagTM PT, BioMedica Diagnostics Inc., Nova Scotia, Canada 제품)
·구슬 슬러리 (예: 직경 25um 및 45um 구슬의 1:1 혼합물(예: Polybead Microspheres, Polysciences, PA 제품)로 HBS에서 세척하고, 원심분리한 후 초과 용액을 제거)
·1x HBS (헤페스 완충 식염수 pH7.4)
·0.02 M CaCl2
이 재료들을 구슬 정착에 의한 PT 응고 변수를 측정하기 위해 다음의 단계에 사용하였다. 모든 단계는 상온에서 자동화 용액 핸들러를 이용하여 수행되었다.
1) 각 혈장 샘플을 HBS로 5배 희석하였다.
2) 구슬들을 PT 시약과 1:4로 혼합하였다(예: 10 ㎕ 구슬 + 40 ㎕ PT 시약)
3) t=0에서, 희석된 혈장 1 ㎕를 구슬/PT 시약 혼합물 1.25 ㎕과 혼합하고 팁으로 흡입하였다
4) 미네랄 오일 1 ㎕를 흡입하여, 관찰 영역을 덮을 정도로 오일에 팁을 깊이 담갔다.
5) 카메라로 이동하고 비디오 녹화를 시작하였다.
6) 응고가 발생한 후 녹화를 중지하였다(통상 < 10분)
7) 3 ~ 6 단계를 한 번(레벨 1 샘플), 세 번(레벨 2 샘플) 또는 두 번(레벨 3 샘플) 더 반복하였다.
도면 12에 예시적인 결과가 보여진다. 여기에서 응고 시간은 수직축에 도시되고 0에서 120초의 범위를 가진다. 수평축에 있는 레벨 1,2,3은 QuikCoagTM 대조군 레벨 1,2,3 샘플을 각각 지칭한다. 각 레벨에 대한 다른 점은 각 레벨 1,2,3 혈장 샘플에 대한 복제 검정의 별도 결과를 보여준다. 그래프에 제시된 평균값은 각 레벨 1,2,3 혈장 샘플로 수행한 검정에 대해 초 단위 평균 응고 시간을 나타낸다. PT 응집 변수는 본서의 다른 부분에 기술한 구슬 정착 검정에 의해 측정되었다.
예시 4 - 구슬 정착에 의한 aPTT 측정
구슬 정착에 의한 aPTT 응고 변수의 측정이 다음 재료를 이용하여 수행되었다.
·혈장 샘플: QuikCoagTM 대조군 레벨 1 (일반 응고 혈장 대조) 및 QuikCoagTM 대조군 레벨 2 (저 비정상 응고 혈장 대조)(각각 BioMedica Diagnostics Inc., Nova Scotia, Canada 제품)
·재구성된 aPTT 시약(QuikCoagTM APTT, BioMedica Diagnostics Inc., Nova Scotia, Canada 제품)
·비드 슬러리(예: 직경 25um 및 45um 구슬의 1:1 혼합물(예: Polybead Microspheres, Polysciences, PA 제품), HBS로 세척하고 원심분리한 후 초과 용액을 제거)
·1 x HBS (헤페스 완충 식염수 pH7.4)
·0.02 M CaCl2
이 재료들을 구슬 정착에 의한 aPTT 응고 변수를 측정하기 위해 다음 단계에 사용하였다. 모든 단계는 상온에서 자동화 용액 핸들러를 사용하여 수행되었다.
1) 각 혈장 샘플들을 HBS로 5배 희석하였다.
2) 구슬들을 0.2M CaCl2 과 1:1로 혼합하였다(예: 10 ㎕ 구슬 + 10 ㎕ 0.2M CaCl2
3) 희석된 혈장 1 ㎕ 을 aPTT 시약 1 ㎕와 혼합하고 3분 동안 배양하였다.
4) t=0에서, 혼합물 1 ㎕ 를 구슬/CaCl2 혼합물 1 ㎕ 와 혼합하고, 팁으로 흡입하였다.
5) 미네랄 오일 1 ㎕을 흡입하고, 관찰 영역을 덮을 정도로 오일에 팁을 깊이 담갔다.
6) 카메라로 이동하고 비디오 녹화를 개시하였다.
7) 응고가 발생한 후 녹화를 중지하였다(통상 < 10분)
8) 3 ~ 7 단계를 세 번 더 반복하였다.
도면 13은 예시적인 결과를 보여준다. 여기에서 응고 시간은 수직축에 도시되고 0에서 최대 300초까지 범위를 가진다. 수평축에 있는 레벨 1 및 2는 QuikCoagTM 대조군 레벨 1 및 2 샘플을 각각 지칭한다. 각 레벨의 다른 점들은 각 레벌 1 및 2 혈장 샘플로 복제 검정을 실시한 별도의 결과를 보여준다. aPTT 응고 변수는 본서의 다른 곳에서 기술한 구슬 침강 검정에 의해 측정되었다.
예시 5 - 형광 현미경에 의한 aPTT 측정
형광 현미경에 의한 aPTT 응고 변수의 측정을 다음 재료를 이용하여 수행하였다.
·혈장 샘플: QuikCoagTM 대조군 레벨 1 (정상 응고 혈장 대조); QuikCoagTM 대조군 레벨 2(저 비정상 응고 혈장 대조), 및 QuikCoagTM 대조군 레벨 3(고 비정상 응고 혈장 대조)(각각BioMedica Diagnostics Inc., Nova Scotia, Canada 제품)
·재구성된 aPTT 시약(예:. QuikCoagTM APTT, BioMedica Diagnostics Inc., Nova Scotia, Canada 제품)
· 1 x HBS(헤페스 완충 식염수 pH7.4)
·0.02 M CaCl2 + 부피로 0.3% 형광 구슬(예: FluoSpheres 카르복실화-변형 미세구, 1.0 ㎛, 진홍색 형광(625/645) (Life Technologies #F-8816 제품))
이 재료들을 형광 현미경을 이용한 aPTT 응고 변수를 측정하기 위해 다음 단계에 사용한다. 모든 단계는 자동화 액체 핸들러를 사용하여 상온에서 실행되었다.
·혈장을 5배 희석한다(HBS로)
·슬라이드에 1 ㎕ CaCl2을 형광 구슬과 함께 첨가한다
·~20% 관찰하기 위해 슬라이드 표면에 있는 방울에 대물 렌즈의 초점을 맞춘다
·희석된 혈장 1ul 을 aPTT 시약 1ul 과 혼합하고 3분 동안 배양한다.
·t=0에서, 이 혼합물 ㎕을 슬라이드에 있는 CaCl2/구슬 혼합물에 첨가하고, 잘 혼합한 후 이미지 녹화를 시작한다
·응고가 발생한 후 녹화를 중지한다(통상 < 10분)
예시 6 -형광 현미경을 이용한 PT 측정
형광 현미경을 이용한 PT 응고 변수의 측정이 다음 재료들을 이용하여 수행되었다.
·혈장 샘플: QuikCoagTM 대조군 레벨 1(정상 응고 혈장 대조), QuikCoagTM 대조군 레벨 2(저 비정상 응고 혈장 대조), 및 QuikCoagTM 대조군 레벨 3(고 비정상 응고 혈장 대조)(각각 BioMedica Diagnostics Inc., Nova Scotia, Canada 제품)
·재구성된 PT 시약(칼슘이 첨가된 QuikCoagTM PT, BioMedica Diagnostics Inc., Nova Scotia, Canada 제품) + 부피로 0.2% 형광 구슬(예: FluoSpheres 카르복실화-변형 미세구, 1.0 ㎛, 진홍색 형광(625/645) (Life Technologies #F-8816 제품))
·1x HBS (헤페스 완충 식염수 pH7.4)
·0.02 M CaCl2 + 부피로 0.3% 형광 구슬(예: FluoSpheres 카르복실화-변형 미세구, 1.0 ㎛, 진홍색 형광(625/645) (Life Technologies #F-8816 제품))
이 재료들을 형광 현미경에 의한 PT 응고 변수를 측정하기 위해 다음 단계에 사용하였다. 모든 단계는 상온에서 자동화 용액 핸들러를 사용하여 수행되었다.
1) 각 혈장 샘플을 HBS로 5배에서 10배 희석하였다.
2) PT 시약 1.5 ㎕ 을 형광 구슬과 함께 슬라이드에 첨가하였다.
3) 방울을 ~20%까지 관찰하기 위해 슬라이드 표면 위에 있는 용액 컬럼에 대물렌즈의 초점을 맞췄다.
4) t=0에서, 희석된 혈장 1.5 ㎕ 을 슬라이드에 있는 구슬/PT 시약 혼합물에 혼합하고 비디오 이미지 녹화를 시작하였다
5) 응고가 발생한 후 녹화를 중지하였다(통상 < 10분)
6) 4~5 단계를 두 번(레벨 1 샘플), 세 번(레벨 2 샘플) 또는 네 번(레벨 3 샘플) 더 반복하였다
도면 14는 예시적인 현미경 결과를 보여준다. 여기에서, 샘플 이미지는 샘플을 혈장으로 정착하고(10x 희석) 샘플 용기에 PT 활성 인자를 투여한 후 채취되었다. 이미지는 5초 1400, 25초 1405, 50초 1410 및 100초 1415에서 얻어졌다. 50초 및 100초에 대한 이미지는 거의 식별하기 어려우며, 이는 50초에서 100초 사이에 입자의 움직임이 제한됨을 의미한다. 이는 입자의 움직임이 50초 또는 이전에 멈췄음을 말해 준다. 이미지 분석은 상기에 기술된 방식으로 응집 시간을 측정하기 위해 사용되었다.
도면 15는 1:5로 희석한 혈장 샘플을 형광 현미경에 의해 PT를 측정한 예시적인 결과를 보여준다. 여기에서, 응고 시간은 10에서 1000초의 범위에서 로그 눈금으로 수직축에 도시되어 있다. 수평축에 있는 레벨 1,2,3은 QuikCoagTM 대조군 레벨 1,2,3을 각각 지칭한다. 각 레벨의 다른 점들은 각 레벨 1,2,3 혈장 샘플에 대한 개별 검정의 별도의 결과를 표시한다. 그래프에 제시된 평균값은 각 레벨 1,2,3 혈장 샘플로 수행한 검정에 대해 초 단위로 평균 응고 시간을 나타낸다.
예시 7 -광 산란에 의한 aPTT 측정
광 산란에 의한 aPTT 응고 변수의 측정은 다음 재료를 이용하여 수행되었다.
·헤파린을 함유하는 인간 혈장
·헤페스 완충 식염수(HBS) pH 7.4에 담겨진 소 피브리노겐(Sigma-Aldrich 제품) 10 mg/ml
·재구성된 aPTT 시약(QuikCoagTM APTT, BioMedica Diagnostics Inc., Nova Scotia, Canada 제품)
·) 1x 헤페스 완충 식염수(HBS)
·0.02 M CaCl2
·돼지 헤파린(돼지 장점막에서 채취한 헤파린 리듐염, Sigma h0878 제품)
이 재료들을 광 산란에 의한 aPTT 응고 변수를 측정하기 위해 다음 단계에 사용하였다. 모든 단계는 상온에서 자동화 용액 핸들러를 이용하여 수행되었다.
1) PBS에 피브리노겐 5 mg/ml을 용해하였다(용액 A)
2) 상이한 헤파린 농도를 가진 인간 혈장의 다양한 샘플을 제조하였다. 이 샘플들을 제조하기 위해, 0~1 U/ml의 범위의 농도에서 헤파린을 함유하는 샘플을 수득하기 위해 상이한 인간 혈장 부분 표본에 헤파린을 첨가하였다.
3) 각 혈장 샘플 0.2부피를 용액 A 0.8부피에 혼합하였다(즉, 각 혈장 샘플은 5배 희석되었다)
4) 각 희석 혈장 5㎕를 aPTT 5㎕로 혼합하고 3분동안 배양하였다.
5) t=0에서, 희석된 혈장/aPTT 시약의 각 혼합물 1 ㎕ 를 0.2M CaCl2,1 ㎕와 혼합하였다.
6) 각 팁으로 미네랄 오일 1 ㎕를 흡입하고, 관찰 영역을 덮을 정도로 오일에 팁을 깊이 담갔다.
7) 카메라/광 검출기로 이동하여 비디오 녹화를 시작하였다
8) 응고가 발생한 후 녹화를 중지하였다(통상 < 10분)
도면 16는 예시적인 결과를 보여준다. 여기에서, 응고 시간은 초단위로 수직축에 표시된다. 상이한 혈장 샘플에 잇는 헤파린의 농도가 U/ml로 수평축에 표시된다. 응고 변수(현탁의 개시)가 예시 1에 기술된 바와 같이 일정 시간동안 탁도 측정에 의해 결정되었다.
도면 16에 있는 검정의 정량-반응은 헤파린 농도의 추정치를 제시하기 위해 측정되었다. 도면 17에 도시된 결과는 임상적 관심 범위에 대해 헤파린 농도를 검정한 우수한 결과를 얻을 수 있음을 보여준다.
상기에 기술된 검정의 수행 이외에, 혈장 샘플의 aPTT 검정을 제조자의 프로토콜에 따라 헬레나 캐스케이드 aPTT 시스템(헬레나 연구소, Beaumont, TX )으로도 수행하였다. 도면 16의 데이터가 aPTT 추정을 제시하기 위해 계산되었고, 이 결과를 동일 혈장 샘플에 대해 헬레나 캐스케이드 aPTT 시스템으로 수행한 결과와 비교하여 다음과 같은 상관관계를 얻었다. aPTT(본 방법) = 1.00*헬레나 aPTT, R2= 0.82로 두 방법이 잘 일치함을 나타낸다.
또한, 헬레나 방법에 의해 측정된 응고 변수가 소정의 헤파린 농도와 상관관계에 있었다. 다음 결과가 관찰되었다. Y(헬레나 aPTT) = x(헤파린 농도) *341, R2= 0.73로 상기에 기술한 방법(즉, 예시 7)의 결과와 좋지 않은 상관관계를 갖는다.
예시 8 -광 산란에 의한 PT 측정
광 산란에 의한 PY 응고 변수의 측정은 다음 재료를 이용하여 수행되었다.
·와파린 치료를 받는 대상 또는 와파린 치료를 받지 않은 대상을 포함하여, EDTA를 함유하는 다양한 인간 혈장 샘플
·헤페스 완충 식염수 pH 7.4(HBS)에 담긴 소 피브리겐(Sigma-Aldrich 제품) 10 mg/ml
·1x 헤페스 완충 식염수(HBS)
·재구성된 PT 시약(칼슘이 첨가된 QuikCoagTM PT, BioMedica Diagnostics Inc., Nova Scotia, Canada 제품)(본서에 개시된 검정을 위해)
·0.02 M CaCl2
이 재료들은 광 산란에 의한 PT 응고 변수를 측정하기 위해 다음 단계에 사용하였다. 모든 단계를 상온에서 자동화 용액 핸들러를 이용하여 수행하였다.
1) 피브리노겐 2.5 mg/ml 를 PB에 용해하였다(용액 A)
2) 용액 A 8부피에 상이한 혈장 샘플 0.2부피를 혼합하였다(즉, 각 혈장 샘플을 5배 희석)
3) 희석된 혈장 부분 표본 5 ㎕ 를 제조하였다
4) t=0에서, 각 희석 샘플 5 ㎕를 헬레나 연구소 트롬보플라스틴 시약(검정 방법의 참조를 위해) 또는 칼슘 첨가 QuikCoagTM PT의 PT 시약(본서가 개시한 검정 방법을 위해)와 혼합하고, 팁으로 혼합물 2 ㎕ 를 흡입하였다.
4) 미네랄 오일 1 ㎕를 흡입하여, 관찰 영역을 덮을 정도로 오일에 팁을 깊이 담갔다.
5) 카메라/광 검출기로 이동하고 녹화를 개시하였다
6) 응고가 발생한 후 녹화를 중지하였다(통상 < 10분)
상기에 기술한 바와 같은 검정의 수행 이외에, 제조자의 프로토콜에 따라 헬레나 캐스케이드 PT 시스템으로 혈장 샘플의 PT 검정도 수행하였다. 도면 18은 방법들을 대비한 예시적 결과를 보여준다. 그래프의 각 점들은 상이한 샘플을 나타낸다. 여기에서, PT(칼슘 첨가 QuikCoagTM PT의 PT 시약) = 1.00(PT 헬레나 캐스케이드); R2 = 0.92.
업계의 숙련된 관계자가 이해하는 바와 같이, 본서가 개시한 실시 예에 대해 다양한 대안, 변형 및 동일 실험을 수행할 수 있다. 그러므로, 본 발명의 범위는 상기에 참고로 기술 범위로 결정되지 않으며 대신, 동일 방법의 전 범위와 함께 첨부의 청구를 참고로 결정되어야 한다. 우선하는 바에 상관 없이, 모든 특징은 모든 다른 특징과, 우선하는 바에 상관없이 결합될 수 있다. 문구 "~에 대해 방법(means for)"를 사용은 특정 청구에 명시적으로 인용되어 제한되지 않는 한, 첨부의 청구는 의미와 역할을 제한하는 것으로 해석되지 않는다. 본서에 기술되었고 이어지는 청구에 사용된 "a", "an", 및 "the"의 의미는 문맥에서 명백하게 달리 명기하지 않는 한 복수의 참조를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본서에 기술되었고 이어지는 청구에 사용된 "in"의 의미는 문맥에서 명백하게 달리 명기하지 않는 한 "in" 및 "on"을 포함한다. 마지막으로, 본서에 기술되었고 이어지는 청구에 사용된 "and" 및 "or"의 의미는 문맥에서 달리 명기하지 않는 한 결합과 분리를 모두 포함하며 상호 교환하여 사용할 수 있다. 그러므로, 문맥에서 용어 "and" 또는 "or"가 사용되는 경우, 문맥에서 명백하게 달리 명기하지 않는 한 이러한 접속사의 사용은 "and/or"의 의미를 배제하지 않는다.

Claims (80)

  1. 대상의 혈액 샘플의 복수의 응고 매개변수들을 측정하기 위한 방법으로서,
    (a) 부피가 1 ml 이하인 혈액 샘플을 얻는 단계;
    (b) 상기 혈액 샘플을 포함하고 복수의 자동화 응고 검정을 실시하는데 필요한 모든 시약을 함유하는 카트리지를, 복수의 자동화 응고 검정을 실시하기 위한 장치로 삽입하는 단계로서, 상기 장치는 자동화 유체 이송 장치를 포함하는 자동화 샘플 처리 기구를 포함하며, 상기 자동화 유체 이송 장치는 팁을 이동시키도록 구성되고 장치 내에 샘플의 일정 부피를 이동시키도록 구성되며, 상기 팁은 수집 팁 및 검정 단위 팁을 포함하는 것인 단계;
    (c) 상기 수집 팁에서 샘플의 적어도 일부를 분배시키는 단계; 및
    (d) 혈액 샘플 또는 이의 부분 또는 부분들에서 복수의 응고 매개변수를 측정하기 위해서 상기 샘플로 복수의 자동화 응고 검정을 수행하는 단계를 포함하고, 상기 수행은 동시에 자동화 응고 검정의 다중 수행을 포함하고, 복수의 자동화 응고 검정은,
    i) 응고 시간 검정, 및
    ii) 응고 시간 외의 응고 매개변수에 대한 하나 이상의 자동화 응고 검정
    을 포함하고, 상기 응고 검정은,
    (e) 상기 자동화 유체 이송 장치를 사용하고, 복수의 비드 또는 다른 입자를 상기 검정 단위 팁 내의 상기 혈액 샘플과 배합하여 샘플 혼합물을 제공하고 검정 단위 팁 내의 상기 샘플 혼합물을 광 검출기 근처로 이동시키는 단계;
    (f) 단계 (e)에 후속하여, 개별 이미지를 포함하는 이미지 세트를 얻는 단계로서, 상기 이미지 세트는 상기 응고 시간 검정의 수행 동안 얻어진, 상기 비드 또는 다른 입자 및 샘플, 또는 이의 부분 또는 부분들의 이미지를 포함하는 단계;
    (g) 상이한 시점에서 비드 또는 다른 입자 이동을 측정하는 단계로서, 상기 측정은 상기 이미지 세트로 상기 비드 또는 다른 입자의 침강 속도를 측정하는 것을 포함하는 단계; 및
    (h) 이미지 세트를 분석하여 혈액 샘플 또는 이의 부분 또는 부분들의 응고 시간을 측정하는 단계로서, 상기 분석은 혈액 샘플 내에 비드 또는 다른 입자의 이동에 전이가 일어나는 시점을 탐색하는 것을 포함하는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 응고 시간 이외의 응고 매개변수에 대한 상기 하나 이상의 자동화 응고 검정은, 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT) 검정, 프로트롬빈 시간(PT) 검정, 국제 정상화 비율(INR) 검정, 피브리노겐 양 검정, 출혈 시간 검정, 응고 인자 농도 검정, 항-인지질 항체 검출 검정, 희석 러셀 살무사 독액 시간(dRVVT) 검정, 혈소판 기능 검정, 혈소판 수 검정, 및 유글로불린 용해시간(ELT) 검정으로 이루어진 자동화 응고 검정의 군으로부터 선택된 검정인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 복수의 검정의 개별 검정을 위해 2 ㎕ 미만의 샘플이 사용되는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 복수의 검정의 각각의 반응 부피는 60 ㎕ 이하인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 단계 (a) 내지 (b)의 수행 시간은 1 시간 이하인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 이미지 세트의 개별 이미지가 화소화되고, 적어도 10,000 화소를 포함하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 희석한 후에 혈액 샘플의 응고 시간이 1 분 내지 10분 사이가 되도록 상기 혈액 샘플을 희석하는 단계를 더 포함하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 샘플, 또는 이의 부분 또는 부분들에 피브리노겐을 첨가하는 단계를 더 포함하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 혈액 샘플은 비-정맥 경로로 채취한 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 이미지가 응고 반응의 광 산란 이미지인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 응고 시간이 산란된 빛의 강도 전이에 기초하여 측정된 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 복수의 비드 또는 다른 입자는 적어도 두 가지의 다른 크기의 비드 또는 다른 입자를 포함하는 방법.
  13. 제1항에 있어서, 이미지 세트의 분석을 수행하는 상기 단계는 상기 비드 또는 다른 입자가 실질적으로 움직이지 않는 시점을 탐색하는 것을 포함하는 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 비드 또는 다른 입자가 표지되는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 비드 또는 다른 입자가 형광 라벨로 표지된 것인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 복수의 검정의 개별 검정을 위해 10 ㎕ 미만의 샘플이 사용되는 것인 방법.
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 삭제
  41. 삭제
  42. 삭제
  43. 삭제
  44. 삭제
  45. 삭제
  46. 삭제
  47. 삭제
  48. 삭제
  49. 삭제
  50. 삭제
  51. 삭제
  52. 삭제
  53. 삭제
  54. 삭제
  55. 삭제
  56. 삭제
  57. 삭제
  58. 삭제
  59. 삭제
  60. 삭제
  61. 삭제
  62. 삭제
  63. 삭제
  64. 삭제
  65. 삭제
  66. 삭제
  67. 삭제
  68. 삭제
  69. 삭제
  70. 삭제
  71. 삭제
  72. 삭제
  73. 삭제
  74. 삭제
  75. 삭제
  76. 삭제
  77. 삭제
  78. 삭제
  79. 삭제
  80. 삭제
KR1020157004309A 2012-07-18 2013-07-18 소량 응집 검정 KR102149318B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261673227P 2012-07-18 2012-07-18
US61/673,227 2012-07-18
PCT/US2013/051162 WO2014015191A2 (en) 2012-07-18 2013-07-18 Low-volume coagulation assay

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20150034793A KR20150034793A (ko) 2015-04-03
KR102149318B1 true KR102149318B1 (ko) 2020-10-14

Family

ID=49949383

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020157004309A KR102149318B1 (ko) 2012-07-18 2013-07-18 소량 응집 검정

Country Status (13)

Country Link
US (4) US9500639B2 (ko)
EP (1) EP2875146B1 (ko)
JP (4) JP2015528911A (ko)
KR (1) KR102149318B1 (ko)
CN (2) CN109884289B (ko)
AU (1) AU2013292392A1 (ko)
BR (1) BR112015001048B1 (ko)
CA (2) CA3124500A1 (ko)
HK (1) HK1210812A1 (ko)
IL (1) IL236768B (ko)
MX (1) MX360564B (ko)
SG (2) SG10201603916UA (ko)
WO (1) WO2014015191A2 (ko)

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9500639B2 (en) 2012-07-18 2016-11-22 Theranos, Inc. Low-volume coagulation assay
MX2016002797A (es) 2013-09-06 2016-05-26 Theranos Inc Dispositivos, sistemas, metodos y equipos para recibir un hisopo.
US10823743B1 (en) 2013-10-28 2020-11-03 Ifirst Medical Technologies, Inc. Methods of measuring coagulation of a biological sample
EP2975383A1 (en) * 2014-07-14 2016-01-20 Johann Wolfgang Goethe-Universität, Frankfurt am Main Method and device for analyzing a fluid medium such as a blood sample
FR3024237B1 (fr) * 2014-07-25 2016-08-05 Stago Diagnostica Methode de determination du profil de structure d'un caillot de fibrine, refletant sa stabilite, pour predire le risque de saignement, de thrombose ou de re-thrombose
CN106999930B (zh) 2014-09-26 2020-09-08 雅培医护站股份有限公司 用于测定流体样本中的凝结的具有分段射流的盒设备
WO2016049506A1 (en) 2014-09-26 2016-03-31 Abbott Point Of Care Inc. Sensors for assaying coagulation in fluid samples
EP3954457A3 (en) 2014-09-26 2022-05-18 Abbott Point Of Care Inc Microfabricated device with micro-environment sensors for assaying coagulation in fluid samples
EP3198281B1 (en) 2014-09-26 2023-01-25 Abbott Point Of Care, Inc. Ellagic acid formulations for use in coagulation assays
CN107107056B (zh) 2014-09-26 2020-04-14 雅培医护站股份有限公司 用于流体样本中的凝结测定的单通道盒设备
CN107107057B (zh) 2014-09-26 2020-12-15 雅培医护站股份有限公司 用于流体样本中的凝结测定的盒设备识别
CN106999932A (zh) 2014-09-26 2017-08-01 雅培医护站股份有限公司 用于流体样本中的凝结测定的具有流体结的盒设备
CA2990573C (en) * 2015-06-29 2020-09-22 Ca Casyso Gmbh Blood testing system and method
CA3020346A1 (en) 2016-04-15 2017-10-19 Baxalta Incorporated Method and apparatus for providing a pharmacokinetic drug dosing regimen
WO2018069582A1 (fr) * 2016-10-14 2018-04-19 Commissariat à l'énergie atomique et aux énergies alternatives Procédé de caractérisation d'un échantillon comportant des particules
US10896749B2 (en) 2017-01-27 2021-01-19 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Drug monitoring tool
US10976305B2 (en) * 2017-04-27 2021-04-13 The University Of Chicago Coagulation testing in underfilled patient samples
CN108956542A (zh) * 2017-05-18 2018-12-07 微采视像科技股份有限公司 凝血酶原时间的测定方法及其应用装置
WO2020023726A1 (en) * 2018-07-25 2020-01-30 Ifirst Medical Technologies, Inc. Medical analyzer and diagnostic sample profiler
CN108982865B (zh) * 2018-08-16 2021-05-11 上海原科实业发展有限公司 一种血栓弹力图法肝素定量检测试剂盒及其制备方法
CN112654850A (zh) * 2018-08-24 2021-04-13 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 血样分析仪及血样混匀方法
JP7135620B2 (ja) * 2018-09-07 2022-09-13 ソニーグループ株式会社 血液凝固系解析装置、血液凝固系解析方法及び血液凝固系解析プログラム
CN109211729A (zh) * 2018-10-29 2019-01-15 杨忠思 一种用于精准医疗检测的血液凝滞状态检测装置及方法
MX2022004558A (es) * 2019-10-17 2023-03-02 Nova Biomedical Corp Aparato de ensayo de coagulacion y metodos del mismo.
EP4087939A1 (en) * 2020-01-08 2022-11-16 DSM IP Assets B.V. Combination of clot-based fibrinogen test and enzyme-based fibrinogen test
CN113777332A (zh) * 2020-06-09 2021-12-10 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 免疫分析仪和自身免疫分析方法
CN116113831A (zh) * 2020-06-23 2023-05-12 布里格姆妇女医院 用于生物分子的超灵敏检测的单分子分析
TWI819402B (zh) 2020-12-22 2023-10-21 財團法人工業技術研究院 反應物多相狀態的製程監控系統及其方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002055109A (ja) 2000-08-09 2002-02-20 Hiroyuki Konno レーザ反射光による粒状斑点模様を利用した血液凝固時間測定方法とその装置
JP2002214241A (ja) 2000-11-20 2002-07-31 Minolta Co Ltd マイクロチップ
US20090061468A1 (en) * 2007-08-31 2009-03-05 Sysmex Corporation Reagent and method for measuring coagulation time of blood sample
US20110312002A1 (en) * 2008-10-29 2011-12-22 Sonia Taktak Nmr detection of coagulation time

Family Cites Families (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4121466A (en) * 1977-04-19 1978-10-24 Technicon Instruments Corporation Liquid dispenser with an improved probe
US5164598A (en) 1985-08-05 1992-11-17 Biotrack Capillary flow device
US5134229A (en) * 1990-01-12 1992-07-28 Johnson & Johnson Medical, Inc. Process for preparing a neutralized oxidized cellulose product and its method of use
US5840573A (en) * 1994-02-01 1998-11-24 Fields; Robert E. Molecular analyzer and method of use
ATE195266T1 (de) * 1994-06-16 2000-08-15 Dade Behring Marburg Gmbh Verfahren und vorrichtung zum mischen von flüssigkeiten
CA2289174A1 (en) * 1998-11-09 2000-05-09 Andrew A. Pham Liquid barriers for assays
WO2000070350A1 (en) 1999-05-12 2000-11-23 Cme Telemetrix Inc. METHOD AND APPARATUS FOR RAPID MEASUREMENT OF HbA¿1c?
US7130046B2 (en) 2004-09-27 2006-10-31 Honeywell International Inc. Data frame selection for cytometer analysis
US6432658B1 (en) 2000-09-13 2002-08-13 Affinity Biologicals, Inc. Method for measuring antithrombin activity
US20030116447A1 (en) 2001-11-16 2003-06-26 Surridge Nigel A. Electrodes, methods, apparatuses comprising micro-electrode arrays
CA2511807A1 (en) * 2002-12-31 2004-07-22 Marine Polymer Technologies, Inc. Hemostatic compositions and uses therefor
KR20140134338A (ko) 2003-09-11 2014-11-21 테라노스, 인코포레이티드 피분석물의 모니터링 및 약물 전달을 위한 의료 기기
EP1700912B1 (en) 2003-11-22 2014-10-29 Techno Medica Co., Ltd. Method of detecting target molecule by using aptamer
US7399637B2 (en) * 2004-04-19 2008-07-15 Medtronic, Inc. Blood coagulation test cartridge, system, and method
EP1745145A4 (en) 2004-05-11 2008-03-26 Heptest Lab Inc COMPOSITIONS, KIT AND METHOD IN ONE STEP FOR MONITORING COMPOUNDS HAVING XA AND / OR ANTIFACTOR IIA ANTIFACTOR ACTIVITIES
EP1775574B1 (en) 2004-07-27 2018-03-14 LSI Medience Corporation Method for automatic determination of sample
US7544514B2 (en) * 2004-12-27 2009-06-09 David Varon Method and system for determining platelet-mediated clot formation
US8029783B2 (en) 2005-02-02 2011-10-04 Genentech, Inc. DR5 antibodies and articles of manufacture containing same
AU2006235025A1 (en) 2005-04-04 2006-10-19 The Regents Of The University Of California Inorganic materials for hemostatic modulation and therapeutic wound healing
US20090202621A1 (en) * 2005-04-29 2009-08-13 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Cell-surface decoration with active agents
KR101762424B1 (ko) 2005-05-09 2017-07-28 테라노스, 인코포레이티드 현장진료 유체 시스템 및 그 용도
WO2007061448A2 (en) 2005-05-18 2007-05-31 President And Fellows Of Harvard College Fabrication of conductive pathways, microcircuits and microstructures in microfluidic networks
US20070073590A1 (en) 2005-08-22 2007-03-29 Cosentino Louis C Remote monitor for physiological parameters and durable medical supplies
US8741230B2 (en) 2006-03-24 2014-06-03 Theranos, Inc. Systems and methods of sample processing and fluid control in a fluidic system
US8012744B2 (en) 2006-10-13 2011-09-06 Theranos, Inc. Reducing optical interference in a fluidic device
EP2657699B1 (en) * 2007-10-02 2017-03-22 Theranos, Inc. Modular point-of-care devices and uses thereof
US8372343B2 (en) 2007-12-07 2013-02-12 Sheldon Goldstein Multiple coagulation test cartridge and method of using same
CN106126881A (zh) 2008-03-26 2016-11-16 赛拉诺斯股份有限公司 表征对象的临床结果的计算机系统
US20110104725A1 (en) * 2008-05-02 2011-05-05 Advanced Liquid Logic, Inc. Method of Effecting Coagulation in a Droplet
WO2010011934A2 (en) 2008-07-24 2010-01-28 The Trustees Of Princeton University Bump array device having asymmetric gaps for segregation of particles
EP2214011B1 (en) * 2008-08-01 2019-01-02 Sysmex Corporation Blood sample analyzing apparatus
JP5465850B2 (ja) 2008-08-01 2014-04-09 シスメックス株式会社 試料分析システム
EP2177624A1 (en) * 2008-10-02 2010-04-21 Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH Blood coagulation assays
FR2943789B1 (fr) 2009-03-26 2013-07-26 Commissariat Energie Atomique Procede et dispositif pour la caracterisation de la dynamique de coagulation ou sedimentation d'un fluide tel que le sang ou le plasma sanguin
JP2010266236A (ja) * 2009-05-12 2010-11-25 Sysmex Corp 試料分析装置
AU2010308329B2 (en) 2009-10-19 2016-10-13 Labrador Diagnostics Llc Integrated health data capture and analysis system
US20110166875A1 (en) * 2010-01-05 2011-07-07 Abbott Diabetes Care Inc. System and method for managing medical data and facilitating reimbursement for health care
TWI748368B (zh) 2011-01-21 2021-12-01 美商拉布拉多診斷有限責任公司 樣本使用最大化之系統及方法
US8697449B2 (en) * 2011-04-01 2014-04-15 Spectral Sciences, Inc. Optical blood coagulation monitor and method
US8435738B2 (en) 2011-09-25 2013-05-07 Theranos, Inc. Systems and methods for multi-analysis
US9500639B2 (en) 2012-07-18 2016-11-22 Theranos, Inc. Low-volume coagulation assay

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002055109A (ja) 2000-08-09 2002-02-20 Hiroyuki Konno レーザ反射光による粒状斑点模様を利用した血液凝固時間測定方法とその装置
JP2002214241A (ja) 2000-11-20 2002-07-31 Minolta Co Ltd マイクロチップ
US20090061468A1 (en) * 2007-08-31 2009-03-05 Sysmex Corporation Reagent and method for measuring coagulation time of blood sample
US20110312002A1 (en) * 2008-10-29 2011-12-22 Sonia Taktak Nmr detection of coagulation time

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Lars Faxalv et al., 'Imaging of blood plasma coagulation and its propagation at surfaces', J Biomed Mater Res A., 2008, Vol. 85, pp 1129-1134. 1부.*

Also Published As

Publication number Publication date
EP2875146A2 (en) 2015-05-27
WO2014015191A2 (en) 2014-01-23
CN104662163A (zh) 2015-05-27
BR112015001048A2 (pt) 2017-06-27
MX2015000808A (es) 2015-05-07
SG10201603916UA (en) 2016-07-28
SG11201500346QA (en) 2015-02-27
IL236768B (en) 2019-10-31
WO2014015191A3 (en) 2014-05-08
CA2878875A1 (en) 2014-01-23
KR20150034793A (ko) 2015-04-03
US11119110B2 (en) 2021-09-14
US20150301018A1 (en) 2015-10-22
CA2878875C (en) 2021-09-07
US20170023594A1 (en) 2017-01-26
JP2019002939A (ja) 2019-01-10
BR112015001048A8 (pt) 2021-07-06
CN109884289A (zh) 2019-06-14
AU2013292392A1 (en) 2015-01-29
CN109884289B (zh) 2022-07-26
EP2875146A4 (en) 2016-03-02
EP2875146B1 (en) 2022-05-18
BR112015001048B1 (pt) 2021-12-14
MX360564B (es) 2018-11-07
US20140087403A1 (en) 2014-03-27
US20220137075A1 (en) 2022-05-05
CA3124500A1 (en) 2014-01-23
JP2015528911A (ja) 2015-10-01
JP2021009153A (ja) 2021-01-28
US9500639B2 (en) 2016-11-22
IL236768A0 (en) 2015-03-31
HK1210812A1 (en) 2016-05-06
JP2022116194A (ja) 2022-08-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102149318B1 (ko) 소량 응집 검정
JP2022078344A (ja) 生物学的サンプルの画像分析および測定
US8778687B2 (en) Method and apparatus for determining the hematocrit of a blood sample utilizing the intrinsic pigmentation of hemoglobin contained within the red blood cells
US20140038230A1 (en) A simple and affordable method for immunophenotyping using a microfluidic chip sample preparation with image cytometry
JP2015528911A5 (ko)
JP2022153471A (ja) サンプル分析のための方法、機器、及びシステム
FR2945350A1 (fr) Appareil et dispositif consommable pour effectuer des analyses sanguines
US10429387B2 (en) Simple and affordable method for immuophenotyping using a microfluidic chip sample preparation with image cytometry

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant