DE102009022352A1

DE102009022352A1 - Ablöseverfahren für adhärente Zellen

Info

Publication number: DE102009022352A1
Application number: DE200910022352
Authority: DE
Inventors: Christian Dipl.-Ing. Derichs; Ulrike Koropp; Heike Prof. Dr. Mertsching; Michaela Dr. Kaufmann; Jan Hansmann
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Priority date: 2009-05-15
Filing date: 2009-05-15
Publication date: 2010-11-18
Also published as: WO2010130307A8; WO2010130307A1; EP2430147A1

Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Kultivierung von adhärenten Zellen, insbesondere zum Ablösen der Zellen von einer Oberfläche, die Verwendung von Membranen bei diesen Verfahren und Vorrichtungen zur Durchführung der Verfahren. Ein besonderes Anwendungsgebiet ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren bei der GMP-konformen vollautomatischen Kultivierung und Vermehrung von Zellen.

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Kultivierung von adhärenten Zellen, insbesondere zum Ablösen der Zellen von einer Oberfläche, die Verwendung von Membranen bei diesen Verfahren und Vorrichtungen zur Durchführung der Verfahren. Ein besonderes Anwendungsgebiet ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren bei der GMP-konformen vollautomatischen Kultivierung und Vermehrung von Zellen.
Stand der Technik
Auf dem technischen Gebiet des so genannten Tissue Engineering, besonders im Zusammenhang mit der regenerativen Medizin besteht der Bedarf, biologische Laborprozesse unter Reinraumbedingungen GMP-konform zu automatisieren. Dadurch soll eine höhere Ausbeute, höhere Prozesssicherheit sowie eine standardisierbare Prozessoptimierung und Prozesskontrolle erreicht werden.
Im Laufe der Jahre haben sich bestimmte Standards bei der Produktion im Labormaßstab durchgesetzt. So werden häufig Wegwerfartikel aus spritzgegossenem Polypropylen oder Polystyrol genutzt, da so die sehr kostenaufwendige Reinigung und Desinfektion der Probenbehälter entfällt. Die zum Aufbau der Gewebekonstrukte benötigten Zellen werden zunächst aus einer Biopsat heraus isoliert und anschließend in Zellkulturschalen, -flaschen oder Multiwellplatten unterschiedlicher Größe über einen mehrtägigen Zeitraum kultiviert.
Zur Kultivierung werden die isolierten Primärzellen zunächst in spezifischen Zellkulturmedien resuspendiert. Die Zellsuspension wird an schließend in Einweg-Kulturgefäße pipettiert, in welchen die Zellen auf den speziell vorbehandelten Plastikoberflächen undefiniert adhärieren. Nach einer mehrtägigen Inkubationszeit im Brutschrank, auch als Inkubator bekannt, und regelmäßiger Austausch des verbrauchten Zellkulturmediums durch frisches Zellkulturmedium wird die ausreichend dicht gewachsene, also konfluente Zellkultur von der Kunststoffoberfläche der Zellkulturgefäße abgelöst. Der Ablösevorgang wird entweder rein enzymatisch, beispielsweise mit einer Trypsin/EDTA-haltigen Lösung, oder in Verbindung mit mechanischer Anregung durchgeführt. Dabei haben sowohl die Enzymaktivität als auch die mechanische Belastung negative Auswirkungen auf die Vitalität der Zellen.
Dieser notwendige Ablösevorgang muss möglichst schnell durchgeführt werden, um eine lange Einwirkzeit und damit Schädigung der Zellen zu vermeiden. Nachteilig sind besonders das Einwirken des Enzyms an der Oberseite der Zellkultur, was zu einer Schädigung der Zellen und zu einer verminderten Zellvitalität führt.
Die Methode Zellen auf PET Membranen zu kultivieren wird im Labor standardmäßig eingesetzt. Hierfür werden Zellkultureinsätze, sogenannte Inserts, verwendet, wie sie zum Beispiel aus der WO 2004/020571 A2 bekannt sind. Diese sind allerdings nur in beschränkter Größe erhältlich. Die Verwendung von Insert-Membranen hat im manuellen Laborprozess den Nachteil, dass der Bewuchs der Zellkultur während der Kulturdauer nicht mikroskopisch kontrollierbar ist.
Bei allen herkömmlichen enzymatischen Ablöseverfahren wird eine Enzymlösung, häufig eine Trypsin/EDTA-haltige Lösung auf die ad härenten Zellen der Zellkultur gegeben, damit das Enzym die Zellen von der Oberfläche, an der sie anhaften, abspalten kann. Nachdem das Enzym eine gewisse Zeit gewirkt hat, wird die Enzymreaktion gestoppt. Einen Überblick über solche Ablöseverfahren gibt zum Beispiel Hans Jürgen Boxberger: „Leitfaden für die Zell- und Gewebekultur: Einführung in Grundlagen und Techniken" Wiley-VCH, Weinheim (2006), Seiten 132 bis 135.
Bei den üblichen Ablöse-Vorgängen werden die Zellen von allen Seiten mit der Enzymlösung umspült. Das Enzym wirkt bei diesem Vorgehen jedoch auf die Membranproteine der gesamten Zelloberfläche und führt somit leicht zu einer Schädigung der Zellen. Durch die vollständige Benetzung mit der Enzymlösung werden auch Zelloberflächenrezeptoren an der Oberseite der Zellen geschädigt, die nicht an der Zelladhäsion an der Zellkulturgefäßoberfläche beteiligt sind.
Zusammenfassung der Erfindung
Der Erfindung lag das technische Problem zugrunde, Verfahren und Vorrichtungen bereitzustellen, die ein gegenüber dem Stand der Technik verbessertes und/oder vereinfachtes Ablösen von adhärenten Zellen ermöglichen.
Der Erfindung lag auch das technische Problem zugrunde, Verfahren und Vorrichtungen bereitzustellen, die ein für adhärente Zellen schonendes Ablösen der Zellen von der Kultivierungsoberfläche ermöglichen.
Der Erfindung lag auch das technische Problem zugrunde, Verfahren und Vorrichtungen bereitzustellen, die eine für Zellen schonende Kultivierung und Expansion der Zellen ermöglichen.
Der Erfindung lag auch das technische Problem zugrunde, Verfahren und Vorrichtungen bereitzustellen, die eine automatisierte Kultivierung und Expansion von Zellen ermöglichen.
Der Erfindung lag auch das technische Problem zugrunde, Verfahren und Vorrichtungen bereitzustellen, die eine Schädigung der Zellen durch ein Passagieren der Zellen vermindern, insbesondere vermeiden.
Das der Erfindung zugrunde liegende technische Problem wird gelöst durch die Gegenstände der unabhängigen Patentansprüche.
Insbesondere wird das der Erfindung zugrunde liegende technische Problem durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1 gelöst.
Insbesondere wird das der Erfindung zugrunde liegende technische Problem durch ein Verfahren zur Kultivierung von adhärenten Zellen gelöst, enthaltend die Schritte a) kultivieren der Zellen auf einer ersten Oberfläche eines porösen Materials und b) enzymatisches Ablösen der Zellen von der ersten Oberfläche des porösen Materials, wobei das enzymatische Ablösen durch das Kontaktieren einer zweiten Oberfläche des porösen Materials mit einer Enzym-haltigen Flüssigkeit erfolgt, und wobei die Zellen während Schritt b) nur mit ihren das poröse Material berührenden Kontaktpunkten mit der Enzym-haltigen Flüssigkeit in Kontakt kommen.
Erfindungsgemäß bevorzugt kommen die Zellen nur mit den Zellausläufern als Kontaktpunkte mit der Enzym-haltigen Flüssigkeit in Kontakt.
Die Erfindung sieht also vor, in Schritt b) die Enzym-haltige Flüssigkeit nicht direkt auf die Zellen zu geben, sondern das poröse Material mit der Enzym-haltigen Flüssigkeit in Kontakt zu bringen, so dass nur die das poröse Material berührenden Kontaktpunkte der Zellen mit dem Enzym in Kontakt kommen. Somit kommen in vorteilhafter Weise nur kleine Teilbereiche der Zelloberfläche mit dem Enzym in Kontakt, nämlich die Kontaktpunkte, insbesondere die Zellausläufer der Zellen, und nicht, wie im Stand der Technik üblich, die gesamte Zelloberfläche. Dies wird erfindungsgemäß dadurch erreicht, dass die Enzym-haltige Flüssigkeit nicht auf die erste Oberfläche des porösen Materials gegeben wird, die die Zellen direkt kontaktiert, also auf der die Zellen angesiedelt sind, sondern über eine zweite Oberfläche des porösen Materials die Flüssigkeit durch das poröse Material hindurch zum Kontaktbereich zwischen dem porösen Material und den Zellen geführt wird.
Erfindungsgemäß bevorzugt wird also die Ablösung der an einem porösen Material, insbesondere einer Membran, adhärierten Zellen in Schritt b) über eine Enzymreaktion gesteuert, wobei das Enzym lediglich durch das poröse Material hindurch am Kontakt der Zellen mit dem porösen Material auf die Zelloberfläche einwirken kann.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter ”adhärenten Zellen” solche Zellen verstanden, die auf einer inerten Oberfläche, beispielsweise einem Reaktionsgefäß oder auf einer Membran, als Monolayer oder als Multilayer, insbesondere aber als Monolayer, in einem Zellkulturmedium angezüchtet werden können. Die adhärenten Zellen kontaktieren die Oberfläche und haften an dieser an.
Die adhärenten Zellen haben also an ihrer Oberfläche Kontaktpunkte mit der inerten Oberfläche, die im vorliegenden Fall durch das poröse Material, bevorzugt einer Membran, gebildet wird. Die adhärenten Zellen wachsen dabei nicht mit ihrer gesamten Fläche auf dem porösen Material, sondern bilden die Bindung an die inerte Oberfläche über sogenannte Zellausläufer aus, die diesen Kontakt zum porösen Material bilden.
Adhärente Zellen bilden zumeist eine zusammenhängende Zelllage. Adhärente Zellen zeigen häufig eine dichteabhängige Proliferationshemmung, auch Kontaktinhibition genannt, die bei Überschreiten der Konfluenz eintreten kann. Adhärente Zellen leiten sich häufig von Geweben ab, wie zum Beispiel Haut, Muskulatur, Nerven, Leber, Nieren. Beispiele für adhärente Zellen sind Fibroblasten, HeLa-Zellen und viele Tumorzellen. Als Zellkulturmedium zur Kultivierung der adhärenten Zellen eignen sich die dem Fachmann bekannten Medien, die je nach anzuwachsendem Zelltyp ausgewählt werden.
Erfindungsgemäß bevorzugt sind die adhärenten Zellen eukaryoitsche Zellen, insbesondere Säugetierzellen. Erfindungsgemäß bevorzugt sind die Zellen tierische Zellen. Erfindungsgemäß bevorzugt sind die Zellen Säugetierzellen, insbesondere humane, bovine oder murine Zellen.
Es können alternativ aber auch prokaryontische Zellen, pflanzliche Zellen oder pilzliche Zellen kultiviert werden, solange es sich um adhärente Zellen handelt.
Das Kultivieren der Zellen auf der ersten Oberfläche des porösen Materials kann in herkömmlicher Art und Weise erfolgen. Dem Fachmann sind verschiedenste Kultivierungsmethoden für adhärente Zellen bekannt, von denen er geeignete auswählen kann.
Erfindungsgemäß bevorzugt werden die Zellen auf einer nach oben gerichteten Oberfläche des porösen Materials kultiviert. Erfindungsgemäß bevorzugt ist also die erste Oberfläche des porösen Materials nach oben gerichtet.
Das Kultivieren erfolgt bevorzugt in einem Zellkulturmedium. Dauer der Kultivierung, Kultivierungstemperatur, Kultivierungsdruck, pH-Wert und Sauerstoffgehalt des Mediums und andere Parameter können von einem Fachmann aus dem ihn bekannten Bereichen gewählt werden.
Erfindungsgemäß bevorzugt werden die Zellen auf das poröse Material gegeben, adhärieren gelassen und dann weiter kultiviert.
Erfindungsgemäß bevorzugt werden die Zellen in einer Zellkonzentration bei der Aussaat von ca. 4000 bis ca. 20.000 Zellen/cm², insbesondere von ca. 4000 bis ca. 16.000 Zellen/cm² auf die poröse Oberfläche aufgebracht.
Dabei wird erfindungsgemäß bevorzugt das als Zellwachstumsfläche vorgesehene poröse Material beim Besiedeln nicht ganzheitlich mit Zellflüssigkeit benetzt, sondern einzelne gleichmäßig auf der Zellwachstumsfläche verteilte Zellverbünde erstellt.
Erfindungsgemäß bevorzugt werden die in einem Zellkulturmedium suspendierten Zellen mit einer Pipette tröpfchenweise mit etwa gleichbleibendem, insbesondere mit gleichbleibendem, Abstand zu Beginn von Schritt a) auf das poröse Material pipettiert.
Bei diesem Vorgang sind für einen Fachmann folgende Parameter variierbar: Tropfenvolumen, Tropfenabstand, Zellkonzentration im Tropfen und/oder Wartezeit bis zum ersten Medienwechsel.
Mit diesen Parametern kann auch das Kultivierungsverhalten der jeweiligen Zellen verändert werden.
Die Zellkonzentration innerhalb eines Tropfens führt dabei zur Einhaltung der für das Zellwachstum notwendigen Zell-Zell-Kontakte bei gleichzeitiger Vergrößerung der verfügbaren Zellwachstumsfläche auf ein Vielfaches der Zellwachstumsfläche eines Standardkulturgefäßes im Labor. Darüber hinaus stellt diese bevorzugte Besiedlungsmethode eine gleichmäßige Verteilung der Zellen über das poröse Material als Kulturfläche sicher, während in den Standardkulturgefäßen die Verteilung der Zellen zufällig erfolgt und häufig in den Randbereichen höher ist als in der Mitte. Eine gleichmäßige Zellverteilung hat den Vorteil, dass die Wachstumsbedingungen auf dem besiedelten porösen Material einheitlich sind. Durch die nun ausreichend große Zellwachstumsfläche können insbesondere zusätzliche Passagierschritte der Zellen, insbesondere im automatisierten Prozess, vermieden werden, wodurch eine Reihe von Handhabungsschritten entfallen, die ansonsten den automatisierten Prozess erschweren und den Zellen schaden.
Erfindungsgemäß bevorzugt liegt das Tropfenvolumen zwischen mindestens 2,5 μl und höchstens 30 μl.
Erfindungsgemäß bevorzugt sind in einem Tropfen zwischen 10 und 500, insbesondere zwischen 25 und 350 Zellen bei Aussaht vorhanden.
Durch eine gleichmäßige tröpfchenweise Besiedlung der Zellwachstumsfläche, kann diese auf ein vielfaches vergrößert werden, ohne die Bedingungen für eine erfolgreiche Zellexpansion zu verletzen. So wird die, für eine passagierfreie Zellexpansion, notwendige Größe der Zellwachstumsfläche erreicht.
Auch die zusätzliche Schädigung der Zellen beim Passagieren durch die Einwirkung von Enzymreaktionen oder mechanische Belastung können auf ein Minimum, insbesondere eine einzige erfindungsgemäße Ablösung der Zellen am Ende des Kultivierungszeitraums, reduziert werden.
Somit bleibt bevorzugt als einziger nötiger Ablösevorgang der Zellen Schritt b) zum Zeitpunkt der Zellernte nach abgeschlossener Kultivierung. Weiterhin kann durch eine neue Ablösemethode die schädliche Wirkung des Enzyms auf die Zellen minimiert werden.
Die Besiedlung des porösen Materials kann alternativ auch auf eine andere Art und Weise als das Pipettieren von Tröpfchen erfolgen, beispielsweise durch besprühen mit in Flüssigkeit suspendierten Zellen oder das Übergießen mit Zellen in Zellkulturmedium.
Erfindungsgemäß bevorzugt werden adhärente Zellen in Schritt a) an die Membran adhärieren gelassen und dann unter Zugabe von Flüssigkeit, insbesondere von Zellkulturmedium, weiter kultiviert.
Erfindungsgemäß bevorzugt werden die Zellen in Schritt a) solange kultiviert, bis sie nahezu konfluent sind oder bis sie konfluent sind.
Es kann auch vorgesehen sein, in Schritt a) das Zellkulturmedium bei Bedarf auszuwechseln, also verbrauchtes Zellkulturmedium durch frisches Zellkulturmedium zu ersetzen.
Es kann auch zum Beispiel vorgesehen sein, die Zellen in Schritt a) in einem Brutschrank zu kultivieren.
Als Konfluenz bezeichnet man die dichtest mögliche Anordnung von adhärenten Zellen an der Oberfläche einer Kulturgefäßoberfläche, im vorliegenden Fall also des porösen Materials. Die Konfluenz gestaltet sich von Zelllinie zu Zelllinie verschieden.
Kurz vor oder bei Erreichen der Konfluenz durch das Wachsen und/oder die Vermehrung der Zellen werden die Zellen bevorzugt geerntet oder passagiert.
Es kann vorgesehen sein, über eine Prozess-Kontrolle des Schritts a), beispielsweise über Elektroden zur TEER-Wert-Messung und/oder der automatisierten Medienzufuhr den Zustand der Zellen messtechnisch auf unterschiedlichste Parameter zu untersuchen. Insbesondere kann vorgesehen sein, die Dauer des Schrittes a) durch die TEER-Wert-Messung zu bestimmen. Dabei kann Schritt a) in vorteilhafter Weise beendet werden, wenn die gewünschte Zelldichte erreicht ist, insbesondere wenn die Zellen nahezu konfluent sind oder konfluent sind.
Durch die Messung des TEER-Werts (TEER = Transepithelialer elektrischer Widerstand) kann die Dichte der Zellbesiedlung bestimmt werden. Somit kann der Zeitpunkt bestimmt werden, an dem die Zellen auf der Membran die gewünschte Zelldichte erreicht ha ben, insbesondere der Zeitpunkt an dem die Zellschicht beinahe konfluent oder konfluent geworden ist.
Es kann auch vorgesehen sein, insbesondere in Schritt a), die Trübung des Zellkulturmediums zu messen. Es kann auch vorgesehen sein, insbesondere in Schritt a), den Sauerstoffgehalt des Zellkulturmediums zu messen. Es kann auch vorgesehen sein, insbesondere in Schritt a), den pH-Wert des Zellkulturmediums zu messen. Es kann auch vorgesehen sein, insbesondere in Schritt a), den Glukosegehalt des Zellkulturmediums zu messen.
In Schritt b) werden die Zellen nach Erreichen der gewünschten Zelldichte enzymatisch abgelöst. Dies erfolgt mit einer Enzym-haltigen Flüssigkeit.
Im Zusammenhang mit dieser Erfindung wird unter einer Enzym-haltigen Flüssigkeit eine Flüssigkeit verstanden, in der ein Enzym enthalten ist, und zwar in einer Konzentration, in der das Enzym wirksam ist. Erfindungsgemäß eignet sich das Enzym zum Ablösen der adhärenten Zellen von einer Oberfläche, insbesondere von dem porösen Material.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Enzym Trypsin. Es können aber auch andere dem Fachmann bekannte Enzyme verwendet werden, wie zum Beispiel Accutase oder rProtease.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist die Flüssigkeit ein Puffer. Dem Fachmann sind geeignete Puffer bekannt, die für das Enzym verwendet werden können. Es können auch Zellkulturmedien als Flüssigkeit verwendet werden.
Das enzymatische Ablösen in Schritt b) kann also mit Enzym-haltigen Flüssigkeiten und Lösungen durchgeführt werden, wie sie auch im Stand der Technik zum Ablösen adhärenter Zellen verwendet werden. Insbesondere wird der Fachmann als Enzym Trypsin verwenden, insbesondere in einer EDTA-Lösung. Der Fachmann kennt dabei geeignete TrypsinKonzentrationen.
Nachdem sich die Zellen abgelöst haben, kann Schritt b) auf verschiedene Art und Weise beendet werden. Insbesondere kann die Enzym-haltige Flüssigkeit wieder entfernt werden. Oder der Ablösevorgang wird durch Hinzufügen von Serum gestoppt. Auch kann das poröse Material mit den darauf liegenden, aber nicht anhaftenden Zellen entfernt werden.
Erfindungsgemäß kann vorgesehen sein, dass in Schritt b) die Oberkante der Enzym-haltigen Flüssigkeit genau auf Höhe der Oberseite des porösen Materials liegt.
Erfindungsgemäß kann vorgesehen sein, dass in Schritt b) die Enzym-haltige Flüssigkeit unter das poröse Material zugegeben wird.
Ein Fachmann weiß, wie lange er das Enzym einwirken lassen muss, wie lange er Schritt b) also durchzuführen ist. Insbesondere kennt der Fachmann auch Methoden zur Bestimmung des Ablösegrades der Zellen.
In einer erfindungsgemäßen alternativen Ausführungsform werden in Schritt b) die Zellen enzymatisch abgelöst, wobei das Ablösen durch physikalische Methoden unterstütz wird. Damit kann der Ablösevorgang beschleunigt werden.
Erfindungsgemäß bevorzugt wird in Schritt b) das Ablösen durch mechanische oder physikalische Verfahren unterstützt, insbesondere durch Ultraschall und/oder von aufsteigenden Luftblasen unterhalb des porösen Materials. Auch kann das Ablösen durch Klopfen und/oder Schütteln unterstützt werden.
Das poröse Material ist erfindungsgemäß flüssigkeitsdurchlässig. Das poröse Material hat erfindungsgemäß eine Oberfläche, insbesondere eine inerte Oberfläche, an der sich adhärente Zellen, insbesondere mit Zellausläufern, anhaften können.
Das poröse Material dient als Wachstumsfläche der Zellen. Das poröse Material hat bevorzugt zwei Oberflächen, insbesondere wenn es blattförmig oder scheibenförmig ist, beispielsweise wenn es eine Membran ist, nämlich eine Oberseite und eine Unterseite. Das poröse Material kann aber auch mehr als zwei Oberflächen haben, beispielsweise wenn es dicker als eine Membran ist, zum Beispiel wenn es schwammförmig ist. Erfindungsgemäß bevorzugt dient nur eine Oberfläche des porösen Materials als Wachstumsfläche der Zellen.
Wenn das poröse Material erfindungsgemäß bevorzugt horizontal, also waagerecht, verwendet wird, so dient erfindungsgemäß bevorzugt die obere Oberfläche, also die Oberseite des porösen Materials als Wachstumsfläche der Zellen.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist das poröse Material ein schwammartiges Material oder eine Membran.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist das poröse Material eine Membran.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist die Membran Teil einer Membran-Einheit. Erfindungsgemäß bevorzugt besteht die Membran-Einheit aus einer Membran und einem Rahmen. Alternativ kann die Membran-Einheit nur aus einer Membran bestehen.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist die Membran-Einheit durch die Membran flüssigkeitsdurchlässig. Erfindungsgemäß bevorzugt bildet also die Membran den flüssigkeitsdurchlässigen Teil, insbesondere den einzigen flüssigkeitsdurchlässigen Teil der Membran-Einheit.
Die erfindungsgemäß bevorzugte Membran dient als Wachstumsfläche der Zellen. Erfindungsgemäß bevorzugt dient nur eine der zwei Oberflächen der Membran als Wachstumsfläche der Zellen.
Erfindungsgemäß bevorzugt wird die Membran während des erfindungsgemäßen Verfahrens waagerecht, also horizontal, verwendet.
Wenn die Membran erfindungsgemäß bevorzugt waagerecht verwendet wird, so dient erfindungsgemäß bevorzugt die obere Oberfläche der Membran als Wachstumsfläche der Zellen. Da die adhärenten Zellen an der Membran anhaften kann auch vorgesehen sein, dass die untere Oberfläche der Membran als Wachstumsfläche der Zellen dient. Auch kann die Membran während des Schritts a) und/oder zu Beginn von Schritt b) umgedreht werden, so dass zum Beispiel die Zellen auf der oberen Oberfläche anwachsen, die Membran umgedreht wird und die Zellen somit auf der Unterseite Weiterwachsen. Dann kann in Schritt b) zum Beispiel die Enzym-haltige Flüssigkeit auf die obere Oberfläche der Membran gegeben werden, oder die Membran wird wieder umgedreht, so dass die Zellen in Schritt b) an der oberen Oberfläche der Membran anliegen.
Insbesondere bei adhärenten Zellen können alternativ aber auch beide Oberflächen der Membran als Wachstumsfläche der Zellen verwendet werden. Dann wird das erfindungemäße Verfahren jedoch nur für die adhärenten Zellen auf einer der beiden Oberflächen angewandt. Die anderen Zellen können beispielsweise als Feeder-Zellen dienen.
In einer alternativen, erfindungsgemäßen Ausführungsform kann die Membran auch durch ein anderes geeignetes poröses Material ersetzt werden, beispielsweise durch ein schwammartiges Material.
Dem Fachmann sind geeignete flüssigkeitsdurchlässige Membranen bekannt, die sich zum Kultivieren von Zellen, insbesondere von adhärenten Zellen, eignen.
Die Zellwachstumsmembran kann beispielsweise aus PET, also Polyethylenterephthalat, oder einem vergleichbaren Material bestehen. Auch ist beispielsweise die Verwendung von Polycarbonat-Membranen möglich. Die Membran weist definitionsgemäß eine poröse Struktur auf, so dass ein Flüssigkeitsaustausch über die Membran möglich ist.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist die Membran ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus PET Membranen, PC Membranen, Nylon Membranen, amphotere Nylon Membranen, positiv geladene Nylon Membranen, negativ geladene Nylon Membranen, PTFE Membranen, Celluloseester Membranen, Celluloseacetat Membranen, Cellulosenitrat Membranen, Cellulosemischester Membranen, regenerierte Cellulose Membranen, Nytran Membranen und Nytran SuPer-Charge++ Membranen.
In einer erfindungsgemäßen alternativen Ausführungsform ist die Membran eine PET Membran. In einer erfindungsgemäßen alternativen Ausführungsform ist die Membran eine PC Membran. In einer erfindungsgemäßen alternativen Ausführungsform ist die Membran eine Nylon Membran. In einer erfindungsgemäßen alternativen Ausführungsform ist die Membran eine amphotere Nylon Membran. In einer erfindungsgemäßen alternativen Ausführungsform ist die Membran eine positiv geladene Nylon Membran. In einer erfindungsgemäßen alternativen Ausführungsform ist die Membran eine negativ geladene Nylon Membran. In einer erfindungsgemäßen alternativen Ausführungsform ist die Membran eine PTFE Membran. In einer erfindungsgemäßen alternativen Ausführungsform ist die Membran eine Celluloseester Membran. In einer erfindungsgemäßen alternativen Ausführungsform ist die Membran eine Celluloseacetat Membran. In einer erfindungsgemäßen alternativen Ausführungsform ist die Membran eine Cellulosenitrat Membran. In einer erfindungsgemäßen alternativen Ausführungsform ist die Membran eine Cellulosemischester Membran. In einer erfindungsgemäßen alternativen Ausführungsform ist die Membran eine regenerierte Cellulose Membran. In einer erfindungsgemäßen alternativen Ausführungsform ist die Membran eine Nytran+ Membran. In einer erfindungsgemäßen alternativen Ausführungsform ist die Membran eine Nytran SuPerCharge++ Membran.
Auch eine Beschichtung der Zellwachstumsmembran oder ein Aufbringen einer Oberflächenstruktur ist wahlweise möglich.
Erfindungsgemäß bevorzugt weist die Membran eine Porengröße von mindestens 0,01 μm auf. Erfindungsgemäß bevorzugt weist die Membran eine Porengröße von mindestens 0,1 μm auf. Erfindungs gemäß bevorzugt weist die Membran eine Porengröße von mindestens 0,35 μm und auf.
Erfindungsgemäß bevorzugt weist die Membran eine Porengröße von höchstens 20 μm auf. Erfindungsgemäß bevorzugt weist die Membran eine Porengröße von höchstens 10 μm auf.
Erfindungsgemäß bevorzugt weist die Membran eine Porengröße von mindestens 0,01 μm, insbesondere 0,1 μm und höchstens 20 μm, insbesondere höchstens 10 μm auf.
Erfindungsgemäß bevorzugt weist die Membran eine Porengröße von mindestens 0,35 μm, insbesondere 0,4 μm und höchstens 9 μm, insbesondere höchstens 8 μm auf.
Es kann beispielsweise eine Porengröße von 0,4 μm, 0,45 μm, 1,0 μm, 1,2 μm, 3,0 μm, 5,0 μm oder 8,0 μm vorgesehen sein.
Dem Fachmann sind geeignete Porengrößen von Membranen bekannt, die sowohl einen genügenden Flüssigkeitsdurchtritt, insbesondere Zellkulturmediumsdurchtritt, und gleichzeitig eine gute Kultivierung der Zellen gewährleisten.
Erfindungsgemäß bevorzugt weist die Membran der Membraneinheit eine Porendichte von mindestens 10⁵ Poren pro cm² auf. Erfindungsgemäß bevorzugt weist die Membran der Membraneinheit eine Porendichte von höchstens 10⁸ Poren pro cm² auf.
Erfindungsgemäß bevorzugt weist die Membran der Membraneinheit eine Porendichte von mindestens 10⁵ Poren pro cm² und höchstens 10⁸ Poren pro cm² auf. Es kann beispielsweise eine Porendichte von 0,1 × 10⁶, 0,2 × 10⁶, 0,4 × 10⁶, 2 × 10⁶, 22 × 10⁶ oder 100 × 10⁶ vorgesehen sein.
Dem Fachmann sind geeignete Porendichten von Membranen bekannt, die sowohl einen genügenden Flüssigkeitsdurchtritt, insbesondere Zellkulturmediumsdurchtritt, und gleichzeitig eine gute Kultivierung der Zellen gewährleisten.
Erfindungsgemäß bevorzugt befindet sich das poröse Material in einem Gefäß.
Es ist also erfindungsgemäß bevorzugt vorgesehen, dass das poröse Material von einem Gefäß zumindest teilweise umgeben wird, insbesondere von einem Kulturgefäß, so dass das Gefäß eine Flüssigkeit aufnehmen kann. Bevorzugt kann das Gefäß die Flüssigkeit aufnehmen, wobei die Flüssigkeit das poröse Material umgibt, also sich unterhalb und oberhalb des porösen Materials befindet.
Es können die verschiedensten Gefäße verwendet werden. Insbesondere eignen sich Zellkulturgefäße, beispielsweise Zellkulturflaschen, Zellkulturschalen oder Multiwellplatten.
Erfindungsgemäß bevorzugt befindet sich das poröse Material in einer Zellkulturschale. Erfindungsgemäß bevorzugt befindet sich das poröse Material in einer Vertiefung einer Multiwellplatte, beispielsweise einer 6-well Platte oder einer 24-well Platte.
Das Gefäß kann auch ein Bioreaktor sein.
Erfindungsgemäß bevorzugt bedeckt das poröse Material nicht den Boden des Gefäßes. Erfindungsgemäß bevorzugt befindet sich das poröse Material im Inneren des Gefäßes, so dass unterhalb und oberhalb des porösen Materials ein Freiraum besteht.
In einer erfindungsgemäßen alternativen Ausführungsform kann vorgesehen sein, dass das poröse Material Bestandteil eines Zellkultureinsatzes ist. Der Zellkultureinsatz kann ein herkömmlicher Zellkultureinsatz aus dem Stand der Technik sein, wie er von verschiedenen Firmen angeboten wird.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist vorgesehen, dass in Schritt a) das poröse Material und die adhärenten Zellen in einem Zellkulturmedium eingetaucht sind und in Schritt b) das Zellkulturmedium entfernt wird und die Enzym-haltige Flüssigkeit zugegeben wird.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform ist das poröse Material der Boden eines Zellkultureinsatzes, der in einem Zellkulturgefäß eingesetzt ist, wobei zwischen dem Boden des Zellkulturgefäßes und dem porösen Material ein Abstand besteht. In Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Zellen in einem Zellkulturmedium kultiviert, wobei das Gefäß mit so viel Zellkulturmedium gefüllt wird, dass das Zellkulturmedium die Zellen überdeckt. In Schritt b) wird dann das Zellkulturmedium entfernt und in das Gefäß die Enzym-haltige Flüssigkeit gegeben, wobei nur soviel Enzym-haltige Flüssigkeit zugegeben wird, dass die Oberkante der Enzym-haltigen Flüssigkeit nur die Kontaktpunkte der Zellen zu dem porösen Material erreicht. Je nach Wahl des porösen Materials kann es ausreichend sein, dass die Enzym-haltige Flüssigkeit nur bis zur Unterseite des porösen Materials reicht, da das Material die Flüssigkeit durch Kapillarkräfte auch zur Oberseite des Materials bringt. Es kann aber auch soviel Enzym-haltige Flüssigkeit zugegeben werden, dass die Flüssigkeit genau bis zur Oberseite des porösen Materials reicht.
Das Zuführen des Zellkulturmediums in Schritt a) kann auf verschiedenste Weise erfolgen.
Auch das Zuführen der Enzym-haltigen Flüssigkeit in Schritt b) kann auf verschiedenste Weise erfolgen.
Beispielsweise kann das Zellkulturgefäß eine, insbesondere verschließbare, Öffnung unterhalb des porösen Materials haben, durch die die Enzym-haltige Flüssigkeit eingefüllt und abgelassen werden kann. Es könnte also im erfindungsgemäßen Verfahren ein Gefäß verwendet werden, dass unterhalb des porösen Materials einen Einlass beziehungsweise einen Auslass hat.
Natürlich kann zum Entfernen des Zellkulturmediums und zum hinzufügen der Enzym-haltigen Flüssigkeit das poröse Material, zum Beispiel mit dem Zellkultureinsatz, auch aus dem Gefäß entfernt werden, so dass das Medium und/oder die Enzym-haltige Flüssigkeit zupipettiert, abpipettiert, zugegossen oder abgegossen werden kann.
Auch kann ein spezieller Zellkultureinsatz mit dem porösen Material verwendet werden, der eine Aussparung aufweist, durch die der Boden des Gefäßes zugänglich ist, so dass das Medium mit eine Pipette abgezogen werden kann und die Enzym-haltige Flüssigkeit an dem porösen Material vorbei mit einer Pipette zugegeben werden kann. Es wird also hierbei die Enzym-haltige Flüssigkeit von oben an dem porösen Material vorbei unter das poröse Material pipettiert.
Bei einem automatisierten Verfahren kann die genaue Menge an Zellkulturmedium und insbesondere an Enzym-haltiger Flüssigkeit computergesteuert in der genau erforderlichen Menge zugeführt werden. Dabei kann die Menge entweder vorher anhand der Maße des Zellkulturgefäßes und des Zellkultureinsatzes berechnet oder bestimmt werden, oder es sind Messeinrichtungen zur Messung der Füllhöhe vorgesehen.
In einer erfindungsgemäßen alternativen Ausführungsform wird das Verfahren in einem Bioreaktor durchgeführt.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist ein Bioreaktor zur Kultivierung von Zellen, wobei der Reaktorraum des Bioreaktors durch eine zumindest in Teilbereichen flüssigkeitsdurchlässige Membran-Einheit in zwei Reaktorbereiche unterteilt wird und wobei jeder dieser zwei Reaktorbereiche eine zum Einlassen und/oder Auslassen einer Flüssigkeit geeignete Öffnung aufweist.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann also in einem Bioreaktor mit einer integrierten Zellwachstumsmembran durchgeführt werden. Der Bioreaktor umgibt als Gehäuse einen Reaktorraum, auch Reaktorkammer genannt. Dieser Reaktorraum wird durch die in Teilbereichen flüssigkeitsdurchlässige Membran-Einheit in zwei Reaktorbereiche aufgeteilt. Der Bioreaktor weist bevorzugt also zwei Reaktorbereiche beziehungsweise Reaktorraumbereiche auf.
Erfindungsgemäß bevorzugt enthält der Bioreaktor ein Reaktorunterteil, einen Reaktordeckel und eine Membran-Einheit. Erfindungsgemäß bevorzugt besteht der Bioreaktor aus einem Reaktorunterteil, einem Reaktordeckel und einer Membran-Einheit. Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Reaktorunterteil nach oben hin geöffnet. Die Membran-Einheit bedeckt dann die Öffnung des Reaktorunterteils, indem die Membran der Membran-Einheit horizontal auf der Öffnung liegt. Der Reaktordeckel hat dann eine nach unten gerichtete Öffnung. Der Reaktordeckel wird dann auf das Reaktorunterteil aufgesetzt, so dass auch die Öffnung des Reaktordeckels durch die horizontale Membran bedeckt wird. Somit grenzt die Membran der Membran-Einheit den durch das Reaktorunterteil gebildete Reaktorbereich oder Reaktorraum von dem durch den Reaktordeckel gebildeten Reaktorbereich oder Reaktorraum ab.
Erfindungsgemäß bevorzugt wird der Reaktorraum also durch die in Teilbereichen flüssigkeitsdurchlässige Membran-Einheit in einen unteren Reaktorbereich und in einen oberen Reaktorbereich aufgeteilt.
Die zum Einlassen und/oder Auslassen einer Flüssigkeit geeigneten Öffnung können insbesondere zum Einlassen und/oder Auslassen des Zellkulturmediums und/oder der Enzym-haltigen Flüssigkeit verwendet werden.
Erfindungsgemäß bevorzugt wird in Schritt b) die Enzym-haltige Flüssigkeit durch die zum Einlassen und/oder Auslassen einer Flüssigkeit geeignete Öffnung des Reaktorunterteils eingeführt.
In einer erfindungsgemäßen alternativen Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren automatisiert, insbesondere in einer automatisierten Vorrichtung zum Herstellen von Gewebe aus Zellkulturen und/oder mit einem Roboter durchgeführt wird.
Erfindungsgemäß bevorzugt weist der Bioreaktor mindestens eine Belüftungsöffnung auf.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist die mindestens eine Belüftungsöffnung mit einem Sterilfilter versehen.
Erfindungsgemäß bevorzugt weist der Bioreaktor mindestens eine Pipettieröffnung auf.
Erfindungsgemäß bevorzugt weist das erste Reaktorgehäuseteil mindestens eine Pipettieröffnung auf. Erfindungsgemäß bevorzugt weist das erste Reaktorgehäuseteil eine Pipettieröffnung auf.
Erfindungsgemäß bevorzugt sind in den Bioreaktor messtechnische Vorrichtungen integriert, die die Messung von Daten, beispielsweise zur TEER-Wert-Messung, ermöglichen.
Der Bioreaktor kann wahlweise als sogenanntes Stand-Alone-Modul oder als Komponente in einem Gesamtsystem, beispielsweise zur Herstellung von Zellgewebe aus Biopsaten, eingesetzt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch den hier beschriebenen Bioreaktor.
Es kann vorgesehen sein, die Zellen nach Beendigung von Schritt b) in einem Schritt c) von der Membran zu entfernen. Beispielsweise können die Zellen in Zellkulturmedium, insbesondere in Serum-haltigem Zellkulturmedium aufgenommen und dann abgesaugt oder abpipettiert werden.
Es kann auch vorgesehen sein nach der Beendigung von Schritt b) in Schritt c) mehr Enzym-haltige Flüssigkeit einzuführen und die Zellen dadurch von der porösen Oberfläche wegzudrücken.
Es kann also eine Entfernung der Zellen von der Membran durch Verwendung eines Überdrucks, insbesondere über eine Flüssigkeit, beispielsweise der Enzym-haltigen Flüssigkeit, vorgesehen sein.
Es kann auch vorgesehen sein, dass die Zellen in Schritt c) vereinzelt werden, insbesondere mit Hilfe der Enzym-haltigen Flüssigkeit.
Als Anwendungsgebiet des erfindungsgemäßen Zellablöseverfahrens kommen insbesondere automatisierte Systeme oder andere Laborprozesse in Frage, bei denen adhärenten Zellen für eine weitere Nutzung von ihrer bisherigen Oberfläche abgelöst werden müssen. Mögliche Felder liegen beispielsweise in der automatisierten Zellexpansion von: – Verschiedenen Zelltypen zur Herstellung von künstlicher Haut als in-vitro-Testsystem oder Transplantat; – Zellen zur Herstellung von künstlichen Knorpeltransplantaten; – allgemein Zellen, die in der Zellkultur oder zum Tissue Engineering eingesetzt werden.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens bei der GMP-konformen vollautomatischen Kultivierung und Vermehrung von Zellen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung eines porösen Materials, insbesondere einer Membran, in einem erfindungsgemäßen Verfahren.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung eines Zellkulturbehälters, insbesondere einer Zellkulturschale, einer Zellkulturflasche oder einer Multiwellplatte, in einem erfindungsgemäßen Verfahren.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung eines Zellkultureinsatzes, insbesondere eines Zellkultureinsatzes mit einem Boden, der aus einem porösen Material, insbesondere einer Membran gebildet wird, in einem erfindungsgemäßen Verfahren.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung eines Bioreaktors in einem erfindungsgemäßen Verfahren.
Erfindungsgemäß bevorzugte und alternative Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren sind auch als erfindungsgemäß bevorzugte und alternative Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verwendungen und als erfindungsgemäß bevorzugte und alternative Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Vorrichtungen zu verstehen.
Besondere Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich auch aus den Unteransprüchen.
Weitere Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgend beschriebenen Figur.
1 zeigt nicht maßstäblich eine erfindungsgemäß bevorzugte Ausführungsform eines Bioreaktors (100) zum Durchführen des erfindungsgemäßen Verfahrens. Der Bioreaktor besteht aus einem Reaktorunterteil (20), einem Reaktoroberteil (30) und einer Membran-Einheit, die aus einer Membran (10) und einem Rahmen (15) gebildet wird. Reaktorunterteil (20) und Reaktoroberteil (30) haben Stützelemente (21, 31), die die Membran (10) fixieren. Reaktorunterteil (20) und Reaktoroberteil (30) sind luftdicht verbunden, so dass einzig die als Anschlüsse ausgebildeten Öffnungen (24, 34) die Reaktorkammern (22, 32) über die Leitsysteme (23, 33) mit der Umge bung des Bioreaktors (100) verbinden. Die Leitsysteme (23, 33) stellen eine kontinuierliche und gleichmäßige Versorgung der Zellwachstumsmembran über die gesamte Fläche sicher. Reaktorunterteil (20) und Reaktoroberteil (30) haben beide Elektroden (26, 36) zur Messung des TEER-Wertes von kultivierten Zellen. Über die gemessenen TEER-Werte kann der Wachstumsprozess kontrolliert und der optimale Erntezeitpunkt bestimmt werden.
Die Membran (10) hat eine Oberseite (11) und eine Unterseite (12). Bevorzugt werden adhärente Zellen auf der Membranoberseite (11) kultiviert. Dabei werden die Reaktorkammern (22, 32) über eine der Öffnungen (24, 34) mit Zellkulturmedium geflutet. Wenn die TEER-Wert-Messung über die Elektroden (26, 36) ergibt, dass eine optimale Zelldichte erreicht ist, beispielsweise dass die Zellen konfluent gewachsen sind, kann das Zellkulturmedium über die untere Öffnung (24) abgelassen werden. Durch die Öffnung (24) kann dann ein Trypsin-haltiger Puffer in den Bioreaktor (100) eingeführt werden. Es wird so viel des Puffers eingeführt, dass dieser gerade Kontakt zur Membran (10) bekommt. Dadurch werden die Zellen von der Membranoberfläche (11) abgelöst, die Zellen kommen aber nur mit ihren Membrankontaktpunkten, also den Zellausläufern, mit dem Trypsin in Kontakt, so dass sie weniger geschädigt werden als bei einem konventionellen Ablösen der Zellen. Danach kann der Puffer wieder durch die Öffnung (24) abgelassen werden. Die Zellen können abpipettiert werden oder mit Hilfe von Zellkulturmedium durch die Öffnung (34) herausgespült werden.
Es kann zum Beispiel vorgesehen sein, über das Leitsystem das Zellkulturmedium zu entfernen und beide Kammern mit PBS-/EDTA zu befüllen und für 1 bis 30 min zu inkubieren. Dieser Vorgang kann je nach Zelltyp 1 bis 2 mal wiederholt werden. Dann kann das vollständige Entleeren beider Kammern und das anschließende Befüllen der unteren Kammer mit einer Enzymlösung erfolgen. Für einen definierten Bereich von 0,2 bis 10 min und der Applikation eines definierten Druckes im Bereich von 50 bis 2000 Pa kann die Enzymlösung durch die Poren mit einem Durchmesser im Bereich von 0,1 bis 10 μm der Membran auch an die Kontaktstellen der Zellen zu der Membranoberseite geführt werden. Anschließend kann ein Inkubationsschritt mit einer Dauer im Bereich von 0,5 bis 10 min erfolgen. Zur Unterstützung des Ablösevorgangs kann anschließend, also nach dem Ablösen, ein Druck in der unteren Kammer im gleichen Druckbereich angelegt werden. Dieser kann zusätzlich mit einer Frequenz von 0,1 bis 200 Hz moduliert werden. Zusätzlich kann durch mechanische Anregung des gesamten Reaktors der Vorgang verstärkt werden. Durch die angelegten Drücke ergeben sich Volumenströme durch die Membran im Bereich von 0,5 bis 20 ml/(mincm²).
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

- WO 2004/020571 A2 [0006]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

- Hans Jürgen Boxberger: „Leitfaden für die Zell- und Gewebekultur: Einführung in Grundlagen und Techniken” Wiley-VCH, Weinheim (2006), Seiten 132 bis 135 [0007]

Claims

Verfahren zur Kultivierung von adhärenten Zellen, enthaltend die Schritte a) Kultivieren der Zellen auf einer ersten Oberfläche eines porösen Materials; b) Enzymatisches Ablösen der Zellen von der ersten Oberfläche des porösen Materials, wobei das enzymatische Ablösen durch das Kontaktieren einer zweiten Oberfläche des porösen Materials mit einer Enzym-haltigen Flüssigkeit erfolgt, und wobei die Zellen in Schritt b) nur mit ihren das poröse Material berührenden Kontaktpunkten mit der Enzym-haltigen Flüssigkeit in Kontakt kommen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das poröse Material eine Membran ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei in schritt a) die Zellen auf der Oberseite des porösen Materials kultiviert werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei in Schritt b) die Oberkante der Enzym-haltigen Flüssigkeit mit dem porösen Material in Kontakt kommt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei in Schritt b) die Oberkante der Enzym-haltigen Flüssigkeit genau auf Höhe der Oberseite des porösen Materials liegt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Enzym-haltige Flüssigkeit eine Trypsin/EDTA Lösung ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei sich das poröse Material in einem Gefäß befindet.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei in Schritt a) das poröse Material und die adhärenten Zellen in einem Zellkulturmedium eingetaucht sind und wobei in Schritt b) das Zellkulturmedium entfernt wird und die Enzym-haltige Flüssigkeit zugegeben wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei in Schritt b) die Enzym-haltige Flüssigkeit unter das poröse Material zugegeben wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Verfahren in einem Bioreaktor durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die adhärenten Zellen eukaryontische Zellen sind, insbesondere Säugetierzellen sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Verfahren automatisiert, insbesondere in einer automatisierten Vorrichtung zum Herstellen von Gewebe aus Zellkulturen und/oder mit einem Roboter durchgeführt wird.
Verwendung eines porösen Materials, insbesondere einer Membran, in einem Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche.
Verwendung eines Zellkulturbehälters, insbesondere einer Zellkulturschale, einer Zellkulturflasche oder einer Multiwellplatte, in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12.
Verwendung eines Zellkultureinsatzes, insbesondere eines Zellkultureinsatzes mit einem Boden, der aus einer Membran gebildet wird, in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12.
Verwendung eines Bioreaktors in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12.