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Viele
Zellen bzw. Gewebe, insbesondere Epithelien, werden im Organismus
an physiologischen Grenzschichten vorgefunden, die oben (luminal)
und unten (basal) unterschiedliche Milieubedingungen zeigen. Dazu
gehören
unterschiedliche Sauerstoffkonzentrationen, Stoffwechselmetabolite
sowie besondere hydrostatische und rheologische Gegebenheiten. Dies
bedeutet, dass sie in einem physiologischen Gradienten vorkommen.
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Beispielsweise
beim Testen von Substanzen im pharmakologisch/toxikologischen Bereich,
beim Erfassen von Umweltparametern und bei der Herstellung von künstlichen
Geweben (Tissue Engineering), aber auch im sonstigen Umfeld der
regenerativen Medizin werden möglichst
realitätsnahe
in vitro Bedingungen für
die Kultur in einem Gradienten benötigt. Dazu werden mit Zellen/Gewebe
Kulturexperimente in einer als Kulturcontainer verwendeten, sogenannten
Gradientenkammer durchgeführt,
wie sie beispielsweise in der
DE
29 23 279 beschrieben ist. Vorzugsweise wird dazu ein mit
den jeweiligen Zellen oder Geweben beladener mechanisch belastbarer Träger in die
Gradientenkammer eingelegt. Dadurch entstehen zwei Teilräume oder
Compartments, die dann luminal und basal mit beispielsweise auch
unterschiedlichem Medium durchströmt werden. Die jeweiligen Medien
sollen dabei die natürlichen
Bedingungen simulieren (Serum/Urin, Nahrung/Blut, Luft/Blut). Experimentell
hat sich gezeigt, dass unter den beschriebenen Bedingungen Zellen/Gewebe
mit einem besonders hohen, also histiotypischen Differenzierungsgrad
entstehen. Durch diese Technik entstehen Zellen oder Gewebe, die
im Vergleich zur herkömmlichen
Kulturtechnik mit statischem Milieu eine entscheidend verbesserte
Qualität
aufweisen. Dennoch ergeben sich bei der Kultur von Zellen oder Geweben
in einer Gradientenkulturkammer unerwartete technische Probleme.
Die alles entscheidende Bedeutung hat dabei die mechanische Fragilität von Zellen
oder Gewebe auf dem Gewebeträger.
Nur wenn alle Zellen/Gewebe intakt angesiedelt sind, kann sich eine
abdichtende physiologische Barriere ausbilden.
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Eine
Kultur in einer Gradientenkammer wird angesetzt, indem ein Träger benutzt
wird, der mit Zellen/Gewebe beladen wird und durch den die Zellen/Gewebe
eine mechanische Stütze
erhalten. Erst dann können
Zellen/Gewebe so auswachsen, dass sie eine physiologische Abdichtung
ausbilden. Dies geschieht entweder vor oder nach dem Einlegen des Gewebeträgers in
die Gradientenkammer. Nach dem Einlegen des Trägers ist eine Gradientenkammer
in ein luminales und basales Compartment geteilt, dazwischen liegt
der Gewebeträger.
Bilden sich Zellen/Gewebe optimal aus, kann Medium auf beiden Seiten
des Gewebeträgers
vorbeigeströmt
werden. Wenn keine Beschädigungen
vorhanden sind, wird sich das Medium von luminal und basal nicht
mischen. In diesem Fall ist eine physiologische Barriere ausgebildet.
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Die
Zellen/Gewebe auf der luminalen und basalen Seite der Gradientenkammer
müssen
neben Nährstoffen
mit Atemgasen versorgt werden. Dazu wird das Kulturmedium mit einer
vergleichsweise geringen Transportrate von z.B. 1ml pro Stunde in
eine Gradientenkammer eingepumpt. Hierbei bilden sich unvermeidlich
Gasblasen, die zur Beschädigung
von Zellen/Gewebe führen.
Um Beschädigungen
an Zellen/Gewebe zu vermeiden, können
die Gasblasen nicht durch eine erhöhte Transportrate des Mediums beseitigt
werden.
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Die
Anreicherung mit Atemgas geschieht in vielen Fällen durch Injektion eines
Gasgemisches in das Kulturmedium. Dadurch entstehen jedoch viele Gasblasen
im System und auch in der verwendeten Gradientenkammer. Liegen die
Gasblasen z.B. an den Zellen/Geweben, so findet keine kontinuierliche Versorgung
der Zellen/Gewebe mit Kulturmedium statt, so dass die Zellen/Gewebe
absterben. Wird ein solches mit Gasblasen angereichertes Medium
in eine Gradientenkammer gepumpt, so bilden sich dort in ganz unterschiedlicher
Verteilung immer größere Gasblasen,
die ohne zusätzliche
Maßnahmen
auch nicht kontinuierlich und gesteuert aus dem Inneren der Gradientenkammer
abgeführt
werden können. Fusionieren
die Gasblasen miteinander, so werden angrenzende Zellen/Gewebe durch
mechanische Einwirkung der Gasblasen beschädigt.
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Gasblasen
verursachen auch Druckunterschiede. Zu nicht vorhersehbaren Zeiten
werden die Gasblasen durch den Fluss des Mediums aus der jeweiligen
Kammer ausgeschwemmt. Da dies auf der luminalen bzw. basalen Seite
nicht zur selben Zeit und in gleichem Maß geschieht, befinden sich
Luftblasen in unterschiedlicher Menge in den Abflussschläuchen. Dadurch
bedingt entstehen zwischen dem luminalen und basalen Compartment
hydrostatische Druckunterschiede. Dies verursacht ebenfalls Beschädigungen
der Zellen/Gewebe, welche sich auf dem Gewebeträger zum Compartment mit niedrigerem
Druck vorwölben.
Es entstehen zuerst kleine Undichtigkeiten durch Mikroverletzungen
von Zellen/Gewebe, dann größere Beschädigungen
bis hin zum großflächigen Bersten
der Zellen/Gewebe. Dadurch ist das luminale und basale Compartment
physiologisch nicht mehr voneinander getrennt.
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Um
diesen Nachteilen zu begegnen, wurde bisher die Atemgasanreicherung
auch schon durch Diffusion über
gaspermeable, für
den Transport von Kulturmedium genutzte Silikonschläuche durchgeführt. Dabei
wird die Außenseite
des Silikonschlauches in einer entsprechenden Gasumgebung gehalten,
so dass das gewünschte
Atemgas durch den Silikonschlauch diffundieren kann und in dem vorbeiströmenden Medium
aufgenommen wird. Im Gegensatz zur Injektion von Gas wird hiermit
zwar eine exzessive Gasblasenbildung vermieden, dennoch bilden sich
bei dem in der Regel erforderlichen langsamen Transport von Kulturmedium
speziell an Materialübergängen Gasblasen,
die in nicht vorhersehbaren Zeitabständen von dem strömenden Medium
mitgeführt
werden und dadurch in die Gradientenkammer gelangen.
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Zur
Vermeidung von Gasblasen im Kulturmedium wurde auch bereits ein
Gasexpandermodul vorgeschlagen. Das Medium wird dabei durch eine Kammer
dieses Moduls geleitet und muss dort eine Barriere überwinden.
Aufgrund physikalischer Gegebenheiten trennen sich hier Gasblasen
vom Kulturmedium. Das flüssige
Medium mit reduziertem Blasengehalt, aber konstantem Atemgas wird
dann in einem Reservoir aufgefangen und in den Kulturcontainer oder
die Gradientenkammer geleitet.
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Die
experimentelle Erfahrung zeigt aber, dass trotz Diffusionsbegasung
des Mediums in Silikonschläuchen
und trotz Reduzierung in einem Gasexpandermodul Gasblasen im Gradientencontainer vorgefunden
werden. Diese entstehen häufig
erst nach Tagen und befinden sich an nicht vorhersehbaren Stellen.
Dabei kann nicht unterschieden werden, ob es sich um Gasblasen handelt,
die durch das Medium importiert wurden, oder ob derartige Gasblasen durch
das Atmen des Gewebes an dessen Oberfläche entstanden sind. Wie oben
geschildert, werden durch das Auftreten von Gasblasen Teile des
Gewebes nicht gleichmäßig mit
Medium versorgt. Zudem treten bei der Elution des Mediums Gasblasen
in abführenden
Schläuchen
auf, die im luminalen und basalen Compartment je nach Größe und Menge
zu unterschiedlichen Staudruckeffekten und damit zu Druckunterschieden
in den Compartments sowie zur Schädigung von Zellen/Gewebe führen. Diese
Gasblasen können
auch nicht durch eine erhöhte
Perfusion des Kulturmediums entfernt werden, da dadurch das Gewebe
irreversibel beschädigt
würde.
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Aufgabe
der Erfindung ist es, eine Gradientenkammer aufzuzeigen, die die
vorgenannten Nachteile vermeidet und/oder ein sauberes Arbeiten
ermöglicht.
Zur Lösung
dieser Aufgabe ist eine Gradientenkammer entsprechend dem Patentanspruch
1, 4 oder 9 ausgebildet.
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Die
Erfindung wird nachstehend an Ausführungsbeispielen erläutert. Es
zeigen:
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1 in
vereinfachter schematischer Darstellung und im Schnitt einen als
Gradientenkammer ausgebildeten Kulturcontainer gemäß der Erfindung;
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2 u. 3 in
einem Vertikalschnitt sowie in einem Schnitt entsprechend der Linie
I-I eine weitere mögliche
Ausführungsform;
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4 u. 5 Darstellungen ähnlich den 2 und 3 bei
einer weiteren möglichen
Ausführungsform;
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6 eine
Darstellung ähnlich 1 bei
einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung.
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Die
in der 1 allgemein mit 1 bezeichnete, beispielsweise
quader- oder würfelförmige Gradientenkammer
ist im wesentlichen zweiteilig ausgebildet, d. h. sie besteht aus
einem in dieser Figur unteren Kammerelement 2 und aus einem
oberen, deckelartigen Kammerelement 3. Beide schalenförmigen Kammerelemente 2 und 3 sind
jeweils mit einer Ausnehmung derart versehen, dass sich diese Ausnehmungen
bei geschlossener Gradientenkammer 1, d. h. bei auf das
untere Kammerelement 2 aufgesetztem oberen Kammerelement 3 zu
einem nach außen
hin dicht verschlossenen Kammerinnenraum ergänzen. Beide Kammerelemente 2 und 3 weisen hierfür jeweils
eine Ringdichtung 4 bzw. 5 auf. Durch ein nicht
dargestelltes Befestigungs- und Verbindungselement sind die beiden
Kammerelemente 2 und 3 lösbar miteinander verbunden.
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Zwischen
den beiden Kammerelementen 2 und 3 ist ein Zell-
bzw. Gewebeträger 6 vorgesehen, durch
den der Innenraum der Gradientenkammer 1 in ein unteres
(basales) Compartment 2.1 und ein oberes (luminales) Compartment 3.1 unterteilt
wird. Zum Zuführen
und Abführen
von Kulturmedium besitzt das untere Compartment 2.1 an
seinem Umfang die Anschlüsse 7 bzw. 8 und
das obere Compartment 3.1 die Anschlüsse 9 und 10.
Die Anschlüsse 7–10 sind so
vorgesehen, dass ihre Achsen in einer gemeinsamen Ebene liegen,
die senkrecht zur Ebene des Trägers 6 orientiert
ist und auch den Mittelpunkt des kreisscheibenförmigen Trägers 6 einschließt.
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Bei
der dargestellten Ausführungsform
liegt bei geschlossener Gradientenkammer das untere Kammerelement 2 und
das obere Kammerelement 3 jeweils mit einer Dichtung 4 bzw. 5 gegen
den Rand des Trägers 6 an,
wodurch nicht nur die beiden Compartments 2.1 und 3.1 voneinander
getrennt, sondern auch die Gradientenkammer nach außen hin
dicht verschlossen ist.
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Um
eine die Zellen/Gewebe auf dem Träger 6 schädigende
Gasblasenbildung aufgrund von mit dem Kulturmedium mitgeführtem Gas
oder von den Zellen/Geweben erzeugten Gasen in den Compartments 2.1 und 3.1 sowie
in den Anschlüssen 8 und 10 und
in mit diesen verbundenen Leitungen (Schlauchleitungen) zu vermeiden,
ist die Gradientenkammer 1 auf einer Halterung 12 befestigt,
die durch einen nicht dargestellten motorischen Antrieb um eine
horizontale Achse 13 senkrecht zu den Achsen der Anschlüsse 7–10 schwenkbar
ist, und zwar zwischen einer Normallage, in der der Träger 6 sowie die
Trennebene E zwischen den beiden Kammerelementen 2 und 3 in
einer horizontalen Ebene angeordnet sind, und einer Schwenk- oder
Entgasungsstellung, in der Träger 6 sowie
die Trennebene E gegenüber
der Horizontalen Ebene geneigt sind, beispielsweise um 90°, und in
der sich die die Auslässe
bildenden Anschlüsse 8 und 10 oberhalb
des jeweiligen Compartments 2.1 und 3.1 befinden.
Bereits entstandene, kleine Luftblasen 11 können dann
in der Entgasungsstellung problemlos über die Anschlüsse 8 bzw. 10 und über die
an diese angeschlossenen Schlauchleitungen abgeführt werden, bevor es zur Bildung
größerer, die
Zellen/Gewebe schädigender Gasblasen
kommt. Das Schwenken des Trägers 12 mit
der an diesem Träger
befestigten Gradientenkammer 1 erfolgt beispielsweise zeitgesteuert
derart, dass der Träger 12 periodisch
jeweils nach einem bestimmten Zeitintervall aus der Normallage kurzzeitig in
die Entgasungsstellung und aus dieser dann wieder zurück in die
Normallage geschwenkt wird.
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Die 2 und 3 zeigen
eine Gradientenkammer 1a, die wiederum quaderförmig ausgebildet
ist und aus den beiden Kammerelementen 2a und 3a besteht,
deren Ausnehmungen sich bei geschlossener Gradientenkammer 1a zu
einem nach außen hin
abgedichteten Innenraum ergänzen.
Zwischen den beiden Kammerelementen 2a und 3a ist
wiederum der Zell- oder Gewebeträger 6 vorgesehen,
der dann den Innenraum der Gradientenkammer 1a in die beiden
Compartments 2.1 und 3.1 unterteilt.
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Die
Besonderheit der Gradientenkammer 1a besteht darin, dass
diese so verwendet wird, dass der Träger 6 und die Trennebene
E vertikal angeordnet sind. Die zum Zuführen des Kulturmediums dienenden
Anschlüsse 7 und 9 münden dabei
unten und die zum Abführen
des Kulturmediums dienenden Anschlüsse 8 bzw. 10 oben
in das jeweilige Compartment 2.1 bzw. 3.1, sodass
in dem jeweiligen Compartment entstehende und im Kulturmedium nach oben
wandernde kleinere Gasblasen 11 über die Anschlüsse 8 bzw. 10 problemlos
abgeführt
werden, bevor sich größere Gasblasen
bilden können.
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Wie
in den 2 und 3 angedeutet, besitzt jedes
Compartment dort, wo der Anschluss 8 bzw. 10 in
dieses Compartment mündet,
eine domartige Erweiterung bzw. einen Sammelraum 14, in
welchem sich im Compartment entstehende Gasblasen für das Abführen über den
Anschluss 8 bzw. 10 sammeln können.
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Die 4 und 5 zeigen
in Darstellungen ähnlich
den 2 und 3 als weitere mögliche Ausführungsform
der Erfindung eine Gradientenkammer 1b, die sich von der
Gradientenkammer 1a im Wesentlichen nur noch dadurch unterscheidet,
dass an den Sammelräumen 14 jeweils
eine von einem hydrophoben Filter gebildete Gasfalle 15 vorgesehen ist,
welche für
Gase durchgängig
ist, Flüssigkeit
aber zurückhält. Die
Gasfalle 15 kann weiterhin auch dazu benutz werden, um
durch kontrolliertes Öffnen
dieser Fallen das jeweilige Medium sanft und somit ohne Beschädigung der
Zellen/Gewebe abfließen
zu fassen.
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Die 6 zeigt
in einer Darstellung ähnlich 1 als
weitere mögliche
Ausführungsform
eine Gradientenkammer 16, die wiederum aus einem unteren,
einem Kammerelement 2 entsprechenden Kammerelement 17 und
aus einem oberen, dem Kammerelement 3 entsprechenden Kammerelement 18 besteht.
Beide Kammerelemente besitzen am Umfang Anschlüsse 19 und 20 bzw. 21 und 22 zum Zuführen und
Abführen
von Kulturmedium. Weiterhin sind die beiden Kammerelemente so ausgebildet, dass
zwischen diesen wiederum der Träger 6 angeordnet
werden kann, und zwar derart, dass die dem Kammerelement 8 hinzugewandte
Oberseite des Trägers 6 bündig mit
der Trennebene E liegt, an der die beiden Kammerelemente 17 und 18 bei
geschlossener Gradientenkammer 16 aneinander anschließen, vorzugsweise
liegt der Träger 6 mit
seiner Oberseite etwas tiefer als die Ebene E innerhalb der im Kammerelement 17 gebildeten
Ausnehmung. Durch den Träger 6 wird
der Innenraum der Gradientenkammer 16 wiederum in das untere
Compartment 17.1 und das obere Compartment 18.1 unterteilt.
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Eine
weitere Besonderheit der Gradientenkammer 16 besteht darin,
dass das Kammerelement 17 an seinem die Öffnung der
Ausnehmung in diesem Kammerelement umschließenden Rand eine umlaufende
rinnenartige Nut oder Vertiefung 23 aufweist, die z.B.
beim Öffnen
der Gradientenkammer 16 einen im oberen Compartment 18.1 noch
vorhandenen Rest des luminalen Kulturmediums aufnehmen kann, der
dann beispielsweise kontrolliert abfließen kann. Hierdurch wird ein
besonders sauberes Arbeiten mit der Gradientenkammer 16 möglich.
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Ist
die Gradientenkammer 16 wieder so ausgeführt, dass
sowohl das Kammerelement 17 als auch das Kammerelement 18 jeweils
mit einer Ringdichtung gegen den äußeren Rand des Trägers 6 anliegt,
wie dies mit der Ringdichtung 24 bzw. 25 angedeutet
ist, so dient die rinnenartige Vertiefung 23 auch dazu,
eventuell durch eine Leckage austretendes Kulturmedium aufzufangen
und gezielt abzuleiten und dadurch zu verhindern, dass dieses Medium durch
den weiter außenliegenden
Spaltbereich zwischen den Kammerelementen 17 und 18 an
die Außen-
bzw. Umfangsfläche
der Gradientenkammer 16 gelangt. Die Vertiefung 23 befindet
sich dabei außerhalb
des von den Ringdichtungen 24 und 25 umflossenen
Bereichs.
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Die
beschriebenen Gradientenkammern 1, 1a, 1b und 16 bzw.
deren Kammerelemente bestehen beispielsweise aus einem Kunststoffmaterial,
bevorzugt aus einem durchscheinenden oder transparenten Kunststoffmaterial.
Weiterhin ist es auch möglich,
sämtliche
Kammerelemente oder nur einzelne Kammerelemente ganz oder teilweise
auch aus Glas zu fertigen, sodass die betreffende Gradientenkammer
dann auch für
die Mikroskopie geeignet ist.
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Die
beschriebenen Gradientenkammern eignen sich u. a.
- – zur Generierung
von Zellen/Geweben/Organoiden beim Tissueengineering
- – für Untersuchungen
zur Entwicklung von Strukturen
- – zum
Testen von Biomaterialien, z.B. Membranen oder Scaffolds im Langzeitversuch
mit angesiedelten Zellen/Geweben
- – zum
Testen von Medikamenten/Drogen unter realitätsnahen Bedingungen
- – für toxikologische
Untersuchungen, chronische Intoxikation
- – zum
Testen von Umwelteinflüssen
im Langzeitversuch
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Die
Erfindung wurde voranstehend an Ausführungsbeispielen beschrieben.
Es versteht sich, dass zahlreiche Änderungen sowie Abwandlungen möglich sind,
ohne das dadurch der der Erfindung zugrunde liegende Erfindungsgedanke
verlassen wird.
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- 1,
1a, 1b
- Gradientenkammer
- 2,
2a, 3, 3a
- Kammerelement
- 2.1
- basales
Compartment
- 3.1
- luminales
Compartment
- 4,
5
- Ringdichtung
- 6
- Zell-Gewebe-Träger
- 7,
8, 9, 10
- Anschluss
- 11
- Gasblase
- 12
- Halter
- 13
- Schwenkachse
- 14
- Sammelraum
- 15
- Gasfalle
- 16
- Gradientenkammer
- 17,
18
- Kammerelement
- 17.1
- basales
Compartment
- 18.1
- luminales
Compartment
- 19,
20, 21, 22
- Anschluss
- 23
- Rinne
- 24,
25
- Ringdichtung