CN110004056A - 一种用于组织工程反应器的细胞量和细胞活性检测方法和检测腔装置 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于组织工程反应器的活细胞检测方法及检测腔装置，其优点在于可在不损伤细胞活性及功能，不中断培养过程的前提下检测组织工程生物反应器中组织培养物的细胞生长情况。其中活细胞检测腔是由石英构成的腔体，其上部的盖子通过一个密封圈和四个紧固螺丝与腔体连接成密封的容器，在不进行检测时该容器作为组织培养腔存在。腔内有组织培养物与检测腔上部的进出口接头相连接，进而与上下游的管路相连。在进行检测时反应液在检测腔内与组织植入物上的活细胞反应，检测腔内没有液体进出，反应产物不会在流路中被稀释，即使在细胞量较少时也有较强的信号。在检测腔的底部有一个磁力搅拌转子，通过旋转磁力搅拌转子在测量检测腔内反应液的吸光度值前对检测腔内的液体进行充分混合。

Description

一种用于组织工程反应器的细胞量和细胞活性检测方法和检 测腔装置

技术领域

本发明涉及组织工程、再生医学领域，更具体地涉及一种能够检测组织工程生物反应器中组织培养物或组织植入物上细胞量和细胞活性的检测装置及检测方法，用于在线定时或连续定量检测组织培养过程中细胞在某一个特定的组织工程支架或组织植入物上生长和存活的真实情况，评估组织培养中细胞生长与存活的影响因素，对样品进行质量控制。

背景技术

组织工程技术的一个重要应用就是体外构建组织植入物，即用组织工程方法体外构建组织植入物是将体外培养的种子细胞，接种于天然或人工合成的组织工程支架上，在体外培养后，再移植到体内，以替代病损的组织。组织工程技术的发展为先天性疾病和获得性疾病的治疗创造了前所未有的机会。

组织植入物上的活细胞量是一个非常重要的参数，它是分析细胞生长、存活和代谢的基础，是控制组织培养过程的首要参数，也是评估组织植入物是否具有生理功能的重要指标。在组织植入物的培养过程中，经常需要及时地、定量地了解细胞的生长情况，以便对培养过程进行监控。

但是目前的组织工程反应器缺乏能够对培养中的组织培养物进行在线、连续、定量检测的装置，在组织培养中大多数情况下只能对细胞在组织植入物上的生长情况进行非连续的、非动态的终点检测，而不能进行连续的、动态的检测。如果要连续观察细胞生长及存活情况，需要同时培养大量样品，在培养过程中取出培养物进行终点检测。这会造成支架、种子细胞、培养基及培养设备的大量浪费。对于种子细胞稀缺、培养过程复杂、培养困难的组织培养过程，受到培养规模的限制，培养过程中细胞生长和存活的连续检测和评估就更加难以实现。因此，在组织工程领域迫切需要建立简单快速、能够在不损伤细胞活性及生理功能，不中断培养过程的前提下进行活细胞定量的检测装置和检测方法。

中国专利(ZL201210579150.3)公开了一种用于组织工程反应器的活细胞检测装置及检测方法，该装置具有一个与组织培养回路相并联的检测回路和一个与组织培养回路相并联的冲洗回路，能够在不中断培养过程的情况下检测细胞活性和细胞生长情况，并且能够及时去除检测试剂对细胞的危害。其缺点在于检测中涉及到的流路过长，造成流路中的反应液体积过大，当组织植入物上细胞量较少时，少量的反应产物被大量的反应液稀释，信号变化非常小，难于检测到。

本发明的目的在于提供了一种能够在线的、定时或连续的、定量的检测组织工程反应器中培养的组织植入物上细胞活性和生长情况的装置和相应的检测方法。与现有技术相比，本发明的优点在于该装置具有一个有组织培养物的、具有良好传质功能的检测腔，和一个与组织培养回路相并联的冲洗回路，能够在不中断培养过程的情况下检测细胞活性和细胞生长情况，并且能够及时去除检测试剂对细胞的危害；第二个优点是本发明公开的检测装置的反应腔和流路的体积小，在反应器内或组织培养物上细胞量较少时也能产生较强的检测信号，适用于细胞量少的情况。第三个优点是该装置和方法简单有效容易实施，对组织培养设备和检测设备的要求也不高。其实施效果在于能够实现组织培养过程中细胞生长的可控化、可监测化，有利于为组织植入物的临床应用、制定相关的GLP和GMP规范提供依据。

发明内容

根据本发明的一个方面，提供了一种能够在线地、定时或连续地、定量地检测组织工程反应器中培养的组织植入物上细胞活性和生长情况的装置，其特征在于包括：一个有组织培养物的检测腔、在检测腔底部有磁力搅拌子，在测量检测腔内反应液的吸光度值前对检测腔内的液体进行充分混合；一个与组织工程反应器的培养回路并联的检测/冲洗回路，检测/冲洗回路通过阀门和管路组合在一起，并通过阀门开闭控制检测和冲洗流路的切换。

所述的检测腔是一个由石英构成的容器，检测腔的上部与培养回路相连，组织培养物在检测腔内培养，检测腔的下部有磁力搅拌转子，在测量检测腔内反应液的吸光度值前磁力搅拌转子旋转使检测腔内的反应液混合均匀，从而保证检测时光线穿过的液体是均一的，使检测器能检测到检测腔中光吸收值的真实变化。从光源灯发出的连续辐射光线，通过会聚及滤光处理后进入检测腔中部，检测腔的中部只有均一的反应液存在，没有其他物体如组织培养物、磁力搅拌转子阻碍光透过检测腔。透过检测腔的光进入光电管，产生相应的光电流，经放大后在微安表上读出。

所述的由石英构成的检测腔，可以是一个长1-5cm、宽0.1-2cm、高1-5cm的，由石英构成的腔体，和一个顶部的盖子构成的长方体容器，上部的盖子通过一个密封圈和四个紧固螺丝与腔体连接成密封的容器，在不进行检测时该容器作为组织培养腔存在：腔内有组织培养物与检测腔上部的进出口接头相连接，接头以密封的方式固定在检测腔的上部，接头的一端连接组织培养物，另一端分别与上下游的管路相连。在进行检测时反应液在检测腔内与组织植入物上的活细胞反应，检测腔内没有液体进出，反应产物不会在流路中被稀释，即使在细胞量较少时(500-1000个细胞/组织培养物)也有较强的信号。在检测腔的底部有一个磁力搅拌转子，通过旋转磁力搅拌转子在测量检测腔内反应液的吸光度值前对检测腔内的液体进行充分混合。

所述的由石英构成的检测腔，可以是一个不规则形状的容器，其上部的形状与组织培养物的形状和大小相适应，其中部是由两层平行的石英构成长方体腔体，平行的石英壁之间的距离为0.1-2cm，中间充满反应液，检测光透过检测腔中部平行的石英壁及检测液进入光电管，产生相应的光电流，经过放大后再微安表上读出。在检测腔的底部有一个磁力搅拌转子，通过旋转磁力搅拌转子在测量检测腔内反应液的吸光度值前对检测腔内的液体进行充分混合。

所述的与组织工程反应器的培养回路并联的检测/冲洗回路，包括一个检测液储液瓶，一个冲洗液储液瓶，一个设置在检测液储液瓶、冲洗液储液瓶和连接有组织培养物的检测腔之间的液体驱动泵，和一个设置在检测腔下游的废液瓶。检测液储液瓶、冲洗液储液瓶和废液瓶通过三通阀连接到流路上，通过三通阀的开闭切换检测和冲洗流路。在检测过程中，关闭冲洗液储液瓶和废液瓶的三通阀，打开检测液储液瓶的三通阀，恒流泵驱动检测液在由检测液储液瓶和检测腔构成的封闭的回路中循环；待回路中充满均一的检测液后，关闭恒流泵和检测液储液瓶的三通阀，进行反应和检测；在检测结束后，关闭检测液储液瓶，打开冲洗液储液瓶和废液瓶的三通阀，恒流泵驱动冲洗液从冲洗液储液瓶流经连接有组织培养物的检测腔，流入废液瓶，完成对检测回路的冲洗；关闭检测/冲洗回路的恒流泵和三通阀，继续组织培养过程。

本发明的另一个方面，提供了一种能够在线地、定时或连续地、定量地检测组织工程反应器中培养的组织植入物上细胞活性和生长情况的方法，其特征在于包括：

1、关闭组织培养回路上下游

2、切换至冲洗流路；

3、冲洗组织培养物；

4、关闭冲洗流路，开启检测流路；

5、将检测试剂注入到检测腔内；

6、让检测试剂在检测流路中循环，检测初始状态的光密度或荧光强度作为初始值(参比)；

7、关闭检测/冲洗回路的恒流泵，关闭检测液储液瓶的三通阀，让检测试剂在检测腔中反应至规定的时间；

8、使磁力搅拌转子旋转，使检测腔中的反应液混合均匀；

9、检测反应结束时检测腔内反应液的光密度或荧光强度，将检测到的信号与参比对照，计算活细胞量；

10、切换至冲洗回路

11、冲洗组织培养物；

12、关闭冲洗回路，切换至培养回路，继续组织培养。

在一个实施方案中，所述的反应试剂可以是对细胞无毒或低毒的试剂包括：含有刃天青(Resazurin)染料的试剂如Alamar Blue，含有二乙酰荧光素(FDA)染料的试剂，含有乳酸脱氢酶的试剂，含有氟衍生物(fluo derivative)、呋喃衍生物(fura derivative)、吲哚衍生物(indo derivate)、rhod-2、钙绿和quin-2组成的试剂。

在一个实施方案里所述的组织培养物111上的细胞包括：原代培养的各种组织细胞、连续培养的细胞系、具有多种分化潜能或单一分化潜能的干细胞。这些细胞生长在组织工程支架上或微载体上。

附图说明

图1示意显示了根据本发明的一个实施例的活细胞检测装置的结构，其中包括培养回路、检测/冲洗回路和检测原件；

图2示意显示了根据本发明的一个实施例的用于组织工程反应器的活细胞检测装置中检测腔的结构；

图3示意显示了根据本发明的一个实施例的用于组织工程反应器的活细胞检测装置中不规则形状的检测腔的结构；

图4示意显示了根据本发明的一个实施例的三通阀的结构和流路方向的切换；

具体实施方式

如图1所示，根据本发明的一个实施例的一种用于组织工程反应器的活细胞检测装置包括一个与组织培养回路并联的检测/冲洗回路包括：一个冲洗液储液瓶101，一个冲洗液储液瓶三通阀102，一个液体驱动泵103，一个位于培养回路上游的三通阀104，一个检测腔105，组织培养物111、一个位于培养回路下游的三通阀106，一个废液瓶三通阀108，一个废液瓶109，一个检测液储液瓶113，一个检测液储液瓶三通阀114，检测/冲洗液管路110把上述部件连接成一个回路。用于在检测之前冲洗组织培养物111及检测回路，去除影响检测反应的培养液；或在检测活细胞量之后冲洗洗组织培养物111及检测回路，去除检测液，消除检测液长期存在对细胞的影响。

所述的三通阀用于控制流路或流路组件的开闭，从而完成流路的切换。其中所述的三通阀104和106分别位于检测腔105的上下游，完成流路在组织培养回路112与检测或冲洗回路之间的切换；三通阀102位于冲洗液储液瓶上游，用于控制冲洗液储液瓶的开闭。

所述的液体驱动泵103设置在冲洗液储液瓶101和检测腔105之间，用于驱动液体从冲洗液储液瓶101流经检测腔105，流入废液瓶109，完成对组织培养物的冲洗。

在冲洗的具体实施过程中：

(1)旋转三通阀102至冲洗液储液瓶101和液体驱动泵103之间流路畅通；旋转三通阀104至液体驱动泵103、检测腔105之间流路畅通，组织培养回路112上游与检测腔105之间流路关闭；旋转三通阀106至检测腔105之间流路畅通，检测腔105组织培养回路112下游之间流路关闭；旋转三通阀108至检测腔107与废液瓶109之间流路畅通。

(2)开启液体驱动泵103，使冲洗液逐渐替换流路的其它液体，直至冲洗液完全充满流路，在此过程中液体流入废液瓶109。

在检测的具体实施过程中：

一个检测液储液瓶113，一个检测液储液瓶三通阀114，一个液体驱动泵103，一个三通阀104，一个检测腔105，组织培养物111，一个三通阀106，一个废液瓶三通阀108，一个废液瓶109，管路110把上述部件连接成一个回路，检测器107进行检测并处理和输出数据。三通阀114位于检测液储液瓶113和液体驱动泵103之间，完成流路在检测/冲洗流路之间的切换；三通阀104和106分别位于组织培养腔105的上下游，完成流路在组织培养回路与检测或冲洗流路之间的切换。

(1)旋转三通阀114至检测液储液瓶113和液体驱动泵103之间流路畅通，检测液储液瓶113和废液瓶109之间流路关闭，旋转三通阀104至液体驱动泵103、检测腔105之间流路畅通，组织培养回路112上游与检测腔105之间流路关闭；旋转三通阀106至检测腔105与检测液储液瓶113之间流路畅通，检测腔105与组织培养回路112下游之间流路关闭；旋转三通阀108至检测腔107与废液瓶109之间流路畅通，废液瓶109与检测液储液瓶113之间流路关闭。

(2)开启液体驱动泵103，使检测液逐渐替换流路的其它液体，直至检测液完全充满流路，在此过程中液体流入废液瓶109。

(3)旋转三通阀114至检测液储液瓶113关闭，旋转三通阀108至废液瓶109关闭，关闭驱动泵103，使得在规定的反应时间内检测腔内的检测剂与组织植入物上的细胞充分反应。在进行检测时检测腔内没有液体进出，反应产物不会在流路中被稀释，即使在细胞量较少时(500-1000个细胞/组织培养物)也有较强的信号。

其中所述的管路110是由无毒的、能够耐受湿热灭菌或化学灭菌如环氧乙烷、酒精灭菌的软管或硬管组成，管子的直径在0.1mm到3mm之间。

其中所述的检测器107是可进行荧光、吸光度、或化学发光检测的设备模块。

其中所述的检测液可以是对细胞无毒或低毒的试剂包括：含有刃天青(Resazurin)染料的试剂如Alamar Blue，含有二乙酰荧光素染料的试剂，含有乳酸脱氢酶的试剂，含有氟衍生物(fluo derivative)、呋喃衍生物(fura derivative)、吲哚衍生物(indo derivate)、rhod-2、钙绿和quin-2组成的试剂。并且检测液含有对应的组织细胞维持代谢必需的营养物质和pH环境，例如与待测细胞培养条件一致的细胞培养液或D-Hanks液、PBS液等，并且这些物质不影响检测反应的进行和信号的检测。

其中所述的组织培养物是具有液体通透性的组织工程支架或组织植入物，细胞可在其上生长。

所述的反应时间为0.5-4小时；所述的反应信号包括：吸光度、荧光强度、化学发光强度等；所述的信号检测包括在反应期间连续检测通过检测腔的信号变化，或者只检测反应终点时检测腔的信号。

如图2所示，根据本发明的一个实施例的一种用于组织工程反应器的活细胞检测装置，其中检测腔，包括：一个长1-5cm、宽0.1-2cm、高1-5cm的，由石英构成的检测腔体201，和一个顶部的盖子202构成的长方体容器，盖子202，通过一个密封圈203和四个紧固螺丝204与腔体201连接成密封的容器，在不进行检测时该容器作为组织培养腔存在：腔内有组织培养物111，与检测腔上部的接头206/207相连接，接头206/207以密封的方式固定在检测腔体201的上部，接头206/207的一端连接组织培养物，另一端分别与上下游的管路相连。在进行检测时反应液在检测腔内与组织植入物111上的活细胞反应，检测腔内没有液体进出，反应产物不会因流路存在而被稀释，即使在细胞量较少时也有较强的信号。在检测腔的底部有一个磁力搅拌转子208，通过旋转磁力搅拌转子208在测量检测腔内反应液的吸光度值前对检测腔内的液体进行充分混合。

如图3所示，根据本发明的一个实施例的一种用于组织工程反应器的活细胞检测装置，其中具有不规则形状的检测腔，其特征在于：检测腔上部的形状与组织培养物的形状和大小相适应(如图3所示检测腔上部为圆柱体，以适应血管等官腔状组织的形状和大小)，检测腔中部是由两层平行的石英构成长方体腔体，平行的石英壁之间的距离为0.1-2cm，中间充满反应液，检测光透过检测腔中部平行的石英壁及检测液进入光电管，产生相应的光电流，经过放大后再微安表上读出。在检测腔的底部有一个磁力搅拌转子，通过旋转磁力搅拌转子在测量检测腔内反应液的吸光度值前对检测腔内的液体进行充分混合。

如图4所示，根据本发明的一个实施例的三通阀，通过三通阀内部阀芯的旋转，控制液体流路在两个或三个方向上畅通，从而完成流路的切换。

值得注意的是，也可以用在回路上设置两个两通阀来代替所述的三通阀，只要其能够完成相应的流路切换的过程。

实施例1在组织培养过程中检测培养的血管组织上的活细胞量

(1)旋转三通阀切换流路，使检测腔105上下游的组织培养回路关闭，检测剂储液瓶113关闭，冲洗回路畅通；

(2)开启恒流泵103，使冲洗液从冲洗液储液瓶101流出，流经检测腔105，再流入废液瓶109，从而完成对组织培养腔及培养物中溶液的置换，排除培养液中物质(如脱落细胞等)对检测的干扰；

(3)冲洗完成后，旋转三通阀切换流路，使冲洗液储液瓶101关闭，检测液储液瓶113通畅，开启恒流泵103，使检测液从检测液储液瓶流出，流经检测腔105，再流入废液瓶109，从而完成检测液对组织培养腔及培养物中冲洗液的置换，使整个检测回路中的液体为浓度均一的，未经稀释的检测液；

(4)旋转三通阀切换流路，使废液储液瓶109关闭，关闭驱动泵103，使得在规定的反应时间内检测腔内的检测剂与组织植入物上的细胞充分反应。

(5)检测反应初始时刻的通过检测器的反应信号作为初始信号。在反应结束时，通过旋转磁力搅拌转子在测量检测腔内反应液的吸光度值前对检测腔内的液体进行充分混合，检测器检测反应信号。

(6)在反应结束后，将三通阀切换至洗液回路畅通；

(7)开启恒流泵103，使冲洗液从冲洗液储液瓶101流出，流经检测腔105，再流入废液瓶109，从而完成对组织培养腔及培养物的冲洗。

(8)关闭恒流泵103，旋转三通阀关闭检测回路上下游，切换至培养回路，使培养回路畅通；继续组织培养。

实施例2在组织培养过程中检测培养的血管组织上较少的活细胞量

检测步骤同实施例1，检测腔为如说明书附图3所示的不规则形状，其中检测腔中部长3cm，宽0.2cm，高3cm，可检测到最低1000个活细胞的反应信号变化。

Claims (7)

1.一种用于组织工程反应器的活细胞检测装置，具有以下特征：

所述的活细胞检测装置包括一个有组织培养物的检测腔:

所述的检测腔是由一个石英构成的腔体和一个顶部的盖子构成的容器，上部的盖子通过一个密封圈和四个紧固螺丝与腔体连接成密封的容器，在不进行检测时该容器作为组织培养腔存在。

所述的腔内有组织培养物与检测腔上部的进出口接头相连接，接头以密封的方式固定在检测腔的上部，接头的一端连接组织培养物，另一端分别与上下游的管路相连。在进行检测时反应液在检测腔内与组织植入物上的活细胞反应，检测腔内没有液体进出，反应产物不会在流路中被稀释，即使在细胞量较少时也有较强的信号。

所述的活细胞检测装置包括一个与组织工程反应器的培养回路并联的检测/冲洗回路：包括一个检测液储液瓶，一个冲洗液储液瓶，一个设置在检测液储液瓶、冲洗液储液瓶和连接有组织培养物的检测腔之间的液体驱动泵，和一个设置在检测腔下游的废液瓶。检测液储液瓶、冲洗液储液瓶和废液瓶通过三通阀连接到流路上，通过三通阀的开闭切换检测和冲洗流路。在检测腔上下游通过三通阀并联连接培养回路和检测/冲洗回路。

2.根据权利要求1所述的一种用于组织工程反应器的活细胞检测装置，其特征在于检测腔可以是一个长方体容器，其长1-5cm、宽0.1-2cm、高1-5cm，由石英构成，其顶部有一个盖子。

3.根据权利要求1所述的一种用于组织工程反应器的活细胞检测装置，其特征在于检测腔可以是一个不规则形状的容器，其上部的形状与组织培养物的形状和大小相适应，其中部是由两层平行的石英构成长方体腔体，平行的石英壁之间的距离为0.1-2cm，中间充满反应液，检测光透过检测腔中部平行的石英壁及检测液进入光电管，产生相应的光电流，经过放大后再微安表上读出。

4.根据权利要求1所述的一种用于组织工程反应器的活细胞检测装置，其特征在于检测腔的底部有一个磁力搅拌转子，通过旋转磁力搅拌转子在测量检测腔内反应液的吸光度值前对检测腔内的液体进行充分混合。

5.根据权利要求1所述的一种用于组织工程反应器的活细胞检测装置，其特征在于进一步包括一个与组织工程反应器的培养回路并联的检测/冲洗回路：包括一个检测液储液瓶，一个冲洗液储液瓶，一个设置在检测液储液瓶、冲洗液储液瓶和连接有组织培养物的检测腔之间的液体驱动泵，和一个设置在检测腔下游的废液瓶。检测液储液瓶、冲洗液储液瓶和废液瓶通过三通阀连接到流路上，通过三通阀的开闭切换检测和冲洗流路。

6.根据权利要求1所述的一种用于组织工程反应器的活细胞检测装置，检测组织工程生物反应器中组织植入物上细胞生长及细胞活性的方法，其特征在于包括：

(1)、关闭组织培养回路上下游

(2)、切换至冲洗流路；

(3)、冲洗组织培养物；

(4)、关闭冲洗流路，开启检测流路；

(5)、将检测试剂注入到检测腔内；

(6)、让检测试剂在检测流路中循环，检测初始状态的光密度或荧光强度作为初始值(参比)；

(7)、关闭检测/冲洗回路的恒流泵，关闭检测液储液瓶的三通阀，让检测试剂在检测腔中反应至规定的时间；

(8)、使磁力搅拌转子旋转，使检测腔中的反应液混合均匀；

(9)、检测反应结束时检测腔内反应液的光密度或荧光强度，将检测到的信号与参比对照，计算活细胞量；

(10)、切换至冲洗回路

(11)、冲洗组织培养物；

(12)、关闭冲洗回路，切换至培养回路，继续组织培养。

7.根据权利要求1所述的一种用于组织工程反应器的活细胞检测装置，其特征在于所述的检测液可以是对细胞无毒或低毒的试剂包括：含有刃天青(Resazurin)染料的试剂如Alamar Blue，含有二乙酰荧光素染料的试剂，含有乳酸脱氢酶的试剂，含有氟衍生物(fluoderivative)、呋喃衍生物(fura derivative)、吲哚衍生物(indo derivate)、rhod-2、钙绿和quin-2组成的试剂。并且检测液含有对应的组织细胞维持代谢必需的营养物质和pH环境，例如与待测细胞培养条件一致的细胞培养液或D-Hanks液、PBS液等，并且这些物质不影响检测反应的进行和信号的检测。