WO2013117193A1 - Stimulationszelle und verfahren zur in vitro stimulation von zellen oder geweben - Google Patents

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WO2013117193A1
WO2013117193A1 PCT/DE2013/100047 DE2013100047W WO2013117193A1 WO 2013117193 A1 WO2013117193 A1 WO 2013117193A1 DE 2013100047 W DE2013100047 W DE 2013100047W WO 2013117193 A1 WO2013117193 A1 WO 2013117193A1
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cell
stimulation
carrier
cells
tissue
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PCT/DE2013/100047
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Holger Lausch
Michael Brand
Michael Arnold
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Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e. V.
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
    • C12M35/02—Electrical or electromagnetic means, e.g. for electroporation or for cell fusion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
    • C12M21/08—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses for producing artificial tissue or for ex-vivo cultivation of tissue
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    • C12M23/34—Internal compartments or partitions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
    • C12M35/06—Magnetic means

Definitions

  • the invention relates to a stimulation cell and a method for in vitro stimulation of cells or tissues.
  • Bioreactors have been developed, modified and patented since the nineties of the last century as part of the so-called tissue management. These were mainly characterized by the use of fluidics or microfluidics, which attempt to reproduce the otherwise lacking nutrient, active and signaling supply virtually in vitro and thus also implement signal transduction and taxies. The fluidics became particularly important for the cellular colonization of scaffolds.
  • the inherent stimulation principle consists of mechanotransducing effects derived from the fluidic process at the scaffold.
  • a method for influencing growth, division and differentiation of cells in a culture container in which electric dipole moments of the cells are used in the sense of a spontaneous polarization via the application of electrical DC fields, changeable in direction and strength , In addition to the change in the applied DC field and the electrical surface potential should be changeable.
  • the device for this purpose is based on two parallel, planar plate electrodes, which are electrically insulated from the culture medium or electrically conductive. The area of the plate electrodes corresponds to the base area or at least one inner wall surface of the culture container.
  • the device is used to produce biotechnologically and biomedically important cells, tissues, organs and unicellular organisms as well as biosensors. A spatially directed development of cells or tissues and a colonization of degradable and non-degradable implant surfaces and tissue substitutes is not provided.
  • Electrodes In numerous scientific works electrical arrangements, z.T. in the form of chambers, with cells and / or microorganisms, which have an analysis of the corresponding influences of electric fields and / or currents to object. Common to them are usually static, invariable arrangements of electrodes, which can only be operated variably by their electrical parameters (magnitude, current direction and frequency). Usually one or two parallel pairs of electrodes, partially orthogonal to each other, are used, which are formed either in or to the medium electrically conductive (current flow) or electrically isolated (voltage / electric field). The pairs are usually in a common plane and act largely planar in their preferred direction. Therefore, these devices are not used for spatial tissue engineering on three-dimensional implant bodies, but primarily for research into the behavior of cells and microorganisms under the influence of defined gradients.
  • Electromagnetic Fields, Electric Current and Bone healing - What is the Evidence ?, Z Orthop accident: 1 -6) attempts to summarize results of experiments on electrical and electromagnetic stimulation in the form of meta-analyzes in order to obtain a statement about their effectiveness. For the significance and evidence of the procedures to be examined, the evidence of electrical and electromagnetic procedures for bone healing is discussed and assessed on the basis of existing randomized clinical studies.
  • EBM Evidence-based Medicine
  • the document US 2004/0058434 A1 discloses a method for producing an implant, in which an implant core is colonized with cell or tissue. Differentiation and growth of cells or tissues is affected by mechanical stimuli.
  • a reactor is used in which two walls are spaced from each other by a gap. On at least one of the walls, which is formed by a surface of the implant, cells or tissue are settled.
  • the other wall is resilient and is deformable in a predetermined manner and amplitude.
  • the elastic wall serves to generate pressure changes in the gap and thus mechanical stimulation of the cells or tissue located on the implant.
  • ECM extracellular matrix
  • the process of in situ-proximal colonization of the implant surface with autologous cells not only reduces the risk of inflammation (inflammation) through the formation of biofilms on unoccupied, free surfaces, but also accelerates the secondary anchoring of the implants in situ.
  • the relevance of using autologous cells to precontain the implants has been demonstrated in experimental monitoring trials to evaluate the bioactivity of implant surfaces.
  • the variance or standard deviation of the adhesion, proliferation, migration and differentiation properties of patient-specific cells with different genetic predisposition or pathologically induced changes is partial to various bioactive implant surfaces more dominant than the variance or standard deviation of the bioactivity of different implant surfaces against an immortalized cell line.
  • the stimulatory and suppressive gradients in bone and soft tissue (bone and soft tissue) management should, in principle, be based on the body's inherent systemic gradients, which can also occur in the organism.
  • the object of the invention is to propose a possibility for a topical in vitro stimulation of cells or tissues in which, starting from a cell substrate, an existing gap is deliberately overgrown.
  • a stimulation cell for in vitro stimulation of cells or tissues which includes a body through which an interior is enclosed.
  • the body has an upper part and a lower part.
  • the stimulation cell also has at least one actuator for causing a stimulating effect on at least a portion of the cells or tissues.
  • a stimulation cell according to the invention is characterized in that a receiving device for receiving a cell substrate and a carrier is arranged in the interior space, wherein after receiving the cell substrate and the carrier by the receiving device, a gap remains between facing surfaces of the cell substrate and the carrier.
  • the at least one actuator is configured to generate an electromagnetic or magnetic gradient that extends along an imaginary propagation line of a controllable spatial gradient field and the imaginary propagation line extends from the cell substrate to the carrier.
  • stimulation is understood to mean any effect on biological processes such as growth, migration or proliferation. Stimulation can also be neutral or negative (suppression). The stimulation cell can therefore also be used as a suppression cell.
  • Portions of cells or tissues may be spatially on a cell substrate delimable cells or tissue, eg. B. cells or tissues that are carried on a particular sub-area of a cell substrate may be. It may also be certain cell or tissue types that are stimulated.
  • An actuator is to be understood below as meaning all means by which at least one gradient of a stimulating effect on the cells or tissue can be caused.
  • Stimulatory effects may be beneficial (positive), suppressive (negative) or neutral.
  • Stimulating effects may preferably be caused by electrical, electromagnetic, magnetic, chemical or physical stimuli.
  • the actuator is preferably designed in such a way that the gradient of the stimulating effect (stimuli) caused by it is spatially defined, directed and has an intensity-variable effect on the growth of the cells and tissue.
  • the gradient may be in its properties, such. As its waveform, strength, magnitude, intensity, direction and extent, and caused variable (metered).
  • a gradient is understood here as the change of a physical quantity along a path.
  • the magnetic field strength of a magnetic field decreases with the distance from the source of the magnetic field.
  • a gradient can only be generated as a spatial entity, which is referred to here as a gradient field.
  • the gradient field is ideally formed symmetrically about an axis. This axis is here for purposes of illustrative explanation of the invention referred to as an imaginary propagation line through which the above path is shown simplified.
  • a direction indication of the course of the imaginary Propagation line (eg from the cell substrate to the carrier) is to be understood as neutral.
  • a gradient may increase or decrease from the cell substrate towards the wearer.
  • a generated gradient preferably also acts in the cell substrate to affect the cells and / or tissues present there, e.g. B. to stimulate.
  • a generated gradient preferably also acts in the cell substrate to affect the cells and / or tissues present there, e.g. B. to stimulate.
  • only one imaginary propagation line will be referred to for simplification.
  • a plurality of imaginary propagation lines can be present in a stimulation cell according to the invention. These can be parallel to one another. In further embodiments of the stimulation cell, they can also have mutually different spatial positions (not parallel to one another).
  • the carrier is preferably a shaped body, for. B. an implant molding (Scaffold).
  • the carrier can basically consist of any material.
  • carriers are preferably shaped bodies of at least one biodegradable material, of at least one non-biodegradable material or of a combination of these materials or tissue substitutes, the latter being given a shape.
  • Under the surface of the support is both an outer, an outline of the molding body defining surface to understand, as well as an inner surface, as it is found in particular in moldings of porous material or moldings, having depressions and molds.
  • bio-degradable and degradable mean that the material in question can be degraded by biochemical reactions of the tissue (eg enzymatically) and optionally in interaction with biophysical processes.
  • the upper part and the lower part of the body can in other embodiments of the stimulation cell according to the invention also similar, z. B. two half-shells, or be firmly connected to each other and a closed body, z. As a cylinder form.
  • the lower and upper part can be designed differently, so that a classic separation in lower and upper part is resolved.
  • the stimulation cell according to the invention is at least one media supply and at least one media removal on at least one side of the interior for the supply and discharge of a medium available.
  • the media supply and the media removal is a monitoring of the processes in the stimulation cell by z. B. allows an analysis of the supplied and the discharged medium.
  • the medium is preferably electrically conductive and serves for the physiological supply of the cells or tissue.
  • a directed overgrowth of the gap is effected by the cells or by the tissue. It is expressly undesirable for the carrier to be colonized by cells that unintentionally detach from the cell substrate and become drifted to the carrier.
  • a very favorable effect of the targeted overgrowth of the gap is that only those cells or tissues actually overgrow the gap, which have a ability to divide (proliferation ability). Cells with corresponding defects are selected out during the process of overgrowth of the gap along the imaginary or at least significantly reduced their share of the total number of overgrowing cells. In addition, the cells which come into contact with the carrier after overgrowth of the gap to adhere to this.
  • the adhesion will only be successful for a part of the cells.
  • the carrier is almost exclusively populated by cells which have a good ability to divide and, in addition, a good ability to adhere to the carrier concerned.
  • the cell substrate can be provided with cells or tissue of the patient.
  • different carriers can be used and the best carrier, then too already populated with the patient's own cells are used.
  • the patient may also be implanted with a corresponding new, uninhabited carrier.
  • a colonization of the carrier can be supported in vivo by applying the gradients, which are found to be advantageous in the test, to the gap between the wound edge and the implant (carrier).
  • the cells or tissues may be present on as well as in a cell substrate other than the carrier and are therefore carried by the cell substrate.
  • the cell substrate is arranged in the interior of the stimulation cell.
  • a cell substrate may be any material or mixture of substances through which cells are provided, for example colonized or inoculated nutrient media such as agarose, alginate, mono- and co-cultures.
  • the stimulation cell of the invention is also useful for stimulating biofilms formed by, for example, bacteria, fungi, algae and protozoa.
  • means may be provided by means of which the effects of the stimulations can be detected and analyzed.
  • the carrier and cell substrate can be covered with a large number of cells, between which ECM can also be formed or tissue can differentiate.
  • ECM electrospray induced cell proliferation
  • tissue can differentiate.
  • simplification of cells is mentioned, but all possible cell biological structures and units as well as single- and multicellular organisms should be included.
  • At least two electrodes are present. These are designed to generate spatially and temporally defined electrical and / or electromagnetic fields with variable shape, magnitude, direction and intensity.
  • the electrodes are selected from a group comprising electrically conductive electrodes against the medium, electrically insulated electrodes against the medium and hybrid electrodes formed from electrodes and electrically conductive electrodes electrically insulated from the medium.
  • Hybrid electrodes represent a combination of electrically isolated and electrically conductive electrodes, either in the sense that portions of the hybrid electrode are isolated from the medium and other portions are not isolated, or both Electrode types are available separately, but in contrast to the separate variant of the two types of electrodes only an identical control option for both types of electrodes exists.
  • the electrodes can be segmented.
  • cluster electrodes may also be present which are formed from electrodes which are arranged in grid form and / or electrodes which can be driven by signal technology.
  • At least one magnetic field generator is assigned to the stimulation cell as an actuator, so that the stimulation cell is arranged at least over regions in a magnetic field generated by the magnetic field generator.
  • the magnetic field generator may be movable along or around the stimulation cell.
  • the magnetic field generator may be, for example, a magnetic coil.
  • the magnetic field generator as an actuator, but also other actuators, with respect to the stimulation cell and against the carrier to be movable, whereby by means of an actuator gradient from changing directions can be generated or a gradient over the surface of the carrier can be guided.
  • a hybrid actuator is present, through which different gradients can be produced simultaneously or consecutively from one another.
  • different gradients can be produced simultaneously or consecutively from one another.
  • the gradients may be the same or different, e.g.
  • an electrical gradient and a mechanotransducing gradient may be caused by a hybrid actuator.
  • the actuator is advantageously such that the stimulating effect produced by the actuator is assigned to certain subregions of the cell substrate and limited to these. Depending on the location of these subregions and the expression of the stimulating effect, a directed colonization of the carrier is stimulated only on a partial surface of a surface of the carrier.
  • the electrodes may be formed segmented.
  • segmentation is a generation of electromagnetic or magnetic fields with spatially determined expression, z. B. the course of the field lines as well the distribution of field strengths, spatially significantly resolved as possible with unsegmented electrodes.
  • At least one receiving device for receiving the carrier or a cell substrate can be arranged in the interior space.
  • the receiving device is designed such that a gap is adjustable between a surface of a carrier located in the receiving device and a surface of a cell substrate located in the receiving device, by which the mutually facing surfaces of the carrier and the cell substrate are separated from each other.
  • at least two receiving devices can also be arranged such that between one surface of a carrier located in a receiving device and a surface of a cell substrate located in another receiving device, a gap is adjustable by which the surfaces of the carrier and the cell substrate are separated from each other ,
  • the carrier and the cell substrate may also be held together in a correspondingly formed receiving device.
  • at least one of the receiving devices allows positioning of the carrier and / or the cell substrate in the interior space.
  • a preferred embodiment of the stimulation cell according to the invention is given by the fact that the carrier and at least one gradient are movable relative to each other. This can be made possible by relative movements of the carrier, the actuator or as a combined movement of the two.
  • the carrier is temporarily arranged with at least one magnetic body or a magnetizable body in direct or indirect contact.
  • This magnetic body or magnetizable body lies at least partially in the field lines of a primary magnetic field, so that in the magnetic body or the magnetizable body by the primary magnetic field, a secondary magnetic field is variable.
  • the secondary magnetic field can be used, for example, as a source of induction.
  • a gap in the sense of this description is a spatial gap. This is when the carrier object and the cell substrate are actually arranged at a distance from one another.
  • the gap has a gap width, which is preferably adjustable up to a gap width of 3 mm.
  • a gap width is an in situ situation between a surface of a carrier, for. B. an implant molding, and a cell substrate, such as a tissue replicated.
  • the electrodes can be designed as measuring means for measuring electrical quantities. It is also possible that further measuring means for measuring physical quantities are arranged.
  • an evaluation, storage and control unit is present, which is connected to the electrodes and other measuring means.
  • the evaluation, storage and control unit can be connected to a database.
  • Physical stimuli such as pressure or accelerations can be coupled in, if, in an advantageous embodiment, the stimulation cell is connected to a controlled drive by means of which the stimulation cell can be moved in a controlled manner.
  • the object is further achieved by a method for directionally stimulating the growth of cells or tissues of a cell substrate towards a carrier separated from the cell substrate by a gap and for stimulating the adhesion of cells or tissues grown on the carrier over the gap.
  • the method comprises the steps:
  • the stimulating effect can be assigned to certain subregions of the cell substrate and caused to be limited to these. It is advantageous if a spatially directed colonization of certain parts of the populated areas, z. B. across a gap, is stimulated.
  • the medium can be fed under control to renew the medium regularly.
  • Various media can be supplied.
  • the stimulating effect is selected from the generation of electromagnetic fields, electric fields, magnetic fields and the coupling of physical stimuli.
  • measured variables whose measured values are variable as a result of reactions of the cells and tissue to the stimulating effect are recorded and stored. It is possible to record and store initial measured values of at least one measured variable at an initial measuring time and to use the initial measured values as reference measured values for measured values recorded at later measuring times.
  • information about the growth of the cells or tissue can be derived from the changes in the measured values acquired and stored at different measurement times.
  • the measured values can be recorded time-resolved or spatially resolved or temporally-spatially resolved.
  • the acquired measured values can be graphically displayed and the information about the growth of the cells or tissue can be derived from the graphical representation. A comparison of the information with a database is possible.
  • control signals for controlling the actuator can be generated on the basis of the measured values in order to change the gradient. This makes it possible to respond specifically to the growth of cells or tissues.
  • a gap with a gap width can be set between the cell substrate and the carrier.
  • a test arrangement with opposing boundary layers including gap region in which a multidimensional method for stimulation of in vitro cell growth in a definable interface situation between a tissue-like region and a region in the form of degradable or non-degradable implant surfaces and / or tissue substitutes are realized can.
  • the stimulation cell should:
  • receiving and removal systems in the form of sockets, fixings and receiving spaces for each different, exchangeable carrier, eg. B. implant shaped bodies and tissue substitutes, as well as for different mono- and co-cultures in the form of, for example alginate or Agaroseblöcken own have at least one media feed and a media removal for the general supply of the cell and tissue growth processes as well as the biofilm development with nutrient and oxygen for in vitro long-term test as well as for a microbiological and / or biochemical microdroplet monitoring
  • a biophysical, non-test-aborting monitoring / controlling measurement method can be carried out which can be used in a complementary and comparative manner to the standard microbiological test and test methods in order to create libraries and to document the course, with the aim: to be able to do without time-consuming and costly microbiological test procedures.
  • Background of the invention is an in vitro / in vivo / in situ simulation, evaluation and validation of stimulation and suppression methods for the in vitro or accelerated in situ colonization of implants with autologous, human cells and tissues, eg. B. for improved and / or accelerated ossification, osteogenesis and / or osseointegration of carriers of different developers and manufacturers with the lowest possible in vivo use.
  • the aim of the invention is to provide a multi-dimensional, static or dynamic stimulation with optional monitoring of the cell / tissue by means of an actuator and optional sensor process arrangement for generating and optionally measuring biophysical / (bio) electrical / (bio) magnetic parameters. / microbial To allow growth in in vitro tissue management procedures on or in functional, bioactive carrier surfaces and / or tissue substitutes.
  • topical gradients are applied in vitro to human, autologous, immortalized and / or altered cells and tissues, which can be varied in type, signal shape, direction and magnitude and in spatial-temporal progression, preferably on three-dimensional carriers for stimulation of the cell and tissue Tissue growth and biofilm formation processes by microbial organisms.
  • the cells or tissue are already present on the carrier or reach an area of action of a gradient caused on the surface of the carrier.
  • the outer shape of the stimulation cell is to be designed in its dimensions and its shape as well as its actuator arrangement such that the carrier can be accommodated in its in-situ dimension.
  • it is designed as a cuboid with receiving devices for the carrier.
  • a cylindrical, hemispherical or spherical shape and combinations thereof are advantageous.
  • the outer stimulation cell is designed to be fixed relative to the inner support.
  • the enclosed by the walls of the stimulation cell carrier can be mounted fixed or movable.
  • the arrangement may also be formed inversely, i. it can parts of the stimulation cell in z. B. cavities of the carrier protrude.
  • the at least one actuator is arranged in such a way that it can reach the entire surface of the carrier, preferably dividing into partial areas with biostimulatory or suppressive gradients defined in the direction, magnitude and signal shape, without having individual, less biostimulatory or partial areas located in the interior suppressive or even the application benefits according to the invention counteracting gradient is acted upon.
  • the subregions can be maximally expanded or coincide.
  • topical electrical, electromagnetic and mechanotransduktive gradient / stimuli are applied in vitro via actuators within and outside the stimulation cell, which are arranged at least in one dimension on the walls or in the center of the stimulation cell. Electrical stimuli are introduced via spatially and temporally stimulation regions associated electrode arrangements.
  • Gravitational, mechanotransduktive and acceleration gradients can be introduced into the stimulation cell via a corresponding, preferably rotary, tiltable and / or swingable, outer support of the stimulation cell.
  • Surface tension and surface energy gradients can be achieved by means of magnetizable elements which can be placed temporarily on or in three-dimensional implant shaped bodies, for example As layers, sheaths or cylinders, via defined associated magnetic actuators or mechanical stress devices are applied.
  • the electrical or electromagnetic, effective actuators in the form of compared to the conductive medium within the stimulation cell electrically conductive and / or electrically insulated electrodes and magnetic field coils, for. B. in pairs on the inner or outer walls of the stimulation cell facing each other, arranged.
  • the coil arrangement can also be designed to surround the interior in at least one plane.
  • the field geometry of the magnetic fields caused by the magnetic field coils can be varied.
  • Electrodes can be designed as electrically conductive, non-insulated electrodes, whereby a flow of current between at least two electrodes and through the medium is made possible. By means of non-isolated electrodes measurements based on current flow can be carried out. If the electrodes are designed to be electrically insulated, these can be used to generate electrical and / or electromagnetic fields in the interior and to use them for the measurement.
  • the electrodes may be formed in various shapes, e.g. B. stripe, plate or punctiform or combined to form so-called clusters.
  • the electrodes may be fixed or freely positionable in the interior. This advantageously provides high flexibility in the design of the measuring arrangements. There may be a plurality of non-insulated electrodes, a plurality of insulated electrodes and hybrid electrodes.
  • the electrodes can also be segmented. This can be achieved, for example, by a spatially defined arrangement of a number of electrodes, wherein a location of the detection of the measured variables can be derived from the differences in the measured variables per electrode and the knowledge of the arrangement of the respective electrodes.
  • the biostimulative and / or suppressive gradient in the form of individual gradients, gradient overlays and / or gradient deflection by auxiliary gradients / fields in amount, direction and shape can be topically defined and applied on any subarea of the cell substrate.
  • the distribution and placement of the actuators for example axially and / or planar symmetrically, in at least one and preferably in all three spatial axes according to the method enables a topically defined application of the (bio) stimulatory gradients at defined partial areas of the support.
  • hitherto known or new stimulation methods which are preferably effective in one dimension, can be applied to three-dimensional carriers by means of the overall arrangement as well as a spatially-temporally topically transforming signal and actuator control.
  • the fixation of the three-dimensional support within the stimulation cell is also to be ensured by means of metrological aids, the topography or its partial surface resolution of the shaped body and its spatial allocation to the distribution and design of the actuators by the subordinate coordinate system of the support in the main coordinate system of the stimulation cell in the downstream Evaluation, storage and control unit integrated and calculated as dual surface system (inner surface of the cell to the outer surface of the carrier).
  • the receiving device of the carrier can be configured such that the carrier itself acts as part of the stimulation actor or the optional monitoring sensor system.
  • Electrical stimuli may be introduced as an electrode using, for example, a conductive carrier or a conductive portion of the carrier.
  • the conductive support or its portion may also serve as a measuring electrode for monitoring.
  • Mechanical stimuli For example, they can also be introduced by direct local influence (for example, by movements, rotations or vibrations) of the wearer.
  • the carrier can be movably arranged at its fixation points with the stimulation cell, so that a rotation or displacement of its surface is possible with respect to the stimulating fields, with the aim of covering a larger part or even the entire surface of the carrier to bring the direction of the stimulating fields or to align to different gradients of these fields.
  • the actuator it may be useful for the actuator to be able to apply several types of stimuli at the same time.
  • piezoelectric stacks designed as electrodes could at the same time apply electrical and mechanical stimuli or magnetically moved bodies or magnetizable layers simultaneously with magnetic and mechanical stimuli.
  • both defined individual frequencies and whole bands of frequencies in the sense of a frequency sweep and direct signals can be used.
  • the exciting signals can also be varied in their amplitudes and their signal shape.
  • the electrodes provided in the arrangement can be varied and distinguished in several respects. On the one hand with regard to their connection with a conductive nutrient solution / a medium in conductive (wet) and non-conductive (dry) electrodes in the form of electrically insulated electrodes as well as electrically conductive, galvanic electrodes, on the other hand with respect to their geometry, eg. B. in point, line, and surface electrodes, and their arrangement with each other, z. B. in single electrode arrangements, raster arrangements and free arrangements.
  • the actuators are advantageously implemented with one another or with different individual electrodes of a grid above the surface or under a seeded carrier (gradient generation along the carrier) or a selection of electrodes of the grid.
  • FIG. 1 shows a first embodiment of a stimulation cell according to the invention in a side sectional view
  • FIG. 2 shows the first exemplary embodiment of the stimulation cell according to the invention in a plan view of the lower part of the stimulation cell
  • FIG 3 shows the first embodiment of the stimulation cell according to the invention in the plan view of the stimulation cell with attached upper part.
  • FIG. 4 shows a first exemplary embodiment of an actuator with electrically insulated and electrically conductive electrodes
  • FIG. 5 shows a second embodiment of an actuator with electrically insulated and electrically conductive electrodes as a hybrid electrode
  • FIG. 6 shows a third exemplary embodiment of an actuator with electrically insulated and electrically conductive electrodes as a cluster electrode
  • FIG. 7 shows a second embodiment of the stimulation cell according to the invention with a vertically arranged magnetic field coil
  • FIG. 8 shows a third exemplary embodiment of the stimulation cell according to the invention with a horizontally arranged magnetic field coil
  • FIG. 9 shows a fourth exemplary embodiment of a stimulation cell according to the invention with a horizontally arranged magnetic field coil
  • FIG. 10 shows a fifth exemplary embodiment of a stimulation cell according to the invention in a lateral sectional drawing with a receiving device
  • FIG. 1 shows a sixth embodiment of a stimulation cell according to the invention in a lateral sectional drawing with a receiving device
  • FIG. 12 shows a seventh exemplary embodiment of a stimulation cell according to the invention with a planar magnetic body in a lateral sectional drawing
  • FIG. 13 shows an eighth exemplary embodiment of a stimulation cell according to the invention with a planar magnetizable body and gap in a lateral sectional drawing
  • FIG. 14 shows a ninth embodiment of a stimulation cell according to the invention with an arcuate magnetizable body in a side sectional view
  • 15 is a tenth embodiment of a stimulation cell according to the invention with an arcuate magnetizable body and gap in a side sectional view.
  • 16 is an eleventh embodiment of a stimulation cell according to the invention in an exploded view
  • FIG. 17 shows an array of six stimulation cells according to the invention in an exploded view.
  • a first embodiment of a stimulation cell according to the invention according to FIG. 1 has, as essential elements, a body consisting of a lower part 1 1 and an upper part 14 and enclosing an inner space 10, as well as electrodes 1 serving as actuators serving as electrically insulated electrodes 1 a on outer sides of the walls of the lower part 1 1 and the upper part 14, and electrically conductive electrodes 1 b on the inner sides of the walls of the lower part 1 1 and the upper part 14 are arranged.
  • An implant molding (not shown) of a biodegradable material serving as support 36 is arranged in the interior space 10.
  • a media supply 12 and in another wall, a media discharge 13 for supplying and discharging an electrically conductive medium M (only indicated) in and out of the interior 10 is present.
  • the stimulation cell can be connected to a pump and reservoir as well as to a microdroplet collection system (all not shown) to provide nutrient and oxygen supply to the cells and tissues.
  • a defined pressure and flow load situation in the gap region can be generated temporarily or periodically or permanently, for example for mechanotransduktive simulation of load and / or movement situations. From Fig.
  • all the electrodes 1 are rectangular and planar and each extending over areas of the inner and outer walls of the lower part 1 1 and the upper part 14 (see Fig. 3).
  • blind bores are each provided with an internal thread 15.1, which allow a detachable attachment of an upper part 14 (see FIG. 3) by means of screw.
  • the carrier 36 is not shown for reasons of clarity.
  • the stimulation cell with attached upper part 14 is shown in FIG. Corresponding to the blind holes with internal thread 15.1 (see FIG. 2), through holes 15.2 are provided in the upper part 14, through which screws (not shown) can be inserted and screwed into the blind holes with internal thread 15.1. Shown are the electrically insulated electrodes 1 a of the upper part 14 and the lateral walls of the lower part 1 1, and the media supply 12 and media discharge 13th
  • Fig. 4 two actuators are shown, each having an electrically insulated electrode 1 a and an electrically conductive electrode 1 b.
  • the electrically conductive electrode 1 b is surrounded by the electrically insulated electrode 1 a and electrically insulated from each other. Both electrodes 1 are unsegmented and can be referred to as global electrodes.
  • the square shaped actuator can be arranged for example in stimulation cells according to FIG. 1 to 3 on the base surfaces of the lower part 1 1 and / or the upper part 14.
  • the rectangular designed actuator can be arranged on lateral walls of the lower part 1 1 and / or the upper part 14.
  • a hybrid electrode comprises an electrode 1 a which is electrically insulated from the medium M and an electrically conductive electrode 1 b which can be driven via terminals 18.
  • Such a hybrid electrode can be arranged in the interior 10 of a stimulation cell, whereby electrodes 1 (see, for example, FIG. 1) arranged on the outer walls of the stimulation cell can be replaced or supplemented.
  • the cluster electrode consists of a number of individual electrically conductive electrodes 1 b, which are spaced apart, arranged in an array.
  • the array (cluster electrode assembly) is surrounded by an outer electrode 16 (global Electrode). Between the outer electrode 16 and the array is a designated as border 17 area.
  • the border 17 may be formed either as an electrically insulating region or as a ground reference electrode.
  • Each of the electrodes 1 of the array and the outer electrode 16 each have a terminal 18 and is connected via a connecting line 60 to an evaluation, storage and control unit 65 (shown in simplified form).
  • the array can also be formed by electrically insulated electrodes 1a or by hybrid electrodes.
  • a counterelectrode to a cluster electrode may be a further cluster electrode, a flat electrically insulated electrode 1 a, a flat electrically conductive electrode 1 b (global electrodes) and a combination of the aforementioned electrodes 1.
  • Several electrodes of a cluster electrode can be driven together.
  • the electrodes 1 may also be arranged in the form of orthogonally isolated stripe electrodes and as a dot-ring electrode cluster (not shown).
  • the electrodes 1 can be excited individually or in groups on the basis of control and frequency, for the migration, adhesion, proliferation, differentiation and formation of an ECM, formation of monolayers and multilayers of cells, maturing or to stimulate biofilm formation, suppression and other cellular processes.
  • a stimulation cell is shown, which is assigned in a running in the vertical direction of the stimulation cell level on four sides each have a magnetic field coil as a respective magnetic field generator 19.
  • the stimulation cell and the magnetic field generator 19 are spaced from each other so that the stimulation cell is at least partially in each of the magnetic fields generated by the magnetic field generator 19.
  • the stimulation cell shown in Fig. 8 is designed, the magnetic field generator 19 are assigned, which are arranged in a, extending in the horizontal direction of the stimulation cell, level.
  • the magnetic field generator 19 are controllable by the evaluation, storage and control unit 65 (not shown).
  • the magnetic fields are controlled in terms of their parameters such as geometry and / or field strengths varied.
  • FIG. 19 An arrangement of a magnetic field generator 19 completely enclosing the stimulation cell in a plane is shown in FIG. Combinations of the aforementioned magnetic field generator 19 are possible in further embodiments of the stimulation cell.
  • the stimulation cell may be in communication with a controlled drive (not shown) and may be movable by the controlled drive. This may cause a relative movement of the carrier 36 to the actuator and a gradient generated by the actuator.
  • FIG. 10 A further embodiment of the stimulation cell according to the invention is shown schematically in FIG.
  • a receiving device 30 for receiving and fixing a carrier 36 in the interior 10 is present.
  • the receiving device 30 is designed symmetrically and allows the recording and fixing two carriers 36 in the form of a respective planar shaped body.
  • the receiving device 30 is adjustable via an adjustment region along all spatial axes, so that the carriers 36 can be positioned within a space given by the adjustment regions.
  • the interior 10 is surrounded by a trough-shaped, open to one side lower part 1 1, and a the open side of the lower part 1 1 overlapping upper part 14.
  • the stimulation cell is shown edgewise. Between the upper part 14 and the lower part 1 1, a circumferential gap for gas exchange 21 is present.
  • an electrically insulated electrode 1 a is on the outside of the wall and an electrically conductive electrode 1 b on the inside.
  • the receiving device 30 protrudes orthogonally from the wall of the lower part 1 1 in the direction of the upper part 14 and spans the inner space 10. Along this direction, the individual elements of the stimulation cell will be described below.
  • a carrier 36 is held at a distance and parallel to the wall.
  • a cell substrate 20 is parallel to the carrier 36, which is separated from the carrier 36 by a constant gap 55.
  • the side facing away from the carrier 36 of the cell substrate 20 is facing a planar-shaped electrically conductive center electrode 32b and spaced therefrom.
  • the electric Conductive center electrode 32b faces an electrically insulated center electrode 32a and is separated therefrom by an insulation 33.
  • the electrically isolated center electrode 32a is followed by an insulation 33, an electrically conductive center electrode 32b, a cell substrate 20, a gap 55, a carrier 36, an electrically conductive electrode 1b and an electrically insulated electrode 1a, the electrically conductive electrode 1b and the electrically insulated electrode 1 a are separated by an insulation 33.
  • the described arrangement of elements is followed by the upper part 14.
  • the electrically insulated center electrode 32a and the electrically conductive center electrode 32b can be driven via terminals 18. In the walls of the lower part 1 1 shown above and below, in each case an electrically conductive electrode 1 b and an electrically insulated electrode 1 a are arranged.
  • a media supply 12 is present in the upper wall and a media discharge 13 is present in the lower wall.
  • the receiving device 30 is also adjustable in itself, so that a gap width of the gap 55 is adjustable.
  • the gap width is adjustable in the embodiment up to 350 ⁇ , they can be adjusted in other embodiments to 3 mm.
  • a gradient may be generated along an imaginary propagation line 56 that is perpendicular to the surface of the cell substrate 20 and the support 36.
  • the imaginary propagation line 56 serves to illustrate the orientation of the gradient and is therefore shown as a dashed line.
  • the dashed line only exemplifies only an imaginary propagation line 56.
  • a sixth embodiment of the stimulation cell according to the invention has, according to FIG. 1 1, an upwardly open lower part 1 1, on whose lower wall and on the lateral walls in each case an electrically insulated electrode 1 a and an electrically conductive electrode 1 b is arranged.
  • Each side wall has a media supply 12 and a media discharge 13.
  • the interior 10 is closed by the upper part 14 and connected via a horizontally extending gap for gas exchange 21 with the environment.
  • the upper part 14 is designed without electrodes 1.
  • a border 17 formed as a ground reference electrode is present.
  • the embodiment of the receiving device 30 and the other elements of the stimulation cell corresponds to FIG. 10.
  • the imaginary propagation line 56 extends with respect to the surface of the Cell substrate 20, the gap 55 and the surface of the carrier 36 is not perpendicular, but is directed at an angle not equal to 90 °.
  • the carrier 36 may be designed non-planar in other embodiments.
  • the gap width of the gap 55 may also vary over its extension.
  • the geometry and position of the cell substrate 20 may be adapted to the geometry and position of the carrier 36 to provide a defined gap 55.
  • the geometry of the stimulation cell can be adapted in the design of its upper part 14 and lower part 1 1 of the geometry and position of the carrier 36.
  • the upper and lower parts 14, 1 1 may have a cuboid, cylindrical, spherical and / or hemispherical shape and all the composite shapes and their combinations.
  • the carrier 36 may be arranged in the interior 10 with respect to the upper and lower parts 14, 1 1, movable. A geometrically adaptable arrangement of the cell substrate 20 to the carrier 36 may also be advantageous. In the stimulation cell and a plurality of carriers 36 may be arranged.
  • FIG. 12 shows a stimulation cell, as described in FIG. 1, with a receiving device 30 in which two carriers 36, each held in a fixing device 31, are held at a distance from one another.
  • the interior 10 is filled with a medium M.
  • a magnetic body 34.1 is arranged in the form of a magnetic plate.
  • the magnetic body 34.1 is enclosed by an insulation 33, which prevents contact of the medium M with the magnetic body 34.1 in order to prevent possible cytotoxic effects of the material of the magnetic body 34.1.
  • the carrier 36 arranged above arranged serves as an abutment for the magnetic body 34.1 and the insulation 33 and is not populated (passive carrier 36).
  • the arrangement shown in addition to a stimulation by means of a magnetic field and a force to be applied to one side of the carrier 36.
  • both carriers 36 can be colonized and introduced into the interior 10.
  • FIG. 13 shows the stimulation cell, as in FIG. 1, with a receiving device 30 with fixing devices 31, in which a magnetizable body 34.2 is arranged between two mutually parallel carriers 36. Between the carriers 36 there is an insulation 33 for electrical insulation and for preventing cytotoxic effects of the magnetizable body 34.2.
  • Each of the carriers 36 is on the side remote from the magnetizable body 34.2 each one, each spaced by a gap 55, cell substrate 20 assigned.
  • the imaginary propagation line 56 is perpendicular to the surface of the cell substrate 20, the gap 55, and the surface of the carrier 36.
  • FIGS. 14 and 15 A variation of the stimulation cell shown in FIG. 12 is shown in FIGS. 14 and 15.
  • a semicircular curved support 36 of the receiving device 30 is held.
  • the carrier 36 is held in the fixing device 31 over its distal regions, while a dome-shaped, upwardly curved construction of a plurality of layers is present below a central region of the carrier 36.
  • Under the support 36 a likewise corresponding curved magnetizable body 34.2, an electrically conductive center electrode 32b and an insulation 33 are arranged.
  • a likewise curved gap 55 and a cell substrate 20 are additionally present above the arched, central region of the carrier 36.
  • the imaginary propagation line 56 again runs perpendicular to the surface of the cell substrate 20, the gap 55 and the surface of the carrier 36. Since the gap 55 is curved, the imaginary propagation lines 56 are at various points along the gap 55 with respect to the interior space 10 Panned circular section.
  • the imaginary propagation lines 56 exemplified are not parallel to each other.
  • a magnetizable body 34.2 may be disposed. If this arrangement is combined with magnetic field generators 19, a magnetic gradient can be generated by means of magnetic fields with a defined variable field geometry, which, mediated via the magnetizable body 34. 2, can act on the carrier 36. In this way, stress conditions up to vibrations can be generated on the surface of the carrier 36 if the magnetizable body 34.2 is located at least in a partially non-homogeneous field region.
  • a magnetic body 34. 1 or a combination of at least one magnetic body 34. 1 and one magnetizable body 34. 2 can also be arranged.
  • piezo stacks formed as electrodes can simultaneously generate electrical and mechanical stimuli.
  • the stimulation cell can also be designed non-fluidically as a static system, in which however a defined gap situation with gravitationally positive as well as negative gradients can be generated.
  • a gap 55 having a gap width of 350 ⁇ m is connected to a receiving unit for cell substrate between a carrier 36 placed in a lower receiving unit for carriers with fixing / convection regions 41 or a carrier with fixing / convection regions 42 having gravitationally positive gradients
  • Fixing / convection regions 43 including a cell substrate 44, prepared on the further building a receiving unit 48 with fixing / convection regions for horizontal two radial electrodes 45, which are connected via an insulating spacer and connector 47, can be placed.
  • Radial electrodes 45 are connected via vertical bores in fixing bolts of a receiving unit 48 by means of vertical connectors 46.
  • a further receiving unit for a cell substrate with fixing / convection regions 43 is placed, by the over distance support surfaces to a receiving unit for carriers with fixing / convection regions 41 placed carrier with fixing / convection regions 42 with gravitationally negative gradient made a gap 55 with 350 ⁇ and a composite stimulation cell 49 is formed.
  • a 6-well-format stimulation cell assembly 51 can be realized with an upper part 52 of the Stimulationszellengephaseuses with distance ranges for gas exchange and Passages for connectors 46 can be completed.
  • each one of the six composite stimulation cells 49 may be connected via lines 60 to the evaluation, storage and control unit 65 (both not shown) in series, in parallel or be switched individually.
  • the surfaces of the planar, upper and lower carriers with fixing / convection regions 42, the distance ranges for the gas exchange in the upper part 52 and the media volumes per well can be parameterized analogously to 6-well standard cultivation systems. This ensures comparability in the conduct of investigations.
  • the stimulation cell serves a non-dynamic, multi-dimensional method for stimulating in vitro cell or tissue growth in a definable interface situation between a tissue-like region and a region in the form of degradable or non-degradable carriers 36; in other words, for the stimulation of growth processes in an in situ similar three-dimensional cell or tissue area with opposing boundary layers including a gap 55.
  • the stimulation of cell growth processes in an in vivo / in situ like situation is accomplished by location based generation and temporal variation of electrical parameters of an array of actuators.

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Abstract

Stimulationszelle und Verfahren zur in vitro Stimulation von Zellen oder Geweben in einer Stimulationszelle. In der Stimulationszelle sind in einem Innenraum (10) der Stimulationszelle ein Träger (36), der wenigstens über Bereiche seiner Oberfläche durch Zellen oder Gewebe besiedelbar ist und mindestens ein Aktor, der so ausgeführt ist, dass durch ihn topisch auf der Oberfläche des Trägers (36) ein dosierbarer Gradient mit einer das Wachstum der Zellen oder Gewebe stimulierenden Wirkung hervorrufbar ist, vorhanden. Zur Durchführung des Verfahrens werden die Schritte des Einbringens eines die Zellen oder Gewebe tragenden Zellsubstrats (20) in einen Innenraum (10) einer Stimulationszelle; des Einlegens eines Trägers (36), der mindestens über besiedelbare Bereiche seiner Oberfläche durch die Zellen oder Gewebe besiedelbar oder bereits besiedelt ist, in eine Aufnahmevorrichtung (30) in dem Innenraum (10) der Stimulationszelle; des Einbringens eines Mediums (M) zur physiologischen Versorgung der Zellen oder Gewebe und des Hervorrufens mindestens eines dosierbaren, topischen Gradienten mit einer das Wachstum der Zellen oder Gewebe stimulierenden Wirkung auf der Oberfläche des Trägers (36), durchgeführt.

Description

Stimulationszelle und Verfahren zur in vitro Stimulation von Zellen oder Geweben
Die Erfindung betrifft eine Stimulationszelle und ein Verfahren zur in vitro Stimulation von Zellen oder Geweben.
Im Rahmen des sogenannten Tissue-Managements wurden seit den neunziger Jahren des letzten Jahrhunderts Bioreaktoren entwickelt, modifiziert und auch patentiert. Diese zeichneten sich vor allem durch die Nutzung der Fluidik bzw. Mikrofluidik aus, die die sonst fehlenden Nähr-, Wirk- und Signalstoff-Versorgung quasi in vitro abzubilden versuchen und somit auch eine Signaltransduktion und Taxien implementierten. Die Fluidik wurde insbesondere für die zelluläre Besiedlung von Scaffolds bedeutsam. Exemplarisch seien hier die DE 39 23 279 und die DE 10 2004 054 125 A1 genannt. Neben der Zuführung von unterschiedlichsten Wachstums- und Differenzierungsfaktoren (Genaktivierung / Genexpression) besteht das inhärente Stimulationsprinzip in vom fluidischen Prozess am Scaffold abgeleiteten mechanotransduktiven Effekten.
In J Exp Zool. 1990 Feb; 253(2): 163-76 beschrieben Harris A.K., Pryer N.K. und Paydarfar D. in „Effects of electric fields on fibroblast contractility and cytoskeleton." eine nichtfluidische elektrische Feldkammer zur Ausrichtung von Osteoblasten in elektrischen Gleichfeldern. Die Zellen richten sich dabei nach einer gewissen Zeit rechtwinklig zu den Feldlinien aus und elongieren (S. T. Curtze (2006, „Zugkraftmikroskopie an Osteoblasten", Diss. Humanmedizin, Uni Marburg: 8 ff.). Diese Feldkammer wurde zur Analyse der Mechanotransduktion von Osteoblasten und nicht zum tissue engineering benutzt.
In DE 37 35 702 A1 wird ein Verfahren zur Beeinflussung von Wachstum, Teilung und Differenzierung von Zellen in einem Kulturbehälter vorgestellt, bei dem über das Anlegen von elektrischen Gleichfeldern, veränderbar in Richtung und Stärke, elektrische Dipolmomente der Zellen im Sinne einer spontanen Polarisation genutzt werden. Neben der Veränderung des angelegten Gleichfeldes soll auch das elektrische Oberflächenpotential veränderbar sein. Die Vorrichtung dazu basiert auf zwei parallelen, planaren Plattenelektroden, die gegenüber dem Kulturmedium elektrisch isoliert oder elektrisch leitend sind. Die Fläche der Plattenelektroden entspricht der Grundfläche oder mindestens einer Wandinnenfläche des Kulturbehälters. Die Vorrichtung dient der Herstellung von biotechnologisch und biomedizinisch bedeutsamen Zellen, Geweben, Organen und Einzellern sowie von Biosensoren. Eine räumlich gerichtete Entwicklung von Zellen oder Geweben sowie eine Besiedelung von degradierbaren und nicht-degradierbaren Implantatoberflächen und Gewebeersatzstoffen ist nicht vorgesehen.
In zahlreichen wissenschaftlichen Arbeiten werden elektrische Anordnungen, z.T. in Gestalt von Kammern, mit Zellen und / oder Mikroorganismen beschrieben, die eine Analyse der entsprechenden Einflüsse von elektrischen Feldern und / oder Strömen zu Gegenstand haben. Ihnen gemeinsam sind in der Regel statische, unveränderliche Anordnungen von Elektroden, die nur durch in ihren elektrischen Parametern (Betrag, Stromrichtung und Frequenz) veränderlich betrieben werden können. Meist werden ein oder zwei parallele Elektrodenpaare, teilweise orthogonal zueinander stehend, verwendet, die entweder im bzw. zum Medium elektrisch leitend (Stromfluss) oder elektrisch isoliert (Spannung / elektrisches Feld) ausgebildet sind. Die Paare befinden sich dabei in der Regel in einer gemeinsamen Ebene und wirken in ihrer Vorzugsrichtung weitgehend planar. Deshalb dienen diese Vorrichtungen nicht einem räumlichen tissue engineering an dreidimensionalen Implantatkörpern, sondern vorrangig der Erforschung des Verhaltens von Zellen und Mikroorganismen unter dem Einfluss definierter Gradienten.
Beispielhaft seien die Arbeiten von Caubet, R. et al (2004, A radio frequency electric current enhances antibiotic efficacy against bacterial biofilms, ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY: 4662^1664) und van der Borden, A. et al. (2007, Prevention of pin tract infection in external stainless steel fixator frames using electric current in a goat model, Biomaterials 28: 2122-2126) angeführt.
Ebenfalls bekannt sind Schriften zum stimulativen Einfluss von gepulsten elektromagnetischen bzw. magnetischen Feldern auf das Wachstum vorrangig von Knochen-, Knorpel- und Muskelgewebe. So wurde in zwei Übersichtspublikationen von Hungerer, S. et al. (2008, Elektromagnetische Verfahren bei Knochenheilungsstörungen. Evidenz dieser additiven Maßnahme, Trauma Berufskrankheit 10 [suppl. 2]: 219-225) und Schmidt-Rohlfing, B. et al. (2010, Elektromagnetische Felder, elektrischer Strom und Knochenheilung: was ist gesichert? Electromagnetic Fields, Electric Current and Bone Healing - What is the Evidence?, Z Orthop Unfall: 1 -6) versucht, Ergebnisse von Versuchen zur elektrischen und elektromagnetischen Stimulation in Form von Metaanalysen zusammenzufassen, um eine Aussage über deren Wirksamkeit zu erhalten. Zur Signifikanz und Evidenz der zu untersuchenden Verfahren wird die Evidenz von elektrischen und elektromagnetischen Verfahren zur Knochenheilung anhand vorhandener randomisierter klinischen Studien diskutiert und beurteilt.
Leider wurden die Techniken der Stimulation (DC/AC elektrisch leitend, DC/AC elektrisch isoliert, magnetisch) in diesen Studien als gleichwertig angesehen. Eine Zusammenfassung in dieser Art ist unter Vorbehalt zu betrachten, obwohl eine gute Übersicht über die klinischen Studien gegeben wird. Abgesehen von der Vergleichbarkeit der oben genannten Verfahren, sind bereits die PEMF (PEMF = Pulsed Electro Magnetic Field)-Studien durch die Vielzahl der verschiedenen Stimulationsparameter und unterschiedlichen Behandlungszeiten kritisch zu werten. Vielen der angegebenen Literaturstellen mangelt es an der exakten Angabe von Stimulationsparametern. Es ist oft nicht nachvollziehbar, welche Flussdichten, Frequenzen und Amplituden verwendet wurden.
Die Arbeiten beschäftigten sich mit dem Einfluss der Feldgrößen auf die Wirksamkeit von elektromagnetischen Verfahren und beschrieben vor allem die niederfrequenten kontinuierlich sinusförmigen Signale im Frequenzbereich von unter 120 Hz als wirksam, mit einem Maximum bei 15-30 Hz.
Studien mit einem EBM-Level 1 (EBM = Evidenzbasierte Medizin) und zahlreiche weitere Studien mit niedrigeren EBM-Level sind vorhanden.
Obwohl die Literatur zahlreich ist und sich mit anderen additiven Therapiekonzepten messen kann, wie der Stoßwelle, Ultraschall oder Bone-Matrix-Proteinen, überrascht es nicht, dass die elektromagnetischen Therapieformen bislang keinen Durchbruch erzielt haben. Dem Anwender wird durch die Vielzahl kommerzieller Geräte mit sehr unterschiedlichen Parametern die Wahl des optimalen Geräts nahezu unmöglich gemacht. Zudem fehlen bisher standardisierte Therapieoptionen, da sich einerseits die von den Forscherteams angewandten Felder hinsichtlich ihrer physikalischen Kenngrößen erheblich unterscheiden, und andererseits ein allgemein anerkannter Wirkmechanismus noch nicht beschrieben wurde. Damit fehlen auch Studienprotokolle für die Behandlung.
Aus der Schrift US 2004/0058434 A1 ist ein Verfahren zur Herstellung eines Implantats bekannt, bei dem ein Implantatkern mit Zelle oder Gewebe besiedelt wird. Eine Differenzierung und ein Wachstum der Zellen oder Gewebe wird durch mechanische Stimuli beeinflusst. Zur Durchführung des Verfahrens wird ein Reaktor verwendet, in dem sich zwei Wände voneinander durch einen Spalt beabstandet gegenüber stehen. Auf mindestens einer der Wände, die durch eine Oberfläche des Implantats gebildet ist, sind Zellen oder Gewebe angesiedelt. Die andere Wand ist elastisch gestaltet und ist in vorbestimmter Weise und Amplitude deformierbar. Die elastische Wand dient der Erzeugung von Druckveränderungen in dem Spalt und damit einer mechanischen Stimulation der auf dem Implantat angesiedelten Zellen oder Gewebe.
Das grundsätzlich auch weitere Möglichkeiten zur Stimulation des Wachstums und der Differenzierung von Zellen oder Geweben möglich sind, ist aus der Schrift DE 100 61 704 A1 zu entnehmen. Auch hier werden Zellen auf einer Basis (Wachstumsgerüst) angesiedelt und stimuliert. Eine Stimulation kann mittels physikalischer Reize, insbesondere mittels elektrischer, chemischer und / oder optischer Reize, erfolgen.
Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass zahlreiche suppressive und stimulative Verfahren und Methoden in in vitro und zum Teil auch in in vivo Studien erforscht und mehr oder minder validiert worden sind. Deutlich weniger konnten diese Entwicklungen human in situ bzw. für in situ Anwendungen realisiert werden. Es gibt sehr viele experimentelle Untersuchungen mit zum Teil sehr signifikanten Ergebnissen, aber kaum randomisierte klinische Studien.
Alle vorstehend genannten Erfindungen, publizierten in vitro Anordnungen, Stimulations- und Suppressionsverfahren sowie die in Anwendung befindlichen oder kommerziell vertriebenen Produkte bilden in vitro die in situ Situation von dreidimensionalen Implantatformkörpern nicht ab. Die in situ ablaufende dreidimensionale Zell-/ Gewebeentwicklung/-anpassung als Konduktion und / oder Induktion sowie spaltüberbrückende und gerüstausfüllende Integration durch An- bzw. Heranwachsen bzw. Volumenausfüllung findet so quasi nicht statt. Außerdem wird bei all diesen Anordnungen der gravitative Aspekt bei der Zell-/ Gewebeentwicklung vernachlässigt bzw. durch Fluidanordnungen aufgehoben, obwohl das atypische „Abflachen" von kultivierten Zellen auf dem Boden von Kulturschalen bzw. auf nichtorganischen Membranen hinreichend bekannt ist.
Die räumliche Verteilung von Zellen/Geweben inklusive der extrazellulären Matrix (= EZM) auf dreidimensionalen Formkörpern, d. h. die Besiedelung von Implantaten mit vorzugsweise autologen Zellen, sowie deren zeitlichen Abfolgen bezüglich der Schichtbildung, Vernetzung und EZM erfordert im Unterschied zu den oben genannten Techniken, Anordnungen und Verfahren eine Transformation der planaren Stimulations- /Suppressionsmodelle/-anordnungen/-verfahren in den in vitro abgebildeten in situ dreidimensionalen Raum. Dafür muss die Gesamtbesiedlungsfläche daher sinnvollerweise erst topographisch in Teilflächen aufgelöst werden.
Im Unterschied zu den fluidischen Bioreaktoren, die chemotaktische Gradienten in Gestalt von Wachstumsfaktoren einbringen, sowie mittels der fluidikbasierten Mechanotransduktion der Zellen stimulativ wirken, ist eine in situ nahe Besiedlung von dreidimensional geformten Implantaten bzw. deren in vitro Simulation für eine in situ / in vivo Stimulation und / oder Suppression ohne eine echte, orts- und zeitaufgelöste, variierende Applikation von auch in in situ anwendbaren Gradienten, variabel in Art, Betrag, Richtung und zeitlichem Verlauf, notwendig.
Das Verfahren einer in situ-nahen Besiedlung der Implantatoberfläche mit autologen Zellen senkt zugleich nicht nur das Risiko einer Entzündung (Inflammation) durch die Bildung von Biofilmen auf unbesiedelten, freien Oberflächen sondern beschleunigt auch die Sekundärverankerung der Implantate in situ.
Die Relevanz der Verwendung von autologen Zellen zur Vorbesiedlung der Implantate hat sich in experimentellen Monitoringversuchen zur Evaluierung der Bioaktivität von Implantatoberflächen gezeigt. Die Varianz bzw. Standardabweichung der Adhäsions-, Proliferations-, Migrations- und Differenzierungseigenschaften von patientenspezifischen Zellen mit unterschiedlicher genetischer Prädisposition bzw. pathologisch bedingten Veränderungen (StoffwechselVKreislauferkrankungen, Diabetes, Alkohol-, Nikotin-, Drogenmissbrauch etc.) ist dabei gegenüber verschiedenen bioaktiven Implantatoberflächen teilweise dominanter als die Varianz bzw. Standardabweichung der Bioaktivität unterschiedlicher Implantatoberflächen gegenüber einer immortalisierten Zelllinie.
In der Praxis bedeutet dies, dass es nicht unbedingt nur eine optimale bioaktive Oberfläche z. B. für die Adhäsion humaner Osteoblasten geben muss, sondern patientenindividuell verschiedene bioaktive Oberflächen jeweils optimal sein können. Die mit einer solchen Individualmedizin möglicherweise einhergehende Kostenexplosion der Implantationsmedizin aufgrund einer, zugespitzt formuliert, individuellen Implantatbereitstellung seitens der Industrie bzw. Implantatoberflächenmodifikation seitens der Industrie generell und / oder der Implantologen, lässt eine patientenspezifische bzw. individualmedizinisch indizierte, in vitro evaluierte und validierte Stimulation von autologen, humanen Zellen / Zelllinien in vitro bzw. in situ als kosten- und risikosenkende Alternative erscheinen. Dies trifft auch auf die Nutzung solcher Anordnungen und Verfahren für eine patientenspezifische bzw. individualisierte Stimulation / Suppression von Differenzierungs- / Dedifferenzierungs- sowie Migrations- / Metastaseverhalten / -potentialen von gesunden und karzinogenen Zellen und Geweben in der Onkologie zu.
Die aus der o. g. Patent- und Fachliteratur bekannten und teils auch bereits im praktischen Einsatz befindlichen suppressiven und stimulativen Methoden und Verfahren unterscheiden sich im jeweilig an den Oberflächen, den Grenzflächen oder in den Formkörpern wirkenden Gradienten:
- akustische oder mechanische Stosswellen oder Ultraschall (Mechanotransduktion) inkl. Vibration und Fluidik,
- positive wie negative Gravitation,
- Spaltsituationen (Kohäsion, Adhäsion),
- Oberflächenspannung/-energie an der Grenzfläche,
- elektrische Felder DC/AC (DC = Gleichspannung / AC = Wechselspannung) - isoliert, elektrische Felder DC/AC - leitend, - elektromagnetische und / oder magnetische Gleich- und Wechselfelder,
- Chemotransduktion.
Die stimulativen und suppressiven Gradienten beim Bone- und Soft-Tissue (Knochen- und Weichgewebe) Management sollten sich prinzipiell an den körpereigenen systemimmanenten Gradienten orientieren, welche auch im Organismus auftreten können.
Aus diesem Grund macht es wenig Sinn in vitro Signalarten, -formen und -stärken zu evaluieren und validieren, welche in situ systembiologisch nicht erzeugt werden und prinzipiell auch künstlich topisch nicht eingebracht werden können. Diese Entscheidung begründet sich dadurch, dass das Einbringen von stimulativen und / oder suppressiven Gradienten immer nur als Additive zu den körpereigenen Heilungs- und Wachstumsprozessen verstanden werden müssen. Dieser additive Charakter ist die Prämisse jeder Methode. Das additive Verfahren muss sich immer in den Grenzen des körpereigenen systembiologischen generativen Verfahrens bewegen. Des Weiteren sind im topischen Therapiebereich immer verschiedene Zellentitäten vorhanden, welche sich bei generativen oder regressiven Prozessen gegenseitig bedingen und chemotaktisch beeinflussen. Es macht wenig Sinn nur einen Zelltyp zu stimulieren, wenn andere Zelltypen supprimiert werden. Selbiges trifft auf die Nachbarschaft und die Wechselwirkung von Bone und Soft-Tissue zu.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Möglichkeit für eine topische in vitro Stimulation von Zellen oder Geweben vorzuschlagen, bei der, ausgehend von einem Zellsubstrat, gezielt ein vorhandener Spalt überwachsen wird.
Die Aufgabe wird durch eine Stimulationszelle zur in vitro Stimulation von Zellen oder Geweben gelöst, die einen Korpus beinhaltet, durch den ein Innenraum umfasst ist. Der Korpus weist je ein Oberteil und ein Unterteil auf. Die Stimulationszelle weist außerdem mindestens einen Aktor zum Hervorrufen einer stimulierenden Wirkung auf mindestens einen Anteil der Zellen oder Gewebe auf. Eine erfindungsgemäße Stimulationszelle ist dadurch gekennzeichnet, dass in dem Innenraum eine Aufnahmevorrichtung zur Aufnahme eines Zellsubstrats und eines Trägers angeordnet ist, wobei nach einer Aufnahme des Zellsubstrats und des Trägers durch die Aufnahmevorrichtung ein Spalt zwischen einander zugewandten Oberflächen des Zellsubstrats und des Trägers verbleibt. Der mindestens eine Aktor ist zur Erzeugung eines elektromagnetischen oder magnetischen Gradienten ausgelegt ist, der sich entlang einer imaginären Ausbreitungslinie eines steuerbaren räumlichen Gradientenfeldes erstreckt und die imaginäre Ausbreitungslinie von dem Zellsubstrat zu dem Träger verläuft.
Unter dem Begriff der Stimulation wird jede Einwirkung auf biologische Vorgänge wie das Wachstum, die Migration oder die Proliferation verstanden. Stimulationen können auch neutral oder negativ (Suppression) wirken. Die Stimulationszelle ist daher auch als Suppressionszelle verwendbar.
Anteile von Zellen oder Geweben können räumlich auf einem Zellsubstrat abgrenzbare Zellen oder Gewebe, z. B. Zellen oder Gewebe, die auf einer bestimmten Teilfläche eines Zellsubstrats getragen sind, sein. Es können auch bestimmte Zell- oder Gewebetypen sein, die stimuliert sind.
Unter einem Aktor sind nachfolgend alle Mittel zu verstehen, durch die mindestens ein Gradient einer stimulierenden Wirkung auf die Zellen oder Gewebe hervorgerufen werden kann. Stimulierende Wirkungen können fördernd (positiv), suppressiv (negativ) oder neutral sein. Stimulierende Wirkungen können vorzugsweise durch elektrische, elektromagnetische, magnetische, chemische oder physikalische Stimuli hervorgerufen werden. Der Aktor ist vorzugsweise so ausgeführt, dass der Gradient der durch ihn hervorgerufene stimulierende Wirkung (Stimuli) räumlich definiert, gerichtet und intensitätsvariabel auf das Wachstum der Zellen und Gewebe einwirkt. Der Gradient kann in seinen Eigenschaften, wie z. B. seiner Signalform, Stärke, Betrag, Intensität, Richtung und Ausdehnung, hervorgerufen und veränderlich (dosierbar) sein.
Unter einem Gradienten wird hier die Veränderung einer physikalischen Größe entlang eines Weges verstanden. Beispielsweise nimmt die Magnetfeldstärke eines Magnetfeldes mit der Entfernung von der Quelle des Magnetfeldes ab. In der Praxis ist ein Gradient nur als ein räumliches Gebilde erzeugbar, dass hier als Gradientenfeld bezeichnet wird. Das Gradientenfeld ist im Idealfall symmetrisch um eine Achse ausgebildet. Diese Achse wird hier zu Zwecken der anschaulicheren Erläuterung der Erfindung als imaginäre Ausbreitungslinie bezeichnet, durch die der oben genannte Weg vereinfacht dargestellt ist. Eine Richtungsangabe des Verlaufs der imaginären Ausbreitungslinie (z. B. vom Zellsubstrat zum Träger) ist neutral zu verstehen. Ein Gradient kann vom Zellsubstrat in Richtung auf den Träger zu- bzw. abnehmen. Er kann auch als ein wechselnder Gradient ausgebildet sein, d.h. die Richtung seiner Zu- oder Abnahme kann wechselnd sein. Ein erzeugter Gradient wirkt vorzugsweise auch in dem Zellsubstrat, um die dort vorhandenen Zellen und / oder Gewebe zu beeinflussen, z. B. zu stimulieren. Im Folgenden wird zur Vereinfachung lediglich auf jeweils eine imaginäre Ausbreitungslinie Bezug genommen. Es ist den Fachmann klar, dass in einer erfindungsgemäßen Stimulationszelle eine Mehrzahl von imaginären Ausbreitungslinien vorhanden sein können. Diese können zueinander parallel verlaufend vorhanden sein. Sie können in weiteren Ausführungen der Stimulationszelle auch voneinander verschiedene Raumlagen (nicht parallel zueinander) besitzen.
Der Träger ist vorzugsweise ein Formkörper, z. B. ein Implantatformkörper (Scaffold). Der Träger kann grundsätzlich aus jedem Material bestehen. Vorzugsweise sind Träger aber Formkörper aus mindestens einem biodegradierbaren Material, aus mindestens einem nicht-biodegradierbaren Material oder aus einer Kombination dieser Materialien oder Gewebeersatzstoffe, wobei letzteren eine Form gegeben ist.
Unter der Oberfläche des Trägers ist sowohl eine äußere, einen Umriss des Formkörpers bestimmende, Oberfläche zu verstehen, als auch eine innere Oberfläche, wie sie insbesondere bei Formkörpern aus porösem Material oder bei Formkörpern, aufweisend Vertiefungen und Hohlformen, zu finden ist.
Die Begriffe bio-degradierbar und degradierbar bedeuten, dass das betreffende Material durch biochemische Reaktionen des Gewebes (z. B. enzymatisch) sowie gegebenenfalls in Wechselwirkung mit biophysikalischen Prozessen abbaubar ist.
Das Oberteil und das Unterteil des Korpus können in weiteren Ausführungen der erfindungsgemäßen Stimulationszelle auch gleichartig, z. B. zwei Halbschalen, oder miteinander fest verbunden sein und einen geschlossenen Korpus, z. B. einen Zylinder, bilden. Durch weitere Gestaltungsformen können Unter- und Oberteil anders gestaltet sein, so dass eine klassische Trennung in Unter- und Oberteil aufgelöst ist.
In einer vorteilhaften Ausführung der erfindungsgemäßen Stimulationszelle ist mindestens eine Medienzuführung und mindestens eine Medienabführung an mindestens einer Seite des Innenraums zur Zu- und Abführung eines Mediums vorhanden.
Durch die Medienzuführung und die Medienabführung ist eine Überwachung der Vorgänge in der Stimulationszelle durch z. B. eine Analyse des zugeführten und des abgeführten Mediums ermöglicht. Das Medium ist vorzugsweise elektrisch leitend und dient der physiologischen Versorgung der Zellen oder Gewebe.
Nachfolgend werden unter dem Begriff des Wachstums von Zellen oder Geweben alle mit einem Wachstum verbundenen Prozesse, wie z. B. Zellmigration, Differenzierung und Proliferation, verstanden. Mit der erfindungsgemäßen Stimulationszelle sind daneben auch Prozesse wie das Absterben und der Abbau von Zellen (Apoptose, Suppression) stimulierbar und, optional, auch analysierbar.
Besonders vorteilhaft an der erfindungsgemäßen Stimulationszelle ist, dass ein gerichtetes Überwachsen des Spalts durch die Zellen bzw. durch das Gewebe bewirkt ist. Es ist ausdrücklich nicht erwünscht, dass der Träger durch Zellen besiedelt wird, die sich ungewollt aus dem Zellsubstrat lösen und zu dem Träger verdriftet werden. Ein sehr günstiger Effekt des gerichteten Überwachsens des Spalts liegt darin, dass nur diejenigen Zellen bzw. Gewebe den Spalt tatsächlich überwachsen, die eine Teilungsfähigkeit (Proliferationsfähigkeit) aufweisen. Zellen mit entsprechenden Defekten werden während des Vorgangs des Überwachsens des Spalts entlang der imaginären ausselektiert oder deren Anteil an der Gesamtzahl der überwachsenden Zellen wird zumindest deutlich reduziert. Außerdem sollen die Zellen, die nach dem Überwachsen des Spalts mit dem Träger in Kontakt gelangen, an diesem adhärieren. Je nach Material und Oberflächenbeschaffenheit sowie der vorliegenden Wachstumsbedingungen in dem Spalt wird auch die Adhäsion nur für einen Teil der Zellen erfolgreich sein. Der Träger ist im Ergebnis nahezu ausschließlich von Zellen besiedelt, die eine gute Teilungsfähigkeit und außerdem eine gute Fähigkeit zu Adhäsion an den betreffenden Träger aufweisen.
Die ermöglicht beispielsweise in vitro zu testen, welcher Träger für einen spezifischen Patienten überhaupt verträglich ist. Dazu kann das Zellsubstrat mit Zellen oder Gewebe des Patienten versehen sein. Es können, beispielsweise in parallel durchgeführten in vitro Test verschiedene Träger verwendet werden und der beste Träger, der dann auch schon mit patienteneigenen Zellen besiedelt ist, verwendet werden. Es kann dem Patienten auch ein entsprechender neuer, unbesiedelter Träger implantiert werden. Anhand der Ergebnisse der Test kann in vivo eine Besiedlung des Trägers unterstützt werden, indem die bei dem Test als vorteilhaft erkannten Gradienten im Bereich des Spalts zwischen Wundrands und Implantat (Träger) appliziert werden.
Die Zellen oder Gewebe können sowohl auf als auch in einem von dem Träger verschiedenen Zellsubstrat vorhanden sein und werden daher durch das Zellsubstrat getragen. Das Zellsubstrat ist in dem Innenraum der Stimulationszelle angeordnet.
Ein Zellsubstrat kann jedes Material oder jedes Stoffgemisch sein, durch welches Zellen bereitgestellt sind, beispielsweise besiedelte oder beimpfte Nährmedien wie Agarose, Alginat, Mono- und Kokulturen.
Die erfindungsgemäße Stimulationszelle ist auch zur Stimulation von Biofilmen, die beispielsweise durch Bakterien, Pilze, Algen und Protozoen gebildet sind, verwendbar. Außerdem können Mittel vorgesehen sein, mittels derer die Auswirkungen der Stimulationen erfassbar und analysierbar sind.
Träger und Zellsubstrat können im Verlauf des Wachstums mit einer großen Zahl von Zellen überdeckt werden, zwischen denen sich auch EZM ausbilden oder sich Gewebe differenzieren kann. Nachfolgend ist vereinfachend von Zellen die Rede, wobei aber alle möglichen zellbiologischen Strukturen und Einheiten sowie ein- und mehrzellige Organismen umfasst sein sollen.
In einer bevorzugten Ausführung der erfindungsgemäßen Stimulationszelle sind mindestens zwei Elektroden vorhanden. Diese sind zur Erzeugung räumlich und zeitlich definierter elektrischer und / oder elektromagnetischer Felder mit variabler Form, Betrag, Richtung und Intensität ausgestaltet. Die Elektroden sind ausgewählt aus einer Gruppe, umfassend gegen das Medium elektrisch leitende Elektroden, gegen das Medium elektrisch isolierte Elektroden und aus aus gegen das Medium elektrisch isolierten Elektroden und elektrisch leitenden Elektroden gebildeten Hybridelektroden. Hybridelektroden stellen eine Kombination elektrisch isolierter und elektrisch leitender Elektroden dar, entweder in dem Sinne, dass Teilbereiche der Hybridelektrode gegen das Medium isoliert und andere Teilbereiche nicht isoliert sind oder, dass beide Elektrodentypen separat vorhanden sind, allerdings im Gegensatz zur separaten Variante der beiden Elektrodentypen nur eine identische Ansteuermöglichkeit für beide Elektrodentypen besteht. Die Elektroden können segmentiert sein.
Es können in weiteren Ausführungen der Stimulationszelle auch Clusterelektroden vorhanden sein, die aus zueinander rasterförmig angeordneten Elektroden und / oder signaltechnisch ansteuerbaren Elektroden gebildet sind.
Es ist ferner möglich, dass der Stimulationszelle mindestens ein Magnetfelderzeuger als einen Aktor zugeordnet ist, so dass die Stimulationszelle mindestens über Bereiche in einem durch den Magnetfelderzeuger erzeugten Magnetfeld angeordnet ist. Der Magnetfelderzeuger kann entlang oder um die Stimulationszelle beweglich sein. Der Magnetfelderzeuger kann beispielsweise eine Magnetspule sein.
Beispielsweise kann der Magnetfelderzeuger als Aktor, aber auch andere Aktoren, gegenüber der Stimulationszelle sowie gegenüber dem Träger beweglich sein, wodurch mittels eines Aktors Gradienten aus wechselnden Richtungen erzeugbar sind oder ein Gradient über die Oberfläche des Trägers führbar ist.
Es ist ferner möglich, dass ein Hybridaktor vorhanden ist, durch den zeitgleich oder aufeinander folgend voneinander verschiedene Gradienten hervorrufbar sind. Beispielsweise können durch einen Piezo-Stack sowohl elektrische als auch mechanische Gradienten hervorgerufen sein. Die Gradienten können gleicher oder verschiedener Natur sein, z. B. kann ein elektrischer Gradient und ein mechanotransduktorischer Gradient durch einen Hybridaktor hervorgerufen sein.
Der Aktor ist vorteilhaft so beschaffen, dass die von dem Aktor hervorgerufene stimulierende Wirkung bestimmten Teilbereichen des Zellsubstrats zugeordnet und auf diese begrenzt ist. Je nach Lage dieser Teilbereiche und Ausprägung der stimulierenden Wirkung, ist eine gerichtete Besiedlung des Trägers nur auf einer Teilfläche einer Oberfläche des Trägers stimuliert.
Zu diesem Zweck können die Elektroden segmentiert ausgebildet sein. Durch eine Segmentierung ist eine Erzeugung von elektromagnetischen oder magnetischen Feldern mit räumlich bestimmter Ausprägung, z. B. des Verlaufs der Feldlinien sowie der Verteilung der Feldstärken, räumlich wesentlich aufgelöster möglich als mit unsegmentierten Elektroden.
In dem Innenraum kann mindestens eine Aufnahmevorrichtung zur Aufnahme des Trägers oder eines Zellsubstrats angeordnet sein. Vorzugsweise ist die Aufnahmevorrichtung so ausgebildet, dass zwischen einer Oberfläche eines in der Aufnahmevorrichtung befindlichen Trägers und einer Oberfläche eines in der Aufnahmevorrichtung befindlichen Zellsubstrats ein Spalt einstellbar ist, durch den die einander zugewandten Oberflächen des Trägers und des Zellsubstrats voneinander getrennt sind. In einer weiteren Ausführung können auch mindestens zwei Aufnahmevorrichtung so angeordnet sein, dass zwischen einer Oberfläche eines in einer Aufnahmevorrichtung befindlichen Trägers und einer Oberfläche eines in einer anderen Aufnahmevorrichtung befindlichen Zellsubstrats ein Spalt einstellbar ist, durch den die Oberflächen des Trägers und des Zellsubstrats voneinander getrennt sind. Der Träger und das Zellsubstrat können auch gemeinsam in einer entsprechend ausgebildeten Aufnahmevorrichtung gehalten sein. Vorzugsweise ist durch mindestens eine der Aufnahmevorrichtungen eine Positionierung des Trägers und / oder des Zellsubstrats in dem Innenraum ermöglicht.
Eine bevorzugte Ausführung der erfindungsgemäßen Stimulationszelle ist dadurch gegeben, dass der Träger und mindestens ein Gradient relativ zueinander beweglich sind. Dies kann durch Relativbewegungen des Trägers, des Aktors oder als kombinierter Bewegungsablauf beider ermöglicht sein.
In einer weiteren Ausführung der erfindungsgemäßen Stimulationszelle ist der Träger temporär mit mindestens einem magnetischen Körper oder einem magnetisierbaren Körper in mittelbaren oder unmittelbaren Kontakt stehend angeordnet. Dieser magnetische Körper oder magnetisierbare Körper liegt mindestens teilweise im Bereich der Feldlinien eines primären magnetischen Feldes, so dass in dem magnetischen Körper oder dem magnetisierbaren Körper durch das primäre magnetische Feld ein sekundäres magnetisches Feld veränderbar ist. Unter einer Veränderung des sekundären magnetischen Felds wird auch dessen Erzeugung, z. B. bei einer Magnetisierung eines magnetisierbaren Körpers, verstanden. Das sekundäre magnetische Feld ist beispielsweise als Quelle einer Induktion nutzbar. Ein Spalt im Sinne dieser Beschreibung ist ein räumlicher Spalt. Dieser liegt vor, wenn Trägerobjekt und Zellsubstrat tatsächlich voneinander beabstandet angeordnet sind. Es ist bevorzugt, dass mindestens eine der Aufnahmevorrichtungen eine Positionierung des Trägers und / oder des Zellsubstrats in dem Innenraum ermöglicht. Der Spalt weist eine Spaltbreite auf, die vorzugsweise bis zu einer Spaltbreite von 3 mm einstellbar ist. Durch den Spalt ist eine in situ Situation zwischen einer Oberfläche eines Trägers, z. B. eines Implantatformkörpers, und einem Zellsubstrat, wie einem Gewebe, nachgebildet.
Um eine Analyse der Vorgänge in der Stimulationszelle zu ermöglichen, können die Elektroden als Messmittel zur Messung elektrischer Größen ausgestaltet sein. Es ist ferner möglich, dass weitere Messmittel zur Messung physikalischer Größen angeordnet sind.
Sehr günstig ist es, wenn eine Auswerte-, Speicher- und Steuereinheit vorhanden ist, die mit den Elektroden und weiteren Messmitteln verbunden ist. Die Auswerte-, Speicher- und Steuereinheit kann mit einer Datenbank in Verbindung stehen.
Physikalische Stimuli wie Druck oder Beschleunigungen sind einkoppelbar, wenn in einer vorteilhaften Ausführung die Stimulationszelle mit einem gesteuerten Antrieb verbunden ist, mittels dem die Stimulationszelle gesteuert bewegbar ist.
Die Aufgabe wird ferner durch ein Verfahren zur gerichteten Stimulation des Wachstums von Zellen oder Geweben eines Zellsubstrats in Richtung auf einen von dem Zellsubstrat durch einen Spalt getrennten Träger und zur Stimulation der Adhäsion von über den Spalt gewachsenen Zellen oder Geweben an dem Träger, gelöst. Das Verfahren umfasst die Schritte:
- Einbringen eines die Zellen oder Gewebe tragenden Zellsubstrats in einen Innenraum einer Stimulationszelle;
- Einlegen eines Trägers in eine Aufnahmevorrichtung in dem Innenraum der Stimulationszelle, wobei zwischen den sich zugewandten Oberflächen des Zellsubstrats und des Trägers ein Spalt erhalten wird;
- Einbringen eines Mediums zur physiologischen Versorgung der Zellen oder Gewebe in die Stimulationszelle;
- Hervorrufen mindestens eines dosierbaren, topischen elektromagnetischen oder magnetischen Gradienten mit einer das Wachstum der Zellen oder Gewebe stimulierenden Wirkung, der sich entlang einer imaginären Ausbreitungslinie eines steuerbaren räumlichen Gradientenfeldes erstreckt und
- Ausrichten der imaginären Ausbreitungslinie derart, dass diese durch den Spalt von dem Zellsubstrat zu dem Träger verläuft.
Die stimulierende Wirkung kann bestimmten Teilbereichen des Zellsubstrats zugeordnet und auf diese begrenzt hervorgerufen werden. Dabei ist es günstig, wenn eine räumlich gerichtete Besiedlung bestimmter Teilbereiche der besiedelbaren Bereiche, z. B. über einen Spalt hinweg, stimuliert ist.
Das Medium kann gesteuert zugeführt werden, um das Medium regelmäßig zu erneuern. Es können verschiedene Medien zugeführt werden.
Die stimulierende Wirkung ist ausgewählt aus der Erzeugung elektromagnetischer Felder, elektrischer Felder, magnetischer Felder und der Einkopplung physikalischer Stimuli.
In einer vorteilhaften Ausführung werden Messgrößen, deren Messwerte infolge von Reaktionen der Zellen und Gewebe auf die stimulierende Wirkung veränderlich sind, erfasst und gespeichert. Es können initiale Messwerte mindestens einer Messgröße zu einem initialen Messzeitpunkt erfasst und gespeichert werden und die initialen Messwerte als Referenzmesswerte für zu späteren Messzeitpunkten erfassten Messwerten verwendet werden.
Es ist ferner möglich, dass aus den Veränderungen der zu verschiedenen Messzeitpunkten erfassten und gespeicherten Messwerten Informationen über das Wachstum der Zellen oder Gewebe abgeleitet werden. Die Messwerte können zeit- oder ortsaufgelöst oder zeitlich-örtlich aufgelöst erfasst werden. Zudem können die erfassten Messwerte graphisch dargestellt werden und die Informationen über das Wachstum der Zellen oder Gewebe aus der graphischen Darstellung abgeleitet werden. Ein Abgleich der Informationen mit einer Datenbank ist möglich.
Vorteilhafterweise können auf Grund der Messwerte Steuersignale zur Ansteuerung des Aktors generiert werden, um den Gradienten zu verändern. Dadurch ist es möglich, gezielt auf das Wachstum der Zellen oder Gewebe zu reagieren. In einer weiteren Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann zwischen dem Zellsubstrat und dem Träger ein Spalt mit einer Spaltbreite eingestellt werden.
Mittels der Erfindung wird eine Testanordnung mit gegenüberliegenden Grenzschichten inklusive Spaltbereich geschaffen, in dem ein mehrdimensionales Verfahren zur Stimulation von in vitro ZellVGewebewachstum in einer definierbaren Grenzflächensituation zwischen einem gewebeähnlichen Bereich und einem Bereich in Gestalt von degradierbaren bzw. nicht degradierbaren Implantatoberflächen und / oder Gewebeersatzstoffen realisiert werden kann. Prinzipiell sollen damit medizinisch anzuwendende Verfahren auf ihre bioaktiven und / oder antiinflammatorischen Wirkungen bezüglich humaner Zellen (Osteoblasten, Endothelzellen, Plattenepithelzellen, Fibroblasten, etc.) sowie Bakterien, Pilze und anderer mikrobieller Organismen, die einen Biofilm bilden können, simulativ evaluiert und validiert, sowie stimulativ und / oder suppressiv zur biologischen in vitro analog zur in situ Situation und / oder in vivo in der aktuellen in situ Situation angewendet werden.
Um der zu simulierenden in situ Situation maximal nahe zu kommen, soll die Stimulationszelle:
- in allen räumlichen Dimensionen drehbar sein, um gravitative Aspekte des Zell- und Gewebewachstums auszuschließen,
- definiert wipp-, kipp-, taumel-, ping-pong- und kreisschüttelbar sein, um Zell- und Gewebewachstumsprozesse sowie auch die Biofilmentwicklung unter normalen, alltäglichen und / oder definierten Körperbewegungssituationen, wie beispielsweise bei der Physiotherapie simulieren zu können,
- definierten Gradienten (beispielsweise Druck, Kraft und Oberflächenspannung) aussetzbar sein, die körperlichen Belastungssituationen in situ vergleichbar sind,
- über Aufnahme- und Entnahmesysteme in Gestalt von Fassungen, Fixierungen und Aufnahmeräumen für jeweils unterschiedliche, austauschbare Träger, z. B. Implantatformkörper und Gewebeersatzstoffe, sowie für unterschiedliche Mono- und Kokulturen in Gestalt von beispielsweise Alginat- oder Agaroseblöcken besitzen, - über mindestens eine Medienzuführung und eine Medienabführung für die generelle Versorgung der Zell- und Gewebewachstumsprozesse sowie auch die Biofilmentwicklung mit Nähr- und Sauerstoff für in vitro Langzeittest sowie für ein mikrobiologisches und / oder biochemisches Mikrotröpfchenmonitoring verfügen,
- einen Höhen-, Breiten- bzw. Abstandsverstellmechanismus für unterschiedlich dicke bzw. große, austauschbare Implantate und / oder Gewebeersatzstoffe (Träger) sowie für die Einstellung des definierten Abstands zu einem der Trägeroberfläche gegenüberliegenden Zellsubstrat sowie zu den Aktoren besitzen,
- über definierte fixe und / oder räumlich veränderliche, austauschbare Elektroden- und / oder Spulenanordnungen inklusive zu applizierender Stimulationsprofile (workflows) verfügen
- sowie, gegebenenfalls optional, mittels der erfindungsgemäßen Stimulationszelle ein biophysikalisches, nichttestabbrechendes Monitoring- / Controllingmessverfahren durchführbar sein, welches komplementär und komparativ zu den mikrobiologischen Standardtest- und Prüfverfahren benutzt werden kann, um Bibliotheken zu erstellen und den Verlauf zu dokumentieren, mit dem Ziel, auf zeit- und kostenaufwändige mikrobiologische Testverfahren verzichten zu können.
Hintergrund der Erfindung ist dabei eine in vitro / in vivo / in situ Simulation, Evaluierung und Validierung von Stimulations- und Suppressionsverfahren für die in vitro bzw. beschleunigte in situ Besiedlung von Implantaten mit autologen, humanen Zellen und Geweben, z. B. für eine verbesserte und / oder beschleunigte Ossifikation, Osteogenese und / oder Osseointegration von Trägern unterschiedlicher Entwickler und Hersteller mit möglichst geringem in vivo Einsatz.
Ziel der Erfindung ist es, mittels einer Aktor- und optionalen Sensor- Verfahrensanordnung zur Erzeugung und gegebenenfalls Messung biophysikalischer / (bio-)elektrischer / (bio-)magnetischer Parameter eine mehrdimensionale, statische oder dynamische Stimulation mit optionalem Monitoring des Zell-/Gewebe-/mikrobiellen Wachstums bei in-vitro-Tissue-Management-Prozeduren an bzw. in funktionalen, bioaktiven Trägeroberflächen und / oder Gewebeersatzstoffen zu ermöglichen.
Dazu erfolgt in vitro eine Applizierung topischer Gradienten an humanen, autologen, immortalisierten und / oder veränderten Zellen und Geweben, die in Art, Signalform, Richtung und Betrag sowie im räumlich-zeitlichen Verlauf variierbar sind, vorzugsweise an dreidimensionalen Trägern zur Stimulation des Zell- und Gewebewachstums- sowie von Biofilmbildungsprozessen durch mikrobielle Organismen. Die Zellen oder Gewebe sind dabei bereits auf dem Träger vorhanden oder gelangen in einen Wirkungsbereich eines auf der Oberfläche des Trägers hervorgerufenen Gradienten.
Es erfolgt
- eine in vitro Simulation von physiologischen oder additiv applizierten in vivo Stimulationsprozessen des Zell- und Gewebewachstums sowie der Biofilmbildung durch mikrobielle Organismen,
- eine Evaluierung und Validierung von topischen Gradienten an Oberflächen und / oder in und an Scaffolds in vitro,
- eine Optimierung des Verfahrens und Anpassung der Aktoranordnung in vitro an die in vivo bzw. in situ Situation,
- eine Extrapolation der in vitro Simulation auf die in situ Situation mit, gegebenenfalls auch nachgelagerten, ex vivo und insbesondere nachgelagerten in vivo Verfahrenskomponenten,
- eine definierte Besiedlung von Implantatkörpern beziehungsweise deren Oberflächen beziehungsweise von resorbierbaren und / oder nicht resorbierbaren Scaffolds mit autologen Zellen und Geweben zur individualmedizinischen Optimierung der Primär- und Sekundärverankerung von Implantaten und zur Vermeidung von Inflammationen durch mikrobielle Biofilmbildung auf unbesiedelten Trägerbereichen wie Implantatoberflächen oder Scaffoldinnenräumen, - eine gezielte Beeinflussung von Adhäsion, Proliferation, Migration oder Differenzierung/ Dedifferenzierung von Zellen, Zellverbänden, Zellschichten sowie der Entwicklung der extrazellulären Matrix und
- eine gezielte Beeinflussung der Gewebsstruktur/-geometrie im Sinne einer definierten Zellausrichtung mit anschließender Ausbildung eines gerichteten Gewebeverbunds.
Es ist möglich, eine mittels einer in vitro erfolgten Simulation gefundene Anordnung des Aktors oder mehrerer Aktoren sowie ein Workflow auf Situationen und Anwendungen in vivo zu extrapolieren. Insbesondere können solche Anordnungen und workflows auf am Körper tragbare oder implantierbare Vorrichtungen übertragen und angewendet werden.
Anordnungsgemäß ist die äußere Gestalt der Stimulationszelle in ihren Dimensionen und ihre Form sowie deren Aktoranordnung so zu gestalten, dass der Träger in seinen in situ Dimension aufgenommen werden kann. In der Regel ist sie dafür als ein Quader mit Aufnahmevorrichtungen für den Träger ausgebildet. Bei rotationssymmetrischen oder sphärischen Trägern ist eine Zylinder-, Halbkugel- oder Kugelform sowie Kombinationen daraus vorteilhaft.
Anordnungsgemäß ist die äußere Stimulationszelle gegenüber dem innenliegenden Träger fix ausgestaltet. Der von den Wänden der Stimulationszelle umschlossene Träger kann fix oder beweglich gelagert sein. Für besondere Hohlkörper kann die Anordnung auch invers ausgebildet sein, d.h. es können Teile der Stimulationszelle in z. B. Hohlräume des Trägers ragen.
Anordnungsgemäß ist der mindestens eine Aktor so angeordnet, dass er die Gesamtoberfläche des Trägers vorzugsweise in Teilflächen zerlegend mit biostimulativen beziehungsweise suppressiven Gradienten definiert in Richtung, Betrag und Signalform erreichen kann, ohne dass auf einzelne, im Innenraum anders liegende Teilbereiche mit abweichenden, weniger biostimulativen beziehungsweise suppressiven oder gar dem erfindungsgemäßen Anwendungsnutzen entgegenwirkenden Gradienten eingewirkt wird. Bei planaren Oberflächen können die Teilbereiche maximal erweitert werden oder zusammenfallen. Anordnungsgemäß erfolgt in vitro die Applizierung topischer elektrischer, elektromagnetischer und mechanotransduktiver Gradienten / Stimuli über Aktoren innerhalb wie außerhalb der Stimulationszelle, die mindestens in einer Dimension an den Wänden beziehungsweise im Zentrum der Stimulationszelle angeordnet sind. Elektrische Stimuli werden über räumlich und zeitlich Stimulationsbereichen zugeordneten Elektrodenanordnungen eingebracht. Gravitative, mechanotransduktive sowie Beschleunigungsgradienten können über eine entsprechende, vorzugsweise dreh-, kipp- und / oder schwingbare, äußere Lagerung der Stimulationszelle in die Stimulationszelle eingebracht sein. Oberflächenspannungs- sowie Oberflächenenergiegradienten können mittels temporär an oder in dreidimensionalen Implantatformkörpern platzierbaren magnetisierbaren Elementen, z. B. Schichten, Hüllen oder Zylindern, über definiert zugeordnete magnetische Aktoren oder mechanische Belastungseinrichtungen appliziert werden.
In der Regel sind die elektrisch, beziehungsweise elektromagnetisch, wirksamen Aktoren in Gestalt von gegenüber dem leitfähigen Medium innerhalb der Stimulationszelle elektrisch leitenden und / oder elektrisch isolierten Elektroden sowie als Magnetfeldspulen, z. B. paarweise an den Innen- oder Außenwänden der Stimulationszelle sich gegenüberstehend, angeordnet. Die Spulenanordnung kann auch den Innenraum in mindestens einer Ebene umschließend ausgebildet sein. Die Feldgeometrie der von den Magnetfeldspulen hervorgerufenen Magnetfeldern ist variierbar.
Elektroden können als elektrisch leitende, nicht-isolierte Elektroden ausgeführt sein, wodurch ein Stromfluss zwischen mindestens zwei Elektroden und durch das Medium ermöglicht ist. Mittels nicht-isolierter Elektroden sind auf Stromfluss beruhende Messungen durchführbar. Sind die Elektroden elektrisch isoliert gestaltet, können mit diesen elektrische und / oder elektromagnetische Felder in dem Innenraum erzeugt und zur Messung verwendet werden. Die Elektroden können in verschiedenartigen Formen ausgebildet, z. B. streifen-, platten- oder punktförmig oder zu sogenannten Clustern zusammengefasst, sein. Die Elektroden können fest angeordnet oder frei in dem Innenraum positionierbar sein. Dadurch ist vorteilhaft eine hohe Flexibilität bei der Gestaltung der Messanordnungen gegeben. Es können mehrere nicht-isolierte Elektroden, mehrere isolierte Elektroden und Hybridelektroden angeordnet sein. Von Vorteil ist es, wenn die Form, Anordnung und die Art und Weise der Erzeugung der elektromagnetischen Felder eine ortsaufgelöste Erfassung der Messgrößen erlaubt. Die Elektroden können auch segmentiert sein. Dies kann beispielsweise durch eine räumlich definierte Anordnung einer Anzahl von Elektroden erreicht sein, wobei aus den Unterschieden der Messgrößen je Elektrode und der Kenntnis der Anordnung der jeweiligen Elektroden ein Ort der Erfassung der Messgrößen ableitbar ist.
Anordnungsgemäß kann an jeder beliebigen Teilfläche des Zellsubstrats der biostimulative und / oder suppressive Gradient in Gestalt einzelner Gradienten, Gradientenüberlagerungen und / oder Gradientenumlenkung durch Hilfsgradienten/- felder in Betrag, Richtung und Form topisch definiert und appliziert werden.
Anordnungsgemäß ermöglicht die, beispielsweise axial- und / oder planarsymmetrische, Verteilung und Platzierung der Aktoren in mindestens einer und vorzugsweise in allen drei Raumachsen verfahrensgemäß eine topisch definierte Applizierung der (bio- ) stimulativen Gradienten an definierten Teilflächen des Trägers. So können bisher bekannte oder neue Stimulationsverfahren, die vorzugsweise in einer Dimension wirksam sind, mittels der Gesamtanordnung sowie einer räumlich-zeitlich topisch transformierenden Signal- und Aktorsteuerung auf dreidimensionale Träger angewendet werden.
Anordnungsgemäß ist über die Fixierung des dreidimensionalen Trägers innerhalb der Stimulationszelle auch über messtechnische Hilfsmittel, die Topographie bzw. deren Teilflächenauflösung des Formkörpers und deren räumliche Zuordnung zur Verteilung und Ausgestaltung der Aktoren zu gewährleisten, indem das Teilkoordinatensystem des Trägers in das Hauptkoordinatensystem der Stimulationszelle in der nachgelagerten Auswerte-, Speicher- und Steuereinheit integriert und als Dualoberflächensystem (Innenoberfläche der Zelle zur Außenoberfläche des Trägers) berechnet wird.
Anordnungsgemäß kann es sinnvoll sein, dass die Aufnahmevorrichtung des Trägers so ausgestaltet ist, dass der Träger selbst als Teil der Stimulationsaktorik bzw. der optionalen Monitoringsensorik fungiert. Elektrische Stimuli können, beispielsweise unter Nutzung eines leitfähigen Trägers oder eines leitfähigen Teilbereichs des Trägers als Elektrode, eingebracht werden. Gleichermaßen kann der leitfähige Träger oder dessen Teilbereich auch als Messelektrode für das Monitoring dienen. Mechanische Stimuli können beispielsweise auch durch direkte örtliche Beeinflussung (z. B. durch Bewegungen, Drehungen oder Vibrationen) des Trägers eingebracht werden.
Anordnungsgemäß kann es sinnvoll sein, dass der Träger an seinen Fixationspunkten mit der Stimulationszelle beweglich angeordnet ist, so dass eine Rotation bzw. Verschiebung dessen Oberfläche gegenüber den stimulierenden Feldern möglich ist, mit dem Ziel, einen größeren Teil oder auch die gesamte Oberfläche des Trägers in die Richtung der stimulierenden Felder zu bringen bzw. zu verschiedenen Gradienten dieser Felder ausrichten zu können.
Anordnungsgemäß kann es sinnvoll sein, dass durch den Aktor mehrere Stimuli-Typen gleichzeitig applizierbar sind. So könnten als Elektroden ausgebildete Piezo-Stacks gleichzeitig elektrische und mechanische Stimuli oder magnetisch bewegte Körper oder magnetisierbare Schichten gleichzeitig magnetische und mechanische Stimuli applizieren.
Zur Anregung der Anordnung können sowohl definierte Einzelfrequenzen als auch ganze Bänder von Frequenzen im Sinne eines Frequenzdurchlaufs sowie Gleichsignale verwendet werden. Die anregenden Signale können außerdem in ihren Amplituden und ihrer Signalform variiert werden. Die in der Anordnung vorgesehenen Elektroden können in mehrerlei Hinsicht variiert und unterschieden werden. Zum einen hinsichtlich Ihrer Verbindung mit einer leitfähigen Nährlösung / einem Medium in leitende (nasse) und nichtleitende (trockene) Elektroden in Gestalt elektrisch isolierter Elektroden wie auch als elektrisch leitende, galvanische Elektroden, zum anderen hinsichtlich ihrer Geometrie, z. B. in Punkt-, Linien-, und Flächenelektroden, sowie ihrer Anordnung untereinander, z. B. in Einzelelektrodenanordnungen, Rasteranordnungen und freie Anordnungen. Weiterhin lassen sich theoretisch beliebige Kombinationen der vorgesehenen Elektroden zur Anregung verwenden. Vorteilhafterweise werden dazu die Aktoren untereinander oder mit unterschiedlichen Einzelelektroden eines Rasters über der Oberfläche bzw. unter einem besäten Träger (Gradientenerzeugen entlang des Trägers) oder einer Auswahl von Elektroden der Raster realisiert.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen und Abbildungen näher erläutert. Es zeigen: Fig. 1 ein erstes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Stimulationszelle in einer seitlichen Schnittzeichnung;
Fig. 2 das erste Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Stimulationszelle in der Draufsicht auf das Unterteil der Stimulationszelle;
Fig. 3 das erste Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Stimulationszelle in der Draufsicht auf die Stimulationszelle mit aufgesetztem Oberteil;
Fig. 4 ein erstes Ausführungsbeispiel eines Aktors mit elektrisch isolierten und elektrisch leitenden Elektroden;
Fig. 5 ein zweites Ausführungsbeispiel eines Aktors mit elektrisch isolierten und elektrisch leitenden Elektroden als eine Hybridelektrode;
Fig. 6 ein drittes Ausführungsbeispiel eines Aktors mit elektrisch isolierten und elektrisch leitenden Elektroden als eine Clusterelektrode;
Fig. 7 ein zweites Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Stimulationszelle mit einer vertikal angeordneten Magnetfeldspule;
Fig. 8 ein drittes Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Stimulationszelle mit einer horizontal angeordneten Magnetfeldspule;
Fig. 9 ein viertes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Stimulationszelle mit einer horizontal angeordneten Magnetfeldspule;
Fig. 10 ein fünftes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Stimulationszelle in einer seitlichen Schnittzeichnung mit Aufnahmevorrichtung;
Fig. 1 1 ein sechstes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Stimulationszelle in einer seitlichen Schnittzeichnung mit Aufnahmevorrichtung;
Fig. 12 ein siebentes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Stimulationszelle mit einem planaren magnetischem Körper in einer seitlichen Schnittzeichnung; Fig. 13 ein achtes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Stimulationszelle mit einem planaren magnetisierbaren Körper und Spalt in einer seitlichen Schnittzeichnung;
Fig. 14 ein neuntes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Stimulationszelle mit einem bogenförmigen magnetisierbaren Körper in einer seitlichen Schnittzeichnung;
Fig. 15 ein zehntes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Stimulationszelle mit einem bogenförmigen magnetisierbaren Körper und Spalt in einer seitlichen Schnittzeichnung;
Fig. 16 ein elftes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Stimulationszelle in Explosionsdarstellung und
Fig. 17 ein Array von sechs erfindungsgemäßen Stimulationszellen in Explosionsdarstellung.
Eine erste Ausführung einer erfindungsgemäßen Stimulationszelle gemäß Fig. 1 weist als wesentliche Elemente einen aus einem Unterteil 1 1 und einem Oberteil 14 bestehenden und einen Innenraum 10 umschließenden Korpus, sowie als Aktoren fungierende Elektroden 1 , die als elektrisch isolierte Elektroden 1 a an Außenseiten der Wände des Unterteils 1 1 und des Oberteils 14, sowie elektrisch leitende Elektroden 1 b an den Innenseiten der Wände des Unterteils 1 1 und des Oberteils 14 angeordnet sind. Ein als Träger 36 dienender Implantatformkörper (nicht gezeigt) aus einem biodegradierbaren Material ist in dem Innenraum 10 angeordnet. In einer seitlichen Wand des Unterteils 1 1 ist eine Medienzuführung 12 und in einer anderen Wand eine Medienabführung 13 zur Zu- und Abführung eines elektrisch leitenden Mediums M (nur angedeutet) in und aus dem Innenraum 10 vorhanden. Damit kann die Stimulationszelle an ein Pumpen- und Reservoir- sowie an ein Mikrotröpfchenentnahmesystem (alle nicht gezeigt) angeschlossen werden, um die Nährstoff- und Sauerstoffversorgung der Zellen und Gewebe zu gewährleisten. Außerdem ist mit einer solchen Anordnung eine definierte Druck- und Strömungsbelastungssituation im Spaltbereich temporär oder periodisch oder dauerhaft, beispielsweise für mechanotransduktive Simulation von Belastungs- und / oder Bewegungssituationen, erzeugbar. Aus Fig. 2 ist ersichtlich, dass alle Elektroden 1 rechteckig und planar ausgeführt sind und jeweils über Bereiche der Innen- beziehungsweise Außenwände des Unterteils 1 1 und des Oberteils 14 (siehe Fig. 3) reichen. In Stoßbereichen der seitlichen Wände des Unterteils 1 1 sind Sackbohrungen mit je einem Innengewinde 15.1 vorhanden, die eine lösbare Befestigung eines Oberteils 14 (siehe Fig. 3) mittels Schraubverbindungen erlauben. Der Träger 36 ist aus Gründen der Übersichtlichkeit nicht gezeigt.
Die Stimulationszelle mit aufgesetztem Oberteil 14 ist in Fig. 3 gezeigt. Korrespondierend zu den Sackbohrungen mit Innengewinde 15.1 (siehe Fig. 2) sind in dem Oberteil 14 Durchgangsbohrungen 15.2 vorhanden, durch die Schrauben (nicht gezeigt) steckbar und in die Sackbohrungen mit Innengewinde 15.1 eindrehbar sind. Dargestellt sind die elektrisch isolierten Elektroden 1 a des Oberteils 14 und der seitlichen Wände des Unterteils 1 1 , sowie Medienzuführung 12 und Medienabführung 13.
In Fig. 4 sind zwei Aktoren gezeigt, die je eine elektrisch isolierte Elektrode 1 a und eine elektrisch leitende Elektrode 1 b aufweisen. Die elektrisch leitende Elektrode 1 b ist von der elektrisch isolierten Elektrode 1 a umfangen und gegeneinander elektrisch isoliert. Beide Elektroden 1 sind unsegmentiert und können als globale Elektroden bezeichnet werden. Der quadratische gestaltete Aktor kann beispielsweise in Stimulationszellen gemäß Fig. 1 bis 3 an den Grundflächen des Unterteils 1 1 und / oder des Oberteils 14 angeordnet sein. Der rechteckig gestaltete Aktor kann an seitlichen Wänden des Unterteils 1 1 und / oder des Oberteils 14 angeordnet sein.
Eine Hybridelektrode umfasst gemäß des in Fig. 5 gezeigten Ausführungsbeispiels eine gegen das Medium M elektrisch isolierte Elektrode 1 a und eine elektrisch leitende Elektrode 1 b, die jeweils über Anschlüsse 18 ansteuerbar sind. Eine solche Hybridelektrode kann in dem Innenraum 10 einer Stimulationszelle angeordnet sein, wodurch an den Außenwänden der Stimulationszelle angeordnete Elektroden 1 (siehe z. B. Fig. 1 ) ersetzbar oder ergänzbar sind.
Eine als Clusterelektrode ausgeführte Elektrode ist in Fig. 6 schematisch dargestellt. Die Clusterelektrode besteht aus einer Anzahl von einzelnen elektrisch leitenden Elektroden 1 b, die, jeweils voneinander beabstandet, in einem Array angeordnet sind. Das Array (Clusterelektrodenanordnung) ist von einer äußeren Elektrode 16 (globale Elektrode) umfangen. Zwischen der äußeren Elektrode 16 und dem Array liegt ein als Umrandung 17 bezeichneter Bereich. Die Umrandung 17 kann entweder als ein elektrisch isolierender Bereich oder als eine Massereferenzelektrode ausgebildet sein. Jede der Elektroden 1 des Arrays und die äußere Elektrode 16 weist je einen Anschluss 18 auf und ist über eine Anschlussleitung 60 mit einer Auswerte-, Speicher- und Steuereinheit 65 verbunden (vereinfacht dargestellt).
In weiteren Ausführungen der erfindungsgemäßen Stimulationszelle kann das Array auch von elektrisch isolierten Elektroden 1 a oder von Hybridelektroden gebildet sein.
Eine Gegenelektrode zu einer Clusterelektrode kann eine weitere Clusterelektrode, eine flächig ausgebildete elektrisch isolierte Elektrode 1 a, eine flächig ausgebildete elektrisch leitende Elektrode 1 b (globale Elektroden) sowie eine Kombination der vorgenannten Elektroden 1 sein. Mehrere Elektroden einer Clusterelektrode können gemeinsam angesteuert sein.
Die Elektroden 1 können auch in Gestalt von orthogonal isoliert sich kreuzenden Streifenelektroden sowie als Punkt-Ring-Elektrodencluster (nicht gezeigt) angeordnet werden.
Durch die Auswerte-, Speicher- und Steuereinheit 65 sind die Elektroden 1 einzeln oder in Gruppen ansteuer- und frequenzbasiert anregbar, um die Migration, Adhäsion, Proliferation, Ausdifferenzierung und Ausbildung einer EZM, eine Bildung von Mono- und Multilayern von Zellen, eine Maturierung oder die Biofilmbildung, Suppression sowie weitere zelluläre Prozesse zu stimulieren.
In Fig. 7 ist eine Stimulationszelle gezeigt, der in einer, in vertikaler Richtung der Stimulationszelle verlaufenden, Ebene auf vier Seiten je eine Magnetfeldspule als je ein Magnetfelderzeuger 19 zugeordnet ist. Die Stimulationszelle und die Magnetfelderzeuger 19 sind so zueinander beabstandet, dass die Stimulationszelle mindestens bereichsweise in jedem der durch die Magnetfelderzeuger 19 erzeugten magnetischen Felder liegt.
Entsprechend ist die in Fig. 8 gezeigte Stimulationszelle gestaltet, der Magnetfelderzeuger 19 zugeordnet sind, die in einer, in horizontaler Richtung der Stimulationszelle verlaufenden, Ebene angeordnet sind. Die Magnetfelderzeuger 19 sind durch die Auswerte-, Speicher- und Steuereinheit 65 (nicht gezeigt) steuerbar. Die magnetischen Felder sind hinsichtlich ihrer Parameter wie Geometrie und / oder Feldstärken gesteuert variierbar.
Eine die Stimulationszelle in einer Ebene vollständig umschließende Anordnung eines Magnetfelderzeugers 19 ist in Fig. 9 gezeigt. Kombinationen der vorgenannten Magnetfelderzeuger 19 sind in weiteren Ausführungen der Stimulationszelle möglich.
Die Stimulationszelle kann mit einem gesteuerten Antrieb (nicht gezeigt) in Verbindung stehen und mittels des gesteuerten Antriebs beweglich sein. Dadurch kann eine relative Bewegung des Trägers 36 zu dem Aktor und einem durch den Aktor erzeugten Gradienten bewirkt sein.
Eine weiterführende Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Stimulationszelle ist in Fig. 10 schematisch gezeigt. In dem Innenraum 10 ist eine Aufnahmevorrichtung 30 zur Aufnahme und Fixierung eines Trägers 36 in dem Innenraum 10 vorhanden. Die Aufnahmevorrichtung 30 ist symmetrisch gestaltet und erlaubt die Aufnahme und Fixierung zweier Träger 36 in Form je eines planaren Formkörpers. Die Aufnahmevorrichtung 30 ist über je einen Verstellbereich entlang aller Raumachsen verstellbar, so dass die Träger 36 innerhalb eines durch die Verstellbereiche gegebenen Raums positionierbar sind. Der Innenraum 10 ist durch ein wannenförmiges, nach einer Seite offenes Unterteil 1 1 , sowie ein die offene Seite des Unterteils 1 1 überdeckendes Oberteil 14 umschlossen. Aus Gründen der Darstellbarkeit ist die Stimulationszelle hochkant gestellt gezeigt. Zwischen dem Oberteil 14 und dem Unterteil 1 1 ist ein umlaufender Spalt zum Gasaustausch 21 vorhanden. An einer Wand des Unterteils 1 1 ist an der Außenseite der Wand eine elektrisch isolierte Elektrode 1 a und an der Innenseite eine elektrisch leitende Elektrode 1 b vorhanden. Die Aufnahmevorrichtung 30 ragt orthogonal von der Wand des Unterteils 1 1 in Richtung des Oberteils 14 und durchspannt den Innenraum 10. Entlang dieser Richtung werden nachfolgend die einzelnen Elemente der Stimulationszelle beschrieben. In einem Abstand und parallel zur Wand ist ein Träger 36 gehalten. Auf seiner der Wand abgewandten Seite ist parallel zu dem Träger 36 ein Zellsubstrat 20 vorhanden, das von dem Träger 36 durch einen gleichbleibenden Spalt 55 getrennt ist. Die dem Träger 36 abgewandte Seite des Zellsubstrats 20 ist einer flächig ausgebildeten elektrisch leitenden Mittelelektrode 32b zugewandt und von dieser beabstandet. Die elektrisch leitende Mittelelektrode 32b ist einer elektrisch isolierten Mittelelektrode 32a zugewandt und von dieser durch eine Isolation 33 getrennt. Der elektrisch isolierten Mittelelektrode 32a folgen eine Isolation 33, eine elektrisch leitende Mittelelektrode 32b, ein Zellsubstrat 20, ein Spalt 55, ein Träger 36, eine elektrisch leitende Elektrode 1 b und eine elektrisch isolierte Elektrode 1 a, wobei die elektrisch leitende Elektrode 1 b und die elektrisch isolierte Elektrode 1 a durch eine Isolation 33 getrennt sind. Der beschriebenen Anordnung von Elementen folgt das Oberteil 14. Die elektrisch isolierte Mittelelektrode 32a und die elektrisch leitende Mittelelektrode 32b sind über Anschlüsse 18 ansteuerbar. In den oben und unten dargestellten Wänden des Unterteils 1 1 sind jeweils eine elektrisch leitende Elektrode 1 b und eine elektrisch isolierte Elektrode 1 a angeordnet. In der oberen Wand ist außerdem eine Medienzuführung 12 und in der unteren Wand eine Medienabführung 13 vorhanden. Die Aufnahmevorrichtung 30 ist auch in sich verstellbar, so dass eine Spaltbreite des Spalts 55 einstellbar ist. Die Spaltbreite ist im Ausführungsbeispiel bis 350 μιτι einstellbar, sie kann in weiteren Ausführungen auch bis 3 mm einstellbar sein. Ein Gradient ist entlang einer imaginären Ausbreitungslinie 56 erzeugbar, die senkrecht zur Oberfläche des Zellsubstrat 20 und des Trägers 36 verläuft. Die imaginäre Ausbreitungslinie 56 dient der Veranschaulichung der Ausrichtung des Gradienten und ist daher als Strichlinie gezeigt. Außerdem gibt die Strichlinie lediglich beispielhaft nur eine imaginäre Ausbreitungslinie 56 wieder.
Ein sechstes Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Stimulationszelle weist gemäß Fig. 1 1 ein nach oben offenes Unterteil 1 1 auf, an dessen unterer Wand und an den seitlichen Wänden jeweils eine elektrisch isolierte Elektrode 1 a und eine elektrisch leitende Elektrode 1 b angeordnet ist. Jede seitliche Wand weist eine Medienzuführung 12 und eine Medienabführung 13 auf. In weiteren Ausgestaltungen der Stimulationszelle können auch andere Anzahlen und / oder Anordnungen der Medienzuführung 12 und der Medienabführung 13 vorhanden sein. Der Innenraum 10 ist durch das Oberteil 14 abgeschlossen und über einen horizontal verlaufenden Spalt zum Gasaustausch 21 mit der Umgebung verbunden. Das Oberteil 14 ist ohne Elektroden 1 ausgeführt. Im Bereich der Isolation 33 ist eine als Massereferenzelektrode ausgebildete Umrandung 17 vorhanden. Die Ausgestaltung der Aufnahmevorrichtung 30 und der sonstigen Elemente der Stimulationszelle entspricht Fig. 10. Die imaginäre Ausbreitungslinie 56 verläuft bezüglich der Oberfläche des Zellsubstrats 20, des Spalts 55 und der Oberfläche des Trägers 36 nicht senkrecht, sondern ist unter einem Winkel ungleich 90°gerichtet.
Der Träger 36 kann in weiteren Ausführungen auch nicht-planar gestaltet sein. Die Spaltbreite des Spalts 55 kann auch über seine Ausdehnung veränderlich sein.
Die Geometrie und Position des Zellsubstrats 20 kann der Geometrie und der Position des Trägers 36 zur Gewährleistung eines definierten Spalts 55 angepasst werden.
Die Geometrie der Stimulationszelle kann in der Gestaltung seines Oberteils 14 und Unterteils 1 1 der Geometrie und Position der Träger 36 angepasst werden. Die Ober- und Unterteile 14, 1 1 können eine Quader-, Zylinder-, Kugel- und / oder Halbkugelform sowie alle zusammengesetzten Formen und deren Kombinationen aufweisen.
Die Träger 36 können im Innenraum 10 bezüglich der Ober- und Unterteile 14, 1 1 , beweglich angeordnet sein. Eine dem Träger 36 geometrisch anpassbare Anordnung des Zellsubstrats 20 kann ebenfalls vorteilhaft sein. In der Stimulationszelle können auch mehrere Träger 36 angeordnet sein.
In Fig. 12 ist eine Stimulationszelle, wie sie in Fig. 1 beschrieben ist, mit einer Aufnahmevorrichtung 30 gezeigt, in der voneinander beabstandet zwei Träger 36 in je einer Fixiereinrichtung 31 gehalten sind. Der Innenraum 10 ist mit einem Medium M ausgefüllt. Zwischen den Trägern 36 ist ein magnetischer Körper 34.1 in Form einer magnetischen Platte angeordnet. Der magnetische Körper 34.1 ist durch eine Isolation 33 umschlossen, die einen Kontakt des Mediums M mit dem magnetischen Körper 34.1 verhindert, um mögliche zytotoxische Wirkungen des Materials des magnetischen Körpers 34.1 zu unterbinden. Der oben angeordnet dargestellte Träger 36 dient als Gegenlager für den magnetischen Körper 34.1 und die Isolation 33 und wird nicht besiedelt (passiver Träger 36). Durch die gezeigte Anordnung ist neben einer Stimulation mittels eines magnetischen Feldes auch eine Kraft auf eine Seite der Träger 36 aufzubringen.
In weiteren Ausführungen der Stimulationszelle können beide Träger 36 besiedelt werden und in den Innenraum 10 eingebracht sein. Fig. 13 zeigt die Stimulationszelle, wie in Fig. 1 , mit einer Aufnahmevorrichtung 30 mit Fixiereinrichtungen 31 , in der zwischen zwei parallel zueinander ausgerichteten Trägern 36 ein magnetisierbarer Körper 34.2 angeordnet ist. Zwischen den Trägern 36 ist eine Isolation 33 zur elektrischen Isolation sowie zur Unterbindung zytotoxischer Wirkungen des magnetisierbaren Körpers 34.2 vorhanden. Jedem der Träger 36 ist auf der dem magnetisierbaren Körper 34.2 abgewandten Seite je ein, durch je einen Spalt 55 beabstandetes, Zellsubstrat 20 zugeordnet. Die imaginäre Ausbreitungslinie 56 verläuft senkrecht zu der Oberfläche des Zellsubstrats 20, des Spalts 55 und der Oberfläche des Trägers 36.
Je eine Variation der in Fig. 12 gezeigten Stimulationszelle zeigen die Fig. 14 und 15. In Fig. 14 ist ein halbkreisförmig gewölbter Träger 36 der Aufnahmevorrichtung 30 gehalten. Der Träger 36 ist über seine distalen Bereiche in der Fixiereinrichtung 31 gehalten, während unter einem zentralen Bereich des Trägers 36 ein kalottenförmiger, nach oben gewölbter Aufbau mehrerer Schichten vorhanden ist. Unter dem Träger 36 sind ein ebenfalls entsprechend gewölbter magnetisierbarer Körper 34.2, eine elektrisch leitende Mittelelektrode 32b und eine Isolation 33 angeordnet.
In einer Ausführung gemäß der Fig. 15 sind über dem gewölbten, zentralen Bereich des Trägers 36 zusätzlich ein ebenfalls gewölbter Spalt 55 und ein Zellsubstrat 20 vorhanden. Die imaginäre Ausbreitungslinie 56 verläuft wiederum senkrecht zu der Oberfläche des Zellsubstrats 20, des Spalts 55 und der Oberfläche des Trägers 36. Da der Spalt 55 gewölbt ist, sind die imaginären Ausbreitungslinien 56 an verschiedenen Punkten entlang des Spalts 55 bezüglich des Innenraums 10 um entlang eines Kreisausschnitts geschwenkt. Die beispielhaft gezeigten imaginären Ausbreitungslinien 56 sind zueinander nicht parallel.
Wie in den Fig. 14 und 15 dargestellt, kann ein magnetisierbarer Körper 34.2 angeordnet sein. Wird diese Anordnung mit Magnetfelderzeugern 19 kombiniert, so kann mittels magnetischer Felder mit einer definiert variierbaren Feldgeometrie ein magnetischer Gradient erzeugt werden, der, vermittelt über den magnetisierbaren Körper 34.2, auf den Träger 36 wirken kann. Damit können an der Oberfläche des Trägers 36 Spannungszustände bis hin zu Vibrationen erzeugt werden, wenn der magnetisierbare Körper 34.2 sich zumindest in einem partiell nichthomogenen Feldbereich befindet. In weiteren Ausführungen kann auch ein magnetischer Körper 34.1 oder eine Kombination von mindestens je einem magnetischen Körper 34.1 und einem magnetisierbaren Körper 34.2 angeordnet sein.
In allen Ausführungen der Stimulationszelle können als Elektroden ausgebildete Piezo- Stacks gleichzeitig elektrische und mechanische Stimuli erzeugen.
Wie in den Figuren 16 und 17 dargestellt, kann die Stimulationszelle auch nichtfluidisch als statisches System ausgebildet sein, in dem aber ebenso eine definierte Spaltsituation mit gravitativ positiven wie negativen Gradienten erzeugt werden kann.
Gemäß Fig. 16 wird zwischen einer in einer unteren Aufnahmeeinheit für Träger mit Fixier-/ Konvektionsbereichen 41 platzierten Träger 36 oder ein Träger mit Fixier- /Konvektionsbereichen 42 mit gravitativ positiven Gradienten ein Spalt 55 mit einer Spaltbreite von 350 μιτι zu einer Aufnahmeeinheit für Zellsubstrat mit Fixier-/Konvektionsbereichen 43, beinhaltend ein Zellsubstrat 44, hergestellt, auf die weiter aufbauend eine Aufnahmeeinheit 48 mit Fixier-/Konvektionsbereichen für horizontal zwei radiale Elektroden 45, die über einen isolierenden Spacer und Verbinder 47 verbunden sind, platziert werden können. Radiale Elektroden 45 sind über vertikale Bohrungen in Fixierbolzen einer Aufnahmeeinheit 48 mittels vertikaler Konnektoren 46 verbunden. Auf vorhandene obere Auflageflächen in der Aufnahmeeinheit 48 wird eine weitere Aufnahmeeinheit für ein Zellsubstrat mit Fixier-/Konvektionsbereichen 43 platziert, durch die über Distanzauflageflächen zu einer Aufnahmeeinheit für Träger mit Fixier-/Konvektionsbereichen 41 platzierten Träger mit Fixier-/Konvektionsbereichen 42 mit gravitativ negativen Gradienten einen Spalt 55 mit 350 μιτι hergestellt und eine zusammengesetzte Stimulationszelle 49 gebildet ist.
In Figur 17 ist dargestellt, dass in einem gekammerten Unterteil 50 eines Stimulationszellengehäuses (6-well Format) zur Aufnahme von zusammengesetzten Stimulationszellen 49 eine 6-well-formatige Stimulationszellenanordnung 51 realisiert werden kann, die mit einem Oberteil 52 des Stimulationszellengehäuses mit Distanzbereichen für Gasaustausch und Durchleitungsöffnungen für Konnektoren 46 abgeschlossen werden kann. Über die Konnektoren 46 kann jede einzelne der sechs zusammengesetzten Stimulationszellen 49 über Anschlussleitungen 60 mit der Auswerte-, Speicher- und Steuereinheit 65 (beide nicht gezeigt) in Reihe, parallel oder einzeln geschaltet sein. Die Flächen der planaren, oberen wie unteren Träger mit Fixier- /Konvektionsbereichen 42, die Distanzbereiche für den Gasaustausch im Oberteil 52 sowie die Medienvolumina pro well sind analog zu 6-well- Standardkultivierungssystemen parametrisierbar. Damit ist eine Vergleichbarkeit bei der Durchführung von Untersuchungen gewährleistet.
Erfindungsgemäß dient die Stimulationszelle einem nicht dynamischen, mehrdimensionalen Verfahren zur Stimulation von in vitro Zell- oder Gewebewachstum in einer definierbaren Grenzflächensituation zwischen einem gewebeähnlichen Bereich und einem Bereich in Gestalt von degradierbaren oder nicht degradierbaren Trägern 36; mit anderen Worten für die Stimulation von Wachstumsprozessen in einem in situ ähnlichen dreidimensionalen Zell- oder Gewebebereich mit gegenüberliegenden Grenzschichten inklusive eines Spalts 55.
Die Stimulation von Zellwachstumsprozessen in einer in vivo / in situ ähnlichen Situation erfolgt über ortsbezogene Erzeugung und zeitlichen Veränderung elektrischer Parameter einer Anordnung von Aktoren.
Bezugszeichenliste
I Elektrode
1 a elektrisch isolierte Elektrode
1 b elektrisch leitende Elektrode
10 Innenraum
I I Unterteil
12 Medienzuführung
13 Medienabführung
14 Oberteil
15.1 Sackbohrung mit Innengewinde
15.2 Durchgangsbohrung
16 äußere Elektrode
17 Umrandung
18 Anschluss
19 Magnetfelderzeuger
20 Zellsubstrat
21 Spalt für Gastaustausch
30 Aufnahmevorrichtung
31 Fixiereinrichtung
32a elektrisch isolierte Mittelelektrode
32b elektrisch leitende Mittelelektrode
33 Isolation
34.1 magnetischer Körper
34.2 magnetisierbarer Körper
36 Träger
41 Aufnahmeeinheit für Träger mit Fixier-/Konvektionsbereichen
42 Träger mit Fixier-/Konvektionsbereichen
43 Aufnahmeeinheit für Zellsubstrat mit Fixier-/Konvektionsbereichen
44 Zellsubstrat (für Aufnahmeeinheit 43)
45 radiale Elektroden
46 Konnektor Spacer und Verbinder
Aufnahmeeinheit
zusammengesetzte Stimulationszelle gekammertes Unterteil Stimulationszellenanordnung
Oberteil
Spalt
imaginäre Ausbreitungslinie
Anschlussleitung
Auswerte-, Speicher- und Steuereinheit Medium

Claims

Patentansprüche
1 . Stimulationszelle zur in vitro Stimulation von Zellen oder Geweben, mit einem einen Innenraum umschließenden Korpus aufweisend je ein Oberteil und ein Unterteil sowie mindestens einen Aktor zum Hervorrufen einer stimulierenden Wirkung auf mindestens einen Anteil der Zellen oder Gewebe, dadurch gekennzeichnet, dass
in dem Innenraum (10) eine Aufnahmevorrichtung (30) zur Aufnahme eines Zellsubstrats (20, 44) und eines Trägers (36) angeordnet ist, wobei nach einer Aufnahme des Zellsubstrats (20, 44) und des Trägers (36) durch die Aufnahmevorrichtung (30) ein Spalt (55) zwischen einander zugewandten Oberflächen des Zellsubstrats (20, 44) und des Trägers (36) verbleibt und der mindestens eine Aktor zur Erzeugung eines elektromagnetischen oder magnetischen Gradienten ausgelegt ist, der sich entlang einer imaginären Ausbreitungslinie (56) eines steuerbaren räumlichen Gradientenfeldes erstreckt und die imaginäre Ausbreitungslinie (56) von dem Zellsubstrat (20, 44) zu dem Träger (36) verläuft.
2. Stimulationszelle nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Medienzuführung (12) und mindestens eine Medienabführung (13) an mindestens einer Seite des Innenraums (10) zur Zu- und Abführung eines Mediums (M) vorhanden ist.
3. Stimulationszelle nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens zwei Elektroden (1 ) als Aktoren vorhanden sind, wobei die Elektroden (1 ) zur Erzeugung räumlich und zeitlich definierter elektrischer und / oder elektromagnetischer Gradienten mit variabler Form, Betrag, Richtung und Intensität ausgestaltet sind.
4. Stimulationszelle nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Elektroden (1 ) segmentiert sind.
5. Stimulationszelle nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Clusterelektroden vorhanden sind, die aus zueinander rasterförmig angeordneten Elektroden (1 ) und / oder signaltechnisch ansteuerbaren Elektroden (1 ) gebildet sind.
6. Stimulationszelle nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Stimulationszelle mindestens ein außerhalb des Innenraums (10) angeordneter Magnetfelderzeuger (19) als ein Aktor zugeordnet ist, so dass die Stimulationszelle mindestens über Bereiche in einem durch den Magnetfelderzeuger (19) erzeugten Magnetfeld angeordnet ist.
7. Stimulationszelle nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein Hybridaktor vorhanden ist, durch den zeitgleich oder aufeinander folgend voneinander verschiedene Gradienten hervorrufbar sind.
8. Stimulationszelle nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Aufnahmevorrichtung (30) so ausgebildet ist, dass der Spalt (55) einstellbar ist, durch den die einander zugewandten Oberflächen des Trägers (36) und des Zellsubstrats (20) voneinander getrennt sind.
9. Stimulationszelle nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine der Aufnahmevorrichtungen (30) eine Positionierung des Trägers (36) und / oder des Zellsubstrats (20) in dem Innenraum (10) ermöglicht, so dass neben einer Positionierung des Trägers (36) auch eine relative Bewegung zwischen Träger (36) und Aktor bewirkbar ist.
10. Stimulationszelle nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger (36) temporär mit mindestens einem magnetischen Körper (34.1 ) oder einem magnetisierbaren Körper (34.2) in Kontakt steht und dieser mindestens teilweise im Bereich der Feldlinien eines primären magnetischen Feldes liegt, so dass in dem magnetischen Körper (34.1 ) oder dem magnetisierbaren Körper (34.2) durch das primäre magnetische Feld ein sekundäres magnetisches Feld veränderbar ist.
1 1 . Stimulationszelle nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Elektroden (1 ) als Messmittel zur Messung elektrischer Größen ausgestaltet sind.
12. Stimulationszelle nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Stimulationszelle mit einem gesteuerten Antrieb verbunden ist, mittels dem die Stimulationszelle gesteuert bewegbar ist.
13. Verfahren zur gerichteten Stimulation des Wachstums von Zellen oder Geweben eines Zellsubstrats (20, 44) in Richtung auf einen von dem Zellsubstrat (20, 44) durch einen Spalt (55) getrennten Träger (36) und zur Stimulation der Adhäsion von über den Spalt (55) gewachsenen Zellen oder Geweben an dem Träger (36), mit den Schritten:
Einbringen eines die Zellen oder Gewebe tragenden Zellsubstrats (20) in einen Innenraum (10) einer Stimulationszelle;
Einlegen eines Trägers (36) in eine Aufnahmevorrichtung (30) in dem Innenraum (10) der Stimulationszelle, wobei zwischen den sich zugewandten Oberflächen des Zellsubstrats (20, 44) und des Trägers (36) ein Spalt (55) erhalten wird;
Einbringen eines Mediums (M) zur physiologischen Versorgung der Zellen oder Gewebe in die Stimulationszelle;
Hervorrufen mindestens eines dosierbaren, topischen elektromagnetischen oder magnetischen Gradienten mit einer das Wachstum der Zellen oder Gewebe stimulierenden Wirkung, der sich entlang einer imaginären Ausbreitungslinie eines steuerbaren räumlichen Gradientenfeldes erstreckt und
- Ausrichten der imaginären Ausbreitungslinie derart, dass diese durch den Spalt (55) von dem Zellsubstrat (20, 44) zu dem Träger (36) verläuft.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass Messgrößen, die infolge von Reaktionen der Zellen und Gewebe auf die stimulierende Wirkung veränderlich sind, erfasst und gespeichert werden.
15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass die stimulierende Wirkung bestimmten Teilbereichen des Zellsubstrats (20) zugeordnet und auf diese begrenzt erzeugt wird.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die stimulierende Wirkung ausgewählt ist aus der Erzeugung elektromagnetischer Felder, elektrischer Felder, magnetischer Felder und der Einkopplung physikalischer Stimuli.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass initiale Messwerte mindestens einer Messgröße zu einem initialen Messzeitpunkt erfasst und gespeichert werden und die initialen Messwerte als Referenzmesswerte für zu späteren Messzeitpunkten erfassten Messwerten verwendet werden.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass aus den Veränderungen der zu verschiedenen Messzeitpunkten erfassten und gespeicherten Messwerten Informationen über das Wachstum der Zellen oder Gewebe abgeleitet werden.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Messwerte zeit- und ortsaufgelöst erfasst werden.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass aufgrund der Messwerte Steuersignale zur Ansteuerung des Aktors generiert werden, um den Gradienten zu verändern. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen dem Zellsubstrat (20) und dem Träger (36) ein Spalt (55) mit einer Spaltbreite eingestellt werden kann.
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