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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein räumlich hoch aufgelöstes in
vitro-Verfahren zur Permeabilisierung von Zellstrukturen, Organellenstrukturen und
zellartigen Strukturen, um Verbindungen in die oder aus den Strukturen
herauszutransferieren.
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Hintergrund der Erfindung
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Während der
letzten zwei Jahrzehnte gab es einen enormen Anstieg bei der Zahl
experimenteller Verfahren, die biochemische und biophysikalische Untersuchungen
einzelner Zellen ermöglichen.
Solche Verfahren schließen
Patch-clamp-Aufzeichnungen, die zur Messung von Transmembranströmen durch
einen einzelnen Innenkanal verwerdet werden können (O.P. Hamill, A. Marty,
E. Neher, B. Sakman, F.J. Sigworth, Pfleugers Arch. 391, 85-100
(1991)); konfokale Lasermikroskopie-Bildgebungstechniken, die verwendet
werden können,
um bioaktive Komponenten in einzelnen Zellen und einzelnen Organellen zu
lokalisieren (S. Maiti, J.B. Shear, R.M. Williams, W.R. Zipfel,
W.W. Webb, Science, 275, 530-532 (1997)); die Verwendung von optischen
Nahfeld-Sonden zur pH-Messung in dem Zellinneren; und die Verwendung
von Ultramikroelektroden zum Messen der Freisetzung einzelner Katechol-
und Indolaminenthaltender Vesikel (R.H. Chow, L. von Ruden, E. Neher,
Nature, 356, 60-63 (1992), und R.M. Wightman, J.A. Jankowski, R.T.
Kennedy, K.T. Kawagoe, T.J. Scroeder, D.J. Leszczyszyn, J.A. Near,
E.J. Diliberto Jr., O.H. Viveros, Proe. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,
88, 10754-10758 (1991)) ein.
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Obwohl
zahlreiche Hochauflösungstechniken
vorhanden sind, um die Inhalte einzelner Zellen und subzellulärer Organellen
zu detektieren, abzubilden und zu analysieren, sind nur wenige Verfahren vorhanden,
um die biochemische Beschaffenheit dieser Kompartimente zu kontrollieren
und zu manipulieren. Die meisten Verbindungen für eine biologische und medizinische
Verwendung, bei denen Interesse daran besteht, sie in Zellen einzuschließen, sind
polar. Polare gelöste
Stoffe sind Zell-impermeant und nicht in der Lage, biologische Membranen
zu passieren, es sei denn, es sind spezifische Transporter vorhanden.
In der experimentellen Biologie sowie in der biochemischen und klinischen
Arbeit ist es häufig
nötig,
polare gelöste
Stoffe an das Cytoplasma von Zellen oder das Innere von Organellen
zu verabreichen. Beispiele solcher polarer gelöster Stoffe sind Nanopartikel,
Farbstoffe, Wirkstoffe, DNAs, RNAs, Proteine, Peptide und Aminosäuren. Gegenwärtig ist
es z.B. außerordentlich
schwierig, eine Zelle in einer Zellkultur mit einem Farbstoff zu
markieren oder sie mit einem Gen zu transfizieren, ohne ihren angrenzenden Nachbarn
zu markieren oder zu transfizieren. Aufgrund ihrer Größe, die
vielfach kleiner ist als die Auflösungsgrenze eines Lichtmikroskops
oder wenigstens weniger als ein paar Mikrometer im Durchmesser beträgt, ist
es sogar noch schwieriger, polare Moleküle in Organellen einzuführen.
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Mikroinjektionstechniken
für einzelne
Zellen und einzelne Kerne wurden ebenfalls beschrieben (siehe z.B.
M.R. Capecchi, Cell, 22, 479-488 (1980), aber diese werden zunehmend
schwierig zu implementieren, so wie die Größe der Zelle oder Organelle abnimmt.
Für Zellen
und Organellen, die nur wenige Mikrometer im Durchmesser oder weniger
messen, werden Mikroinjektionstechniken faktisch unmöglich anwendbar.
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Es
wurde für
eine lange Zeit erkannt, dass Zellemembranen durch gepulste elektrische
Felder permeabilisiert werden können
(siehe z.B. Zimmermann, U., Biochim. Biophys Acta, 694, 227-277 (1982);
Tsong, T.Y., Biophys. J., 60, 297-306 (1991); Weaver, J.C., J. Cell.
Biochem., 51, 426-435 (1993)). Diese Technik wird Elektroporation
genannt. Die Membranspannung, Vm, an verschiedenen
Orten auf den Phospholipid-Doppelschicht-Kugeln bzw. -Sphären während der
Exposition in einem homogenen elektrischen Feld der Dauer t kann
aus: Vm 1,5rcEcosα[1 – exp (–τ/t)] (1)berechnet
werden, wobei E die elektrische Feldstärke ist, rc der
Zellradius, α der
Winkel in Relation zu der Richtung des elektrischen Feldes und τ die Widerstands-Kapazitäts-Zeitkonstante
("capacitive-resistive
time constant")
ist. Eine Porenbildung wird an den Kugelkoordinaten resultieren,
die einer maximalen Potentialveränderung
ausgesetzt sind, was an den Polen, die den Elektroden gegenüberliegen,
der Fall ist (cosα =
1 für α = 0, cosα = –1 für α = π). Allgemein
sind elektrische Feldstärken
in der Größenordnung
von 1 bis 1,5 kV/cm für
Dauern von wenigen Mikrosekunden bis zu wenigen Millisekunden ausreichend,
um eine vorübergehende
Permeabilisierung in sphärischen
Zellen mit 10 μm
Außendurchmesser zu
verursachen. Eine neuere Untersuchung zeigt, dass isolierte Mitochondrien
aufgrund ihrer entsprechend geringeren Größe, 7-10fach höhere elektrische
Feldstärken
benötigen,
um eine 7,2-Kilobasen-Plasmid-DNA zu inkorporieren (J-M. Collombet, V.C.
Wheeler, F. Vogel & C.
Coutelle, J. Biol. Chem., 272, 5342-5347 (1997)). Es wurde auch
eine Fusion der äußeren Mitochondrienmembran
bei geringeren elektrischen Feldstärken von etwa 2,5 kV/cm beobachtet.
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Herkömmlicherweise
wird Elektroporation in einem Chargenmodus durchgeführt, welcher
das Verabreichen von polaren gelösten
Stoffen in einige Millionen von Zellen gleichzeitig ermöglicht.
Die Elektroden, die solche Felder erzeugen, können einige Quadratzentimeter
groß sein,
und der Abstand zwischen den Elektroden kann einige Zentimeter betragen,
wodurch Hochspannungsenergiequellen benötigt werden, um die benötigten elektrischen
Feldstärken
zu erhalten, um eine elektrisch hervorgerufene Permeabilisierung
biologischer Membranen zu verursachen.
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Ein
Vorteil von Elektroporation, verglichen mit Mikroinjektionstechniken,
ist, dass Elektroporation extrem schnell und zeitlich genau abgestimmt
sein kann (siehe z.B. K. Kinosita, K., Jr., I. Ashikawa, N. Saita,
H. Yoshimura, H. Itoh, K. Nagayama & A. Ikegami, J. Biophys., 53, 1015-1019
(1988); M. Hibino, M. Shigemori, H. Itoh, K. Nagayama & K. Kinosita,
K., Jr., Biophys. J., 59, 209-220 (1991)), was beim Untersuchen
schneller Reaktionsphänomene
von Bedeutung ist.
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Die
Geräteausstattung,
die zur Elektroporation einer kleinen Anzahl von Zellen in Suspension
(K. Kinosita, Jr. & T.Y.
Tsong, T., Biochim. Biophys. Acta, 554, 479-497 (1979); D.C. Chang,
J. Biophys., 56, 641-652 (1989; P.E. Marszalek, B. Farrel, P. Verdugo & J.M. Fernandez,
Biophys. J., 73, 1160-1168 (1997)) und für eine kleine Anzahl von anhaftenden
Zellen, die auf einem Substrat gewachsen sind, (Q.A. Zheng & D.C. Chang, Biochim.
Biophys. Acta, 1088, 104-110 (1991); M.N. Teruel & T. Meyer, Biophys.
J., 73, 1785-1796 (1997)) verwendet werden kann, wurde ebenfalls
beschrieben. Der Aufbau der von Marszalek et al. konstruierten Elektroporationsvorrichtung basiert
auf 6 mm langen Platindrähten
mit 80 μm Durchmesser,
die in einer parallelen Anordnung bei einem fixierten Abstand von
100 μm an
eine einzelne Glasmikropipette geklebt sind. Der Aufbau von Kinosita
und Tsong verwendet fixierte Messingelektroden, beabstandet mit
einer Zwischenraumstrecke von 2 nun, der Mikroporator-Aufbau von Teruel
und Meyer beruht auf zwei Platinelektroden, die mit einer Zwischenraumstärke von
etwa 5 mm beabstandet sind, und der Elektroporationskammer-Aufbau
von Chang verwendet näherungsweise
1 mm lange Platindrähte, die
mit einer Strecke von 0,4 mm beabstandet sind. Es ist offensichtlich,
dass diese Elektroporationsvorrichtungen, welche zur Verwendung
in vitro optimiert sind, elektrische Felder erzeugen, die einige
Größenordnungen
größer sind
als die Größe einer
einzelnen Zelle, welche typischerweise 10 μm im Durchmesser ist, und dass
sie somit nicht für
eine ausschließliche Elektroporation
einer einzelnen Zelle oder einer einzelnen Organelle oder zur Elektroporation
innerhalb einer einzelnen Zelle verwendet werden können. Die Techniken
bieten keine ausreichende Positions- und individuelle Kontrolle
der Elektroden, um eine einzelne Zelle oder eine kleine Population
von Zellen auszuwählen.
Darüber
hinaus sind diese Techniken nicht für die Elektroporation in vivo
oder die Elektroporation von entfernten bzw. dezentralen Zellen
und Geweben optimiert. Elektroporationsvorrichtungen für klinische
und in vivo-Anwendungen wurden ebenfalls entwickelt. Beispiele schließen Vorrichtungen
für Elektroporations-vermittelte
Abgabe von Wirkstoffen und Genen an Tumore (WO 96/39226) und an
Blutzellen (US Pat. 5 501 662) und an entfernte bzw. dezentrale
Zellen und Gewebe (US Pat. 5 389 069) ein. Gleichermaßen können diese
nicht verwendet werden, um ein hoch lokalisiertes elektrisches Feld
zur Elektroporation einer einzelnen Zelle, einer einzelnen Organelle
oder einer Population von Organellen innerhalb einer Zelle zu erzeugen.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Einer
der Hauptnachteile bei den bekannten Techniken ist, dass sie nicht
für die
Permeabilisierung von einzelnen Zellen oder einzelnen intrazellulären Organellen
anwendbar sind. Die vorliegende Erfindung stellt eine räumlich hoch
aufgelöste
Technik bereit, um den Biochemikaliengehalt einzelner Zellen und
Organellen, basierend auf Permeabilisierung von Phospholipid-Doppelschicht-Membranen
durch gepulste elektrische Felder, d.h., sogenannte Elektroporation,
zu verändern.
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Ein
Vorteil des Verfahrens gemäß der vorliegenden
Erfindung, verglichen mit bekannten Verfahren zur Elektroporation,
ist, dass das Verfahren gemäß der Erfindung
durch eine extrem hohe räumliche Auflösung, definiert
durch hoch fokussierte permeabilisierende elektrische Felder, gekennzeichnet
ist. Solche hoch fokussierten elektrischen Felder werden erhalten,
indem ein Paar von Elektroporationselektroden mit Außendurchmessern
im Bereich von wenigen Nanometern bis zu wenigen Mikrometern verwendet
wird. Dies ermöglicht
die Elektroporation einzelner Zellen und sogar intrazellulärer Strukturen. Die
Elektroden werden individuell mit Mikropositionierern mit hoher
Unterteilung ("high-graduation") kontrolliert, wodurch
eine genaue Elektrodenanordnung hinsichtlich einer Struktur, die
permeabilisiert werden soll, ermöglicht
wird. Während
der wirksamen Porenöffnungszeit
können
Zell-impermeante gelöste
Stoffe, die zu dem extrazellulären
oder extraorganellären
Medium hinzugefügt
wurden, durch Diffusion in das Zell- oder Organelleninnere gelangen.
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Im
Unterschied zu den bekannten Mikroinjektionstechniken für einzelne
Zellen und einzelne Kerne kann die vorliegende Erfindung für biologische Behälter mit
Subfemtoliter-Volumina
(< 10–15 l)
oder mit weniger als wenigen Mikrometern im Durchmesser angewendet
werden, was ein weiterer wichtiger Vorteil der Erfindung ist.
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Darüber hinaus
unterscheidet sich die vorliegende Erfindung dahingehend vom Stand
der Technik, dass die Elektroporation bei Einzelzell- oder subzellulärer räumlicher
Auflösung
durch Anlegen des elektrischen Feldes durch Elektroden mit Nanometer-
und Mikrometer-Durchmesser
mit extrem kurzen Interelektrodenabständen erzielt wird. Die Elektroden werden
individuell durch Mikromanipulatoren mit hoher Unterteilung kontrolliert,
was das genaue Fokussieren des elektrischen Feldes zwischen den
Elektroden ermöglicht.
Die Elektroporation individueller Zellen und individueller Organellen
kann dadurch erzielt werden. Die Elektroporation kann mit der vorliegenden
Erfindung in einer solchen Weise durchgeführt werden, dass nur eine Zielzelle
permeabilisiert wird und nicht ihr angrenzender Nachbar. Es können ebenfalls
individuelle zelluläre
Prozesse elektroporiert werden. Sogar räumlich genau definierte intrazelluläre Domänen mit
einer Klasse von Organellen, auf die abgezielt wird, können mit
dieser Erfindung unter einem lokalisierten elektrischen Feld gehalten werden,
wodurch der Transfer polarer gelöster
Stoffe in die Organellen ermöglicht
wird. Anwendungen von Elektroporation von Organellen schließen in vitro-Veränderungen
des Mitochondriengenoms ein. Es ist gut bekannt, das Mutationen
in dem Mitochondriengenom zu einer Vielzahl von Krankheiten führen können und
dass eine Gentherapie möglicherweise von
hauptsächlicher
Bedeutung sein kann. Jedoch mussten Mitochondrien bislang aus den
Zellen isoliert werden, bevor ein Transfer des neuen Genfragments
in die Mitochondrien durchgeführt
werden konnte. Dann mussten die Mitochondrien wieder in die Zelle
eingeführt
werden. Die Technik gemäß der Erfindung
macht es möglich,
Gene direkt in die Mitochondrien einzuführen, wenn diese innerhalb
einer Zelle enthalten sind. Dies ist ein signifikanter Fortschritt
gegenüber
herkömmlichen
Transfektionsschemata von Mitochondrien.
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Zusätzlich zu
der hohen räumlichen
Auflösung,
die durch Verwenden von Nano- und Mikroelektroden erreicht wird,
vermeidet die Technik gemäß der Erfindung
die Verwendung teurer Hochspannungsimpulsgeneratoren und komplizierter
Mikrokammeraufbauten. Das Verfahren gemäß der Erfindung kann im Prinzip
Batterie-betrieben sein, weil der Abstand zwischen den Elektroden
klein ist, typischerweise 20 μm
oder weniger, was in einer hohen elektrischen Feldstärke mit
einem Spannungsimpuls mit kleiner Amplitude resultiert. Diese Technik
ist die erste Demonstration eines selektiven Transfers von gelösten Stoffen
in biologische Strukturen unter Verwendung hoch fokussierter elektrischer
Felder in den Dimensionen einzelner Zellen und subzellulären Dimensionen.
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Das
Verfahren gemäß der Erfindung
kann zusätzlich
für Biosensoranwendungen
verwendet werden, bei denen eine Zelle oder eine zellartige Struktur
in einem permeabilisierenden Gleichstrom- oder Wechselstrom-elektrischen
Feld platziert wird, während
mit Wirkstoffen oder anderen Verbindungen von Interesse supplementiert
wird. Eine spezielle Anwendung ist die Kombination von Elektroporation
und miniaturisierten chemischen Trennungen, wobei Flüssigkeits-Hohlelektroden,
die aus Quarzglas oder ähnlichen
Materialien hergestellt sind, verwendet werden.
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Mit
Ultramikroelektroden, wie Kohlenstofffaser-Elektroden, kontrolliert
durch Mikromanipulatoren mit hoher Unterteilung, verwendet gemäß der vorliegenden
Erfindung, ist es leicht, das elektrische Feld auf sehr genau definierte
Bereiche zu fokussieren.
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Somit
betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, wie in Anspruch
1 definiert.
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Die
Zellstruktur kann eine beliebige Art von Zelle oder zellartiger
Struktur oder Zellpopulation, wie eine Zelle in einer primären Zellkultur,
eine Zelle in einem Gewebeschnitt oder einem Gewebe, ein Liposom
oder eine intrazelluläre
Zellstruktur, wie eine Organelle, sein.
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Das
Verfahren gemäß der Erfindung
kann verwendet werden, um entweder gelöste Stoffe aus einem extrazellulären Medium
in eine permeabilisierte Zellstruktur zu transferieren oder gelöste Stoffe, die
in der Zellstruktur eingeschlossen sind, in das extrazelluläre Medium
hinauszutransferieren. Das Verfahren gemäß der Erfindung kann auch verwendet werden,
um eine Substanz in eine oder aus einer Organelle zu transferieren,
sogar wenn sich die Organelle innerhalb einer Zelle befindet.
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Das
Verfahren ist gut geeignet zur Untersuchung von zellulärer Migration,
Proliferation, Wachstum und zellulärer Differenzierung sowie einer
Vielzahl biochemischer und biophysikalischer Ereignisse. Es eröffnet auch
neue Möglichkeiten
für eine räumlich hoch
aufgelöste
Verteilung von Nanopartikeln, Wirkstoffen, Genen und verschiedenen
biochemischen Markern, wie Farbstoffen, in einzelne Zellen oder
Organellen.
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Das
Verfahren kann auch für
Biosensor-Anwendungen nützlich
sein. Insbesondere kann eine einzelne Zelle in einem permeabilisierenden
Wechselstrom- oder Gleichstromfeld platziert werden, wodurch ermöglicht wird,
dass Zell-impermeante Moleküle,
welche die intrazelluläre
Chemie beeinflussen, einschließlich
Aktivierung von Rezeptoren, die auf der Oberfläche ver schiedener Organellen
vorhanden sind, aktiviert werden. In dieser Weise kann eine Verbindungsbibliothek,
die auf die intrazelluläre
Chemie wirkt, auf biologische Aktivität hin gescreent werden. Die
Verbindungen von Interesse können
dann zu der Zelllösung
unter Verwendung eines Perfusionssystems oder einer Spritze hinzugefügt werden.
In einem speziellen Fall können
die Verbindungen von Interesse mittels einer Quarzglas-Elektrophorese-Kapillare von
engen Innenabmessungen abgegeben werden. Weil die Elektrophorese-Kapillare
mit einer Spannungsquelle verbunden ist, kann die Elektrophorese-Kapillare
als eine flüssigkeitsgefüllte Elektrode angesehen
werden. Wenn das Auslassende der Elektrophorese-Kapillare nahe genug
an der Zellmembran platziert wird und eine elektrische Feldstärke angelegt
wird, die ausreichend ist, um einen dielektrischen Membranzusammenbruch
zu verursachen, werden Verbindungen, die in die Kapillare injiziert
werden, die Zellmembranbarriere überqueren und
in das Zellinnere gelangen, wo sie auf intrazelluläre Rezeptoren
und die intrazelluläre
Chemie wirken können.
Weil die Elektrophorese eine chemische Trennungstechnik ist, kann
sie als Fraktionierungs- und Screeningverfahren für biologisch
wichtige Verbindungen verwendet werden.
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Die
kennzeichnenden Merkmale der Erfindung werden aus der folgenden
Beschreibung und den beigefügten
Ansprüchen
offensichtlich werden.
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Kurze Beschreibung der
Zeichnungen
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In
der Beschreibung und den untenstehenden Beispielen wird auf die
begleitenden Zeichnungen Bezug genommen, bei denen:
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1 eine
bevorzugte Ausführungsform
einer Vorrichtung zeigt, die zum Durchführen des Verfahrens gemäß der Erfindung
verwendet wird.
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2A-C schematische Zeichnungen des Positionierens
der Elektroden und des elektrischen Felds zur Elektroporation einer
einzelnen Zelle sind. 2A veranschaulicht
die Situation vor der Elektroporation, wenn alle gelösten Stoffe
in dem extrazellulären
Volumen vorhanden sind. 2B veranschaulicht
die Situation während
des Anlegens eines Spannungsimpulses, wenn ein hoch fokussiertes
elektrisches Feld über
der Zelle erzeugt wird, was in Permeabilisierung und Diffusion der
gelösten
Stoffe in die Zelle resultiert. 2C veranschaulicht
die Situation nach der Elektroporation, wenn die Membranporen wieder
verschlossen sind und die gelösten
Stoffe innerhalb der Zelle eingeschlossen sind. Unter Verwendung
dieses Schemas ist es auch möglich,
bei hohen elektrischen Feldstärken
intrazelluläre
Organellen zu elektroporieren. Dies resultiert in Porenbildung,
sowohl in der Zellmembran als auch in den organellären Strukturen.
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3 einen
Aufbau zeigt, der zur Elektroporation intrazellulärer Organellen
verwendet werden kann. 3A zeigt ein
Paar von Elektroden, die in eine Zelle eingeführt sind. Die Elektrodenspitzen
sind so platziert, dass sich eine Organelle, die permeabilisiert
werden soll, zwischen den Elektrodenspitzen befindet. 3B zeigt das Anlegen eines elektrischen
Feldes einer Stärke,
die ausreichend ist, um Po renbildung in den Organellen zu verursachen.
Organellen-impermeante Moleküle,
die in die Zelle injiziert werden, können dadurch in die Organelle
diffundieren. In 3C sind die Elektroden
zurückgezogen, überschüssige Moleküle sind
aus dem Cytoplasma entfernt, und die Moleküle befinden sich ausschließlich innerhalb
einer Population von permeabilisierten Organellen.
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4A und B die Elektroporation von Zellen unter
Verwendung von Elektrolytgefüllten
Elektroden zeigen. 4A zeigt eine flüssigkeitsgefüllte Quarzglaselektrode
mit ihrem Auslass, der nahe an der Membran einer einzelnen Zelle
platziert ist. Der Elektrolyt innerhalb der Kapillarelektrode enthält Zell-impermeante Moleküle. 4A veranschaulicht die Situation, wenn
ein permeabilisierendes Feld angelegt wird und die in dem Elektrolyten
enthaltenen Moleküle
durch Elektroosmose und Elektrophorese zu dem Auslassende der Kapillarelektrode
migrieren.
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5 ein
Beispiel einer klinischen Anwendung des Verfahrens veranschaulicht,
welche nicht unter den Rahmen von Anspruch 1 fällt. Zwei Elektroden werden
in einer zellulären
Struktur im menschlichen Gehirn platziert. Das Positionieren der
Elektroden kann unter Verwendung eines stereotaktischen Atlas, dargestellt
in der Figur durch das Cartesische Koordinatensystem, und stereotaktischer
Mikropositionierer durchgeführt
werden. Eine Elektrode ist hohl für die Perfusion von z.B. Wirkstoffen
oder Genen. Die Perfusion kann, wie hier gezeigt, mit einer Spritze oder
durch einige andere Mittel, einschließlich Elektrophorese, erreicht
werden.
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6A und B durch ein Mikroskop aufgenommene
Videobilder zeigen, welche die Elektroporation von Progenitorzellen
zum Inkorporieren von Fluorescein zeigen. 6A ist
ein Hellfeldbild zweier Progenitorzellen. Die Zelle am oberen Ende
wurde in Gegenwart von Fluorescein elektroporiert. 6B ist ein
Fluoreszenzbild, welches zeigt, dass die Fluoreszenz sich einzig
bei der oberen Zelle befindet mit faktisch null Überlaufen des Fluoresceins
zu der benachbarten Zelle.
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7 Mikroaufnahmen
zeigt, welche Fluoreszenz-Differentialfärbung zeigen, die aus der Elektroporation
von Fluorescein in einzelne Progenitorzellen bei hohen bzw. niedrigen
elektrischen Feldstärken
resultiert. 7A zeigt zwei Zellen,
die bei Überschwellenwert-Potentialen
der Plasmamembran von näherungsweise
2 V (zehn Impulse mit 0,5 Hz Wiederholungsrate) elektroporiert wurden,
welche beide ein unterbrochenes cytoplasmatisches Fluoreszenzmuster
aufgrund von Inkorporation des Farbstoffs in die Organellen aufweisen. 7B zeigt Bilder dreier Zellen nach Elektroporation
bei dem Schwellenwertpotential der Plasmamembran von etwa 1 V (zehn
Impulse mit 0,5 Hz Wiederholungsrate), bei denen die Fluoreszenz
diffus ist und gleichmäßig über die
gesamte Zelle verteilt ist, was die Elektroporation von Fluorescein
in das Cytoplasma der Zellen zeigt.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Mit
dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung
ist es möglich,
Zellstrukturen oder zellartige Strukturen zu permeabilisieren und
dadurch polare, Zell-impermeante gelöste Stoffe, wie Nanopartikel,
Wirkstoffe, Farbstoffe, RNA, DNA, Proteine und Peptide, in die oder
aus den zellartigen Strukturen zu transferieren. Die Technik basiert
auf der Verwendung eines hoch fokussierten elektrischen Feldes, das über die
Zellstruktur mittels Mikroelektroden, die nahe an der Zellstruktur
platziert sind, und einer Spannungsquelle angelegt wird. Die Mikroelektroden werden
durch Mikromanipulatoren kontrolliert, vorzugsweise Mikromanipulatoren
mit hoher Unterteilung, und sie können im dreidimensionalen Raum
in Schrittweiten von 10 bis zu wenigen hundert Nanometern verschoben
werden. Vorzugsweise werden zwei Mikroelektroden verwendet, diese
können
aus Kohlenstofffaser, Metall oder anderem elektrisch leitfähigem Material
hergestellt sein. Die Elektroden können zur Verabreichung von
z.B. Wirkstoffen, Genen oder Farbstoffen durch den Innenkanal hohl
sein. Der elektrische Strom, der zur Elektroporation einer Zellstruktur
benötigt
wird, kann auch durch einen Elektrolyten übertragen werden, der in dem
Innenkanal enthalten ist. Solche Hohlkapillaretektroden können aus
Quarzglas oder ähnlichen
Materialien hergestellt sein, wodurch sie die Abgabe des Wirkstoffs, Gens
oder Farbstoffs an die Zelle oder Organelle durch Elektrophorese
oder Elektroosmose ermöglichen.
Die Elektrodendurchmesser sind vorzugsweise nur wenige Nanometer
bis wenige Mikrometer im Durchmesser. Im Fall von Hohlelektroden
kann der Innenkanaldurchmesser wenige Nanometer bis wenige zehn
Mikrometer im Durchmesser sein, wohingegen der Außendurchmesser
wenige Mikrometer bis zu einigen hundert Mikrometern sein kann.
Vorzugsweise werden zwei Mikroelektroden verwendet. Jedoch kann
auch eine einzelne Mikroelektrode zur Elektroporation zusammen mit
einer mesoskopischen oder größeren Elektrode
verwendet werden, die geerdet ist oder auf negativem Potential gehalten ist.
Die Elektroden können
angrenzend an eine Zelle zur Elektroporation der Zellmembran und
der innerhalb der Zelle enthaltenen Organellen platziert werden,
oder die Elektroden können
innerhalb der Zelle für
ausschließliche
Elektroporation der innerhalb der Zelle enthaltenen Organellen platziert
werden.
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Die
Spannungsquelle erzeugt einen Spannungsimpuls mit einer Wellenform,
die quadratisch, exponentiell oder von einer beliebigen anderen
Form sein kann. Es ist auch möglich,
sowohl Gleichströme als
auch Wechselströme
zu verwenden.
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Die
elektrischen Felder, welche benötigt
werden, um Elektroporation zu verursachen, variieren abhängig vom
Typ und der Größe der behandelten Zellstruktur
stark. Die geeignete Feldstärke
kann durch den Fachmann auf dem Gebiet unter Verwendung der gesehenen
Gleichung 1, die in der Hintergrundbeschreibung dieser Anmeldung
angegeben ist, berechnet werden. Die elektrische Feldstärke wird
durch die Spannung und den Interelektrodenabstand eingestellt. Geeignete
Feldstärken
können
in den Bereich von 0,01 kV/cm bis zu 100 kV/cm liegen.
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Geeignete
Interelektrodenabstände
sind Abstände
kleiner als 10 mm, vorzugsweise kleiner als 100 μm. Wenn eine einzelne Säugerzelle
behandelt werden soll, kann es zweckmäßig sein, einen Interelektrodenabstand
von 0,1 μm
bis 30 μm
und eine Spannung von 100 mV bis 100 V zu verwenden.
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Die
Dauer des Spannungsimpulses kann von wenigen Mikrosekunden bis zu
einigen Minuten variieren, ebenfalls abhängig vom Typ und der Größe der behandelten
Zellstruktur. Die Länge
des Spannungsimpulses ist vorzugsweise von 1 μs bis zu 500 ms.
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Während des
Anlegens des Spannungsimpulses wird die Zellstruktur durch Porenbildung
permeabilisiert, was es polaren gelösten Stoffen ermöglicht,
die biologische Doppelschicht-Membranen andernfalls nicht passieren
können,
durch Diffusion in das Innere der Zellstruktur zu gelangen oder
daraus herauszugelangen. Die räumliche
Auflösung
des Verfahrens gemäß der Erfindung
wird durch die Größe der Elektroden,
die so hergestellt werden können, dass
sie nur wenige Nanometer im Durchmesser sind, und durch die Zwischenraumstrecke
zwischen den Elektroden, die so eingestellt sein kann, dass sie wenige
Nanometer bis zu wenigen Mikrometern ist, vorgegeben, wodurch die
Elektroporation sogar der kleinsten der intrazellulären Organellen
und z.B. von Nanobakterien ermöglicht
wird.
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Wenn
das Verfahren gemäß der Erfindung zum
Transferieren von biologischen Markern, Nanopartikeln, Farbstoffen
und anderen Partikeln in Zellstrukturen verwendet wird, sind einige
der Anwendungen die Untersuchung von zellulärer Migration, von Zellproliferation,
-wachstum, -differenzierung sowie anderer biochemischer und biophysikalischer
Ereignisse. Das Verfahren könnte
sich als zweckmäßig in klinischen
Anwendungen als ein Vehikel zum Verabreichen von Wirkstoffen und
Genen an Patienten erweisen. Für
klinische Anwendungen insbesondere ist eine Hohlelektrodenkonfiguration
geeignet, in der die Verbindung, die in die Zelle elektroporiert
werden soll, durch einen kleinen Kanal in der Elektrode verabreicht
wird. Jedoch ist diese klinische Anwendung nicht durch den Rahmen
von Anspruch 1 umfasst.
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Für das Verfahren
gemäß der Erfindung, durchgeführt in vitro,
um gelöste
Stoffe in eine Zellstruktur zu transferieren, wie einen Gewebeschnitt, eine
Primärkultur,
eine Zelllinie oder eine Präparation einer
Organelle, kann eine geeignete Vorrichtung die bevorzugte Ausführungsform
sein, die in 1 dargestellt ist, umfassend
zwei Kohlenstofffaser-Mikroelektroden, 1, 2, mit
Außendurchmessern
im Nanometer- bis Mikrometer-Größenbereich,
verbunden mit einem Spannungsgenerator 3. Vorzugsweise
sind die Elektroden mit dem Spannungsgenerator über die Phiolen 4, 5 verbunden,
die z.B. 3 M KCl, Quecksilber oder Silberkleber und die Silberdrähte 6 und 7 enthalten.
Die Zellstruktur 8 wird typischerweise in z.B. einer Petrischale 9 in
einer gewissen Art von physiologischem Puffer gehalten, der mit
der Verbindung, die in die Zelle inkorporiert werden soll, ergänzt ist.
Um das Betrachten, und daher das Positionieren der Elektroden in
Relation zu der Zellstruktur zu ermöglichen bzw. zu vereinfachen,
ist es möglich,
ein Mikroskop zu verwenden. In der bevorzugten Ausführungsform,
die in 1 gezeigt ist, ist die Petrischale auf einem umgekehrten
Mikroskopgestell 10 angeordnet und wird durch ein Mikroskopobjektiv 11 betrachtet.
Die Elektroden 1, 2 werden mittels der dreidimensionalen
Mikropositionierer 12, 13, vorzugsweise mit hoher
Unterteilung, nahe an jeder Seite der Zellstruktur positioniert,
vorzugsweise in einer sich gegenüberliegenden
linearen Anordnung, so dass sich die Elektroden mit der Zellstruktur
in der Mitte gegenüberliegen.
Dies wird in einer solchen Weise durchgeführt, dass das elektrische Feld,
das zwischen den Elektroden erzeugt wird, hoch fokussiert über der
Struktur vorliegt, die elektroporiert werden soll.
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Da
der Abstand zwischen den Spitzen der Elektroden sehr kurz ist, nur
wenige Mikrometer, wird typischerweise nur ein Niederspannungsgenerator benötigt, um
die erforderlichen elektrischen Feldstärken zur Elektroporation von
biologischen Membranen zu erzeugen. Vorzugsweise wird ein rechteckförmiger Gleichspannungsimpuls über die
Zelle angelegt, und es werden Poren in der Membran erzeugt, durch
welche die gelösten
Stoffe in das Innere entlang ihres Konzentrationsgradienten diffundieren.
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Abhängig von
der Zusammensetzung des Puffers, werden die Bedingungen an den Elektroden verändert. Elektrochemische
Reaktionen an den Elektroden, z.B. Reduktion von Wasser und Oxidation
von Chlorid, verursachen einen gewissen Spannungsverlust, und die
wirksame Spannung sollte für jeden
gegebenen Satz von Elektrodenmaterialien und Puffersystemen berechnet
werden.
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2A-C sind schematische Zeichnungen der
Positionierung der Elektroden und des elektrischen Feldes zur Elektroporation
einer einzelnen Zelle. 2A veranschaulicht
die Situation vor der Elektroporation, wenn alle gelösten Stoffe
in dem extrazellulären
Volumen vorhanden sind. 2B veranschaulicht
die Situation während
des Anlegens eines Spannungsimpulses, wenn ein hoch fokussiertes elektrisches
Feld über
der Zelle erzeugt wird, was in Permeabilisierung und Diffusion der
gelösten
Stoffe in die Zelle resultiert. 2C veranschaulicht
die Situation nach der Elektroporation, wenn die Membranporen wieder
verschlossen sind und die gelösten Stoffe
innerhalb der Zelle eingeschlossen sind. Unter Verwendung dieses
Schemas ist es auch möglich, bei
hohen elektrischen Feldstärken
intrazelluläre
Organellen zu elektroporieren. Dies resultiert in der Porenbildung,
sowohl in der Zellmembran als auch in den organellären Strukturen.
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Nach
der Elektroporation der Zellstruktur kann ein Waschschritt der Zellschale
durchgeführt werden,
um, falls erforderlich, überschüssige gelöste Stoffe
zu entfernen. Der Puffer wird dann durch einen Puffer, dem der gelöste Stoff
fehlt, oder ein Kulturmedium ersetzt.
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Mit
der vorliegenden Erfindung ist es auch möglich, ausschließlich Organellen
zu elektroporieren. Die Organellen können innerhalb einer einzelnen
Zelle enthalten sein oder sie können
aus einer einzelnen Zelle oder einer Population von Zellen isoliert
sein. Wie oben angegeben, hängen
die Stärken der
Impulse davon ab, welche Strukturen elektroporiert werden sollen
und von dem Abstand zwischen den Elektroden. Kleine organelläre Strukturen,
wie endoplasmatische Retikuli und Mitochondrien, benötigen eine
höhere
Spannung, um Poren in der Membran zu erzeugen. Die Impulsdauer kann
auch in den Bereich von wenigen Mikrosekunden bis zu einigen Minuten,
abhängig
von der Membranstruktur, aber auch von der Struktur der Verbindung,
die inkorporiert werden soll, variiert werden. Große Moleküle mit niedrigen
Diffusionsgeschwindigkeiten erfordern längere Zeitdauern, um sich in
die Zelle zu bewegen. Zur Elektroporation von Organellen innerhalb
einer Zelle werden vorzugsweise intrazelluläre Elektroporationselektroden
verwendet. Diese Elektroden können
elektrisch isolierende Schäfte
haben, so dass der Teil der Elektrode, der mit der Zellmembran in
Kontakt kommt, nicht in elektrisch-induzierter Porenbildung resultiert.
Die Spitzen der Elektroden können aus
elektrisch leitfähigen
Materialien hergestellt sein, wie abgeschiedenem Metall oder Kohlenstofffaser. Alternativ
können
Hohlfaserelektroden, die mit einem Elektrolyten gefüllt sind,
für solche
Zwecke verwendet werden. Die physikalischen Abmessungen intrazellulärer Elektroden
zur Elektroporation von Organellen können von wenigen Nanometern
bis zu wenigen Mikrometern im Durchmesser reichen.
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Eine
bevorzugte Ausführungsform
zur Elektroporation von intrazellulären Organellen ist in 3 gezeigt.
Die Elektroden 1, 2, die in diesem Aufbau verwendet
werden, haben eine scharfe Spitze 14, 15, die
aus einem leitfähigen
Material hergestellt ist, und elektrisch isolierte Schäfte. Der
Spitzendurchmesser solcher Elektroden liegt zwischen wenigen Nanometern
und wenigen Mikrometern im Durchmesser. 3A zeigt
ein Paar von Elektroden 1, 2, die in eine Zelle,
umgeben durch eine Zellmembran 16, eingeführt sind.
Die Einführung
und Positionierung der Elektroden wird mittels Mikromanipulatoren
mit hoher Unterteilung durchgeführt
(nicht gezeigt). Die Elektrodenspitzen 14, 15 werden
in einer intrazellulären Domäne von Interesse
platziert. Die Elektroden werden so angeordnet, dass die Organelle 17,
die permeabilisiert werden soll, sich zwischen den Elektrodenspitzen
befindet. In 3B wurde ein elektrisches
Feld einer Stärke,
die ausreichend ist, um Porenbildung in der Organelle 17 zu
verursachen, angelegt. Organellen-impermeante Moleküle 18,
die mittels einer Mikrospritze oder durch einige andere Mittel in
die Zelle injiziert wurden, können
dadurch in die permeabilisierte Organelle 17 diffundieren.
Diese Vorgehensweise wird wiederholt, bis die gewünschte Anzahl
von Organellen permeabilisiert wurde. In 3C sind
die Elektroden zurückgezogen, überschüssige Moleküle werden
aus dem Cytoplasma unter Verwendung von Abbauwegen oder durch einige
andere Mittel entfernt, und die Moleküle befinden sich ausschließlich innerhalb
einer Population von permeabilisierten Organellen.
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Eine
weitere Anwendung der vorliegenden Erfindung ist zur Verwendung
mit Biosensortechniken. Insbesondere durch Anlegen eines permeabilisierenden
elektrischen Feldes über
eine einzelne Zelle können
die intrazelluläre
Chemie und die Organellen für
Biosensor-Zwecke verwendet werden. Als ein Beispiel kann Inositoltriphosphat,
welches Rezeptoren auf endoplasmatischen Retikuli aktiviert, unter
Verwendung solcher Schemata untersucht werden. Die Verbindung wird
einfach zu dem Puffer hinzugefügt,
der die permeabilisierte Zelle umgibt, und wird in das Zellinnere
diffundieren und an Rezeptoren auf endoplasmatischen Retikuli binden.
Beim Binden von Inositoltriphosphat an die Rezeptoren werden endoplasmatische
Retikuli Calciumionen freisetzen. Wenn die Zelle dann mit einem
fluorogenen Calcium-Chelat-Komplex-bildenden
Farbstoff supplementiert wird, wie Fluor-3, kann die Rezeptoraktivierung als
eine Zunahme bei der Fluoreszenz gemessen werden.
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Wenn
Hohlfaserelektroden verwendet werden, gemäß der vorliegenden Erfindung,
können Zell-impermeante
Moleküle,
die zu der Intraelektrodenlösung
hinzugefügt
wurden, unter Verwendung eines Perfusionssystems, wie einer Mikrospritzenpumpe
oder einer peristaltischen Pumpe, an die Zelle verabreicht werden.
Gemäß einem
anderen Schema werden Elektrolytgefüllte Quarzglas-Kapillaren mit engen
Innendurchmessern als Elektroporationselektroden verwendet. Mit
diesen Elektroden können
die Zell-impermeanten Moleküle,
die in der Elektrolytlösung
enthalten sind, unter Verwendung von Elektrophorese oder Elektroosmose,
wie in 4 gezeigt, an eine Zelle abgegeben werden. Das
angelegte elektrische Feld verursacht Porenbildung in der Zelle, wie
zuvor diskutiert. Weil die Komponenten innerhalb des Elektrodenelektrolyten,
basierend auf ihrem Ladung-zu-Reibungswiderstand-Verhältnis ("charge-to-frictional drag ratio") getrennt werden,
kann dieses Verfahren z.B. für
Biosensor-Anwendungen verwendet werden. Zur Elektroporation von
Zellen ist es möglich,
entweder Elektroden mit leitfähiger
Spitze zum Anlegen des elektrischen Feldes, das notwendig ist, um
Porenbildung zu erzeugen, oder Elektroden, die mit einem Elektrolyten
gefüllt
sind, der den elektrischen Strom überträgt, der notwendig ist, um Porenbildung
zu erzeugen, zu verwenden. Im Fall von Elektroden mit einer leitfähigen Spitze
können Zell-impermeante
Moleküle,
mit denen die Flüssigkeit
supplementiert wurde, die in den Hohlelektroden enthalten ist, unter
Verwendung eines Perfusionssystems, wie eine Spritzenpumpe oder
eine peristaltische Pumpe, an die Zelle verabreicht werden. Im Fall des
Verwendens von Hohlelektroden, in denen der permeabilisierende Strom
durch den Elektrolyten übertragen
wird, können
zusätzlich
die Moleküle,
die in dem Elektrolyten der Hohlelektrode enthalten sind, an die
Zellstruktur durch Elektrophorese oder Elektroosmose abgegeben werden.
Wenn Elektrophorese oder Elektroosmose verwendet wird, können die Komponenten
in der Hohlelektrode, basierend auf ihrem Ladung-zu-Reibungswiderstand-Verhältnis, getrennt
werden. Dies eröffnet
Möglichkeiten
zum Durchführen
einer Organelle-Sensor-basierten
Detektion von Spezies, die durch Elektrophorese fraktioniert werden.
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Die
Elektroporation von Zellen unter Verwendung von flüssigkeitsgefüllten Quarzglaselektroden mit
konischen Spitzen ist in 4A und B
veranschaulicht. Solche konischen Spitzen können durch Ausziehen der Quarzglas-Kapillare
in einer Flamme, Ätzen
in Fluorwasserstoffsäure
oder durch Abschleifen erzeugt werden.
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4A zeigt eine Elektrolyt-gefüllte Quarzglaselektrode 1 mit
ihrem konischen Auslass, der nahe an der Membran 16 einer
einzelnen Zelle platziert ist. Der Elektrolyt innerhalb der Kapillare
enthält Zell-impermeante
Moleküle 19,
die hydrodynamisch oder durch einige andere Mittel in die Kapillare
injiziert wurden. In diesem Fall aktivieren die supplementierten
Zell-impermeanten Moleküle 19 die
Rezeptoren 20 auf den Organellen 17. Wenn durch
Anlegen einer positiven Spannung an das Einlassende der Kapillarelektrode
ein permeabilisierendes Feld angelegt wird, werden die Moleküle, die
in dem Elektrolyten enthalten sind, durch Elektroosmese und Elektrophorese
zu dem Auslassende der Kapillarelektrode migrieren. Weil das elektrische
Feld stark genug gewählt
wird, um die Zellmembran zu permeabilisieren, werden die Zell-impermeanten
Moleküle, mit
denen der Elektrolyt supplementiert ist, der in der Elektrode enthalten
ist, die Poren 21, die sich in der Zellmembran gebildet
haben, passieren, und sie können
z.B. Rezeptoren auf Organellen, wie in 4B gezeigt,
aktivieren. Weil das elektrische Feld stark genug gewählt wird,
um die Zellmembran zu permeabilisieren, werden die Zell-impermeanten Moleküle, mit
denen der Elektrolyt supplementiert ist, der in der Elektrode enthalten
ist, die in der Zellmembran gebildeten Poren passieren, und sie
können
z.B. Rezeptoren auf Organellen aktivieren. Elektroden von ähnlicher
Art, aber kleinerer Abmessung, können
zur Elektroporation von Organellen verwendet werden.
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Wenn
das Verfahren, obwohl es nicht unter den Rahmen von Anspruch 1 fällt, in
vivo durchgeführt
wird, ist es möglich,
ein chirurgisches Mikroskop zu verwenden, um die Zellstruktur zu
sehen. Darüber hinaus
ist es möglich,
eine stereotaktische Vorrichtung zum Positionieren der Elektroden
zu verwenden. Wenn das Verfahren in vivo durchgeführt wird, ist
es natürlich
nicht möglich,
die Zellstruktur in einer Art Behälter mit Puffer zu platzieren.
Anstatt dessen wird die Verbindung, die in die Zellstruktur inkorporiert
werden soll, in einem physiologischen Puffer, entweder getrennt über einen
Katheter oder direkt über
eine Hohlfaserelektrode, verabreicht. Wenn Hohlfaserelektroden verwendet
werden, wird die Verbindung durch einen kleinen Kanal in den Elektroden, der
an eine Spritze gekoppelt ist, kontrolliert durch eine Mikrometerschraube
oder eine Mikroinjektionspumpe, um die Verabreichung eines genauen
Volumens zu ermöglichen,
an die Zellstruktur verabreicht. Die Möglichkeiten, die Verbindung
entweder zur gleichen Zeit, wie die Elektroporation auftritt, oder
mit einiger Zeitverzögerung
hinzuzufügen,
macht diese Technik sehr nützlich.
Eine sehr hohe Konzentration wird lokal bei der ausgewählten Zelle
erreicht, und die Diffusion in sie wird aufgrund des größeren Konzentrationsgradienten
schneller sein. Der geringere Verbrauch der Verbindung und die Minimierung
der Probleme aufgrund des Waschvorgangs sind einige weitere Vorteile.
Häufig
kann erwartet werden, dass eine fokale Verabreichung, d.h., eine
Verabreichung von Wirkstoffen oder Genen direkt an die Gruppe von Zellen
mit Fehlfunktion, einer intraperitonealen, oralen, intraventrikulären oder
beliebigen anderen Art von gemeinhin eingesetzter Wirkstoffverabreichungstechnik überlegen
ist. Eine intrazelluläre
Wirkstoff- und Genverabreichung in vivo kann mit einem Verfahren
erzielt werden, das nicht unter den Rahmen der Ansprüche fällt. Aufgrund
der extrem kleinen Abmessungen der Elektroden in Kombination mit
den angelegten niedrigen Spannungen wird sehr wenig Gewebetrauma
erwartet. Darüber
hinaus ist die Positionierung der Elektroden und die nachfolgende
Gen- oder Wirkstoffabgabe sehr genau. Es wurde gezeigt, dass Mikrodialysesonden,
die größenordnungsmäßig hundert
Mal größer sind
als die Elektroden, die in dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet
werden, sehr wenig Gewebetrauma und Störung des örtlichen Metabolismus verursachen.
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Mit
dem Verfahren gemäß der Erfindung, verwendet
in Kombination mit Gentherapie, wird es möglich sein, Zellen zu "reprogrammieren"; entweder, um eine
Zelle mit Fehlfunktion dazu zu bringen, in der richtigen Weise zu
funktionieren, oder um einer Zelle eine neue Funktion zu geben.
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Es
ist somit möglich,
ein Verfahren, das nicht unter den Rahmen der Ansprüche fällt, in
Therapien für
und in der Behandlung von verschiedenen Krankheiten und Zuständen zu
verwenden, die durch die Fehlfunktion einzelner Zellen oder einer
kleinen Population von Zellen verursacht werden, wie Parkinson'sche Krankheit und
Hirntumoren, was untenstehend weiter veranschaulicht wird.
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Viele
Erkrankungen, seien sie genetisch erworben oder nicht, resultieren
in metabolischen Störungen.
Z.B. resultiert die Parkinson'sche
Krankheit, die durch Degeneration von Neuronen in dem Nigro-striatalen
Weg verursacht wird, in einer Fehlfunktion in der biochemischen
Maschinerie zur Herstellung von Dopamin in einer isolierten Population von
Zellen. Dies wiederum resultiert in Bewegungsverhaltensdefiziten.
Die Standardbehandlung der Parkinsonschen Krankheit ist durch orale
Verabreichung von L-Dopa, einem Vorläufer von Dopamin. Alternativ
wird ein Gewebetransplantat mit Nervenzellen, die Dopamin erzeugen,
in das Hirn des Patienten transplantiert. Eine intrazelluläre Wirkstoff-
oder Genverabreichung in vivo in die geeigneten Hirnstrukturen kann
unter Verwendung einer Elektroporationsvorgehensweise ähnlich derjenigen,
die in den zwei obigen Beispielen beschrieben wurde, erzielt werden,
und als eine therapeutische Strategie verwendet werden.
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Die
experimentelle Behandlung von Hirntumoren unter Verwendung von genetisch
manipulierten Viren zur Genabgabe wurde mit Einzelberichten von
Erfolg verwendet. Die Verwendung von Viren als Abgabesystem hat
dahingehend Einschränkungen, dass
sie eine mögliche
Gefährdung
darstellen könnte,
falls das Virus mutiert. Das Anwenden einer Elektroporationsvorgehensweise
zur Genabgabe, z.B. "Suizid-Gene" für Cytokindeaminase
oder Thymidinkinase, ähnlich
derjenigen, die in den Beispielen unten beschrieben wird, beseitigt
die Notwendigkeit für die
Verwendung von Virus-Abgabesystemen in der Krebstherapie.
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5 ist
eine schematische Veranschaulichung einer Behandlung von Hirntumoren
mit einem Verfahren, das nicht unter den Rahmen der Ansprüche fällt. Zwei
Elektroden, vorzugsweise mindestens eine Hohlfaserelektrode zur
Perfusion von z.B. Wirkstoffen oder Genen, werden in einer zellulären Struktur
im menschlichen Gehirn platziert. Die Positionierung der Elektroden
kann unter Verwendung eines stereotaktischen Atlas, in der Figur
dargestellt durch das Cartesische Koordinatensystem, und stereotaktischer
Mikropositionierer durchgeführt
werden. Die Perfusion kann, wie in der Figur gezeigt, mit einer Spritze
oder mittels einiger anderer geeigneter Mittel erreicht werden.
Die Positionierung der Elektroden und das angelegte elektrische
Feld können
variiert werden, so dass eine gewünschte Anzahl von Zellen elektroporiert
wird.
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Die
gelösten
Stoffe, die in die Zellen elektroporiert werden sollen, werden dann
einfach durch den engen Kanal in der Mitte der Elektrode oder der Elektroden
durch Anlegen eines Flusses mittels einer Spritzenpumpe oder einer
peristaltischen Pumpe oder einem beliebigen anderen Typ eines Lösungspumpsystems,
einschließlich
Elektrophorese, verabreicht.
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Eine
besonders interessante Möglichkeit
ist es, Batterie-betriebene Perfusion/Elektroporation-Implantate
in biologisch annehmbaren Materialien zur kontinuierlichen Applikation
von gelösten
Stoffen in Zellen zu verwenden. Weil so niedrige Potentiale benötigt werden,
können
Batterien, die Spannungen im Bereich von wenigen bis etwa 20 Volt
liefern, verwendet werden. Diese Batterie-betriebenen Elektroporationseinheiten
können
sehr klein hergestellt werden, sie können auf einem Chip eingeschlossen
sein, der nur wenige Quadratmillimeter misst. Ein solches System
könnte
ein gelöste
Stoffe-enthaltendes Lösungsreservoir,
zwei Elektroden für
die Elektroporation, elektronische Schaltkreise für eine zeitlich
abgestimmte Abgabe und Kontrolle der Elektroporationsparameter,
d.h., Impulsprofil, Impulsdauer, Wiederholung und Amplitude, sowie
eine Batteriequelle, und einen Reservoir-Nachfülleinlass enthalten.
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Die
gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendeten Elektroden können eine beliebige geeignete
Form oder Konfiguration haben. Sie können von dem in 1 veranschaulichten
Typ sein. Sie können
auch z.B. ein Paar oder mehrere Paare von stabartigen Elektroden
sein, die die gesamte Länge
der Struktur, die elektroporiert werden soll, durchdringen. Wenn
ein elektrisches Feld über
diese stabartigen Elektroden angelegt wird, werden alle Zellen,
die diesem ausgesetzt sind, elektroporiert werden. Dies ermöglicht eine
höhere
Umsatzzahl und schnellere Behandlungen.
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Wenn
das Verfahren gemäß der Erfindung zum
Transferieren eingeschlossener gelöster Stoffe aus Zellstrukturen
verwendet wird, sogenannte umgekehrte Elektroporation, sind einige
der Anwendungen Wirkstoffabgabe an einzelne Zellen oder kleine Populationen
von Zellen. Dies wird z.B. verwendet, um Zellen und zellartige Strukturen
zu permeabilisieren, wie Liposome, um Zell-impermeante gelöste Stoffe
aus ihrem Inneren in das extrazelluläre Medium zu transferieren.
Der Konzentrationsgradient für die
gelösten
Stoffe hat dann die entgegengesetzte Richtung, d.h., hohe Konzentrationen
des gelösten Stoffs
innerhalb der Zellstruktur und niedrige Konzentrationen des gelösten Stoffs
außerhalb
der Zellstruktur. Insbesondere können
Liposome mit eingeschlossenen Wirkstoffen in einer kontrollierten
Weise nahe an der Zielzelle einfach durch Anlegen eines Gleichspannungsimpulses über ihre
Membran durch Kohlenstofffaser-Mikroelektroden, die in der gleiche
Weise, wie oben beschrieben, positioniert sind, geleert werden.
Die Verwendung solcher Liposomen-basierten Abgabe von Wirkstoffen,
die durch Elektroporation getriggert wird, kann in der Grundlagenforschung, wie
auch in der pharmazeutischen Industrie, z.B. für Zusammensetzungen mit verzögerter Freisetzung, verwendet
werden.
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Es
ist auch möglich,
Zellen dazu zu bringen, gelöste
Stoffe, die in ihrem Cytoplasma vorhanden sind, durch Anlegen eines
elektrischen Feldes, identisch zu dem, wie oben für den gelöste Stoffe-Transfer
in die Zellen unter Verwendung von Elektroporation beschrieben,
freizusetzen.
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Die
Erfindung wird weiter in den untenstehenden Beispielen veranschaulicht,
die in keiner Weise den Rahmen der Erfindung einschränken.
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Beispiel 1. Elektroporation
von Progenitorzellen aus reifem Rattenhirn, um einen Fluoreszenzmarker
zu inkorporieren
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Progenitorzellen
wurden gemäß der Standardvorgehensweisen
(T.D. Palmer, J. Ray, F.H. Gage, Mol. Cell. Neurosci., 6, 474-486
(1995)) kultiviert und auf Nummer 1, 1-Inch, kreisförmige Deckgläser, die
mit Poly-D-ornithin und Lamilin beschichtet waren, plattiert. Die
Zellen wurden dann über
Nacht stehen gelassen, um an die Glasoberfläche zu binden. Die Zellen wurden
in einer feuchten Atmosphäre
bei 37°C
mit 5% CO2 und 95% Luft inkubiert. Zur Elektroporation
wurden die Zellschalen in einen kreisförmigen Polycarbonathalter mit
niedrigem Rand unter Verwendung von Montagefett angebracht. Der
Polycarbonathalter mit dem Deckglas war auf dem Gestell eines umgekehrten
Mikroskops (Leica DM IRB) angebracht. Die Zellen wurden in einer
HEPES-gepufferten Salzlösung,
enthaltend 137 mM NaCl, 0,4 mM MgCl2, 0,64
mM KH2PO4, 3,0 mM
NaHCO3, 0,41 mM MgSO4,
5,4 mM KCl, 20 mM HEPES, 1,26 mM CaCl2 und
5,5 mM D-Glucose (pH mit NaOH auf 7,4 eingestellt) gehalten. Dieser
HEPES-Puffer wurde mit Fluorescein (Natriumsalz, 5 μM), einer
hochfluoreszenten geladenen Spezies, supplementiert.
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Um
die Zellen zu elektroporieren, wurden zwei Kohlenstofffaser-Mikroelektroden
(Pro CFE, Axon Instruments, Foster City, CA), verbunden mit der
Energieversorgung über
eine flüssige
Verbindung von KCl (3 M) und einen dünnen Silberdraht, in dem Zellbad
mit einem Abstand von etwa 15 μm
zwischen den Spitzen und mit der Zelle, positioniert in der Mitte
zwischen den zwei Spitzen, platziert. Diese Konfiguration ist in 3A veranschaulicht. Die Elektroporation
der Zellmembran wurde erzielt, indem ein bis zehn Impulse von Gleichspannung,
was Membranpotentiale von 0,5 bis 1 Volt ergab, mit einer Dauer
von etwa 1 ms über
die Spitzen unter Verwendung eines Niedrigspannungsimpulsgenerators
(Digitimer Stimulator, DS9A, UK) angelegt wurden. Es sollte angemerkt
werden, dass verschiedene Spannungen, Dauern, Pulsprofile und auch
Wechselströme
eingesetzt werden können,
falls erforderlich. Während
des Anlegens des Spannungsimpulses wird ein hoch fokussiertes elektrisches
Feld über
der Zelle erzeugt. Das Vorhandensein des Feldes resultiert in der
Permeabilisierung der Zelle durch Porenbildung, und die gelösten Moleküle diffundieren
in die Zelle abwärts entlang
ihres Konzentrationsgradienten, was in 3B veranschaulicht
ist. Nach dem Anlegen des elektrischen Impulses werden die Membranporen wieder
verschlossen, und die Analyten sind innerhalb der Zelle eingeschlossen.
Schließlich
werden die Zellschalen mit HEPES-Pufferlösung gewaschen. Die abschließende Situation
ist in 3C veranschaulicht.
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Die
Zellen wurden dann in dem Mikroskop unter Verwendung der Anregung
des Fluoresceins bei 488 nm unter Verwendung eines Ar-Ionenlasers (Spectra
Physics Modell 2025-05, Sunnyvale, CA) betrachtet. Das Laserlicht
wurde durch einen 488-Linie-Interferenzfilter geschickt, gefolgt
von einer rotierenden Scheibe, um die Kohärenz zu brechen und das Laserlicht
zu streuen. Der Laserstrahl wurde mittels einer Linse gesammelt
und durch einen Fluorescein-Filterwürfel (Leica
I-3) in das Objektiv geschickt, um die Fluorophore anzuregen. Die
resultierende Fluoreszenz wurde durch das gleiche Objektiv gesammelt,
und das Bild wurde mittels einer 3-Chip-Farb-CCD-Kamera (Panasonic)
detektiert und mittels Super VHS (Panasonic SVHS AG-5700) mit einer
25 Hz-Vollbildaufzeichnungsrate aufgezeichnet. Die CCD-Bilder wurden
von dem Band digitalisiert und für
eine Präsentation
bearbeitet. Das Ergebnis ist in 6 gezeigt.
Die Zelle oben in 6A, welche ein Hellfeldbild
zweier Progenitorzellen in engem Kontakt miteinander ist, wurde
in Gegenwart von Fluorescein, wie oben beschrieben, elektroporiert.
Wie in dem Fluoreszenzbild in 6B gezeigt, befindet
sich die Fluoreszenz einzig in der oberen Zelle mit faktisch null Überlaufen
des Fluoresceins zu der benachbarten Zelle. Somit ist es mit den
gegenwärtigen
Elektroden und der gegenwärtigen
Ausrüstung
machbar, eine ausreichende räumliche
Auflösung
zu erzielen, um einzelne Zellen zu elektroporieren.
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Beispiel 2. Elektroporation
von intrazellulären
Organellen in Progenitorzellen auf dem Hirn erwachsener Ratten unter
Verwendung extrazellulärer
Elektroden
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Der
experimentelle Aufbau aus Beispiel 1 wurde für eine in situ-Elektroporation
von Organellen in einzelnen Progenitorzellen wiederholt. Dieses
Beispiel fällt
nicht unter den Rahmen der Erfindung. Speziell wurde Fluorescein
in einzelne Zellen durch zehn 0,5 Hz-Überschwellenwert-Feldanlegungen,
resultierend in Potentialveränderungen
an der Zellmembran von 1,6 V ± 0,07
V (Bereich 1,5-2,4V) eingebracht, und es wurde mit Zellen verglichen,
die bei niedrigen Membranpotentialen von 0,5-1,0 V elektroporiert worden
waren. Nach der Elektroporation wurde das extrazelluläre Farbstoff-enthaltende
Medium durch eine Hank-Hepes-Lösung ersetzt.
Das Ergebnis der Elektroporation bei hohen Spannungen ist in 7A gezeigt, in der unterbrochene Fluoreszenz
in dem exo-nucleären
cytoplasmatischen Bereich, aber nicht in dem nucleären Bereich,
der eine kleinere Anzahl von Organellen enthält, beobachtet wird. Insgesamt zeigten
achtzehn von zwanzig Zellen, die in diesem Protokoll elektroporiert
wurden, ein ähnliches
Färbungsmuster,
daran erinnernd, was unter Verwendung eines Organellen-spezifischen
Farbstoffs, wie Rhodamin 123, beobachtet wird, der die Mitochondrien-Fraktion der Organellen
markiert. Im Vergleich damit zeigten Zellen, die bei dem Schwellenwertpotential
der Plasmamembran elektroporiert worden waren, allgemein eine diffuse
Fluoreszenz des im Cytosol eingeschlossenen Fluoresceins, wie in 7B gezeigt. Diese Beobachtung einer unterschiedlichen Lokalisierung
des Fluoresceins war im Vergleich zum Anlegen niedriger und hoher
elektrischer Feldstärken konsistent
mit dem höheren
Potential für
den Zusammenbruch der intrazellulären Organellen, wie durch Gleichung
1, angegeben in dem Hintergrund-Abschnitt, aufgrund ihrer kleineren
Dimension vorhergesagt. Es wurde gezeigt, dass 2,5-10fach höhere elektrische
Feldstärken
zur Elektroporation und Fusion isolierter Mitochondrien, verglichen
mit Zellen mit 10 mm Durchmesser, erforderlich sind. Die Ergebnisse sind auch
in Übereinstimmung
mit morphologischen Beobachtungen in Riesentintenfischaxonen („giant squid
axons"), die auf
milde, moderate und strenge Elektroporationsprotokolle folgen.