CN104173287B

CN104173287B - 用于靶向释放药物载体的脉冲电场敏感脂质体的制备方法

Info

Publication number: CN104173287B
Application number: CN201410353287.6A
Authority: CN
Inventors: 曾新安; 刘志伟; 孙大文; 韩忠; 王满生
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2014-07-23
Filing date: 2014-07-23
Publication date: 2016-10-05
Anticipated expiration: 2034-07-23
Also published as: CN104173287A

Abstract

本发明公开了用于靶向释放药物载体的脉冲电场敏感脂质体的制备方法，包括以下步骤：(1)以磷脂、胆固醇、维生素E为原料制备脂质膜；(2)将脂质膜用乙醚溶解，加载待包裹药物，得到脂质体；(3)离心除去脂质体外未包裹的药物；(4)加入镁盐，对脂质体进行修饰，得到脉冲电场敏感脂质体。本发明制备工艺简单，脂质体对水溶性药物的包封率高、性能稳定；在脉冲电场作用下释放率高。

Description

用于靶向释放药物载体的脉冲电场敏感脂质体的制备方法

技术领域

本发明涉及药物制剂领域，特别涉及用于靶向释放药物载体的脉冲电场敏感脂质体的制备方法。

背景技术

脂质体是单层或多层脂质双分子膜以同心圆的形式包封而成，类似细胞膜的微球体，其主要成分为磷脂和胆固醇。20世纪70年代初用脂质体作为药物载体包埋淀粉葡萄糖苷酶治疗糖原沉积病首次获得成功。此后，脂质体作为药物载体具有使药物靶向网状内皮系统、延长药效、降低药物毒性、提高疗效、避免耐受性、改变给药途径等优点，因而受到医药界的广泛关注。但脂质体作为药物载体仍存在对有些疾病的靶向特征不理想等缺点，因而限制了脂质体的临床应用。近年来人们设计开发了温度敏感脂质体、pH敏感脂质体、免疫脂质体、磁性脂质体等新型脂质体以提高脂质体的靶向性。

近二十年来，脉冲电场对细胞膜的电穿孔效应获得了广泛深入的研究，其作用机理是当外加电脉冲电场强度达到kV/cm量级，脉冲宽度为纳米或者微秒量级时，由于磷脂双分子层构成的细胞膜内部充满着电解质和带电荷的离子，在高压电场脉冲作用下，细胞膜内各带电物质在电场作用力下定向移动，并在磷脂双分子层的两侧聚集，膜两侧电位差变大形成跨膜电压，但跨膜电压高于磷脂双分子层临界击穿电压时，脉冲电场则击穿细胞的磷脂双分子层，在细胞膜上形成亲水性的小孔，从而细胞膜的通透性增加，有利于细胞吸收各种药物、基因、蛋白质、其它大分子。同时，利用脉冲电场临床上应用于肿瘤治疗也进行了大量研究，脉冲电场可以引起肿瘤细胞内部出现一系列结构和功能的改变，同时诱导肿瘤细胞凋亡。脉冲电场诱导肿瘤细胞凋亡用于浅表肿瘤(乳腺癌、腋下癌症、靠近胸壁癌症等)病变治疗，可以实现肿瘤的准确定位和微创治疗，且避免了炎症、溃疡等。

镁属于人体营养素矿物质元素中的一种。人体中的镁60-65％存在于骨骼和牙齿中，27％存在于软组织中，细胞内镁离子占1％，多以活性形式Mg²⁺-ATP形式存在。人体的生命活动离不开镁离子。镁离子作为酶的激活剂，参与300种以上的酶促反应。镁离子参与糖酵解、脂肪酸氧化、蛋白质的合成、核酸代谢等，促进骨的形成，在骨骼中仅次于钙、磷，是骨细胞结构和功能所必需的元素，对促进骨形成和骨再生，维持骨骼和牙齿的强度和密度具有重要作用；调节神经肌肉的兴奋性，能抑制钾、钙通道。镁、钙、钾离子协同维持神经肌肉的兴奋性，镁也是重要的神经传导物质，它可以让肌肉放松下来；维护胃肠道和激素的功能，与含钙食品一同补充，能促进钙的吸收。中国营养学会建议，成年男性每天约需镁350mg。成年女性约为300mg。

中国发明专利CN201110340040.7公布了一种多西他赛pH敏感脂质体及其制备方法。该专利根据肿瘤附近的pH值比周围正常组织低的事实,在脂质体的制备过程中加入的物质设计了pH敏感脂质体。中国发明专利CN200480028904.X公布了一种具有糖链的靶向性和肠道吸收控制性脂质体制备方法。中国发明专利CN201210009962.4公布了一种表面修饰有肿瘤归巢肽CREKA或具有CREKA核心序列的肽段的热敏脂质体的制备方法，该专利利用相变温度在人体体温之上的磷脂制备脂质体，当局部超过磷脂的相变温度时，脂质膜由“凝胶态”转到液晶结构，其磷脂的脂酰链紊乱度增加，膜的流动性增大，此时包封的药物的释放速率亦增大，从而达到同过控制病变部位的温度达到定向释放的效果。中国专CN201210052450.6公布了一种氯化钾脂质体注射剂。

近年来新型脂质体的研究已从单一脂质体向多功能脂质体如pH敏感免疫脂质体、热敏性脂质体、热敏感长循环脂质体等方向发展。这些新型脂质体在稳定性、靶向性和疗效方面都比传统脂质体有明显改善。但新型脂质体各自仍存在自身的缺点：

(1)pH敏感免疫脂质体易引起免疫反应；

(2)热敏性脂质体在病变部位的聚集是被动靶向分布，特异性有限，加热时间过长可造成正常结缔组织损伤；

(3)热敏感长循环脂质体由于亲水性大分子的嵌入，在一定程度上降低了脂质体的热敏性，在进行电疗时，药物释放效率低。

随着脂质体研究工作的不断深入，不同理论互相渗透，互相补充，脂质体作为药物载体所转运的药物种类和范围将不断扩大，有着广阔的应用前景。

发明内容

为了克服现有技术的上述缺点与不足，本发明的目的在于提供一种用于靶向释放药物载体的脉冲电场敏感脂质体的制备方法，制备工艺简单，脂质体对水溶性药物的包封率高、性能稳定，在脉冲电场作用下释放率高。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

用于靶向释放药物载体的脉冲电场敏感脂质体的制备方法，包括以下步骤：

(1)将磷脂、胆固醇、维生素E用氯仿和乙醇的混合液进行溶解，并于旋转蒸发仪减压蒸干混合溶液形成脂质膜；然后，将脂质膜放入真空干燥箱中干燥，除去残留氯仿和乙醇；

(2)将步骤(1)处理后的脂质膜用乙醚进行溶解，溶解完全后得到乙醚和磷脂的混合液；向乙醚和磷脂的混合液中加入待包裹药物的水溶液，水浴超声处理，使混合液中的有机相和水相充分混合均匀；旋蒸去除乙醚，制得脂质体；将制得的脂质体用等渗葡萄糖溶液重悬，得到脂质体的悬浮液；

(3)将脂质体的悬浮液在液氮或者-78℃的超低温冰箱中冷冻、在室温下溶解，混匀；反复冻融多次，然后，离心除去上清液，用等渗葡萄糖溶液重悬下层脂质体沉淀；反复离心多次，除去脂质体外未包裹的药物，制得普通的脂质体；

(4)将步骤(3)制备的脂质体用等渗葡萄糖溶液重悬，得到脂质体的悬浮液，向脂质体的悬浮液加入镁盐，溶解，孵化，即得脉冲电场敏感脂质体；所述镁盐的加入量为：每升脂质体的悬浮液加入10～100mg镁盐。

步骤(1)所述磷脂、胆固醇、维生素E的质量比为10:2:1～10:5:1。

步骤(1)所述氯仿和乙醇的混合液的体积比为9:1。

步骤(2)所述乙醚和磷脂的混合液与待包裹药物的水溶液的质量比为3：1。

所述镁盐为粉末状。

步骤(2)所述水浴超声处理，具体为：

水浴超声处理时温度控制在0～10℃，时间为3～5min，超声功率500～600W。

步骤(3)所述离心，具体为：离心力为10000～15000g，时间10～15min。重复离心的次数为4～10次。

步骤(4)所述孵化，具体为：孵化温度为20～35℃，时间5～25min。

本发明的用于靶向释放药物载体的脉冲电场敏感脂质体在脉冲电场作用下促进包裹物质释放的技术原理如下：

镁离子与脂质体相互作用研究表明，镁离子与磷脂的头部基团结合，脂质体的磷脂双分子层的磷脂酰基链的有序性增加，双分子层的流动性降低，从而使脂质体在水溶液中稳定性增加。同时脂质体上因为镁离子的存在，镁离子吸附在脂质体上、膜电位差增加，使脉冲电场作用下，细胞膜两侧电介质极化加强，使磷脂分子在脉冲电场作用下更易于极化，在脂质体的磷脂双分子层两侧产生更高的跨膜电压，随着电场强度的增大和处理时间的延长，细胞膜极化加剧，膜两侧的电位差增大，两侧的异性离子之间就会产生相互吸引的库仑力，此作用力相当于在膜的两侧施加了挤压力，引起细胞膜厚度减小。当脉冲电场场强达到临界崩解电压V_c时，细胞膜上形成小孔，使得细胞膜的通透性增加使内容物泄漏。不同离子对脂质体的相互作用研究表明，不同的离子与磷脂头部基团的结合程度和极化位点也不同，Ca²⁺倾向于与一个磷脂头部的COO^-和另一个磷脂PO₄ ^-。而Mg²⁺倾向于与两个磷脂COO^-或PO₄ ^-结合。因为不同离子结合位点的不同从而使其在脉冲电场作用下有不同的泄漏特性。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：

(1)本发明的脉冲电场敏感脂质体制备工艺简单，脂质体对水溶性药物的包封率高、性能稳定；在脉冲电场作用下释放率高；

(2)本发明的脉冲电场敏感脂质体可用于辅助脉冲电场治疗肿瘤，将治疗肿瘤的药物用脉冲电场敏感脂质体进行包裹，制备成注射液；采用静脉或者直接对病变部位进行注射，本发明的脂质体在血液循环运送过程中稳定高，脂质体内药物释放率低，与传统的化疗方法相比能有效降低化疗药物对正常组织的毒害；当药物运送到病变部位时，在脉冲电场的作用下，使脂质体内部包裹药物释放，从而电脉冲辅助化疗药物能定向，高效的作用于肿瘤细胞，减少对非病变部位的损害，提高药物的作用效果。

附图说明

图1为本发明的实施例制备得到的脉冲电场敏脂质体的粒径分布。

图2为本发明的实施例制备的包裹水溶性荧光素–羧基荧光素的脉冲电场敏感脂质体与普通脂质体的在脉冲电场作用下的对比图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图，对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

称取250mg大豆卵磷脂、50mg胆固醇、25mg维生素E与50ml的旋转蒸发瓶中，并用10ml的氯仿和乙醇的混合液(V_氯仿：V_乙醇＝9：1)充分溶解，在温度为30℃下，旋转蒸发仪(RE-2000B，上海亚荣生化仪器厂)中减压蒸发氯仿和乙醇混合液直至形成均匀的脂质膜。然后，在温度为25℃下，真空干燥箱(DZF-6050，上海齐欣科学仪器有限公司)抽真空干燥15h，除去残留的氯仿和乙醇。将脂质膜用9ml的乙醚充分溶解，得到乙醚和磷脂的混合液；乙醚和磷脂的混合液中加入3ml的0.05M的羧基荧光素水溶液。在温度为5℃下，功率600 W水浴超声3min，使两相充分混匀后。在温度低于10℃的条件下，抽真空旋转蒸发3h去除乙醚，得到脂质体。将制得的脂质体用等渗葡萄糖溶液7ml重悬得脂质体的悬浮液。脂质体的悬浮液在温度为-78℃的超低温冰箱中冷冻10 min，然后在室温下融解，重复冻融3次。高速冷冻离心机(JW-3021HR，安徽嘉文仪器装备有限公司)12000g离心力下离心15min去掉上层清液。用等渗葡萄糖溶液重悬下层脂质体沉淀，重复离心3次，去除未包裹的羧基荧光素。最后，向制得的10ml脂质体葡萄糖悬浮液中加入0.5mg的氯化镁溶解、混匀。在30℃下保温10min，即制得本实施例的包裹水溶性荧光素–羧基荧光素的脉冲电场敏感脂质体。本实施例制备的脉冲电场敏感脂质体与普通脂质体在脉冲电场作用下的对比。如图1所示，制得脂质体的平均粒径为339.3nm，粒径分布在131.2–766.0nm；普通的脂质体在脉冲场强为2kV/cm、脉宽为4μs的脉冲电场作用下释放率为6.32％，本实施例制备的脉冲电场敏感脂质体的释放率为20.85％，提高了212.11％。

实施例2

称取150mg蛋黄卵磷脂、75mg胆固醇、15mg维生素E于50ml的旋转蒸发瓶中，并用10 ml的氯仿和乙醇的混合液(V_氯仿：V_乙醇＝9：1)充分溶解，在温度为35℃下，旋转蒸发仪(RE-2000B，上海亚荣生化仪器厂)中减压蒸发氯仿和乙醇混合液直至形成均匀的脂质膜。然后，在温度为30℃下，真空干燥箱(DZF-6050，上海齐欣科学仪器有限公司)抽真空干燥10h，除去残留的氯仿和乙醇。将脂质膜用9 ml的乙醚充分溶解得到乙醚和磷脂的混合液；乙醚和磷脂的混合液中加入3ml的0.05M的羧基荧光素水溶液。在温度为8℃下,功率600W水浴超声5min，使两相充分混匀后。在温度低于10℃的条件下，抽真空旋转蒸发5h去除乙醚，得到脂质体。将制得的脂质体用等渗葡萄糖溶液7ml重悬得脂质体的悬浮液。在液氮中冷冻10min，然后在室温下融解，重复冻融5次。高速冷冻离心机(JW-3021HR，安徽嘉文仪器装备有限公司)15000g离心力下离心15min去掉上层清液。用等渗葡萄糖溶液重悬下层脂质体沉淀，重复离心5次，去除未包裹的羧基荧光素。最后，向制得的10ml脂质体葡萄糖悬浮液中加入0.5mg的粉末状氯化镁溶解、混匀。在30℃下保温20min。即制得本实施例的包裹水溶性荧光素–羧基荧光素的脉冲电场敏感脂质体。本实施例制备的脉冲电场敏感脂质体与普通脂质体在脉冲电场作用下的对比。制得脂质体的平均粒径为318.4nm，粒径分布在131.2–671.8nm，如图2所示，普通的脂质体在脉冲场强为1kV/cm、脉宽为10μs的脉冲电场作用下释放率为7.85％，脉冲电场脂质体的释放率为21.00％，提高了167.51％。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.用于靶向释放药物载体的脉冲电场敏感脂质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的用于靶向释放药物载体的脉冲电场敏感脂质体的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述磷脂、胆固醇、维生素E的质量比为10:2:1～10:5:1。

3.根据权利要求1所述的用于靶向释放药物载体的脉冲电场敏感脂质体的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述氯仿和乙醇的混合液的体积比为9:1。

4.根据权利要求1所述的用于靶向释放药物载体的脉冲电场敏感脂质体的制备方法，步骤(2)所述乙醚和磷脂的混合液与待包裹药物的水溶液的质量比为3：1。

5.根据权利要求1所述的用于靶向释放药物载体的脉冲电场敏感脂质体的制备方法，其特征在于，所述镁盐为粉末状。

6.根据权利要求1所述的用于靶向释放药物载体的脉冲电场敏感脂质体的制备方法，步骤(2)所述水浴超声处理，具体为：

7.根据权利要求1所述的用于靶向释放药物载体的脉冲电场敏感脂质体的制备方法，步骤(3)所述离心，具体为：离心力为10000～15000g，时间10～15min，重复离心的次数为4～10次。

8.根据权利要求1所述的用于靶向释放药物载体的脉冲电场敏感脂质体的制备方法，步骤(4)所述孵化，具体为：孵化温度为20～35℃，时间5～25min。