CN1638780A - 用脉冲电场进行颗粒辅助的多核苷酸免疫的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供增强DNA疫苗施用所诱导的免疫应答的方法。在本发明的方法中，将编码抗原的DNA疫苗及不化学结合的佐剂颗粒基本上于同一时间注射入个体的肌肉、皮肤或粘膜组织，然后使该组织接受足够强度的脉冲电场作用，从而导致DNA疫苗进入靶组织的细胞中。与DNA疫苗单独施用或将其分别与脉冲电场或佐剂颗粒单独联合施用相比，本发明的方法使个体对抗原的免疫应答得到了增强。

Description

用脉冲电场进行颗粒辅助的多核苷酸免疫的方法
发明领域
本发明一般涉及在个体中产生免疫应答的方法和组合物。具体的说，本发明涉及通过电辅助递送编码抗原的多核苷酸以达到在个体中产生免疫应答的目的。
发明背景
现已开发了许多疫苗制剂，包括减毒后的病原体或亚单位蛋白质抗原。常规的疫苗组合物常包括免疫佐剂以增强免疫应答。例如，贮存佐剂(depotadjuvant)是经常被使用的，它吸附和/或沉淀所施用的抗原并将抗原保持在注射位置。典型的贮存佐剂包括铝化合物和油包水乳剂。不过，尽管贮存佐剂提高了抗原性，但当它通过皮下或肌肉注射时常常引起严重持久的局部反应，诸如肉芽肿、脓肿和疤痕。其它的佐剂，诸如脂多糖之类，注射时能引起发热反应和/或Reiter症状(类流行性感冒的症状，全身性关节不适及有时候的前葡萄膜炎、关节炎和尿道炎)。诸如Quillaja saponaria之类的皂苷也已在抗多种疾病的疫苗组合物中用作免疫佐剂。
更具体地说，完全弗氏佐剂(CFA)是一种在实验基础上已成功地与许多抗原一起使用的强免疫刺激剂。CFA包括三个组分：矿物油、乳化剂和灭活的分枝杆菌，诸如肺结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)之类。将抗原水溶液与这些组分混合产生油包水的乳剂。尽管CFA作为佐剂是有效的，但主要由于分枝杆菌组分的存在，CFA会引起严重的副作用，包括痛感、脓肿形成和发热。因此，CFA不用于人和牲畜的疫苗中。
尽管存在这些佐剂，常规的疫苗仍经常不能提供足够抗靶病原体的保护。在这方面，越来越多的证据显示抗细胞内病原体诸如许多病毒的疫苗接种应靶向于免疫系统的细胞和体液免疫两方面。
更具体地说，细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)在抗细胞内病原体诸如病毒和恶性细胞产生的肿瘤特异抗原的细胞介导的免疫防卫中起了重要的作用。CTL通过识别被感染细胞上展示的与I类MHC分子结合的病毒决定簇来介导对受病毒感染的细胞的细胞毒性。蛋白质的胞质表达是I类MHC加工和抗原肽呈递给CTL的先决条件。不过，用灭活或减毒病毒进行免疫经常不能产生抑制细胞内感染所必需的CTL。此外，常规的疫苗接种技术当应用于呈现明显遗传异质性及/或快速突变率的病毒诸如HIV或流感病毒等时是成问题的，因为这会有利于免疫逃逸变体的选择。因此，研究者开发了可供选择的接种技术。
携带被吸附或被俘获抗原的颗粒载体已试用于引发足够的免疫应答。这样的载体通常向免疫系统呈递多拷贝的被选抗原并促进抗原在局部淋巴结的俘获和停留。颗粒可被巨噬细胞吞噬并能通过细胞因子的释放而增强抗原的呈递。颗粒载体的例子包括金属颗粒和来自诸如聚甲基丙烯酸甲酯聚合物之类的多种聚合物的颗粒，以及来自聚(丙交酯)和聚(丙交酯共乙交酯)的颗粒(称作PLG)。PLG颗粒可通过非酶催化的随机酯键水解而生物降解成能通过正常代谢途径排泄的乳酸和乙醇酸，而聚甲基丙烯酸甲酯聚合物是不可降解的。
最近的研究已显示带被俘获抗原的PLG颗粒在口服时能引起细胞介导的免疫和/或粘膜IgA应答。此外，通过用PLG俘获的肺结核分枝杆菌进行接种已在小鼠体内诱导抗体和T细胞应答。此外，用微囊化的合成短肽在小鼠体内也诱导了抗原特异的CTL应答。
另一最近关于疫苗的进展是将编码抗原的多核苷酸施用于个体从而由个体在体内产生期望的抗原。这样的“DNA疫苗”可以以“裸”DNA或载体制剂形式，吸附或化学结合于颗粒表面(或内部)，包含于表达载体或质粒等中，通过施用途径如粘膜暴露、注射入组织(通常是肌肉注射)来施用。
还已知可以通过多种类型的电极将多种形式的电脉冲施加于皮肤或诸如肌肉之类的其它组织，以此方式运送药物、核酸或免疫原性剂至个体。例如，通过选择合适的电参数，对DNA疫苗或其它类型免疫诱导剂所施用或注射的组织中细胞进行电穿孔可以用于增强疫苗向个体的递送，从而达到增加保护性免疫应答的目的。
不过，本领域需要有新的、更好的方法来递送编码抗原的多核苷酸，从而达到增加个体中保护性免疫应答的目的。为此目的将生物可降解的或惰性的颗粒佐剂和脉冲电场联合施用于靶组织——其中颗粒和多核苷酸互相之间基本上不化学结合——迄今为止仍未有描述。
发明简述
个体对施用于其皮肤、肌肉或粘膜中的DNA疫苗的免疫应答可以通过将生物可降解的或惰性的颗粒佐剂及脉冲电场共施用于靶组织来增强，其中的颗粒和多核苷酸互相之间基本上不化学结合——这一惊人的、未预期到的发现是本发明的基础。此联合的使用为增强多种抗原的免疫原性提供了一个安全有效的方法。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了通过将编码抗原的多核苷酸施用于个体以诱导免疫应答的方法。在本发明的方法中，将免疫原性有效量的至少一种编码抗原的多核苷酸引入个体靶组织中，所用的途径选自肌内、皮内、皮下和粘膜内；基本上在引入多核苷酸的同一时间在靶组织处产生足够强度的脉冲电场，从而使多核苷酸进入靶组织的细胞以便在其中表达，并使得个体产生对多核苷酸所编码之抗原的免疫应答；在引入多核苷酸和产生电场的数天内将佐剂有效量的颗粒引入靶组织，其中多核苷酸和颗粒在引入前相互之间基本上不化学结合。与涉及施用编码抗原的多核苷酸的其它免疫方式所产生的免疫应答相比，这种方法所产生的免疫应答是被增强了的。
在另一实施方案中，本发明提供了通过将编码抗原的多核苷酸施用于个体以诱导免疫应答的方法，包括：将免疫原性有效量的至少一种编码抗原的多核苷酸通过肌内注射引入个体靶组织中；在引入多核苷酸的基本上同一时间在靶组织处产生足够强度的脉冲电场，从而使多核苷酸进入靶组织的细胞以在其中表达，并导致在个体中产生对多核苷酸编码之抗原的免疫应答；在引入多核苷酸和产生电场的数天内将佐剂有效量的颗粒引入靶组织，其中的多核苷酸和颗粒在引入前相互之间基本上不化学结合。与涉及施用编码抗原的多核苷酸的其它免疫方式所产生的免疫应答相比，本发明方法所产生的免疫应答是被增强了的。
从此处所公布的内容，本发明的这些或其它实施方案对本领域普通技术人员来说是容易的。
附图简述
图1显示了当以以下联合方式将DNA注射入胫骨肌后进行无毛小鼠中分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)基因表达检测的对比试验的结果：与金颗粒和电穿孔一起(柱1)；与金颗粒一起，不经电穿孔(柱2)；与电穿孔一起，无颗粒(柱3)；或单独的DNA(柱4)。□表示0天时的基因表达；■表示注射后第3天的基因表达；带斜条纹的柱子表示注射后7天的基因表达。在此实例中，“与金颗粒一起”表示DNA与颗粒相互之间基本上不化学结合。
发明详述
除非另外提及，本发明的实际操作中将应用本领域的常规化学、生化、分子生物学、免疫学和药理学方法。这些技术在文献中有充分的解释。参阅，如Remington制药科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，第18版(Easton，PA.：Mack出版公司，1990)；酶学方法(Methods InEnzymology)(S.Colowick和N.Kaplan编辑，Academic Press，Inc.)；和实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)，第1-4卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑，1986，Blackwell ScientificPublication)；和Sambrook和Russell，分子克隆：实验室手册(MolecularCloning：A Laboratory Manual)(第3版，2000)。
本文所引用的所有出版物、专利和专利申请都特此全文引入作为参照。
除非内容中明确提及，本说明书和所附权利要求书中所用的单数形式“a”、“an”和“the”包括复数的形式。
在本发明的描述中，以下术语将被应用并按如下所示定义。
“惰性”指当被引入生物体时自身不会与活体产生任何可察觉的化学反应的稳定组合物。
“多核苷酸”指诸如DNA、cDNA、mRNA和RNA之类的核酸聚合物，它可以是线性的、松驰的、环状的、超螺旋的或凝聚的单链或双链。多核苷酸还可包含一个或多个与自然发生部分相比进行了化学修饰的部分。多核苷酸可以不用放入递送载体中(如作为“裸”多核苷酸)提供，或可以在表达质粒或本领域已知的其它适宜类型的载体中提供。本发明范围内明确认为多核苷酸可以是寡核苷酸。除了以“裸露”形式施用多核苷酸外，多核苷酸还可以以配制的形式或修饰的形式施用。例如，可通过与保护性的、相互作用的、非缩聚的(protective，interactive，non-condensingpolymer，PINC)聚合物混合配制多核苷酸(Fewell，J.G.等，用电穿孔将PINC配制的质粒运送入肌肉治疗血友病B的基因疗法，分子治疗(Molecular Therapy)，3：574-583(2000))或可将肽或其它化学实体诸如标记分子之类附着于多核苷酸上对多核苷酸进行修饰(Zelphati，O.等，PNA依赖型基因化学：肽和寡核苷酸与质粒DNA的稳定偶联(生物技术(Biotechniques)28：304-310；312-314；316(2000)))。
“化学结合的”指化学复合、化学附着、包被、吸附、或其它的化学结合方式。例如，包于或吸附于颗粒上的核酸是与颗粒化学结合的。结合可通过共价或非共价键实现。在本发明的上下文中，颗粒不与编码目的抗原的多核苷酸或多核苷酸的运送工具诸如含多核苷酸的质粒或载体“化学结合”。因此，颗粒和多核苷酸或含多核苷酸的质粒或载体不发生显著程度地相互吸附、结合或键合或结合于复合物中。相反地，即使出现于同一溶液、悬浮液或载体中，多核苷酸或含多核苷酸的质粒或载体仍保持与颗粒基本上分离和区分。通过本领域技术人员已知的各种方式可确定颗粒和多核苷酸相互间是否为基本上不化学结合。例如，为施用于个体而制备的多核苷酸和颗粒的溶液的样品可通过离心分离成颗粒和多核苷酸，且结合的程度可通过凝胶电泳显示。或者，可将样品进行凝胶电泳并从而可探测化学结合的缺乏。此外，DNA疫苗可存在于溶液，通常是1xPBS盐水或水中，它也可防止DNA和颗粒化学结合。
“皮肤组织”是指角质层之下的表皮和真皮。
“抗原呈递细胞”或“APC”指单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、郎氏细胞等等，它可起始细胞过程，使APC收缴抗原并在迁移到滤过性淋巴结之后向T细胞呈递抗原或其部分。
“皮内的”或“通过皮内”指施用入皮肤的真皮层，而不是施用于皮肤表面。例如，皮内途径包括，但不局限于，真皮细胞的肿瘤。
“肌内施用”和“通过肌内”指施用入肌肉物质中，即施用入肌层。
“粘膜内施用”和“粘膜内”指施用入衬有各种管状结构，包括但不局限于上皮、固有层及在消化道内平滑肌层的粘膜层或粘液组织。
“皮下施用”和“皮下”指施用入皮肤下的组织中。
“免疫”指引起个体免疫应答或形成免疫应答的过程。
“抗体”指抗原在包括人在内的动物体内引起的免疫或保护性蛋白质，其特征在于免疫蛋白与抗原的特异反应。
“基本上同一时间”当涉及共施用多核苷酸和脉冲电场的时间选择时，指两者同时施用或相互间在约数分钟至数小时至数天内施用。颗粒可在施用多核苷酸和脉冲电场之前或之后数天内施用。例如，在一优选的实施方案中，首先引入多核苷酸，然后施加脉冲电场并引入颗粒，后两者可以一起进行或顺序进行，发生在引入多核苷酸后不超过约3小时。在另一实施方案中，引入多核苷酸和施加脉冲电场在一起或在几小时之内相继地进行，而颗粒在颗粒引入和电穿孔之前或之后不超过约3天，例如不超过2天或不超过1天一次或多次引入。再一实施方案是引入颗粒和多核苷酸的混合物，其中颗粒和多核苷酸相互之间不发生化学结合，而其中脉冲电场在引入颗粒和配制的或未配制的(即“裸露的”)多核苷酸后不超过约5小时施加。目前优选的实施方案是那些其中多核苷酸、颗粒和电脉冲同时施加或相互之间间隔不超过5分钟的实施方案。技术人员可以通过进行数次本领域技术人员所已知的及实施例5所提出的简单实验确定引入颗粒和多核苷酸及施加电场的最佳次序，在这些实验中各组分的时间选择和次序进行变化。
“抗原”指包含一个或多个表位的分子，所述表位可刺激宿主免疫系统产生体液抗体应答或在抗原呈递后引起细胞抗原特异性免疫应答。正常的情况下，表位将包括约3-15个氨基酸，通常约为5-15个。为了达到本发明的目的，抗原可来自许多已知的病毒、细菌、寄生虫和真菌。此术语还意图包括多种肿瘤抗原。此外，为了达到本发明的目的，“抗原”包括那些对天然序列进行了修饰的分子，所述修饰为诸如缺失、添加和替代(通常在性质上是保守性的)，只要蛋白质、多肽或多糖保持引起免疫学应答的能力就行。这些修饰可以是有意的，如通过定点诱变，或可以是意外造成的，如由产生抗原的宿主的突变造成。
对抗原或组合物的“免疫应答”是在个体体内对目的组合物中存在的分子产生体液的和/或细胞的免疫应答。为本发明目的，“体液免疫应答”指抗体分子介导的免疫应答，而“细胞免疫应答”指T淋巴细胞和/或其它白细胞介导的免疫应答。细胞免疫的一个重要方面涉及溶细胞性T细胞(“CTL”)引起的抗原特异性应答。CTL对与主要组织相容性复合物(MHC)所编码的蛋白质相结合而呈递并展现于细胞表面的肽抗原有特异性。CTL协助诱导和促进细胞内微生物的细胞内破坏或这些微生物所感染的细胞的裂解。细胞免疫的另一方面涉及通过辅助T细胞而产生的抗原特异性应答。辅助T细胞用于帮助刺激非特异性效应细胞的功能或使其活性集中以对抗表面展示有肽抗原与MHC分子的结合物的细胞。“细胞免疫应答”还指产生细胞因子、趋化因子和其它产生自活化T细胞和/或其它白细胞的此类分子，包括那些来自CD4+和CD8+T细胞的分子。
术语“颗粒”用于此处是指惰性和/或生物可降解材料或组合物的颗粒，其中颗粒具有足以被抗原呈递细胞内在化的刚性并可任选地为中性或带负电荷。颗粒可以是固体或半固体。颗粒的最大平均尺寸是直径在约0.05微米至约20微米范围内，优选约0.1微米至约3微米范围内。优选尺寸范围内的颗粒容易被抗原呈递细胞内在化。优选的颗粒是微粒，诸如那些来自贵重金属的微粒，尤其是金微粒以及铝、钛、钨和碳微粒。尽管纯的金属颗粒是优选的，尤其是纯金颗粒，但含99.5％-95％体积的该金属的合金也可用于本发明方法的实践中。这些金属微粒是容易购买到的。其它颗粒材料的例子是脂质体、其它小泡、聚合物等等。
当发明方法加快免疫应答的出现(即增强免疫应答的动力学)或与不存在颗粒/脉冲电场辅助效应情况下的等量多核苷酸相比具有更强的引起免疫应答的能力时，发明方法就“增强”了编码抗原的多核苷酸的“免疫原性”。因此，诱导免疫应答的方法可以因为如下原因而呈现“增强的免疫原性”：所产生的抗原具有更强的免疫原性，或需要较低剂量的编码抗原的多核苷酸就可在所施用个体体内产生免疫应答，或施用后更迅速地达到有效的免疫应答，如由抗体效价(但并不局限于此)所证明的。在本发明中，被增强的免疫应答优选包括如下优势：免疫应答在动力学上加快，表现为与其它免疫方案相比免疫应答的出现，如抗体效价的上升加快。可以通过将多核苷酸组合物和脉冲电场、或多核苷酸和颗粒作为对照施用于动物，并用诸如放射免疫试验和ELISA之类的标准试验与本发明方法比较免疫应答，从而确定所说的被增强了的免疫原性，所说的标准试验是如本领域已知的并在本文实施例中以ELISA为例作了描述。
术语“佐剂有效量”应用于本发明方法中的颗粒时指颗粒量足以为期望的免疫学应答提供佐剂效应及相应的治疗效应。不同的个体所要求的确切数量是不同的，取决于个体的种属、年龄和总体条件、被治疗疾病的严重性、编码目的抗原的具体的多核苷酸、施药方式(如是否通过肌肉或皮肤)、颗粒的大小和类型，等等。在任何个案中，合适的“有效”量可由本领域普通技术人员用常规实验确定。
含编码抗原的多核苷酸的组合物将包含“免疫原性有效量”的目的多核苷酸。即，包括在组合物中的多核苷酸的量将使得当所编码抗原产生于个体体内时，其与颗粒和脉冲电场的联合将引起个体产生足够的免疫学应答以预防、减少或消除症状。本领域技术人员可容易地确定合适的有效量。因此，“免疫原性有效量”将落入通过常规试验可确定的相对宽的范围内。
用于此处时，“诱导免疫应答”指以下之任一：(i)如同在传统疫苗中一样，防止感染或再感染，(ii)减轻或消除症状，和(iii)基本上或完全消除所关心的病原体。因此，诱导免疫应答的方法可预防性的(感染前)或治疗性的(感染后)实行。
“制药学可接受的”或“药学可接受的”是指不具有生物学或其它方面的不良性质的材料，即，该材料可与颗粒佐剂制剂一起施用于个体，不会引起任何不良的生物学效应或与含有其的组合物中的任何组分产生有害的相互作用。
“生理学上的pH”或“生理学范围内的pH”指pH在约7.2-8.0的范围内(包括端值)，更典型的是在约7.2-7.6的范围内(包括端值)。
“个体”是指任何哺乳动物，包括但不局限于，人和其它灵长类，包括非人的灵长类动物，诸如黑猩猩和其它猿和猴种属；诸如牛、绵羊、猪、山羊和马之类的农畜；诸如狗和猫之类的驯养哺乳动物；包括诸如小鼠、大鼠和豚鼠之类啮齿动物在内的实验室动物、驯养的宠物、诸如鸡之类的农场饲养动物，等等。该术语不表示具体的年龄。因此，成年和新生的个体都包括在可按本发明方法进行处理的对象中。此处所述之本发明的方法意图用于任何上述哺乳动物物种，因为所有这些哺乳动物的免疫系统的运转都是相似的。
引起细胞免疫应答的发明方法可通过抗原与MHC结合呈递于细胞表面而用于使哺乳动物个体致敏。细胞介导的免疫应答对准呈递抗原于其细胞表面的细胞。此外，为了对被免疫宿主产生未来的保护作用，还可产生抗原特异的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
一个具体的发明方法刺激细胞介导之免疫学应答的能力可通过许多试验来确定，诸如淋巴细胞增殖(淋巴细胞活化)试验、CTL细胞试验、或用于测定致敏后个体中的抗原特异性T淋巴细胞的试验。这样的试验是本领域众所周知的。参阅，如Erickson等，免疫学杂志(J.Immunol.)(1993)151：4189-4199；Doe等，欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)(1994)24：2369-2376；以及以下实施例。
因而，此处所用的免疫学应答可以是刺激CTL产生和/或辅助T细胞产生或活化的免疫应答。目的抗原还可引起抗体介导的免疫应答。因此，免疫学应答可包括一个或多个以下效应：B细胞产生抗体和/或抑制性T细胞活化。这些应答可以用于中和感染性和/或介导抗体补体或抗体依赖性的细胞毒性(ADCC)，从而为被免疫的宿主提供保护，如抵抗引起疾病的生物体或肿瘤细胞的攻击。这样的应答可用本领域众所周知的标准免疫试验和中和试验进行测定。
发明实施方式
本发明是以以下发现为基础的，即，当将与DNA疫苗不化学结合的佐剂颗粒和DNA疫苗组合施用于组织并在组织处产生脉冲电场时，在个体体内会可靠地产生对所编码抗原的免疫应答。本发明的方法提供了另外的有利之处，即，与所测试的其它类型免疫方法相比，在个体体内产生了增强的免疫应答，如更快的免疫应答。在一些情况中，如以下实施例2的结果所示，可见到协同效应，以致用本发明方法获得的免疫应答大于(如按效价测定)佐剂颗粒或脉冲电场单独与多核苷酸疫苗组合使用时所产生的加性增强效应。当观察到这样的协同效应时，它通常出现于施用最初的疫苗接种方案后约6周，与其它方案处理的个体体内的抗体效价相比，此时间点在用本发明方法处理的个体体内可观察到更高的抗体效价。
尽管此处所述的本发明方法中的各个组分都是已知的，但令人惊奇和意想不到的是，与这些组分单独使用或按不同于本发明所述之三方方案的任何组合方式使用时相比，按本发明方法进行的联合施用可以增强体内产生的抗原的免疫原性。
在许多不同的情况中，增强免疫应答是有利的。例如，当急需要进行保护性免疫时，如当军队在紧急情况下向外地部署或当病原体(如炭疽)出乎意料地爆发时，用本发明方法在较短时间内达到保护性免疫将是有利的。类似地，当急需要保护性免疫来处理急性疾病或爆发时，本发明增强的免疫同样可解决这样的需要。
本发明方法涉及基本上在多核苷酸和颗粒引入组织的相同时间在靶组织中产生脉冲电场，其中电脉冲强度足以使多核苷酸疫苗进入靶组织的细胞并以吸引APC及免疫系统其它有关细胞的方式干扰组织。脉冲电场的强度足以引起多核苷酸经电转运进入靶组织的细胞。
电转运的一种类型是电穿孔。例如，为了在肌肉组织中引起细胞的电穿孔，本发明方法中所用的脉冲电场将具有约50V/cm-约400V/cm的低额定电场强度，优选约100V/cm-约200V/cm。递送至肌肉的脉冲电场中所用的脉冲长度将在约1-100毫秒(msec)范围内，优选20-60msec，并应用约1-6个脉冲。电脉冲的波形可以是单极的或双极的。对于将DNA递送至皮肤的本发明方法来说，形成脉冲电场，具有1-约12个脉冲，每个50V-80V，每个脉冲持续时间约为100微秒-100毫秒。另一在皮肤中产生适宜电场的替代方案是向真皮组织应用例如约70V-约100V持续数百微秒的单一短高电压脉冲以破坏角质层，随后用1-约3个低电压长脉冲(例如，50V-约80V持续1-100msec)以驱使DNA疫苗进入细胞。
本发明方法实施中所用的电穿孔可应用本领域已知的任何类型的合适电极。例如，为了基本上在引入DNA疫苗和颗粒的同一时间在肌肉中产生电场，优选使用由2、4、或6个电极组成的针电极。可以考虑将电极安成成对的、对置的对、平行的排、三角形、矩形、正方形或任何其它合适几何形状。除了侵入式电极外，可以向DNA和颗粒递送位点上方的皮肤施用非侵入式或最低程度的侵入式电极以在肌肉内产生电场。为了基本上在引入DNA疫苗和颗粒的同一时间在皮肤中产生电场，可使用多种侵入式电极或非侵入式电极。优选非侵入式电极，诸如卡钳电极(caliperelectrode)、弯电极(meander electrode)、微片电极(micropatch electrode)和微针电极及其变体。这样的电极都是可购买到的且在本领域中有充分的描述。对于应用于皮肤表面的电穿孔来说，优选诸如弯曲电极之类的非侵入式电极或长度不超过数毫米的短针电极以刺入角质层。相反，对于应用于肌肉的电穿孔来说，优选较长的针电极。
在实施本发明方法时用于提供电穿孔的几个目前优选的条件如下表1所示：
                                        表1
  递送位置 电极类型 电场强度 脉冲数   脉冲长度   外加电压   频率Hz
肌肉 2-针电极 低150-200V/cm   1-3相同脉冲   长60msec N/A 0.1-10
肌肉 4-针电极 低150-200V/cm   1-3相同脉冲   长60msec N/A 0.1-10
肌肉 6-针电极 低100-200V/cm   6相同脉冲且极性相反   长20-60msec N/A 0.1-10
  进入皮肤细胞 弯电极 N/A   1-12相同脉冲   长10-100msec 50-80V 0.1-50
  进入皮肤细胞 微片电极 N/A   1-6相同脉冲   长10-100msec 50-80V 1-50
  进入皮肤细胞 短针电极 低100-250V/cm   1-6相同脉冲   长100μsec-60msec 0.1-50
本发明方法可以以粘膜组织作为靶组织进行，诸如口腔和鼻粘膜。电荷应用参数基本上与本文中应用于皮肤组织的相同。通过将裸露的、配制的或修饰形式的多核苷酸注射入粘膜层，随后用本领域技术人员已知的诸如卡钳电极或弯电极之类非侵入性表面电极进行电穿孔，可将多核苷酸运送至粘膜组织和细胞、或粘膜层以下的细胞。表面电极可设计成适合预期应用的位点(如中空的器官或腔)的形状。或者，可应用最低程度的侵入型电极，如由多个短针电极组成的电极(美国专利5,810,762；Glasspool-Malone，J.等，有效的非病毒的皮肤转染。分子治疗(MolecularTherapy)2：140-146(2000))或锯齿形电极。锯齿形电极的形状如其名称所暗示，可以以交替极性的平行排应用，电极齿尖端比锯齿上方较宽部分刺入粘膜更深。颗粒也可以通过中空的针或液体注射方式注射进入粘膜，或可通过弹道学的方法引入。技术人员可进行简单的实验来确定将DNA疫苗运送至特定粘膜组织的最适条件。
本发明的方法提供了细胞介导的免疫应答和/或体液或抗体应答。因此，除了常规的抗体应答外，通过本文所述系统还可提供，如，所表达抗原与I类MHC分子的结合，从而使体内对目的抗原的细胞免疫应答可以发生，包括产生CTL以便未来识别靶细胞上的抗原。此外，这些方法还可通过辅助T细胞引起抗原特异性应答。因此，任何抗原，如果期望产生针对其的细胞和/或体液免疫应答，都可应用于本发明的方法中，所述抗原包括来自病毒、细菌、真菌和寄生病原体并能诱导抗体的抗原、T辅助细胞表位和T细胞细胞毒性表位。这样的抗原包括，但不局限于，人和动物病毒编码的抗原、肿瘤细胞表面表达增强的抗原，并可相应于结构或非结构蛋白质。
如果佐剂颗粒与多核苷酸疫苗分开引入个体的组织，则佐剂颗粒与多核苷酸疫苗运送至基本上相同的位置。佐剂颗粒也可与多核苷酸疫苗混合以便同时运送至相同位点。优选地，DNA疫苗与1xPBS或水混合，然后加入颗粒。在此实施方案中，颗粒带负电荷或为中性。因为DNA是在溶液中，所以颗粒和DNA不会有任何实质程度的化学结合。
本发明方法实践中所用的编码抗原的多核苷酸和颗粒(或含此类药剂的制品)经皮下引入，通常用针注射或用无针压力辅助注射系统进行无针注射，如系统可以提供具一定力量的小的液流或射流(通常通过使诸如二氧化碳之类的压缩气体膨胀并在几分之一秒内穿过微孔而产生)使药剂穿透组织表面并进入下面的真皮组织、粘膜层和/或肌肉。这些制剂可以通过粘膜、皮内、皮下或肌内注射，但不应用于皮肤表面(如，作为局部用溶液、膏或洗液)。
本发明方法可用于诱导免疫应答以抵抗核苷酸序列已知且在人和其它哺乳动物中引起疾病的任何抗原。例如，已知来自一些细胞内致病病毒的抗原，诸如来自疱疹病毒家族的抗原，包括类型1和2单纯疱疹病毒(HSV)来源的蛋白质中所含的抗原，诸如HSV-1和HSV-2糖蛋白gB、gD和gH；来自水痘带状疱疹病毒(VZV)、EB病毒(EBV)和巨细胞病毒(CMV)的抗原，包括CMVgB和gH；以及来自诸如HHV6和HHV7之类的其它人类疱疹病毒的抗原。(参阅，如Chee等，巨细胞病毒(J.K.McDougall编辑，Springer-Verlag 1990)第125-169页，是有关巨细胞病毒的蛋白编码内容的综述；McGeoch等，遗传病毒学杂志(J.Gen.Virol.)(1988)69：1531-1574，是关于各种HSV-1编码蛋白的讨论；美国专利5,171,568，是关于HSV-1和HSV-2gB和gD蛋白质及其编码基因的论述；Baer等，自然(Nature)(1984)310：207-211，涉及鉴定EBV基因组中的蛋白质编码序列；以及Davison和Scott，遗传病毒学杂志(J.Gen.Virol.)(1986)67：1759-1816，是关于VZV的综述)。
所编码抗原来自肝炎病毒家族的多核苷酸也可方便地用于本文所述的技术中，包括甲肝病毒(HAV)、乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)、δ肝炎病毒(HDV)、E肝炎病毒(HEV)和G肝炎病毒(HGV)。举例说来，HCV的病毒基因组序列和获得该序列的方法是已知的。参阅，如，国际公布号WO89/04669、WO90/11089和WO90/14436。HCV基因组编码数个病毒蛋白，包括E1(也称作E)和E2(也称作E2/NSI)和N末端核壳蛋白质(称“核心”)(参阅，Houghton等，肝脏学(Hepatology)(1991)14：381-388，论述了HCV蛋白质，包括E1和E2)。编码这些蛋白质中任一个及其抗原性片段的多核苷酸都能在本发明方法中得到应用。
所编码抗原来自其它病毒的多核苷酸也可用于本申请所要求的方法中，例如但不局限于，来自以下科的成员的蛋白质：小RNA病毒科(如脊髓灰质炎病毒等)；杯状病毒科；披膜病毒科(如，风疹病毒、登革病毒，等)；黄病毒科；冠形病毒科、呼肠孤病毒科；双RNA病毒科；弹状病毒科(如狂犬病毒等)；线状病毒；副粘病毒科(如腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒等)；正粘病毒科(如流行性感冒病毒A、B和C等)；布尼亚病毒科；沙粒病毒科；逆转录病毒科(如HTLV-I；HTLV-II；HIV-1(也称作HTLV-III、LAV、ARV、hTLR等))，包括但不局限于来自分离株HIVIIIb、HIVSF2、HIVLAV、HIVLA1、HIVMN、HIV-1CM235、HIV-1US4、HIV-2、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)等的抗原。此外，抗原还可来自人乳头瘤病毒(HPV)和蜱传脑炎病毒。参阅，如病毒学(Virology)，第三版(W.K.Joklik编辑，1988)；基础病毒学(Fundamental Virology)，第二版(B.N.Fields和D.M.Knipe编辑，1991)，是关于这些病毒和其它病毒的描述。
更特别地，来自任何上述HIV分离株，包括多种HIV遗传亚型成员的gp120包膜蛋白是已知并报道了的(参阅，如Myers等，Los Alamos数据库，Los Alamos国家实验室，Los Alamos，N.M.(1992)；Myers等，人逆转录病毒和辅助物(Human Retroviruses and Aids)，1990，LosAlamos，N.M.：Los Alamos国家实验室；和Modrow等，病毒学杂志(J.Virol.)(1987)61：570-578，比较了各种HIV分离株的包膜蛋白序列)，而来自任何这些分离株的抗原都可用于本发明的方法中。
流行性感冒病毒是本发明对其特别有用的病毒的另一实例。具体地，流行性感冒病毒A的包膜糖蛋白HA和NA对于产生免疫应答尤其有意义。流行性感冒病毒A的许多HA亚型已被鉴定(Kawaoka等，病毒学(Virology)(1990)179：759-767；Webster等，“A类流行性感冒病毒中的抗原性变异”，第127-168页，P.Palese和D.W.Kingsbury(编辑)，流行性感冒病毒的遗传学，springer-Verlag，纽约)。因此，来自任何这些分离株的蛋白质也可用于本文所述的免疫技术中。
本文所述方法还可用于抗许多细菌抗原，诸如那些其来源生物体会引起白喉、霍乱、结核病、破伤风、百日咳、脑膜炎及其它发病情形的抗原，这些生物体包括但并不局限于脑膜炎球菌(Meningococcus)A、B和C、流感嗜血杆菌B(Hemophilus influenza type B，HIB)和幽门螺旋菌(Helicobacter pylori)。寄生抗原的例子包括那些其来源生物体可引起疟疾和Lyme氏疏螺旋体病的抗原。
此外，本文所述方法为治疗各种恶性肿瘤提供了一条途径。例如，本发明方法可用于对特异于所关心的癌症的特定蛋白质引起体液和细胞介导的免疫应答，所述蛋白为诸如活化的癌基因、胎儿抗原或活化的标记。这些肿瘤抗原包括但不局限于，各种MAGE(黑素瘤相关抗原E)中的任一种，包括MAGE1、2、3、4等(Boon，T.科学美国人(Scientific American)(1993年三月)：第82-89页)；各种酪氨酸酶中的任一种；MART1(T细胞所识别的黑素瘤抗原)、突变ras；突变p53；p97黑素瘤抗原；CEA(癌胚抗原)及其它。很显然本发明可用于预防或治疗广泛种类的疾病。
剂量治疗可以是单剂量给药的时间表或多剂量给药的时间表。所谓多剂量给药的时间表是指最初的接种过程可用单一剂量进行，然后间隔地给予其它剂量——剂量的选择是为了维持和/或加强免疫应答，例如在初次免疫接种后4周施用第二剂量，且如果需要的话，在数周后施用随后的剂量，例如在初次免疫后不超过6个月。加强剂量可以使用与引起初次免疫应答时所用相同类型的颗粒、含核苷酸的组合物及脉冲电场来给予，或可以用不同的制剂或不同的免疫步骤组合来施用和/或引入。下表2举例阐明了可用于本发明实践中的治疗步骤的多种组合：
                         表2
    方法     初次     加强1     加强2
    1     DNA/颗粒     DNA/颗粒     DNA/颗粒
    2     DNA/颗粒     DNA/颗粒     DNA
    3     DNA/颗粒     DNA     DNA
    4     DNA     DNA/颗粒     DNA/颗粒
    5     DNA     DNA/颗粒     DNA
    6     DNA/颗粒     DNA/颗粒     蛋白质
    7     DNA/颗粒     DNA     蛋白质
    8     DNA     DNA/颗粒     蛋白质
    9     DNA/颗粒     DNA/颗粒     蛋白质/颗粒
    10     DNA/颗粒     DNA     蛋白质/颗粒
    11     DNA     DNA/颗粒     蛋白质/颗粒
    12     DNA     DNA     蛋白质/颗粒
    13     DNA/颗粒     蛋白质     蛋白质
    14     DNA/颗粒   蛋白质/颗粒   蛋白质
    15     DNA/颗粒   蛋白质/颗粒   蛋白质/颗粒
    16     DNA   蛋白质/颗粒   蛋白质/颗粒
    17     DNA   蛋白质/颗粒   蛋白质
    18     DNA   蛋白质   蛋白质/颗粒
    19     蛋白质/颗粒   蛋白质/颗粒   蛋白质/颗粒
    20     蛋白质/颗粒   蛋白质   蛋白质
    21     蛋白质/颗粒   蛋白质/颗粒   蛋白质
    22     蛋白质   蛋白质/颗粒   蛋白质/颗粒
    23     蛋白质   蛋白质/颗粒   蛋白质
    24     蛋白质   蛋白质   蛋白质/颗粒
剂量方案还将取决于，至少部分取决于个体的需要，并依赖于医师的判断。此外，如果是期望达到预防疾病的目的，通常在初次感染目的病原体前应用本发明方法。如果是为了治疗的目的，如减轻症状或降低复发，通常在初次感染后施用本发明的方法。
组合物通常将包括一种或多种“制药学可接受的赋形剂或赋形药”，诸如水、盐水、甘油、聚乙二醇、透明质酸、乙醇等。此外，诸如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等辅助物也可存在于所说的赋形药中。
适用于本发明的颗粒还可来自，如聚(丙交酯)(“PLA”)之类的聚α羟酸或诸如聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)(“PLG”或“PLGA”)之类的D，L-丙交酯和乙交酯或羟基乙酸的共聚物，或D，L-丙交酯和己内酯的共聚物。颗粒可来自各种单体起始材料，具有各种各样分子量并且对于诸如PLG之类的共聚物，可有各种各样的丙交酯∶乙交酯的比率，其选择主要是抉择的问题，而部分取决于共同施用的多核苷酸或含多核苷酸的组合物。
或者，当颗粒是脂质体(如水包油乳剂)时，该颗粒可以来自如两亲性脂类等形成泡囊的脂类，它具有疏水部分和极性头部基团，并且(a)能在水中自发地形成双层泡囊(以磷脂为例)，或(b)可以稳定掺入脂双层，疏水部分与双层膜内部的疏水区接触，而极性头部基团部分则朝向膜的外部极性表面。尽管可以使用不带电或带负电且平均大小在期望的0.2-2微米范围内的任何类型脂质体，但优选的脂质体是单层脂质体和多层脂质体。
这种形成泡囊的脂类典型地包括一个或两个疏水酰基碳氢链或类固醇基团，且可以在极性头部基团处包含化学反应基团，诸如胺、酸、酯、醛或醇。包括于此类别内的有磷脂，如磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酸(PA)、磷脂酰肌醇(PI)和鞘磷脂(SM)，其中的两条碳氢链通常长度在约为14-22个碳原子，并具有不同程度的不饱和。其它形成泡囊的脂类包括诸如脑苷脂和神经节苷脂之类的糖脂和诸如胆固醇之类的固醇。
本发明中用于制备微颗粒的生物可降解性聚合物可方便地购自以下公司：如德国的Boehringer Ingelheim和美国阿拉巴马州伯明翰的Birmingham Polymers，Inc.。例如，此处用于形成颗粒的聚合物包括来自如下的那些：聚羟基丁酸、聚己内酯、聚原酸酯、聚酐；以及聚(α-羟酸)，诸如聚(L-丙交酯)、聚(D，L-丙交酯)(此处都称为“PLA”)、聚(羟基丁酸)，DL-丙交酯和乙交酯的共聚物，诸如聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)(此处称“PLG”或“PLGA”)，或D，L-丙交酯和己内酯的共聚物。此处特别优选使用的聚合物是PLA和PLG聚合物。这些聚合物可以以各种各样的分子量获得，本领域技术人员很容易确定对于给定的应用而言合适的分子量。因此，如，对于PLA，合适的分子量约为2000-250000。对于PLG，合适的分子量范围通常约为10000-200000，优选约15000-约150000，最优选约50000-约100000。
若用诸如PLG之类的共聚物形成颗粒，在此可用各种丙交酯∶乙交酯比率，此比率主要是一个选择的问题，部分取决于共施用的多核苷酸或含多核苷酸的载体或质粒以及期望的降解率。例如，含50％D，L-丙交酯和50％乙交酯的50∶50 PLG聚合物将提供一种快速再吸收的共聚物，而通过增加丙交酯成分，比率为75∶25的PLG将降解较慢，而85∶15和90∶10则降解更慢。此外，在配制中可使用具有不同丙交酯∶乙交酯比率的微颗粒的混合物来获得所给抗原的期望释放动力学并提供初次和再次免疫应答。
颗粒可以用本领域众所周知的数种方法中的任一种制备。例如，如美国专利号3,523,907和Ogawa等，药物化学公告(Chem.Pharm.Bull.)(1988)36：1095-1103中所述的，双乳剂/溶剂蒸发技术可用于此处形成颗粒。这些技术涉及形成由聚合物溶液小滴组成的初级乳剂，随后将其与含颗粒稳定剂/表面活性剂的连续水相混合。
更特别地，水包油包水(W/O/W)溶剂蒸发系统可用于形成颗粒，见文献所述：O’Hagan等，疫苗(Vaccine)(1993)11：965-969和Jeffery等，药学研究(Pharm.Res.)(1993)10：362。在此技术中，特定的聚合物与有机溶剂混合，如乙酸乙酯、dimethylchloride(也称二氯甲烷)、乙腈、丙酮、氯仿等等。聚合物以溶于有机溶剂中的溶液形式提供，浓度约为2-15％，更优选约4-10％，最优选6％的溶液。加入水溶液并用如匀浆器使聚合物/水溶液乳化。然后将乳剂与更大体积的诸如聚乙烯醇(PVA)或聚乙烯吡咯烷酮之类的乳剂稳定剂的水溶液混合。通常提供的乳剂稳定剂为约2-15％的溶液，更典型的是约4-10％的溶液。然后匀浆混合物产生稳定的w/o/w双乳剂。有机溶剂随后被蒸发。
此处所用水包油乳剂诸如脂质体之类包括无毒的可代谢油和商业乳化剂。无毒的可代谢油的例子包括但不局限于，植物油、鱼油、动物油或合成制备油。优选诸如鳕鱼鱼肝油、鲨鱼鱼肝油和鲸鱼油之类的鱼油。尤其优选存在于鲨鱼鱼肝油中的鲨烯，2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯。鱼油组分的存在量可以为约0.5％-约20％体积，优选不超过约15％，更优选约1％-约12％，最优选的是1％-约4％的油。
颗粒佐剂的水溶液部分可以是缓冲盐水或未搀杂的水。如果使用盐水而非水，优选缓冲盐水以维持生理学范围内的pH。此外，在某些情况下，可能必须维持特定水平的pH以保证某些组合物成分的稳定性。因此，组合物的pH通常是pH6-8，且pH可用生理学可接受的缓冲液来维持，诸如磷酸盐、醋酸盐、tris、重碳酸盐或碳酸盐缓冲液，等等。水性剂的存在量通常可以为使组合物达到期望终体积所必需的量。
适用于水包油制剂的乳化剂包括但不局限于，以山梨聚糖为基础的非离子表面活性剂(如可购买到的SPAN或ARLACEL表面活性剂)；聚氧乙烯山梨聚糖单酯和聚氧乙烯山梨聚糖三酯(可以以TWEEN表面活性剂购得)；聚氧乙烯脂肪酸(可以以MYRJ表面活性剂购得)；来自十二烷基、乙酰基、十八烷基和油基醇的聚氧乙烯脂肪酸醚，如已知名称为BRIJ的表面活性剂；等等。这些乳化剂可单独使用或联合使用。乳化剂的存在量按重量(w/w)计通常为0.02％-约2.5％，优选0.05％-约1％，最优选0.01％-约0.5％。此存在量通常约为所用油重量的20-30％。
乳剂还可任选的包含其它免疫刺激剂，如胞壁酰肽，包括但不局限于，N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-去甲胞壁酰基-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)、N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰基-L-丙氨酸-2-(1’，2’-二棕榈酰基-sn-甘油-3-羟基磷酰基氧基)-乙胺(MTP-PE)，等。还可存在免疫刺激性细菌细胞壁组分，如单磷酸脂A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)。
关于制备用于本发明的各种合适的水包油乳剂制剂的方法，参阅，如，国际专利WO90/14837；Remington：The Science and Practice ofPharmacy，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，第19版，1995；VanNest等，“与重组亚单位疫苗一起使用的改进佐剂制剂”，见《Vaccines 92，Modern Approaches to New Vaccines》(Brown等编辑)冷泉港实验室出版社，第57-62页(1992)；和Ott等，“MF59-设计和评估安全有效的人疫苗佐剂”，见《Vaccine Design：The Subunit and Adjuvant Approach》(Powell，M.F.和Newman，M.J.编辑)Plenum Press，纽约(1995)，第277-296页。
为了生产直径小于1微米的颗粒，许多技术都是可以应用的。例如，可以使用商业乳化器，其运作原理是迫使流体在高压下穿过小孔形成高剪切力。商业乳化器的例子包括但不局限于，110Y型微型流化床装置(Microfluidics，Newton，Mass.)、Gaulin型号30CD(Gaulin，Ine.，Everett，Mass.)和Rainnie Minilab型8.30H(Miro Atomizer Food andDairy，ine.，Hudson，Wis.)。本领域技术人员很容易确定用于各乳化器的合适压力。
粒径可用例如整合了氦-氖激光器的光度计通过如激光散射来测定。通常地，粒径在室温下测定，并涉及对待测样品的多次分析(如5-10次)，从而得到颗粒直径的平均值。粒径还可用扫描电子显微镜(SEM)、光子相干分光术和/或激光衍射方法方便地测定。本文所用的颗粒是由惰性、可灭菌、无毒且优选地生物可降解的材料制成的。
以下是实施本发明的具体实施方案的实施例。实施例只供举例阐明目的，并未意图以任何形式限制本发明的范围。
实施例
实施例1
进行实验测定编码分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)的DNA在小鼠内的转基因表达水平，测定在与DNA不化学结合的颗粒存在或不存在的情况下进行，其中通过电穿孔(EP)增强DNA的递送。在第一组中，质粒pSEAP-2对照(Clontech实验室有限公司，编号#6052-1)(GenBank登录号U89938)包含编码SEAP抗原的DNA，与1xPBS混合，以5μg于50μl中的剂量注射入无毛小鼠(n＝5只)两腿的胫骨肌。
在第二组中是5只无毛小鼠，用与第一组相同的技术施用DNA，然后基本上在同一时间进行电穿孔，在此情况下，是在DNA注射后立即用两针电极进行电穿孔，两针间距为0.5cm，由ECM830脉冲发生器(Genetronics)提供如下电参数：6个脉冲，50V，持续时间20ms，5Hz。
在第三组的5只无毛小鼠中，用与第一组相同的技术施用DNA，与之一起施用的是与DNA不化学结合的佐剂金颗粒。颗粒大小为直径1.6μm。先称重金颗粒(每个注射位点0.5mg)，然后与DNA的1xPBS溶液混合。恰在注射前将DNA与颗粒混合在一起。
在第四组的5只无毛小鼠中，用上述的同一技术施加DNA、电穿孔和金颗粒，但电穿孔是在注射后10-30秒内进行的。
用SEAP报道基因检测试剂盒(Roche)检测小鼠血清中的基因表达。
这些实验的结果以图解形式总结于图1和下表3中，显示了与单独注射DNA或注射DNA和颗粒但都未使用电穿孔的方式相比，佐剂颗粒和电穿孔的联合使用导致了更高水平的可检测基因表达。此外，第三天和第七天在接受佐剂颗粒和电穿孔联合的小鼠中检测到的基因表达水平可比得上或高于在第三和第七天从接受DNA和电穿孔但无颗粒佐剂施用的小鼠检测到的表达水平。
                                    表3
        0天         第三天         第七天
  平均值ng/ml   标准误   平均值ng/ml   标准误   平均值ng/ml   标准误
   DNA+颗粒+EP   1.4   1.3   13.1   5.0   5.6   2.9
   DNA+颗粒   1.4   1.4   1.4   1.4
   DNA+EP   8.5   4.8   5.9   3.1
   DNA   2.1   2.0   1.5   1.4
“DNA+颗粒+EP”和“DNA+EP”之间的t-检验p-值为：独立的(0.32)，成对的(0.467)。
“ng/ml”指每ml血清中SEAP抗原的ng数。
实施例2：在进行电穿孔增强的DNA疫苗接种后颗粒对免疫应答的影响
进行进一步试验以便(1)测定施用与DNA疫苗不化学结合的佐剂颗粒是否对使用电穿孔增强的DNA疫苗接种所产生的免疫应答具有加性效应或不只是加性效应，和(2)比较是否不同的靶组织(皮肤和肌肉)产生不同的免疫应答。
试验选择了两种靶组织：肌肉和皮肤。对于各种靶组织来说，DNA疫苗都施用于四组小鼠(见下表4)。金颗粒和DNA一起同时经肌内(i.m.)或皮内(i.d.)注射入小鼠，随后进行电穿孔；金颗粒和DNA不是化学结合的。小鼠被致敏后，分别在免疫后的4周和8周加强注射两次。在2、4、6、8和10周检测血清中抗疫苗DNA所编码的特异抗原的抗体；评估初次和再次抗体免疫应答。
                          表4
   组   靶组织   处理(每只小鼠施用于两个位点)
   1(对照)   肌肉(肌内)   DNA
   2   肌肉(肌内)   DNA+EP
   3   肌肉(肌内)   DNA+颗粒
   4   肌肉(肌内)   DNA+颗粒+EP
   5(对照)   皮肤(皮内)   DNA
   6   皮肤(皮内)   DNA+EP
   7   皮肤(皮内)   DNA+颗粒
   8   皮肤(皮内)   DNA+颗粒+EP
材料和方法
小鼠：Balb/c，实验组大小：6只小鼠
DNA：编码乙肝病毒表面抗原(HbsAg)的ElsAg表达载体。为了得到HbsAg表达构建体，将pAMS(ATCC)的BamHI片段1.4kb插入真核表达载体pEF-BOS中，该真核表达载体在Puc119原核载体骨架中包含人延伸因子1α启动子和第一内含子及来自G-CSF cDNA的聚腺苷酸化信号(S.Mizushima等，核酸研究(Nucleic Acids Research)18：5322，1990)。pAM6(ATCC编号45020)是HBV血清型adw的基因组克隆，而1.4kb的BamHI片段被证实编码“小”HBV表面抗原(HbsAG)(A.M.Moriarty等，美国国家科学进展(Proc.Natl.Acad.Sci.)(USA)78：2606-2620，1981)。
为进行免疫，对于每只小鼠，在两个位点的每一个施用溶于50μl PBS的DNA 10μg(胫骨肌)，或溶于25μl PBS的DNA 10μg(皮肤位点)。金颗粒与DNA混合，但不化学结合，然后与DNA一起注射。在每一注射位点施用约0.5mg颗粒。
实验：(1)用具有定量板的ABBOTT AUSAB EIA测定抗HbsAg的抗体，单位mIU/ml。(2)用抗HbsAg的ELISA测定终点抗体效价。
颗粒：BioRad Biolistic 1.6微米金颗粒；目录号：1652264
免疫位点和模式：(1)对于肌内注射来说，注射位点是两条后腿的胫骨前肌，(2)对于皮内注射来说，注射位点是下背的背部皮肤上两个位点，用针和注射器注射。用与初始或致敏免疫相同的方案分别在第4周和8周时进行第一和第二次加强免疫。
电穿孔条件：(1)对于肌内注射，用Genetronics 2针阵列电极在胫骨肌处进行电穿孔。针距5mm，电脉冲由ECM830脉冲发生器提供，设置如下：50V，20msec，6个脉冲，5Hz。(2)对于皮内注射，用Genetronics弯电极(电极宽度1mm)在背部皮肤处进行电穿孔，两电极间绝缘(0.2mm)，电脉冲由ECM830脉冲发生器提供，设置如下：70V，20msec，3个脉冲，5Hz。
结果：下表5显示了肌内和皮内施用多核苷酸和颗粒后ELISA测定抗HbsAg抗体终点效价的结果：
                    表5
                    初次应答          再次应答
   组     4周效价     6周效价(加强1后2周)
   i.m.DNA     1∶5000     1∶2500
    1∶1000     1∶2500
    1∶5000     1∶2500
    1∶5000     1∶2500
    1∶1000     1∶2500
    1∶1000     1∶2500
   i.m.DNA+EP     1∶1000     1∶50,000
    ＞1∶5000     1∶50,000
    1∶5000     1∶25,000
    1∶5000     1∶25,000
    1∶5000     1∶25,000
    ＞1∶1000     1∶2500
   i.m.DNA+颗粒     ＞1∶5000     1∶2500
    1∶5000     1∶2500
    1∶5000     1∶2500
    1∶5000     1∶2500
    1∶5000     1∶2500
    ＞1∶25     1∶2500
   i.m.DNA+颗粒+EP     1∶1000     1∶2500
    ＞1∶5000     ＞1∶50,000
    ＞1∶5000     ＞1∶50,000
    ＞1∶5000     ＞1∶50,000
    ＞1∶5000     ＞1∶50,000
    ＞1∶5000     ＞1∶50,000
    i.d.DNA     1∶1000     1∶2500
    1∶1000     1∶2500
    1∶1000     1∶2500
    1∶1000     1∶2500
    1∶1000     1∶2500
    1∶1000     1∶2500
i.d.DNA+EP     1∶1000     1∶2500
    1∶1000     1∶2500
    1∶5000     ＞1∶50,000
    1∶1000     1∶2500
    ＞1∶5000     ＞1∶50,000
    ＞1∶250     1∶2500
    i.d.DNA+颗粒     ＞1∶5000     1∶2500
    1∶1000     1∶2500
    1∶1000     1∶25,000
    1∶1000     1∶2500
    1∶1000     1∶2500
    1∶1000     1∶250
    i.d.DNA+颗粒+EP     ＞1∶5000     ＞1∶50,000
    ＞1∶5000     1∶25,000
    1∶5000     ＞1∶50,000
    1∶5000     1∶2500
    1∶1000     1∶25,000
    1∶5000     ＞1∶50,000
下表6显示了肌内(i.m.)和皮内(i.d.)施用多核苷酸和颗粒后AUSYME EIA测定抗HbsAg抗体效价的结果，单位为mIU/ml(GMT)。
                                 表6
组     初次GMT      再次GMT(加强1) 加强2
2周  4周 6周 8周 10周
DNA(i.m.) 0  0   (0/6) 0   (0/6) 7   (1/6) 40  (5/6)
DNA+EP 1  10  (1/6) 47  (5/6) 129 (6/6) 122 (6/6)
DNA+颗粒 0  6   (2/6) 13  (2/6) 17  (4/6) 65  (6/6)
DNA+颗粒+EP 4  15  (6/6) 121 (5/6) 130 (6/6) 107 (6/6)
DNA(i.d.) 0  0   (0/6) 0   (0/6) 0   (0/6) 0   (0/6)
DNA+EP 0  2   (2/6) 0   (4/6) 88  (5/6) 114 (6/6)
DNA+颗粒 0  13  (1/6) 0   (1/6) 1   (2/6) 14  (3/6)
DNA+颗粒+EP 1  18  (3/6) 44  (5/6) 82  (6/6) 130 (6/6)
*GMT＝从应答个体中计算得到的几何平均效价。每组应答个体的数目，适用时，显示于括号中。
下表7显示了对肌内(i.m.)和皮内(i.d.)施用多核苷酸和颗粒后细胞应答的同种型研究结果。
                                  表7
组 初次应答 再次应答(第一次加强) (第二次加强)
4周 6周 10周
DNA(肌内注射) Th1样，IgG1＜IgG2比率：0.48(1/3) Th1样，IgG2(3/3)
DNA+电穿孔(肌内注射) Th1样IgG1＜IgG2比率：0.31(1/3) Th1样，IgG1＜IgG2比率：0.22(1/3) Th1/Th2混合，IgG1＜IgG2比率：0.30(2/3)，(IgG1增加)
DNA+颗粒(肌内注射) Th1样IgG1＜IgG2比率：0.45(1/3) Th1样，IgG2(3/3) Th1样，IgG1＜IgG2比率：0.16(1/3)，
DNA+颗粒+电穿孔(肌内注射) Th1样IgG1＜＜IgG2比率：0.18(2/3) Th1/Th2混合，IgG1＜IgG2比率：0.44(3/3)，(IgG1增加) Th1/Th2混合，IgG1＜IgG2比率：0.40(3/3)，(IgG1，IgG2增加)
DNA(皮内注射)
DNA+电穿孔(皮内注射) Th1/Th2混合IgG1＜IgG2比率：0.46(2/3) Th1样，IgG1＜IgG2比率：0.26(1/3) Th1/Th2混合，IgG1＜IgG2比率：0.24(2/3)，(IgG1增加)
DNA+颗粒(皮内注射) Th1样，IgG2a(1/3) Th1/Th2混合，IgG1＜IgG2比率：0.43(2/3)，(IgG1增加)
DNA+颗粒+电穿孔(皮内注射) Th1样，IgG1＜IgG2比率：0.19(1/3) Th1/Th2混合，IgG1＜IgG2比率：0.26(3/3)，(IgG1，IgG2增加)
结论：如表5和6所总结的，研究结果显示使用与DNA疫苗不化学结合的佐剂颗粒可以增强电辅助的DNA疫苗接种的免疫应答。例如，正如初次免疫后产生的强抗体效价显示的，与其它已描述的方法相比，利用本发明方法产生的免疫应答的动力学较快。此外，免疫应答中免疫应答量的增加明显提前了：在进行电穿孔的情况下，使用颗粒佐剂经一次加强后获得的效价与不使用颗粒佐剂经两次加强后获得的效价相似。免疫应答的性质(例如，Th1应答的出现)不会由颗粒佐剂的存在而改变：如由所观察到的主要IgG2同种型所显示的，DNA疫苗接种引起主要的Th1应答。
将与DNA疫苗不化学结合的佐剂颗粒和电辅助的疫苗递送进行联合，显示出在DNA疫苗接种后的早期(初次免疫后及第一次加强免疫后)对免疫应答具有协同效应(比加性效应好)。
实施例4
检测疫苗接种后细胞应答(Th1型)的诱导的一种方法是，估计免疫接种为被治疗个体在随后用肿瘤细胞系攻击时提供的保护水平，所说的肿瘤细胞系表达用于免疫接种的抗原。在被免疫的动物中，抗原修饰的肿瘤细胞将被CTL杀死，而未修饰的肿瘤细胞将不会被免疫系统发现，从而使肿瘤得以生长。通过用CT26细胞克隆C12注射被免疫的小鼠来实现肿瘤攻击，所说的CT26细胞已通过ElsAg表达载体的转染而改造成表达HbsAg抗原(见上文实施例2)。作为对照，用未修饰的野生型细胞系(称MDA)注射被免疫的小鼠。肿瘤攻击测试的结果如下表8所示。
                                          表8
    组     靶组织   治疗   攻击             攻击后的肿瘤负担
   3周    4周     5周
1     肌肉(i.m.) DNA HBsAg 0/3 1/3 2/3
  MDA    2/3    3/3(处死)
    2     同上   DNA+电穿孔   HBsAg    0/3    0/3     0/3
  MDA    3/3(处死)
    3     同上   DNA+颗粒   HBsAg    0/3    0/3     1/3
  MDA    3/3(处死)
4 同上   DNA+颗粒+电穿孔 HBsAg 0/3 0/3 1/3
  MDA    3/3(处死)
5     皮肤(i.d.) DNA HBsAg 1/3 1/3 1/3
  MDA    3/3(处死)
    6     同上   DNA+电穿孔   HBsAg    0/3    0/3     1/3
  MDA    3/3(处死)
    7     同上   DNA+颗粒   HBsAg    2/3    2/3     2/3
  MDA    3/3(处死)
8 同上   DNA+颗粒+电穿孔 HBsAg 1/3 1/3 1/3
  MDA    2/3    3/3(处死)
“肿瘤负担”是指在CT26细胞施加后的指定时间点显示有任何肿瘤生长的动物数目。因为在用HbsAg表达细胞攻击时大部分动物都得到保护，故存在肿瘤抗原特异性CTL细胞并该细胞由DNA免疫方案诱导。当用不表达肿瘤抗原的相同细胞系注射动物时，除了两只之外，所有其它动物都在遭受攻击后3周死于肿瘤，剩下的两只动物此后未存活1周。
如表8中的数据所示，所有模式的DNA疫苗接种在初次免疫和两次加强免疫后都产生了足够的细胞免疫应答，从而为肿瘤细胞系的攻击提供实质的保护，其中所说的肿瘤细胞系表达用于免疫的抗原。野生型细胞系(MDA)的致瘤力为快速和致死的肿瘤生长所证实。因而，本发明的方法在不改变期望的细胞应答的情况下增强了免疫原性作用。
实施例5
进行进一步的测试来测定在施用DNA疫苗和产生电场后于不同时间施加佐剂颗粒是否会增强免疫应答。在三组小鼠(每组10只)中进行DNA疫苗接种和电穿孔。在电穿孔的时候对其中一组施加金颗粒。第二组在电穿孔后1天接受金颗粒，第三组不接受任何颗粒。小鼠接受致敏，然后在第四周，即第一次加强免疫的时间检测血清中疫苗特异的抗体，在第6周，即加强免疫后2周测定再次抗体免疫应答。
小鼠：C57/B16实验组大小＝10只小鼠。
DNA：用25μg DNA于50μl PBS中在每一位点施加编码乙肝病毒表面抗原(HbsAg)的ElsAg-表达载体。对1天组小鼠施加与DNA混合但不化学结合的金或于50μl PBS中的金颗粒，每肌肉施加1mg。
试验：用带定量板的ABBOTT AUSAB EIA测定抗HbsAg的抗体，单位为mIU/ml。
颗粒：BioRad Biolistic 1.6微米金颗粒；目录号：1652264
免疫位点和模式：两条后腿的胫骨前肌，用针和注射器。
电穿孔条件：用针距5mm的Genetronics 2针阵列电极，电脉冲由ECM830脉冲发生器提供，设置如下：100V，25msec，6个脉冲，5Hz。
这些实验的结果显示于下表9中，表明了与不存在颗粒时DNA疫苗接种和电穿孔相比，将颗粒与DNA混合(但不化学结合)并基本上在电穿孔时施用，可导致增强的免疫应答。在递送DNA时施加佐剂颗粒获得了更大的增强效果。当佐剂颗粒于DNA递送后一天给予时，与未接受佐剂颗粒的小鼠相比，仍能检测到免疫应答的增强。此外，此实验显示，在低应答的小鼠株，如实施例5所用的C57/B16小鼠中，颗粒佐剂使小鼠能对所用DNA剂量产生免疫应答。
                           表9
                 GMT抗HbsAg抗体效价(mIU/ml)
  组   4周   6周
  DNA+电穿孔加颗粒   30.11(9/10阳性)   140.61(10/10阳性)
  DNA+仅电穿孔   1.86(3/10阳性)   1.25(1/10阳性)
  DNA+电穿孔+1天时颗粒   7.59(7/10阳性)   10.68(5/10阳性)
在加强免疫后抗体效价的独立t-检验：
DNA/电穿孔加颗粒相对于DNA/仅电穿孔：p＝0.0069
DNA/电穿孔加颗粒相对于DNA/电穿孔加第1天金颗粒：p＝0.059
DNA/电穿孔加第1天颗粒相对于DNA/仅电穿孔：p＝0.040

Claims (48)

1.通过给个体施用编码抗原的多核苷酸来诱导免疫应答的方法，所说的方法包括：
a)将免疫原性有效量的至少一种编码抗原的多核苷酸引入个体靶组织中，施用途径选自肌内、皮内、皮下和粘膜内途径；
b)基本上在引入多核苷酸的同一时间在靶组织处产生足够强度的脉冲电场，从而导致多核苷酸进入靶组织细胞中以在其中表达，并导致个体体内产生对多核苷酸所编码抗原的免疫应答；及
c)在多核苷酸引入和电场产生的数天内将佐剂有效量的颗粒引入靶组织中，其中，多核苷酸和颗粒在引入之前相互之间基本上是不化学结合的；
其中，与涉及施用编码抗原的多核苷酸的其它免疫方式所产生的免疫应答相比，此方法增强编码抗原的多核苷酸的免疫原性。
2.权利要求1的方法，其中多核苷酸在颗粒之前被引入。
3.权利要求1的方法，其中多核苷酸在颗粒之后被引入。
4.权利要求1的方法，其中多核苷酸与颗粒在同一时间被引入。
5.权利要求1的方法，其中免疫应答包括细胞免疫应答。
6.权利要求1的方法，其中免疫应答包括体液应答。
7.权利要求1的方法，其中免疫应答包括产生抗多核苷酸所编码抗原的抗体。
8.权利要求1的方法，其中免疫应答是T细胞介导的免疫应答。
9.权利要求1的方法，其中抗原是肿瘤相关抗原。
10.权利要求9的方法，其中肿瘤相关抗原是细胞表面抗原。
11.权利要求10的方法，其中肿瘤相关抗原是蛋白质、多肽或多糖。
12.权利要求1的方法，其中多核苷酸是选自以下的形式：线性、松弛、环状、超螺旋、凝聚和化学修饰形式。
13.权利要求1的方法，其中多核苷酸是DNA。
14.权利要求12的方法，其中多核苷酸包含于载体或质粒中。
15.权利要求1的方法，其中个体是哺乳动物。
16.权利要求15的方法，其中哺乳动物是人类。
17.权利要求15的方法，其中脉冲电场足以引起多核苷酸电转运进入组织细胞。
18.权利要求17的方法，其中颗粒选自聚合物、脂质体、生物相容性材料的微球体和微粒。
19.权利要求18的方法，其中颗粒选自金、铝、钛、钨和碳微粒。
20.权利要求19的方法，其中脉冲电场通过在至少两个电极上施加至少一个电脉冲而产生于靶组织中，所述至少两个电极位于个体的组织表面或表面以内。
21.权利要求1的方法，其中脉冲电场是引起电穿孔的电场。
22.权利要求21的方法，其中脉冲电场具有约50V/cm-400V/cm的额定电场强度。
23.权利要求22的方法，其中脉冲电场具有约100V/cm-200V/cm的额定电场强度。
24.权利要求1的方法，其中脉冲电场中的脉冲长度约为100μsec-100msec。
25.权利要求1的方法，其中电脉冲的波形是单极或双极的。
26.权利要求1的方法，其中脉冲频率为0.1-约10KHz。
27.权利要求1的方法，其中颗粒选自生物相容性材料的微球体和微粒。
28.权利要求27的方法，其中颗粒是金微粒或其它贵重金属微粒。
29.权利要求27的方法，其中颗粒是钛、钨、铝或碳微粒。
30.权利要求1的方法，其中颗粒是聚合物或脂质体。
31.权利要求1的方法，其中颗粒的最大平均尺寸在约0.05微米-约20微米的范围内。
32.权利要求31的方法，其中颗粒的最大平均尺寸在约0.1微米-约3微米的范围内。
33.权利要求1的方法，其中脉冲电场通过在至少两个电极上施加至少一个电脉冲而产生于靶组织中，所述至少两个电极位于个体组织上或组织内。
34.权利要求1的方法，其中至少一个电极通过皮内方式插入个体的靶组织中。
35.权利要求1的方法，其中靶组织是皮肤，而电极包含在弯电极中。
36.权利要求1的方法，其中靶组织是肌肉，而电极是针电极。
37.权利要求1的方法，其中该方法间隔地对个体进行重复以向个体施用加强剂量的抗原或编码抗原的多核苷酸。
38.权利要求37的方法，其中加强剂量于选自起始施用后4周、6周和10周的一个或多个间隔时间点施用。
40.权利要求1的方法，其中多核苷酸编码来自细菌或病毒病原体的抗原。
41.权利要求1的方法，其中颗粒在多核苷酸引入和电场产生之前或之后不超过3天引入。
42.通过给个体施用编码抗原的多核苷酸来诱导免疫应答的方法，所说的方法包括：
a)通过肌内注射将免疫原性有效量的至少一种编码抗原的多核苷酸引入个体靶组织中；
b)基本上在引入多核苷酸的同一时间在靶组织处产生足够强度的脉冲电场，从而导致多核苷酸进入靶组织细胞中以在其中表达，并导致在个体体内产生对多核苷酸所编码抗原的免疫应答；及
c)在多核苷酸引入和电场产生的数天内将佐剂有效量的颗粒引入靶组织中，其中多核苷酸和颗粒在引入之前相互之间基本上是不化学结合的；
其中，与涉及施用编码抗原的多核苷酸的其它免疫方式所产生的免疫应答相比，此方法增强编码抗原的多核苷酸的免疫原性。
43.权利要求42的方法，其中颗粒在多核苷酸引入和电场产生之前或之后不超过3天引入。
44.权利要求43的方法，其中个体是哺乳动物。
45.权利要求44的方法，其中哺乳动物是人类。
46.权利要求44的方法，其中脉冲电场足以引起多核苷酸电转运进入组织细胞。
47.权利要求46的方法，其中颗粒选自聚合物、脂质体、生物相容性材料的微球体和微粒。
48.权利要求47的方法，其中颗粒选自金、铝、钛、钨和碳微粒。
49.权利要求48的方法，其中脉冲电场通过在至少两个电极上施加至少一个电脉冲而产生于靶组织中，所述至少两个电极位于个体的肌肉内或肌肉上。
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