CN1882358A - 添加烷基磷脂酰胆碱作为辅药的疫苗组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及含有至少一种疫苗抗原的药物组合物。本发明组合物的特征在于，它还含有至少一种具有通式I结构的磷脂酰胆碱磷酸酯衍生物，其中R1是低级烷基，R2和R3相同或不同，各自可以表示具有13～21个碳原子的线型烃链。

Description

添加烷基磷脂酰胆碱作为辅药的疫苗组合物
本发明涉及疫苗的领域，更特别涉及添加辅药的疫苗。本发明特别涉及含有至少一种疫苗抗原和至少一种磷脂酰胆碱磷脂衍生物的药物组合物。
按照先有技术，众所周知希望借助于辅药增大在疫苗中存在的抗原所诱发的免疫应答或使之定向。之所以希望如此，是因为单独给予的抗原，还不足以构成免疫源，特别是由于其很高的纯度，或者由于希望减少在疫苗中存在的抗原的量或将要进行的重复接种次数，或者还由于希望延长被疫苗所带来的保护时间。有时与其说定量地不如说定性地涉及到改变说诱发的应答。
虽然先有技术拥有大量建议可用作辅药的产品，可是要注意到，获准在人类医疗市场上使用的大多数添加辅药的疫苗是借助于铝盐或乳液来添加辅药的。
目前，有实际的需要提出一种新型的辅药，其用量在保持完全安全的给药量的同时能够改变免疫应答。
另外，在作为转染的其它领域中，在先有技术中已经提出了使用阳离子脂质的方法。比如在题为《通过阳离子脂质体包被的DNA免疫接种对抗丙肝病毒结构蛋白质3的细胞免疫进行的调节》(Modulationof Cellular Immune Against Hepatitis C Virus Nonstructural Protein 3 byCationic Liposome Encapsulated DNA Immunization)中，对于其运输涉及细胞的血浆DNA的能力，对多种构成脂质体的阳离子脂质进行了测试。本文的兴趣在于疫苗的领域，因为希望免疫系统对抗原的转染DNA密码做出应答。为了使免疫系统具有良好的反应，首先应该对抗原进行表达，因此在最好的条件下将DNA“交给”能够表达的细胞。对DNA起着“载体”作用的转染剂所起的作用与药物组合物中存在的疫苗抗原同时存在的辅药所起的作用是不同的。本文作者得到的结果表明，当借助于脂质体来转染DNA时，与DNA被“裸”注入时相比，得到的应答更大，但是根据用来形成脂质体的脂质种类的不同，得到的应答随着种类和强度而变化。
尽管对可用作辅药的不同产品有着大量的文献，总还有需要提出能够没有风险地用于被给药机体的产品，这使得增大和/或改变免疫系统对与其一起给药的疫苗抗原的应答。
提供这样的产品就是本发明的目的。
本发明的另一个目的是提供一种容易得到的疫苗辅药，其成本使得能够被加入疫苗组合物中而不会使其成本提高到妨碍其使用的程度。
为了实现这些目的，本发明的目标是含有至少一种疫苗抗原的药物组合物，其特征在于，该药物组合物还含有至少一种具有如下结构的磷脂酰胆碱的磷酸酯衍生物：
其中：
—R1是低级烷基，
—R2和R3相同或不同，各自可表示具有13～21个碳原子的线型烃链。
按照一个特定的实施方式，R1表示乙基，因此此衍生物在其将要被给药的生物体内降解将会产生生物相容的产物：磷脂酰胆碱和乙醇。
按照本发明的一个特定实施方式，R2和R3选自来自如下脂肪酸的基团：肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸。
按照一个有利的特定方式，R2和R3是相同的，并表示油酸的基团。这样的产品完全能够通过化学合成来制备，并具有各种安全保证和在制药行业中所需再现性。
本发明的另一个目标是具有如下结构式的磷脂酰胆碱磷酸酯衍生物用于制备疫苗辅药方面的应用：
其中：
—R1是低级烷基，
—R2和R3相同或不同，各自可表示具有13～21个碳原子的线型烃链。
本发明的再一个目标是一种哺乳类动物的免疫方法，按照该方法，给予其至少一种疫苗抗原，还给予其一种具有如下结构的磷脂酰胆碱磷酸酯衍生物：
—R1是低级烷基，
—R2和R3相同或不同，各自可表示具有13～21个碳原子的线型烃链。
因此，与没有磷脂酰胆碱衍生物时给药疫苗抗原所得到的应答相比，免疫系统的应答被改变。
通过阅读如下的详细叙述，本发明的许多其它优点将更加明显。
本发明涉及一种含有至少一种疫苗抗原的药物组合物。所谓“疫苗抗原”指的是当将其给予人或动物时能够诱发免疫系统应答的抗原。免疫系统的这种应答可以表现为产生抗体，或者表现为激活某种细胞，特别是抗原呈递细胞(比如树枝状细胞)、淋巴细胞T、淋巴细胞B。
该药物组合物可以是一种旨在预防或旨在治疗，或者二者兼顾的组合物。
该组合物可以通过对于疫苗通常使用或推荐的各种途径：肠道外途径、肌肉途径给药，并呈不同的形式：可注射或可雾化的液体、冷冻干燥或雾化干燥或空气干燥的制剂等。该组合物可借助于注射器或用于肌肉注射、皮下注射或透皮注射的无针注射器给药。它也可以通过能够向粘膜，比如鼻部、肺部、阴道或直肠喷洒干粉或雾状液体喷雾器给药。
在按照本发明的药物组合物中使用的疫苗抗原是“直接”抗原，即不涉及编码此抗原的DNA，而只是该抗原本身，它可涉及整个微生物，或者只涉及此微生物的一部分，因此在疫苗中经常使用的抗原当中特别可以举出：
—多糖，单独使用或与载体要素，比如载体蛋白质结合使用；
—整体的减毒活微生物；
—灭活微生物
—重组肽和蛋白质；
—糖蛋白、糖脂、脂肽；
—合成肽；
—在被称为“分裂”疫苗的情况下的爆裂的微生物。
这些抗原用来或可被用来治疗或预防各种疾病，比如白喉、破伤风、脊髓灰质炎、狂犬病、百日咳、甲型、乙型或丙型肝炎、黄热病、伤寒、水痘、麻疹、流行性腮腺炎、风疹、流行性脑炎、脑膜炎、肺炎、轮状病毒感染、艾滋病、癌症、结核病、莱姆病、劳斯肉瘤病毒感染、胞疹、由衣原体、淋病双球菌、肺炎链球菌、卡他莫拉菌、金色链球菌或B型流感嗜血杆菌引起的细菌感染、疟疾、立时曼病、李斯特菌病等。
按照本发明的药物组合物可以用来对单一的病原或癌，即含有单一病原或癌的一种或几种抗原进行免疫，或者用来对多种病原或癌进行免疫(此时称之为组合疫苗)。
所用的磷脂酰胆碱磷酸酯衍生物的作用是对疫苗组合物予以促进，即相对于在没有这样的化合物存在时所得到的应答来增大或改变被给药疫苗组合物的机体免疫系统的应答。特别是，可以涉及体液应答或细胞应答，或者同时涉及两者的增加。该作用还可能不是使应答增大，而是诱发应答的不同定向：比如与体液应答的定向相比更倾向于细胞应答定向、与其它种类相比更倾向于产生某些细胞因子、与其它抗体相比更倾向于产生某些类型或亚类型的抗体、与其它细胞相比更倾向于模拟某些细胞等。辅药的作用还可能包括增大免疫应答随时间的寿命。还可涉及到能够减少为得到对被免疫个体的保护所必需的给药数量或者减少在给药的剂量中所含的抗原量。
当在其给药中与药物组合物中的一种或几种抗原一起给药，即在药物组合物中直接存在而使用时，或者当与希望由其改变免疫源能力的一种或几种抗原分别给药时，就能够得到按照本发明衍生物辅药作用。但是，优选在与待给药的一种或几种抗原同样的药物组合物中使用该辅药。
对于本发明的目的来说，所谓磷脂酰胆碱，指的是由甘油分子、两个脂肪酸分子、硫酸根和胆碱组成的磷脂。这样的化合物也称为卵磷脂，根据其脂肪酸的不同而变化。
为了本发明的需要，两个脂肪酸R2和R3可以是相同或不同的、饱和或不饱和的脂肪酸，优选使用通过具有至少13个碳原子的脂肪酸酯化得到的磷脂酰胆碱，所述脂肪酸特别是如下的酸：肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸或油酸。
所谓“低级烷基R1”，指的是最多具有5个碳原子的烷基。按照本发明，实际上磷脂酰胆碱衍生物是磷脂酰胆碱的磷酸酯，这可以涉及通过磷脂酰胆碱和甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或戊醇反应得到的酯，使用来自乙醇的酯得到了特别好的结果。
通过全化学合成，或者通过将天然的磷脂酰胆碱，比如从大豆或蛋类提取的磷脂酰胆碱酯化，就能够得到适合于本发明目的的化合物。这是能够以可药用盐，特别是盐酸盐的形式使用的化合物。在特别适合于使用的化合物当中，可以举出比如1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱、1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱或1，2-棕榈酰基-油酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱，特别是从AvantiPolar Lipids公司购得的商品。这些化合物以粉末或氯仿溶液的形式提供。
按照本发明，将这些化合物分散在水中或者分散在水性缓冲液中形成悬浮液，此时将此悬浮液与含有疫苗抗原的溶液混合，或者使用含有磷脂酰胆碱磷酸酯衍生物的悬浮液去处理含有疫苗抗原的冷冻干粉。另外可以用已经含有至少一种疫苗抗原的水或缓冲液来分散磷脂酰胆碱酯衍生物或使其水合。
此时，使用的磷脂酰胆碱磷酸酯衍生物可形成脂质的或脂质体泡囊，其尺寸有利地为50～220nm。
还可以在含有乳液的组合物中使用本发明的辅药。
下面的非限定性实施例说明本发明的实施实例。
实施例1：具有TAT蛋白质作为抗原的疫苗组合物
1.1.组合物制备
制备含有可用于抗艾滋病疫苗的重组蛋白质作为疫苗抗原的疫苗组合物，这涉及通过在大肠杆菌内表达而得到，并经不同色谱步骤提纯，随后经过化学灭活而得到的解毒TAT III B蛋白质，在申请书WO99/33346中对其进行了叙述，在该文中称其为羧甲基化Tat。
按照如下所述的方法制备该组合物。
AVANTIPOLAR LIPIDS公司提供的氯化1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱(乙基PC)的粉末，将其溶解于4/1的氯仿/甲醇混合物中，以得到2mg/mL的浓度。
将得到的3.18mL溶液，即6.36mg乙基PC加入到玻璃烧瓶中，借助于旋转蒸发器除去溶剂，直至在烧瓶的壁上得到规则的脂质膜。然后将此膜在高真空下干燥以除去极少量的残留溶剂。
然后，使用超声处理浴，在40℃下用4mL蒸馏水将此膜重新水合。再在50℃的恒温器中，在氮气压力下将如此得到的泡囊分散液挤压通过装在挤压机(Lipex Biomembranes公司)上的多层聚碳酸酯膜(0.8μm、0.4μm和0.2μm)。
此时得到的脂质体悬浮液的浓度为1.59mg/mL，在由100mmol/L的TRIS和200mmol/L的NaCl的pH值7.4的缓冲液中将其以体积计(volume àvolume)混合在200μg/mL的浓Tat溶液中。
再制备出只含有TAT抗原而无辅药的组合物。
如此得到200μL的制剂，其组成如下：
1)20μgTAT
2)20μgTAT和159μg乙基PC
1.2.免疫
取2组6只8周龄的BALB/c雌性小鼠，通过皮下对其注射在1.1节中制备的组合物，每只鼠的剂量为200μL，在第0天和第21天进行注射。
在第14天从后眶窦采集血样，以评价初级应答，在第35天评价次级应答。使用标准ELISA测试进行IgG1和IgG2a比率的测定。
在第37天杀死小鼠，采集脾的试样，分离出脾细胞。
得到的涉及体液应答的结果概括在下面的表格中，在该表中IgG的效价(taux)是任意的ELISA单位(log10)。
对于每一组小鼠，给出的值是每个小鼠得到的数值的几何平均效价(titre)。
鼠的编组 在第14天IgG1效价 在第14天IgG2a效价 在第35天IgG1效价 在第35天IgG2a效价
只有Tat 1.943 1.045 3.950 2.437
Tat+乙基PC 2.931 2.429 4.889 4.368
得到的结果表明，按照本发明的组合物能够得到比只单独给出抗原的情况下得到的高得多的体液应答。
还观察到辅药对IgG2a应答的效果是非常明显的，这表明免疫应答的定向更倾向于TH1型应答。
为了评价本发明的药物组合物对于细胞应答的作用，通过ELISPOT测试进行了能够产生γ干扰素的脾细胞计数。对新鲜细胞和重复刺激的细胞同时进行此测试。
为了进行此测试，只在介质存在下，或者在重组TAT抗原存在下，在细胞培养板上培养脾细胞，每个穴200,000个细胞。在培养16h以后，进行ELISPOT取样，即对分泌γ干扰素的细胞相对应的点进行计数。得到的结果汇总在下面的表中，给出的数值是平均值(每组小鼠)，对于每个小鼠，计算出在具有重组TAT的穴中每百万个细胞数出的点数与只有介质的穴中每百万细胞数出的点数之差。下面的表中汇总了在新鲜细胞上得到的结果。
测试的药物组合物 每百万细胞的点数
20μgTAT 31.67
20μgTAT+乙基PC 129.17
下面的表中汇总了对在IL2存在下被重组TAT重新刺激的细胞得到的结果。
测试的药物组合物 每百万细胞的点数
20μgTAT 44.16
20μgTAT+乙基PC 411.66
这些结果表明了使用本发明组合物对于刺激CD4+细胞得到的正效应。
2.具有巨细胞病毒糖蛋白gB作为抗原的疫苗组合物
2.1组合物制备
制备含有来源于名为gB的Towne株系巨细胞病毒(CMV)包膜糖蛋白的重组蛋白质作为疫苗抗原的疫苗组合物，在美国专利USP5,834,307中叙述了这种病毒的核苷酸和蛋白质序列。此重组蛋白质是通过由含有gB转基因的名为pPRgB27clv4的质粒转染的重组CHO谱系得到的。实际上为了更容易通过CHO谱系制造这种重组蛋白质，要通过预先除去部分基因来改变gB基因，即给相当于缬氨酸677和精氨酸752之间的氨基酸序列的蛋白质gB的跨膜区进行编码，并且引进3个点的突变，使得除去在原生gB中存在的切割位点。最后，通过重组CHO谱系制造的重组蛋白质相当于被称为gBdTM的缺少切割位点和跨膜区的被截短的gB蛋白质。
在美国专利6,100,064中叙述了通过重组CHO谱系构建pPRgB27clv4质粒和制造截短的gB蛋白质(gBdTM)的方法。使用Rasmussen L等人在J.Virol.(1985)55：274-280中叙述的单克隆抗体15D8在免疫亲合层析柱上进行截短蛋白质gB的提纯。
提供1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱氯化物(乙基DSPC)和1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱(乙基DOPC)氯化物的粉末，它们都是由AVANTIPOLAR LIPIDS公司供货的。对于每一种产品进行如下的操作：
将5mg粉末溶解于5mL氯仿/甲醇(4∶1，v/v)。借助于旋转干燥器将玻璃烧瓶中的溶液干燥，在瓶壁上留下脂质膜。再在高真空下干燥此膜除去极少量残留的溶剂，然后在60℃下在2.5mL水中重新处理得到最终的浓度为2mg/mL。通过涡流搅拌10min、在超声浴中进行5min的超声处理，然后在50℃的恒温槽中借助于Lipex挤压机(Northen Lipids公司，Vancouver，CA)5次通过孔隙度0.2μm的聚碳酸酯膜片，使得到的脂质体悬浮液均化。
再制备含有乙基PC的乳液配方。
为此，借助于10mL的氯仿/甲醇(4/1，v/v)在玻璃烧瓶中溶解25mg1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱(乙基DOPC-AvantiPolar Lipids公司供应)。借助于旋转干燥器将得到的溶液干燥，在烧瓶壁上留下脂质膜。再在高真空下干燥此膜以除去极少量残留的溶剂。
在烧杯中称量375mg由Merck公司供应的植物Tween80，在其中加入29.29g水，搅拌直至此表面活性剂完全溶解。
然后，用此Tween80的溶液重新处理在前面的步骤中得到脂质膜。在此悬浮液中加入1475mg角鲨烯(Fluka)，在60psi的压力下，先经过Ultraturrax(8000～9500rpm)，然后通过Microfluidiseur M110(Microfluidics，Newton，MA.)20次将得到的乳液均化。
此乳液中的最终角鲨烯浓度为5％。
将如上所述的辅药配方或水与160μg/mL的gB蛋白质抗原基础水溶液和PBS缓冲液混合，制备免疫制剂，得到具有如下组成的50μL制剂：
1)2μg gB
2)2μg gB和50μg乙基DOPC
3)2μg gB和50μg乙基DSPC
4)2μg gB、50μg乙基DOPC、1.25mg角鲨烯和0.3mgTween80
2.2.免疫
取4组8只8周龄的非近交系OF1雌性小鼠，通过皮下对其注射在2.1节中制备的组合物，每只鼠的剂量为50μL，在第0天和第21天进行注射。
在第20天从后眶窦采集血样，以评价初级应答，在第34天评价次级应答。使用标准ELISA测试进行IgG1和IgG2a效价的测定。
在第37天杀死小鼠，采集脾的试样，分离出脾细胞。使用或不用重组gB蛋白质对其进行刺激。
此时用ELISA方法通过对用gB蛋白质刺激脾细胞5天的上层清液以及在没有刺激的细胞上层清液中的细胞因子(IL5、IFN-γ和TNF-α)的浓度进行测试，通过比较推导出细胞因子的比产量。
得到的涉及体液应答的结果概括在下面的表格中，在该表中IgG的效价是任意的ELISA单位(log10)。
对于每一组小鼠，给出的值是对于每只小鼠得到的值的几何平均效价。
小鼠编组 IgG1效价第21天 IgG2a效价第21天 IgG1效价第35天 IgG2a效价第35天
只有gB 2.703±0.773 1.624±0.572 4.409±0.564 3.187±0.595
gB+乙基DOPC 3.673±0.521 3.763±0.371 4.472±0.453 4.741±0.260
gB+乙基DSPC 3.708±0.545 3.869±0.303 4.388±0.393 4.600±0.246
gB+乙基DSPC+乳液 4.205±0.388 2.944±0.445 5.294±0.416 4.272±0.348
对于各种细胞因子的结果，在下面的表中再次给出了结果，指出的值对于每一种细胞因子，是在对于被蛋白质gB重复刺激的细胞测量的细胞因子数量平均值和对于只在介质中进行培养的细胞(可看作是测试的背景噪音)所测量的细胞因子数量平均值之间的差(单位是pg/mL)，因此可以认为，指出的量是专门对gB蛋白质的刺激应答产生的数量。
小鼠编组 IFN-γ   IL5     TNF-α
只是gB 2193   399     61
gB+乙基DOPC 56338   416     310
gB+乙基DSPC 28756   32     93
gB+乙基DSPC+乳液 3432   4054     134
在此测试中得到的全部结果表明了磷脂酰胆碱磷酸酯辅药的良好效果，它具有很强的增大Th1型免疫应答的能力(增加IgG2a和γ干扰素)，而不会抑制已经被抗原诱发的Th2型应答。
3.皮内给药的疫苗组合物
3.1制备组合物
提供由AvantiPolar Lipids公司供应的1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱氯化物(乙基DOPC)粉末，将5mg该化合物溶解于10mL氯仿/甲醇(4/1，v/v)中。借助于旋转蒸发器将得到的溶液在玻璃烧瓶中干燥，使其在烧瓶壁上留下脂质膜。在高真空下再次干燥此膜以除去极少量残留的溶剂，然后在60℃下在2.5mL水中重新处理使最终浓度为2mg/mL。通过在涡流中搅拌10min，在超声浴中进行超声处理5min，然后在50℃的恒温槽中借助于Lipex挤压机(Northen Lipids公司，Vancouver，CA)使其通过0.8μm的聚碳酸酯膜片，然后通过0.4μm的聚碳酸酯膜片，最后通过5次孔隙度0.2μm的聚碳酸酯膜片使得到的脂质体悬浮液均化。
再提供由浓度为160μg/mL的如在前面的实施例中叙述的方法得到的蛋白质gB构成的抗原基础溶液。
将抗原溶液与计算浓度2mg/mL的辅药悬浮液混合，得到每50μL的剂量具有如下组成的实验疫苗：
1)2μg gB
2)2μg gB和50μg乙基DOPC
3)0.2μg gB
4)0.2μg gB和50μg乙基DOPC
3.2.免疫
提供4组每组8个8周龄的OF1小鼠。
每组小鼠经皮内接受如上所示的4个配方中的一个。
在第0天和第20天进行免疫。
在第二次免疫前的第20天，从后眶窦采集血样，以评价初级应答，在第35天评价次级应答。
通过标准ELISA测试确定IgG1和IgG2a的具体效价。
在第35天杀死小鼠，采集脾脏试样并分离出脾细胞，用重组gB蛋白质对其刺激和不进行刺激。
此时通过ELISA测试进行在用gB蛋白质刺激5天的脾细胞上层清液以及没有刺激的脾细胞上层清液中细胞因子(IL5、IFN-γ和TNF-α)浓度的测定，通过比较推导出细胞因子的比产量。
将得到的涉及到体液应答的结果汇总在下面的表中，此处IgG的效价是任意的ELISA单位(log10)。
对于每组小鼠，指出的数值是对于每只小鼠得到的数值的几何平均效价。
小鼠编组 IgG1效价第20天 IgG2a效价第20天 IgG1效价第35天 IgG2a效价第35天
2μg gB 2.095 1.097 4.478 2.829
2μg gB+乙基DOPC 4.111 3.574 5.023 4.766
0.2μg gB 1.351 1.185 2.738 1.647
0.2μg gB+乙基DOPC 3.621 2.607 4.698 4.087
对于各种细胞因子的结果汇总在下面的表中，指出的数值是对于每一种细胞因子的，是对于用蛋白质gB重新刺激的细胞测量的细胞因子量的平均值和对于只在介质中培养的细胞(可看作是测量的背景噪音)测量的细胞因子量平均值之差(单位为pg/mL)，因此可以认为指出的数值就是被蛋白质gB刺激做出应答时专门产生的量。
小鼠编组   IFN-γ   IL5   TNF-α
2μg gB   3295   1891   65
2μg gB+乙基DOPC   49716   1373   638
0.2μg gB   2892   102   135
0.2μg gB+乙基DOPC   37877   690   533
在此测试中看到，按照本发明的辅药通过皮内给药是有效的，对于同样量的抗原它能够明显增大免疫应答，或者减少在注射制剂中存在的抗原量。
在此可以同时观察到辅药对Th2型(IgG1)和Th1型(IgG2a、干扰素γ)的效果，而且对后者甚至于更为有效。
4.具有SARS抗原的疫苗组合物
4.1.制备组合物
通过在细胞谱系上培养，然后灭活来制备灭活人类冠状病毒，在此就是SARS(严重急性呼吸综合征)病毒悬浮液，使用的悬浮液的浓度为在灭活前7.56log CCID50，将其稀释到1/10，得到浓度为6.56logCCID50的悬浮液。
提供由AvantiPolar Lipids公司供给的1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱氯化物(乙基DOPC)粉末，将30g该化合物溶解于10mL氯仿/甲醇(4/1，v/v)。借助于旋转干燥器将得到的溶液在玻璃烧瓶中干燥，使得在烧瓶壁上留下脂质膜。在高真空下再次将此膜干燥以除去极少量残留的溶剂，然后用5mL水在60℃下重新处理，使最终浓度达到6mg/mL。通过在涡流中搅拌10min，在超声浴中进行5min的超声处理，然后在50℃的恒温槽中借助于Lipex挤压机(NorthenLipids公司，Vancouver，CA)，使之通过孔隙度0.2μm的聚碳酸酯膜5次，使得到的脂质体悬浮液均化。
按照如下表中所指出的混合方式制备200μL的免疫制剂：
水 病毒悬浮液6.56log TCID50 辅药 磷酸盐缓冲液 每剂病毒量
1.418mL 110μL稀释1/10 - 472μL 104.6CCID50
1.151mL 110μL稀释1/10 267μL乙基DOPC 472μL 104.6CCID50
1.418mL 110μL稀释1 - 472μL 105.6CCID50
1.151mL 110μL稀释1 267μL乙基DOPC 472μL 105.6CCID50
4.2.免疫
提供4组每组8只BALB/c小鼠，在3周的间隔中用如上所述的配方对其进行免疫，皮下注射，注射的剂量是每次200μL。
在每次注射之后2周采集血样，以通过ELISA测试评价完整(灭活)抗SARS病毒抗体应答，在第14天是初级应答，在第33天是次级应答。
在第33天采集脾细胞试样。
通过对分泌γ干扰素的细胞进行ELISPOT计量评价SARS的特异性细胞应答，可以在活体外(ex vivo)进行，或者在使用灭活的整体病毒在体外(in vitro)刺激7天之后进行。在每一种情况下，都把脾细胞(活体外和体外重新刺激)培养16h，培养时使用灭活完整病毒，或者使用其序列(在10个氨基酸上)交叠并与SARS病毒不同抗原相当的混合肽18聚体。
另外，通过用整体灭活病毒或用混合肽刺激脾细胞所分泌的细胞因子进行ELISA计量的方法评价诱发的辅助T细胞应答的极化作用。
得到的涉及体液应答的结果汇总在下面的表中，其是以ELISA测试的任意单位的log 10表示，表示每组小鼠的几何平均效价。
免疫组合物   IgG效价第14天   IgG效价第33天
104.6CCID50   1   1.191
104.6CCID50+乙基DOPC   1.246   2.424
105.6CCID50   1.776   3.122
105.6CCID50+乙基DOPC   2.621   4.387
这些结果表明，按照本发明的辅药能够增大对病毒抗原的体液应答。
在涉及细胞应答时，当用整体病毒对新鲜细胞进行刺激(活体外)进行ELISPOT计数时得到的结果汇总在下面的表中，它表示对于每组小鼠的几何平均值。
免疫组合物 每106个脾细胞的点数
104.6CCID50 2
104.6CCID50+乙基DOPC 18
105.6CCID50 17
105.6CCID50+乙基DOPC 132
在涉及到对混合肽的应答所得到的结果时，根据使用的混合肽不同，应答会发生变化。
在用灭活SARS病毒重新刺激之后所得到的ELISPOT结果也表明，在乙基DOPC存在下，对使用的某些肽作出应答，使γ干扰素的产生增多。
这些结果表明，按照本发明的辅药能够增大对病毒抗原的T CD4+细胞应答。
在涉及到由ELISA对细胞因子IFN-γ(细胞因子Th1)和IL5(细胞因子Th2)进行计量时可观察到，在用灭活病毒刺激之后，对于除了抗原之外还接受了乙基DOPC的小鼠，IFN-γ的生产大大提高，反之，IL-5的产生则没有明显改变。
在下面的表中给出了得到的结果，它们的单位是pg/mL，表示每一组小鼠的几何平均值。
免疫组合物     用灭活整体病毒刺激
    IFN-γ(pg/mL)   IL-5(pg/mL)
104.6TCID50     4910   2793
104.6TCID50+乙基DOPC     9262   3037
105.6TCID50     7223   3649
105.6TCID50+乙基DOPC     51453   5270
这些结果表明，按照本发明的辅药能够增大Th1型细胞应答。
因此，所有这些结果表明，当给予由灭活病毒构成的抗原时，按照本发明的辅药能够明显地增大所诱发的免疫应答，同时包括细胞应答(Th1)和体液应答。
权利要求书
(按照条约第19条的修改)
1.含有至少一种“定向”疫苗抗原的药物组合物，其特征在于，该药物组合物还含有至少一种具有如下结构的磷脂酰胆碱的磷酸酯衍生物：
其中：
—R1是低级烷基，
—R2和R3相同或不同，各自可表示具有13～21个碳原子的线型烃链。
2.按照前面权利要求的组合物，其特征在于，R1表示乙基。
3.按照前面各项权利要求中之一的组合物，其特征在于，R2和R3选自来源于如下脂肪酸的基团：肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸和油酸。
4.按照前面各项权利要求中之一的组合物，其特征在于，R2和R3是两个相同的基团，表示油酸基团。
5.按照前面各项权利要求中之一的组合物，其特征在于，它还含有乳液。
6.具有如下结构的磷脂酰胆碱衍生物用于制备疫苗辅药的应用：
其中：
—R1是低级烷基，
—R2和R3相同或不同，各自可表示具有13～21个碳原子的线型烃链。
7.按照权利要求6的应用，其特征在于，R1表示乙基。
8.按照权利要求6或7中之一的应用，其特征在于，R2和R3选自来源于如下脂肪酸的基团：肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸和油酸。
9.按照权利要求6～8中之一的应用，其特征在于，R2和R3是两个相同的基团，每一个都表示油酸基团。
10.哺乳类动物免疫的方法，按照该方法，给予其至少一种“定向”疫苗抗原，还给予其具有如下结构的磷脂酰胆碱磷酸酯衍生物：
其中：
—R1是低级烷基，
—R2和R3相同或不同，各自可表示具有13～21个碳原子的线型烃链。

Claims (10)

1.含有至少一种疫苗抗原的药物组合物，其特征在于，该药物组合物还含有至少一种具有如下结构的磷脂酰胆碱的磷酸酯衍生物：
Figure A2004800338750002C1
其中：
-R1是低级烷基，
-R2和R3相同或不同，各自可表示具有13～21个碳原子的线型烃链。
2.按照前面权利要求的组合物，其特征在于，R1表示乙基。
3.按照前面各项权利要求中之一的组合物，其特征在于，R2和R3选自来源于如下脂肪酸的基团：月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸和油酸。
4.按照前面各项权利要求中之一的组合物，其特征在于，R2和R3是两个相同的基团，表示油酸基团。
5.按照前面各项权利要求中之一的组合物，其特征在于，它还含有乳液。
6.具有如下结构的磷脂酰胆碱衍生物用于制备疫苗辅药的应用：
其中：
-R1是低级烷基，
-R2和R3相同或不同，各自可表示具有13～21个碳原子的线型烃链。
7.按照权利要求6的应用，其特征在于，R1表示乙基。
8.按照权利要求6或7中之一的应用，其特征在于，R2和R3选自来源于如下脂肪酸的基团：肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸和油酸。
9.按照权利要求6～8中之一的应用，其特征在于，R2和R3是两个相同的基团，每一个都表示油酸基团。
10.哺乳类动物免疫的方法，按照该方法，给予其至少一种疫苗抗原，还给予其具有如下结构的磷脂酰胆碱磷酸酯衍生物：
其中：
-R1是低级烷基，
-R2和R3相同或不同，各自可表示具有13～21个碳原子的线型烃链。
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