ES2311875T3

ES2311875T3 - Composicion vaccinea mezclada con una alquilfosfatidilcolina.

Info

Publication number: ES2311875T3
Application number: ES04805451T
Authority: ES
Inventors: Jean Haensler
Original assignee: Sanofi Pasteur Inc
Current assignee: Sanofi Pasteur Inc
Priority date: 2003-11-17
Filing date: 2004-11-15
Publication date: 2009-02-16
Anticipated expiration: 2024-11-15
Also published as: FR2862306B1; NO20062779L; IL175573A0; CY1108498T1; JP4638880B2; DE602004017504D1; EP1696954B1; CN1882358B; WO2005049080A1; IL175573A; US7767658B2; CA2545086C; AU2004290943A1; PT1696954E; KR101136107B1; FR2862306A1; DK1696954T3; SI1696954T1; ZA200603522B; WO2005049080B1

Abstract

Composición farmacéutica que comprende al menos un antígeno vacunal distinto de un codificador de ADN, caracterizada porque comprende además al menos un derivado de éster fosfórico de fosfatidilcolina, con la estructura: (Ver fórmula) en la que: - R1 es un alquilo inferior, que tiene a lo sumo 5 átomos de carbono, - R2 y R3 son iguales o diferentes y cada uno puede representar cadenas hidrocarbonadas lineales que tienen de 13 a 21 átomos de carbono.

Description

Composición vaccínea mezclada con una alquilfosfatidilcolina.

La presente invención se refiere al campo de las vacunas y más en particular a vacunas con adyuvantes. En particular, la invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un antígeno vacunal y al menos un derivado del éster fosfórico de fosfatidilcolina.

Según la técnica anterior, es conocido el deseo de aumentar u orientar la respuesta inmunitaria inducida por los antígenos presentes en una vacuna, mediante adyuvantes. Esto puede ser deseable debido a que el antígeno, administrado solo, no es suficientemente inmunógeno, debido especialmente a su muy alto grado de pureza o debido a que se desea reducir la cantidad de antígenos presentes en la vacuna o el número de recuerdos que hay que efectuar o incluso debido a que se desea prolongar la duración de la protección conferida por la vacuna. A veces, se trata de modificar cualitativamente más que cuantitativamente la respuesta inducida.

Aunque la técnica anterior abunda en proposiciones de productos que pueden ser utilizados como adyuvantes, se observa que la mayoría de las vacunas con adyuvantes que son objeto de una autorización de lanzamiento al mercado en la medicina humana, son adyuvantes mediante una sal de aluminio o una emulsión.

O existe una demanda real de disponer de nuevos adyuvantes, pues las cualidades permitirán modificar la respuesta inmunitaria mientras se conservan las cualidades de una administración con toda seguridad.

Por otro lado, en otro campo que es el de la transinfección, se ha propuesto en el estado de la técnica utilizar lípidos catiónicos. Así, por ejemplo, en la publicación titulada "Modulation of Cellular Immune Response Against Hepatitis C Virus Nonstructural Protein 3 by Cationic Liposome Encapsulated DNA Immunization" (Jiao X et al., Hepatology (2.003) 37(2): 452-460), se ensaya en diversos lípidos catiónicos que constituyen liposomas, su capacidad para transportar el ADN plasmídico de interés hacia las células. Esta publicación tiene interés en el campo de las vacunas debido a que el ADN transinfectado codifica los antígenos contra los que se desea una respuesta del sistema inmunitario. Para que la reacción del sistema inmunitario sea buena, en primer lugar el antígeno se tiene que expresar y así el ADN es "liberado" en las mejores condiciones en las células capaces de expresarlo. El papel que juegan los agentes de transinfección que sirven de "vehículo" al ADN, es diferente del papel jugado por un adyuvante que acompaña a un antígeno vacunal presente en una composición farmacéutica. Los resultados obtenidos por los autores de esta publicación demuestran que la respuesta obtenida es más importante cuando el ADN es transportado mediante liposomas que cuando el ADN se inyecta "desnudo"; sin embargo, dependiendo de la naturaleza de los lípidos utilizados para formar los liposomas, las respuestas obtenidas varían de naturaleza e intensidad.

A pesar de la abundante bibliografía sobre los diversos productos que se pueden utilizar como adyuvantes, siempre existe la necesidad de disponer de un producto que se pueda utilizar sin riesgo para el organismo al que se administra y que permita incrementar y/o modificar la respuesta del sistema inmunitario en comparación con la del antígeno vacunal con el que se administra.

Es uno de los objetivos de la invención proponer dicho producto.

Otro objetivo de la invención es proponer un adyuvante vacunal fácilmente disponible, cuyo coste sea tal que se pueda añadir a las composiciones vacunales sin aumentar el precio de coste de manera prohibitiva.

Para lograr estos objetivos, la presente invención tiene por objeto una composición farmacéutica que comprende al menos un antígeno vacunal distinto de un ADN codificador, caracterizado por que comprende además al menos un derivado de éster fosfórico de fosfatidilcolina con la estructura:

1

en la que:

-: R_{1} es un alquilo inferior, que tiene a lo sumo 5 átomos de carbono,

-: R_{2} y R_{3} son iguales o diferentes y cada uno puede representar cadenas hidrocarbonadas lineales que tienen de 13 a 21 átomos de carbono.

Según un modo de realización particular, R_{1} representa el radical etilo; así, la degradación de este derivado en el organismo al que se habrá administrado producirá productos biocompatibles: fosfatidilcolinas y etanol.

Según un modo particular de la invención, R_{2} y R_{3} se eligen entre los radicales que proceden de los ácidos grasos siguientes: ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido oleico.

Según un modo particularmente ventajoso, los dos R_{2} y R_{3} son iguales y representan el radical del ácido oleico. Tal producto que puede ser totalmente preparado por síntesis química presenta todas las garantías de seguridad y de reproducibilidad deseadas para un uso farmacéutico.

La invención tiene igualmente por objeto la utilización de un derivado de éster fosfórico de fosfatidilcolina con la estructura:

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en la que:

-: R_{1} es un alquilo inferior, que tiene a lo sumo 5 átomos de carbono,

-: R_{2} y R_{3} son iguales o diferentes y cada uno puede representar cadenas hidrocarbonadas lineales que tengan de 13 a 21 átomos de carbono,

para la preparación de un adyuvante vacunal.

Otras numerosas ventajas de la presente invención aparecerán con la lectura de la descripción detallada que aparece a continuación.

La presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos un antígeno vacunal. Por antígeno vacunal, se entiende un antígeno susceptible de inducir una respuesta del sistema inmunitario cuando se administra al hombre o a un animal. Esta respuesta del sistema inmunitario se puede traducir en una producción de anticuerpos o una activación de ciertas células, especialmente las células que presentan antígenos (ej: las células dendríticas), linfocitos T, linfocitos B.

La composición farmacéutica puede ser una composición considerada profiláctica o considerada terapéutica o incluso las dos.

Se puede administrar por todas las vías utilizadas habitualmente o preconizadas para las vacunas: vía parenteral, vía mucosal y se presenta de diversas formas: líquido inyectable o pulverizable, formulación liofilizada o secada por atomización o por el aire,... etc. Se puede administrar mediante una jeringa o mediante un inyector sin aguja para inyección intramuscular, subcutánea o intradérmica. También se puede administrar gracias a un nebulizador capaz de liberar un polvo seco o un aerosol líquido al nivel de las mucosas, sean nasales, pulmonares, vaginales o
rectales.

Los antígenos vacunales utilizados en las composiciones farmacéuticas según la presente invención son antígenos "directos", es decir que no se trata de ADN codificador para estos antígenos, sino los propios antígenos; se puede tratar de un germen entero o solamente de una parte de este germen; así se pueden citar especialmente entre los antígenos utilizados habitualmente en las vacunas:

-: polisacáridos que estén solos o conjugados con elementos portadores, tales como las proteínas portadoras,

-: gérmenes enteros que vivan atenuados,

-: gérmenes inactivados,

-: péptidos y proteínas recombinantes,

-: glicoproteínas, glucolípidos, lipopéptidos,

-: péptidos sintéticos,

-: gérmenes fraccionados en el caso de las vacunas denominadas vacunas "divididas".

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Estos antígenos son los antígenos utilizados o susceptibles de ser utilizados para el tratamiento o la prevención de diversas enfermedades tales como por ejemplo: difteria, tétanos, polio, rabia, tosferina, hepatitis A, B, C, fiebre amarilla, fiebre tifoidea, varicela, sarampión, paperas, rubeola, encefalitis japonesa, meningitis, infecciones por pneumococos, infecciones por rotavirus, SIDA, tumores malignos, tuberculosis, enfermedad de Lyme, infecciones por RSV, herpes, afecciones bacterianas provocadas por Chlamydia, Neisseria gonorrheae, Streptococcus pneumoniae, Moraxella catarrhalis, Staphilococcus aureus o Haemophilus influenza tipo B, malaria, leshmaniosis, listerio-
sis,... etc.

La composición farmacéutica según la invención puede ser una composición destinada a la inmunización contra un solo patógeno o cáncer, es decir que comprende uno o varios antígenos de un solo patógeno o cáncer o puede ser una composición destinada a la inmunización contra diversos patógenos o tumores malignos (se habla entonces de combinación vacunal).

La acción del derivado de éster fosfórico de la fosfatidilcolina utilizada es ser adyuvante en la composición vacunal, es decir incrementar o modificar la respuesta del sistema inmunitario del organismo al que se administra la composición vacunal, con respecto a la respuesta que se obtendría en ausencia de dicho compuesto. En particular, se puede tratar de un aumento de la respuesta humoral o de la respuesta celular o de ambas. La acción puede ser igualmente no un aumento de la respuesta sino una orientación diferente de la respuesta inducida: por ejemplo, la orientación hacia una respuesta celular más bien que una respuesta humoral, producción de ciertas citocinas más que de otras, producción de ciertos tipos o subtipos de anticuerpos más que de otros, estimulación de ciertas células más que de otras, etc., ... La acción de un adyuvante puede consistir igualmente en aumentar la duración de la respuesta inmunitaria con el tiempo. También se puede tratar de permitir disminuir el número de administraciones necesarias para obtener una protección del individuo inmunizado o incluso disminuir la cantidad de antígeno contenida en la dosis administrada.

La acción adyuvante del derivado según la invención se puede obtener bien cuando se asocia al antígeno o a los antígenos de la composición farmacéutica durante su administración, es decir, cuando está presente directamente en la composición farmacéutica o incluso cuando se administra por separado el antígeno o los antígenos en que se quiere modificar el poder inmunógeno. Se prefiere utilizar sin embargo en la misma composición farmacéutica que el antígeno o los antígenos que se tienen que administrar.

Para los fines de la presente invención, se entiende por fosfatidilcolina los fosfolípidos constituidos por una molécula de glicerol, 2 ácidos grasos, un grupo fosfato y la colina. Estos compuestos también denominados lecitinas, varían en función de sus ácidos grasos. Para las necesidades de la invención, los 2 ácidos grasos R_{2} y R_{3} pueden ser iguales o diferentes, saturados o insaturados; se utilizan preferentemente fosfatidilcolinas que proceden de la esterificación de ácidos grasos que tienen al menos 13 átomos de carbono y especialmente los ácidos siguientes: mirístico, palmítico, esteárico u oleico.

Por radical alquilo inferior R_{1}, se entiende un radical alquilo que tiene a lo sumo 5 átomos de carbono. En efecto, según la invención, el derivado de fosfatidilcolina es un éster fosfórico de una fosfatidilcolina; se puede tratar de un éster que proceda de la reacción de la fosfatidilcolina y metanol, etanol, propanol, butanol o pentanol; se han obtenido buenos resultados en particular con un éster que procede de etanol.

Los compuestos que convienen para los fines de la invención se pueden obtener por síntesis química completa o incluso por esterificación de fosfatidilcolinas naturales, tales como la fosfatidilcolina extraída de la soja o los huevos. Son los compuestos que se pueden utilizar en forma de sal farmacéuticamente aceptable y especialmente cloruro. Entre los compuestos que convienen particularmente se pueden citar: 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina, 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina, 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina, 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina o incluso 1,2-palmitoil-oleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina, disponibles especialmente en la Compañía Avanti® Polar Lipids Inc. Estos compuestos están disponibles en forma de polvo o en disolución en
cloroformo.

Según la invención, los compuestos se dispersan en agua o en un tampón acuoso para formar una suspensión que se mezcla después con una disolución que comprende antígenos vacunales o la suspensión que contiene derivado de éster fosfórico de fosfatidilcolina se utiliza para recoger un liofilizado que comprenda los antígenos vacunales. De manera alternativa, es posible dispersar o hidratar el derivado de éster de fosfatidilcolina con agua o un tampón que comprenda ya al menos un antígeno vacunal.

Los derivados de ésteres fosfóricos de fosfatidilcolina utilizados pueden formar entonces vesículas lipídicas o liposomas, cuyo tamaño esté comprendido ventajosamente entre 50 y 220 nm.

Igualmente es posible utilizar adyuvantes según la invención en una composición que comprenda una emulsión.

Los ejemplos que siguen ilustran de manera no limitante, ejemplos de realización de la presente invención.

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Ejemplo 1 Composiciones vacunales que tienen como antígeno proteína TAT 1.1. Preparación de las composiciones

Se preparan composiciones vacunales que comprenden como antígeno vacunal, una proteína recombinante susceptible de ser utilizada en una vacuna contra el SIDA; se trata de la proteína TAT III B destoxificada que se obtiene por expresión en E. coli y purificación por diferentes etapas de cromatografía, después inactivación química así como se describe en la solicitud de patente internacional WO99/33346, donde se identifica con la terminología Tat carboximetilada.

Las composiciones se preparan de la manera descrita más adelante.

Se dispone de polvo de cloruro de 1,2 dioleoil-sn-glicero-3 etilfosfocolina (etil FC) suministrado por la compañía AVANTI® POLAR LIPIDS Inc. que se solubiliza en una mezcla de cloroformo/metanol 4/1 para obtener una concentración de 2 mg/ml.

Se introducen en un matraz de vidrio 3,18 ml de la disolución obtenida, que son 6,36 mg de etil FC; se elimina el disolvente con ayuda de un evaporador rotatorio hasta la obtención de una película lipídica regular en las paredes del matraz. Esta película se seca a continuación a alto vacío para eliminar cualquier traza de disolvente residual

Se vuelve a hidratar a continuación la película con 4 ml de agua destilada, a 40ºC, utilizando un baño de ultrasonidos. La dispersión de las vesículas así obtenidas son extruidas a continuación a través de diversas membranas de policarbonato (0,8 \mum; 0,4 \mum y 0,2 \mum) montadas sobre una Extrusora (Lipex Biomembranes, Inc.) termostatizadas a 50ºC, con presión de nitrógeno.

La suspensión liposomal obtenida entonces, "con una concentración" de 1,59 mg/ml se mezcla volumen a volumen con una disolución de Tat concentrada a 200 \mug/ml en tampón TRIS 100 mmol/l, NaCl 200 mmol/l, a pH 7,4.

Se prepara igualmente una composición que comprende solamente el antígeno TAT, sin adyuvantes.

Se obtienen así dosis de 200 \mul, cuyas composiciones son las siguientes:

1): 20 \mug de TAT

2): 20 \mug de TAT y 159 \mug de etil FC.

1.2. Inmunización

Se dispone de 2 grupos de 6 ratones BALB/c, hembras, de 8 semanas de edad, a los que se inyecta una de las composiciones preparadas en el párrafo 1.1, por vía subcutánea, a razón de una dosis de 200 \mul por ratón; se realizan las inyecciones a J0 y a J21.

Se extraen muestras sanguíneas del seno retro-orbital a J14 para la apreciación de la respuesta primaria y a J35 para la respuesta secundaria. La determinación de los índices IgG1 e IgG2, específicos, se efectúa gracias a los análisis ELISA estandarizados.

Se sacrifican los ratones de J37; se les extrae el bazo y se aíslan los esplenocitos.

Los resultados obtenidos en lo que se refiere a las respuestas humorales, se recogen en la tabla a continuación, donde se expresan los índices IgG en unidades arbitrarias ELISA (log 10). Para cada grupo de ratones, el valor indicado es el valor medio geométrico de los valores obtenidos para cada uno de los ratones.

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Los resultados obtenidos muestran que las composiciones según la invención permiten obtener una respuesta humoral netamente superior a la obtenida en el caso en que se administra el antígeno solo.

Se observa que el efecto adyuvante está netamente marcado con respecto a la respuesta en IgG2a, lo que indica una respuesta inmunitaria más bien orientada hacia una respuesta de tipo Th1.

Para apreciar el efecto de las composiciones farmacéuticas según la invención sobre la respuesta celular, se efectúan recuentos de células esplénicas capaces de producir interferón \gamma por un análisis ELISPOT. Este análisis se realiza a la vez sobre células frescas y sobre células reestimuladas.

Para la realización del análisis, se cultivan células esplénicas en las placas de cultivo celular, a razón de 200.000 células por pozo, en presencia bien de medio solo bien de antígeno TAT recombinante. Después de 16 horas de cultivo, se revela el ELISPOT, es decir, que se cuenta el número de manchas que corresponden a las células que segregan el interferón \gamma. Los resultados obtenidos se recogen en las tablas más adelante; los valores indicados son los valores medios (por grupo de ratones), las diferencias calculadas para cada ratón entre el número de manchas contadas por millón de células en los pozos que tienen TAT recombinante y el número de manchas contadas por millón de células en los pozos que no tienen más que el medio. La tabla a continuación resume los resultados obtenidos en células frescas.

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La tabla a continuación resume los resultados obtenidos en células reestimuladas por TAT recombinante en presencia de IL2.

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Estos resultados demuestran el efecto positivo obtenido utilizando una composición farmacéutica según la presente invención, con la estimulación de las células CD4+.

2. Composiciones vacunales que tienen como antígeno glicoproteína gB de Citomegalovirus 2.1. Preparación de las composiciones

Se preparan composiciones vacunales que comprenden como antígeno vacunal una proteína recombinante procedente de una glicoproteína de sobre de la cepa Towne del Citomegalovirus (CMV) denominada gB, cuyas secuencias de nucleótidos y proteínas se describen en la patente de EE.UU. 5.834.307. Esta proteína recombinante se produce por una línea CHO recombinante transinfectada por un plásmido denominado pPRgB27clv4 que contiene un gen modificado de la gB. En efecto, para facilitar la producción de esta proteína recombinante por la línea CHO se ha modificado previamente el gen de la gB suprimiendo la parte del gen que codifica la región transmembranaria de la proteína gB, que corresponde a la secuencia de aminoácidos comprendidos entre la Valina 677 y la Arginina 752 e introduciendo 3 mutaciones puntuales para que haya sido suprimido el sitio de escisión que existe en la gB nativa. En definitiva, la proteína recombinante producida por la línea CHO recombinante corresponde a una proteína gB troncada desprovista del sitio de escisión y de la región transmembranaria denominada gBdTM.

La construcción del plásmido pPRgB27clv4 y la producción de la proteína gB truncada (gBdTM) por la línea CHO recombinante, se describen en la patente de EE.UU. 6.100.064. La purificación de la proteína gB truncada se realiza en columna cromatográfica de inmunoafinidad utilizando anticuerpos monoclonales 15D8 descritos por Rasmussen L et al. (J. Virol. (1.985) 55: 274-280).

Se dispone de polvo de cloruro de 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (Etil DEFC) y cloruro de 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (Etil DOFC), suministrados por la Compañía AVANTI® POLAR LIPIDS Inc. Para cada uno de los productos se efectúan las operaciones siguientes:

Se solubilizan 5 mg de polvo en 5 ml de cloroformo/metanol 4:1 (vol/vol). Se seca la disolución en un matraz de vidrio con ayuda de un evaporador rotatorio de manera que se deje una película lipídica en las paredes del matraz. Se seca otra vez esta película a alto vacío para eliminar cualquier traza de disolvente residual, después se recoge en 2,5 ml de agua, a 60ºC, para una concentración final de 2 mg/ml. La suspensión liposomal resultante se homogeneiza por agitación vorticial 10 minutos, se somete a ultrasonidos en un baño de ultrasonidos 5 minutos, después se extruye con ayuda de un extrusor Lipex (Northern Lipids Inc.,Vancouver, CA) termostatizado a 50ºC, en cinco pases a través de una membrana de policarbonato de 0,2 \mum de porosidad.

Se prepara igualmente una formulación que comprende el etil FC en emulsión.

Para ello, se solubilizan en un matraz de vidrio 25 mg de cloruro de 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (Etil DOFC-Avanti Polar Lipids) con ayuda de 10 ml de cloroformo/metanol 4:1 (vol/vol). Se seca la disolución obtenida con ayuda de un evaporador rotatorio de manera que se deje una película lipídica en las paredes del matraz. Esta película se seca a continuación a alto vacío para eliminar cualquier traza de disolvente residual.

En un vaso de precipitados, se pesan 375 mg de Tween® 80 vegetal suministrado por la Compañía Merck y se le añaden 29,29 g de agua, se agita hasta la completa disolución del tensioactivo.

Después, se recoge la película lipídica obtenida en la etapa precedente por esta disolución de Tween® 80.

A esta suspensión se añaden 1.475 mg de escualeno (Fluka) y se homogeneiza la emulsión obtenida en Ultraturrax [(838-995 rad/s) 8.000-9.500 rpm], después en el Microfluidizador M110 (Microfluidics, Newton MA.), 20 pases a 414 kPa (60 psi).

La concentración final en escualeno de esta emulsión es de 5%.

Se preparan las dosis de inmunización mezclando las formulaciones adyuvantes descritas anteriormente o de agua, a una disolución acuosa patrón de antígeno a 160 \mug/ml de proteína gB y tampón PBS, para obtener las dosis de 50 \mul con las siguientes composiciones:

1): 2 \mug de gB

2): 2 \mug de gB y 50 \mug de etil DOFC,

3): 2 \mug de gB y 50 \mug de etil DEFC,

4): 2 \mug de gB, 50 \mug de etil DOFC, 1,25 mg de escualeno y 0,3 mg de Tween® 80.

2.2. Inmunización

Se dispone de 4 grupos de 8 ratones no consanguíneos OF1, hembras, de 8 semanas de edad, a los que se inyecta una de las composiciones preparadas en el párrafo 2.1, por vía subcutánea, a razón de una dosis de 50 \mul por ratón; se realizan las inyecciones de J0 y de J21.

Se extraen las muestras sanguíneas del seno retro-orbital de J20 para la apreciación de la respuesta primaria y de J34 para la respuesta secundaria. La determinación del índice IgG1 e IgG2a, específicos, se efectúa gracias a los análisis ELISA estandarizados.

Se sacrifican los ratones de J37; se extrae su bazo y se aíslan los esplenocitos, que se estimulan o no con la proteína gB recombinante.

Se efectúa entonces una determinación por análisis ELISA de la concentración en citocinas (IL5, IFN-\gamma y TNF-\alpha) en los sobrenadantes de células esplénicas estimuladas durante 5 días con la proteína gB, así como en el sobrenadante de células no estimuladas para deducir por comparación la producción específica de citocinas.

Los resultados obtenidos en lo que se refiere a las respuestas humorales se recogen en la tabla a continuación, donde se expresan los índices IgG en unidades arbitrarias ELISA (log 10).

Para cada grupo de ratones, el valor indicado es el valor de la media geométrica de los valores obtenidos para cada uno de los ratones.

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Los resultados para las citocinas se reproducen en la tabla a continuación; los valores indicados son para cada citocina, la diferencia en pg/ml entre la media de las cantidades de citocinas medidas para las células reestimuladas por la proteína gB y la media de las cantidades de citocinas medidas para las células cultivadas en el medio solo (considerado como el ruido de fondo del análisis); se puede considerar pues que las cantidades indicadas son las cantidades producidas específicamente en respuesta a la estimulación por la proteína gB.

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El conjunto de los resultados producidos en este análisis demuestra el buen efecto adyuvante de los ésteres fosfóricos de fosfatidilcolina que tienen una gran capacidad para aumentar la respuesta inmunitaria de tipo Th1 (aumento de los IgG2a y del Interferón \gamma), sin inhibir sin embargo la respuesta de tipo Th2 ya inducida por el antígeno.

3. Composiciones vacunales administradas por vía intradérmica 3.1. Preparación de las composiciones

Se dispone de polvo de cloruro de 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (Etil DOFC) suministrado por la Compañía AVANTI® POLAR LIPIDS Inc del que se solubilizan 5 mg en 10 ml de cloroformo/metanol 4:1 (vol/vol). Se seca la disolución obtenida en un matraz de vidrio con ayuda de un evaporador rotatorio de manera que quede una película lipídica sobre las paredes del matraz. Se seca otra vez esta película a alto vacío para eliminar cualquier traza de disolvente residual, después se recoge en 2,5 ml de agua, a 60ºC, para una concentración final de 2 mg/ml. La suspensión liposomal resultante se homogeneiza por agitación vorticial 10 minutos, se somete a ultrasonidos en un baño de ultrasonidos 5 minutos, después se extruye con ayuda de un extrusor Lipex (Northern Lipids inc, Vancouver, CA), termostatizado a 50ºC, en un pase por membrana de policarbonato de 0,8 \mum, después un pase por membrana de policarbonato de 0,4 \mum y por último cinco pases a través de una membrana de policarbonato de 0,2 \mum de
porosidad.

Se dispone igualmente de una disolución patrón de antígeno constituida por la proteína gB obtenida de la manera descrita en el ejemplo precedente, a una concentración de 160 \mug/ml.

Se mezcla la disolución de antígeno con la suspensión de adjuvante a 2 mg/ml en las proporciones calculadas para obtener las vacunas experimentales, que tienen por dosis de 50 \mul, las composiciones siguientes:

1): 2 \mug de gB,

2): 2 \mug de gB y 50 \mug de etil DOFC

3): 0,2 \mug de gB,

4): 0,2 \mug de gB y 50 \mug de etil DOFC.

3.2. Inmunización

Se dispone de 4 grupos de 8 ratones OF1, de 8 semanas.

Cada grupo de ratones recibe una de las 4 formulaciones indicadas anteriormente, por vía intradérmica.

Las inmunizaciones se realizan a J0 y a J20.

Se extraen muestras sanguíneas del seno retro-orbital a J20 antes de la 2ª inmunización para la apreciación de la respuesta primaria y a J35 para la respuesta secundaria.

La determinación del índice IgG1 e IgG2a, específicos, se efectúa gracias a los análisis ELISA estandarizados.

Se sacrifican los ratones de J37; se extraen sus bazos y se aíslan los esplenocitos, que se estimulan o no con la proteína gB recombinante.

Se efectúa entonces una determinación por análisis ELISA de la concentración en citocinas (IL5, IFN-\gamma y TNF-\alpha) en el sobrenadante de células esplénicas estimuladas durante 5 días con la proteína gB, así como en el sobrenadante de células no estimuladas para deducir por comparación la producción específica de citocina.

Para cada grupo de ratones, el valor indicado es el valor de la media geométrica de los valores obtenidos para cada ratón.

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Los resultados para las citocinas se reproducen en la tabla a continuación; los valores indicados son para cada citocina, la diferencia en pg/ml entre la media de las cantidades de citocinas medidas para las células reestimuladas por la proteína gB y la media de las cantidades de citocinas medidas para las células cultivadas en medio solo (considerado como el ruido de fondo del análisis); se puede considerar pues que las cantidades indicadas son las cantidades producidas específicamente en respuesta a la estimulación por la proteína gB.

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En este análisis, se ve que el adyuvante según la invención es eficaz por vía intradérmica y que permite o aumentar la respuesta inmunitaria para una misma cantidad de antígenos o reducir la cantidad de antígenos presentes en la dosis inyectada. Aquí, el efecto adjuvante es visible a la vez en comparación con la respuesta del tipo Th2 (IgG1) pero también y de la misma manera muy espectacular, en comparación con la respuesta del tipo Th1 (IgG2a, Interferón y).

4. Composiciones vacunales con un antígeno de SARS 4.1. Preparación de las composiciones

Se prepara una suspensión viral de un coronavirus humano inactivado, en el caso del virus de SARS (Síndrome Respiratorio Agudo Severo) obtenido por cultivo sobre línea celular, después inactivación ; la suspensión utilizada está a una concentración de 7,56 log CCID50 antes de inactivación; se diluye a 1/10 para obtener una suspensión con una concentración de 6,56 log CCID50.

Se dispone de polvo de cloruro de 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (Etil DOFC) suministrado por la Compañía AVANTI® POLAR LIPIDS Inc del que se solubilizan 30 mg en 10 ml de cloroformo/metanol 4:1 (vol/vol). Se seca la disolución obtenida en un matraz de vidrio con ayuda de un evaporador rotatorio de manera que quede una película lipídica sobre las paredes del matraz. Se seca otra vez esta película a alto vacío para eliminar cualquier traza de disolvente residual, después se recoge en 5 ml de agua a 60ºC para una concentración final de 6 mg/ml. La suspensión liposomal resultante se homogeneiza por agitación vorticial 10 minutos, se somete a ultrasonidos en un baño de ultrasonidos, 5 minutos, después se extruye con ayuda de un extrusor Lipex (Northern Lipids Inc.,Vancouver, CA) termostatizado a 50ºC, en cinco pases a través de una membrana de policarbonato de 0,2 \mum de porosidad.

Se preparan dosis de inmunización de 200 \mul, efectuándose las mezclas indicadas en la tabla a continuación:

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4.2. Inmunización

Se dispone de 4 grupos de 8 ratones BALB/c, que se inmunizan a 3 semanas de intervalo con una de las formulaciones indicadas a continuación; las inyecciones se realizan por vía subcutánea; las dosis inyectadas son cada vez de 200 \mul.

Las muestras sanguíneas se extraen 2 semanas antes de cada inyección para la evaluación de respuestas anticuerpo anti-virus SARS entero (inactivado) por dosis ELISA, a J14 para la respuesta primaria y a J33 para la respuesta secundaria.

Se extraen las células esplénicas a J33.

Se evalúa la respuesta celular específica del SARS, gracias a una dosis ELISPOT de células secretoras de Interferón-\gamma bien ex vivo, bien después de la estimulación in vitro con el virus entero inactivado durante 7 días. En cada caso, las células esplénicas (ex vivo o reestimuladas in vitro) se incuban 16 horas, bien con virus entero inactivado, bien con los péptidos 18-meros combinados, cuyas secuencias están superpuestas (sobre 10 aminoácidos) y corresponden a diferentes antígenos del virus de SARS .

Por otra parte, se aprecia la polarización de la respuesta celular T helper inducida, gracias a una dosis ELISA de citocinas segregadas por las células esplénicas estimuladas por el virus inactivado entero o por una combinación de péptidos.

Los resultados obtenidos en lo que se refiere a la respuesta humoral se reagrupan en la tabla a continuación; se expresan en log 10 de unidades arbitrarias del análisis ELISA y representan las medias de los valores geométricos de cada grupo de ratones.

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Estos resultados demuestran que el adyuvante según la invención permite incrementar la respuesta humoral contra un antígeno viral.

En lo que se refiere a la respuesta celular, los resultados obtenidos durante el recuento de ELISPOT realizado sobre células frescas (ex vivo), estimuladas por el virus entero se representan en la tabla a continuación, que indica la media geométrica para cada grupo de ratones.

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En lo que se refiere a los resultados obtenidos en respuesta a combinaciones de péptidos, las respuestas varían según las combinaciones de péptidos utilizadas.

Los resultados en ELISPOT obtenidos después de la reestimulación con el virus SARS inactivado han demostrado igualmente que la producción de interferón \gamma había aumentado en presencia de etil DOFC, como respuesta a ciertos péptidos utilizados.

Estos resultados demuestran que el adyuvante según la invención permite incrementar la respuesta celular T CD4+ contra un antígeno viral.

En lo que se refiere a las dosis de citocinas IFN-\gamma (citocina Th1) e IL-5 (citocina Th2) por ELISA, se ha observado que después de la estimulación por el virus inactivado, la producción de IFN-\gamma había aumentado mucho para los ratones que habían recibido además antígeno de etil DOFC; por el contrario, la producción de IL-5 no se había modificado netamente.

Los resultados obtenidos se recogen en la tabla a continuación: se expresan en pg/ml y representan las medias geométricas de los grupos de ratones.

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Estos resultados demuestran que el adyuvante según la invención permite incrementar la respuesta celular de tipo Th1.

Así, el conjunto de estos resultados demuestra que el adyuvante según la invención permite incrementar significativamente la respuesta inmunitaria inducida durante la administración de un antígeno constituido por un virus inactivado, a la vez celular (Th1) y humoral.

Claims

1. Composición farmacéutica que comprende al menos un antígeno vacunal distinto de un codificador de ADN, caracterizada porque comprende además al menos un derivado de éster fosfórico de fosfatidilcolina, con la estructura:

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en la que:

-: R_{1} es un alquilo inferior, que tiene a lo sumo 5 átomos de carbono,

2. Composición según la reivindicación precedente, caracterizada porque R_{1} representa el radical etilo.

3. Composición según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque R_{2} y R_{3} se eligen entre los radicales que proceden de los ácidos grasos siguientes: ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido oleico.

4. Composición según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque R_{2} y R_{3} son los dos idénticos y representan el radical de ácido oleico.

5. Composición según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque comprende además una emulsión.

6. Utilización de un derivado de fosfatidilcolina con la estructura:

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en la que:

-: R_{1} es un alquilo inferior, que tiene a lo sumo 5 átomos de carbono,

-: R_{2} y R_{3} son iguales o diferentes y cada uno puede representar cadenas hidrocarbonadas lineales que tienen de 13 a 21 átomos de carbono, para la preparación de un adjuvante vacunal.

7. Utilización según la reivindicación 6, caracterizada porque R_{1} representa el radical etilo.

8. Utilización según una de las reivindicaciones 6 ó 7, caracterizada porque R_{2} y R_{3} se eligen entre los radicales que proceden de los ácidos grasos siguientes: ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido oleico.

9. Utilización según una de las reivindicaciones 6 a 8, caracterizada porque R_{2} y R_{3} son los 2 idénticos y cada uno representa el radical del ácido oleico.