MXPA06006958A - Composicion inmunoestimuladora que comprende al menos un receptor y similar a toll o agonista de receptor 8 similar a toll y un agonista de receptor 4 similar a toll - Google Patents

Abstract

La invención se relaciona a una composición inmunoestimuladora que comprende por lo menos un receptor 7 similar a Toll o agonista de receptor 8 similar a Toll y un agonista de receptor 4 similar a Toll. La composición del invento puede también comprender un antígeno de vacuna.

Description

COMPOSICIÓN INMUNOESTIMULADORA QUE COMPRENDE AL MENOS UN RECEPTOR 7 SIMILAR A TOLL O AGONISTA DE RECEPTOR 8 SIMILAR A TOLL Y UN AGONISTA DE RECEPTOR 4 SIMILAR A TOLL La invención se relaciona al campo de composiciones inmunoestimulantes que comprenden por lo menos un agonista de receptor 7 similar a Toll o del receptor 8 similar a Toll que están presentes en células que presentan antigeno. Más particularmente la invención se relaciona a composiciones que comprenden adicionalmente un agonista de receptor 4 similar a Toll, y en particular tales composiciones que comprenden adicionalmente un antigeno de vacuna. Es conocido en la técnica previa querer incrementar u orientar la respuesta inmune inducida por los antigenos presentes en una vacuna por medio de adyuvantes que se seleccionan de la categoría de inmunoestimulantes. Esto puede ser deseable debido a que el antigeno, cuando se administra solo, no es suficientemente inmunogénico debido en particular de su grado muy alto de pureza, o debido a que se desea reducir la cantidad de antigenos presentes en la vacuna o el número de refuerzos que sean hechos, o de otra manera debido a que se desea extender el periodo de protección conferido por la vacuna. Algunas veces, el objetivo es modificar cualitativamente, antes que cuantitativamente, la respuesta inducida . Numerosas moléculas ya han sido descritas en relación a sus propiedades adyuvantes; sin embargo, los adyuvantes principales actualmente comercializados en vacunas son adyuvantes basados sobre aluminio o emulsiones. Asi, entre la técnica previa conocida, se puede mencionar en particular la patente EP636031, la cual divulga el uso de una ÍH-imidazol [4, 5c] quinolina-4-amina como adyuvante de vacuna hacia una glicoproteina del virus de Herpes Simple 2 en conejillos de indias. En este documento, la vacuna administrada no hace posible prevenir completamente el desarrollo de la enfermedad durante una estimulación de los animales con el virus HSV2, pero ésta hace posible reducir las lesiones, la excreción vaginal del virus y el fenómeno de recurrencia de la enfermedad. De acuerdo a la publicación intitulada "Adjuvant activities of Inmune Response Modifier R848 : Comparison with CpG ODN", por Vasilakos y colaboradores en Cellular Immunology 204, 64-74 (2000) , el derivado de imidazoquinolina R-848 se describe por ser un adyuvante del tipo TH1, en una prueba que utiliza, como antigeno, ovalbúmina administrada a los ratones . Esta publicación también describe otro tipo de adyuvante de vacuna que consiste de oligonucleótidos que comprenden un dinucleótido CG, en el que la citosina no está metilada. En otro documento de la técnica previa que consiste de la publicación intitulada "Human TLR7 o TLR8 independently confer responsiveness to the antiviral compound R-848" por Jurk y colaboradores, in Nature Immnulogy, June 2002, volumen 3 No. 6, p 499, se establece que los receptores similares a Toll desempeñan una función importante en las respuestas inmunes a patógenos, el receptor 9 similar a Toll que se activa mediante el DNA Bacteriano que tiene unidades CpG no metiladas, puesto que el R-848 activa las células por la via del receptor 7 similar a Toll y el receptor 8 similar a Toll. En la publicación intitulada "Novel synthetic LPS receptor agonists boost systemic and mucosal antibody responses in mice", por Przetak y colaboradores, in Vaccine 21 (2003) páginas 961-970, se describen compuestos químicos que tienen cadenas de ácidos grasos, en los que los compuestos carecen de anillos de azúcar pero que tienen una actividad adyuvante hacia los antigenos formados por la toxina de tétanos o la ovalbúmina. Estos compuestos son conocidos para activar un mecanismo de acción enlazada al receptor 4 similar a Toll. Todos estos compuestos son conocidos individualmente por tener propiedades inmunoestimulantes en varios grados de acuerdo a las condiciones para la administración; sin embargo, permanece deseable que sea capaz de tener una composición lo cual hace posible potenciar estas propiedades inmunoestimulantes, en particular, en el caso de la administración de un antigeno de vacuna. Para lograr este objetivor el sujeto de la presente invención es una composición inmunoestimulante que comprende por lo menos un agonista de receptor 7 similar a Toll o del receptor 8 similar a Toll, que adicionalmente comprende un agonista de receptor 4 similar a Toll. Por consiguiente, se obtiene la potenciación de la respuesta inmunoestimulante. De acuerdo a una modalidad particular de la invención, el agonista de receptor 7 similar a Toll o del receptor 8 similar a Toll es un compuesto diferente del agonista de receptor 4 similar a Toll. De acuerdo a una modalidad particular, la composición inmunoestimulante adicionalmente comprende por lo menos un antigeno de vacuna. Por consiguiente, la respuesta inmune inducida contra el antigeno es potenciada. De acuerdo a una modalidad particular - de la invención, el agonista de receptor 7 similar a Toll o del receptor 8 similar a Toll es un derivado de •imidazoquinolineamina. Tal agonista se puede obtener mediante la sintesis quimica pura y por lo tanto tiene todas las garantías de capacidad reproductora y seguridad necesarias para el uso farmacéutico. De acuerdo a una modalidad particular, el derivado de imidazoquinolinamina es 4-amino-2-etoximetil-a-a-dimetil- 1-H-imidazo [4, 5c] quinolina~l-etanol . De acuerdo a una modalidad, el agonista del receptor 4 similar a Toll es un compuesto descrito en la solicitud WO0044758, y en particular ER804057; tal compuesto, obtenido mediante la sintesis quimica pura, también tiene todas las garantías de capacidad de reproducción y seguridad necesarias para uso farmacéutico. Otras ventajas numerosas de la presente invención emergerán en vista de la descripción detallada que sigue, con referencia a las figuras 1 a la 4 las cuales ilustran los resultados obtenidos en el ejemplo 5. La presente invención se relaciona a una composición inmunoestimulante; la composición inmunoestimulante de expresión se entiende que significar una composición capaz de inducir la maduración o la activación de las células del sistema inmune, tal como las células dendriticas, que luego conducen a la expresión, sobre las células, o ciertos marcadores (CD25, CD80, CD83 y los similares) que pueden ser detectados, o a la secreción de citoquinas (IL6, I112p70, TNF-a, y las similares) que se pueden analizar. De acuerdo a una modalidad particular, la composición inmunoestimulante de la invención comprende por lo menos un antigeno de vacuna. El antigeno de vacuna de expresión se entiende que significa un antigeno capaz de inducir una respuesta al sistema inmune cuando éste se administra a humanos o a un animal. Esta respuesta del sistema inmune se puede manifestar mediante una producción de anticuerpos o mediante una activación de ciertas células, en particular células que presentan antigenos (por ejemplo: células dendriticas) , limfocitos T y limfocitos B. La composición de vacuna puede ser una composición para uso profiláctico o para uso terapéutico, o ambos. Se puede administrar mediante cualquiera de las rutas normalmente utilizadas o recomendadas para las vacunas: ruta parenteral, ruta mucosal, y se puede proporcionar en varias formas: liquido inyectable o pulverizable, formulación deshidratada por congelación o deshidratada por roció o deshidratada por aire, y las similares. Se puede administrar por medio de una jeringa o por medio de un inyector libre de aguja para inyección intramuscular, subcutánea o intradérmica. También se puede administrar por medio de un nebulizador capaz de suministrar un polvo seco o un roclo liquido en el nivel de las membranas mucosas, si son nasales, pulmonares, vaginales o rectales. Los antigenos de vacuna utilizados en las composiciones de vacuna de acuerdo a la presente invención son antigenos "directos", que es decir que éste no es DNA que codifique estos antigenos, sino los antigenos por si mismos; este puede ser un microbio completo o solamente una porción de este microbio; por consiguiente, entre los antigenos normalmente utilizados en vacunas, se puede mencionar en particular: - polisacáridos, si son solos o conjugados con elementos portadores, tal como proteínas portadoras, microbios completos vivos atenuados, microbios inactivados, - péptidos y proteínas recombinantes, glicoproteinas, glicolipidos, lipopéptidos, péptidos sintéticos, microbios de interrupción en el caso de vacunas llamadas vacunas "divididas" Estos antigenos son antigenos que se utilizan o son capaces de ser utilizados para el tratamiento o prevención de varias enfermedades tales como, por ejemplo: difteria, tétanos, polio, rabia, tosferina, hepatitis A, B, C, fiebre amarilla, fiebre tifoidea, varicela, sarampión, paperas, rubéola, encefalitis Japonesa, meningitis, infecciones neumococales, infecciones de rotavirus, SIDA, canceres, tuberculosis, enfermedad de Lyme, infecciones RSV, herpes, condiciones bacterianas causadas por la Chlamydia, gonorrea Neisseria, Streptococus pneumoniae, Moraxella catarrhalis o influenza Haemophilus tipo B, malaria, leishmaniasis, listeriosis, y las similares. La composición de vacuna de acuerdo a la invención puede ser una composición propuesta para inmunización contra un patógeno o cáncer solo, que es decir que comprende uno o más antigenos de un patógeno o cáncer solo, o puede ser una composición propuesta para inmunización contra varios patógenos o canceres (la referencia se hace a una combinación de vacuna) . Para los propósitos de la presente invención, el agonista de expresión de los receptores 7 similar a Toll y 8 similar a Toll se entiende que significa un compuesto capaz de enlazar a cualquiera de estos receptores o a ambos y de accionar la cascada de señalización asociada con estos receptores, en particular un compuesto capaz de activar la translocación de NF-?B en células transfectadas con cDNA que codifica cualquiera de estos receptores, o ambos. Entre los agonistas adecuados para los propósitos de la invención, se puede mencionar en particular las imidazoquinolineaminas sustituidas, y en particular aquellas descritas en la patente norteamericana No. 5389640. Particularmente se obtuvieron buenos resultados con el 4-amino-2-etoxi-metil-a, a-dimetil-1-H-imidazo [4, 5c] quinolina-1-etano.1, también llamado R-848, del cual se indica un método de preparación en los ejemplos 99 y 101 de la patente norteamericana 5389640. Para los propósitos de la presente invención, el agonista de expresión del receptor 4 similar a Toll se entiende que significa un compuesto capaz de enlazarse a este receptor y de accionar la cascada de señalización asociada, en particular un compuesto capaz de activar la translocación de NF-?B en las células transferidas con cDNA que codifican este receptor. Entre los agonistas adecuados para los propósitos de la invención, se pueden mencionar los LPSs de las bacterias Gram-negativas, o, más aproximadamente, derivados monofosforilados de lipidos A de estos LPSs, y en particular 3D-MPL o lipido A monofosforilado desacilado en la posición 3 que se describe por RIBI en la patente inglesa No. 2211502 y en la USP4436727 y su nueva publicación 4912094. Los análogos sintéticos de estos productos, tales como aquellos descritos en CORIXA en la solicitud WO98/50399, y en particular RC-529, o alternativamente aquellos descritos en la solicitud W002/12258 también son adecuados. Del mismo modo, los compuestos que son los objetivos de las solicitudes WO95/14026, WO00/00462, WO01/46126 y WO01/46127 bajo el nombre de OM Pharma pueden ser adecuados. Preferentemente, se utilizan los productos puramente sintéticos, libres del anillo de sacáridos, tal como aquellos descritos en la patente USP 629073 bajo el nombre de EISAI CO, y en particular el producto llamado ER 112066, o más preferentemente todavía el producto llamado ER804057. Este producto es una sal de disodio de (IR, 6R, 22R, 27R) -1, 27-diheptil-l, 27-bisdodecanoil-9, 19-dihidroxi-9, 19-dióxido-14-oxo-6, 22-bis [ (1, 3-dioxotetradecil) amino] -4,8, 10, 18, 20, 24-hexaoxa-13, 15-diaza-9, 19-difosfoheptacosan que se puede obtener de acuerdo al método de preparación indicado en la solicitud de patente WO0044758, para el compuesto No. 50, es decir, el método descrito en la página 32, proporcionó que el cloruro de miristoil se reemplaza previamente con ácido ß-queetomiristico en la presencia de EDC (que es decir 1- (3-dimetilaminopropil) -3-etilcarbodiimida hidrocloruro) en la etapa que conduce del producto 39 al producto 41 descrito en la página 28 de la solicitud de patente. Cada uno de estos agonistas, ya sea el agonista de receptor 4 similar a Toll o el agonista de los receptores 7 y 8 similar a Toll, se conocen por tener propiedades inmunoestimulantes . La importancia de la presente invención es que la respuesta observada en el contexto de la presente invención es una respuesta hecha más potente. Mientras que la obtención de tal potenciación, para una persona no familiar con el campo de la inmunología, inicialmente se presenta como que es obvio, al contrario se debe considerar como sorprendente en el campo particular de la invención; es decir, los experimentos han mostrado que cuando dos o más inmunoestimulantes están presentes en la misma composición, es frecuente para el efecto producido por uno de ellos que sea inhibidor hacia el (os) otro(s) inmunoestimulante (s) presente (s), o por lo menos cuando un producto ejerce un efecto inmunoestimulante, es difícil incrementar adicionalmente la respuesta ya obtenida. En las pruebas de inmunoestimulación in vitro, se observa una sinergia de los efectos de los inmunoestimulantes llevados en contacto con las células del sistema inmune que induce un nivel de activación de las células el cual es completamente excepcional, que podria no ser anticipado del nivel de activación inducido por cada uno de " los inmunoestimulantes utilizados separadamente. Del mismo modo, la sinergia observada en la respuesta obtenida cuando la composición inmunoestimulante comprende antígenos de vacuna, en particular en cuanto el número de sujetos de respuesta con un muy buen nivel de respuesta, es completamente excepcional, y no podria en absoluto ser deducida de las respuestas obtenidas con cada uno de los adyuvantes tomados en aislamiento. Los resultados obtenidos utilizando los agonistas de estos receptores 7, 8 y 4 similar a Toll son todos los más sorprendentes puesto que las pruebas llevadas a cabo al combinar varios agonistas de otros receptores no han conducido a ninguna potenciación de los efectos observados por cada uno de los agonistas utilizados en el aislamiento. Los agonistas de los receptores 4, 7 y 8 similar a Toll de la presente invención tienen la propiedad para adyuvar los antigenos de vacuna con lo que ellos se administran, lo que significa en general que son capaces de incrementar o modificar la respuesta del sistema inmune del organismo por lo cual se administra la composición de vacuna, comparada con la respuesta que seria obtenida en su ausencia. En particular, esto puede involucrar un incremento en la respuesta humoral, o en la respuesta celular, o en ambas. La acción también no puede ser un incremento en la respuesta, sino una orientación diferente de la respuesta inducida: por ejemplo, la orientación hacia una respuesta celular antes que una respuesta humoral, la producción de ciertas citoquinas antes que otra, la producción de ciertos tipos de subtipos de anticuerpos antes que otra estimulación de ciertas células antes que otras, y las similares. La acción de un adyuvante también puede consistir en incrementar la duración de la respuesta inmune a través del tiempo. También esto puede involucrar permitir la reducción en el número de administraciones necesarias para obtener la protección del individuo inmunizado, o la reducción en la cantidad de antigenos los cuales están contenidos en la dosis administrada. En el caso de la presente invención, la sinergia observada se manifiesta por si misma esencialmente por una disminución en la dispersión de los resultados obtenidos, en particular en cuanto a la respuesta Thl . La acción adyuvante de los agonistas de acuerdo a la invención se puede obtener ya sea cuando se combinan con el antigeno o con los antigenos de la composición de vacuna durante su administración, es decir, cuando están presentes directamente en la composición de vacuna, o cuando separadamente del antigeno o antigenos para lo cual se desea modificar la inmunogenecidad. Sin embargo es preferible utilizarlos en la misma composición de vacuna como el antigeno o los antigenos que van hacer administrados. Los ejemplos que siguen ilustran modalidades particulares de la presente invención. 1. Preparación de una suspensión de extracción de agonistas de los receptores 7 y 8 similares a Toll. Hay disponibles dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) obtenida de Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL) , y 4-amino-2-etoximetil-a-a-dimetil-1-H-imidazo [4, 5c] -quinolina-1-etanol (R-848) proporcionado por la compañía In Vivogen. Estos compuestos se proporcionan en forma pulverizada. 342 µg de DPPC (0.46 µmol), suplementado con 150 µg de R-848 (0.51 µmol), se disuelven en 984 µl de una mezcla de cloroformo/metanol 4:1 (vol/vol) . La solución se seca en un matraz de vidrio de fondo redondo con la ayuda de un evaporador rotatorio a fin de dejar una película de lipidos homogénea sobre las paredes del matraz de fondo redondo. Está película se seca adicionalmente bajo un vacio alto a fin de remover cualquiera de las pequeñísimas cantidades del solvente residual, y luego se llevó arriba en 3 ml de agua a 60°C. La suspensión liposomal resultante se homogenizó mediante la formación de un vórtice, la sonicación en un baño de ultrasonido y luego se extruyó secuencialmente con la ayuda de un extrusor Lipex termoajustado a 50°C, en un paso a través de una de una membrana de policarbonato que tiene una porosidad de 0.8 µm, después por un paso a través de una membrana que tiene una porosidad de 0.4 µm y finalmente un paso a través de una membrana que tiene una porosidad de 0.2 µm. Los liposomas DPPC/R-848 (0.9:1 mol/mol) asi se obtienen en agua en 114 µg/ml de DPPC y 50 µl/ml de R-848. 2. Preparación de una suspensión de extracto de agonistas del receptor 4 similar a Toll. Hay disponibles dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) obtenida de Avanti Polar Lipid's (Alabaster, AL) y ER804057 proporcionados por la compañía Eisai. Estos compuestos se proporcionan en forma pulverizada. 273 µg de DPPC (0.37 µmol), suplementada con 150 µg de ER804057 (0.092 µmol), se disuelven en 760 µl de una mezcla de cloroformo/metanol 4:1 (vol/vol). La solución se seca en un matraz de vidrio de fondo redondo con la ayuda de un evaporador rotatorio a fin de dejar una película de lipidos homogénea sobre las paredes del matraz de fondo redondo. Esta película se seca adicionalmente bajo un vacio alto a fin de remover cualquiera de las pequeñísimas cantidades del solvente residual, y luego llevar arriba en 3 ml de agua a 60 °C. La suspensión liposomal resultante se homogeniza mediante la formación de un vórtice, la sonicación en un baño de ultrasonido y luego se extruyó secuencialmente con la ayuda de un extrusor Lipex termoajustado a 50°C, en un paso a través de una de una membrana de policarbonato que tiene una porosidad de 0.8 µm, después por un paso a través de ' una membrana que tiene una porosidad de 0.4 µm y finalmente un paso a través de una membrana que tiene una porosidad de 0.2 µm. Los liposomas DPPC/ER-804057 (4:1 mol/mol) asi se obtuvieron en agua en 91 µg/ml de DPPC y 50 µg/ml de ER-804057. 3. Preparación de una suspensión de extracción de agonistas del receptor 4 similar a Toll y agonistas de los receptores 7 y 8 similar a Toll. Hay disponibles dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) obtenida de Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL) y 4-amino-2-etoximetil-a-a-dimetil-1-H-imidazo [4, 5c] -quinolina-1-etanol (R-848) proporcionado por la compañía InVivogen, y ER804057 proporcionado por la compañía Eisai. Estos compuestos se proporcionan en forma pulverizada. 273 µg de DPPC (0.37 µmol), suplementada con 150 µg de TLA4 (0.092 µmol), y con 150 µl de R848 (0.51 µmol), se disuelven en 1.06 ml de una mezcla de cloroformo/metanol 4:1 (vol/vol) . La solución se seca en un matraz de vidrio de fondo redondo con la ayuda de un evaporador rotatorio a fin de dejar una película de lipidos homogénea sobre las paredes del matraz de fondo redondo. Esta película se seca adicionalmente bajo un vacio alto a fin de remover cualquiera de las pequeñísimas cantidades del solvente residual, y luego se lleva arriba de 3 ml de agua a 60°C. La suspensión liposomal resultante se homogeniza mediante la formación de un vórtice, la sonicación en un baño de ultrasonido y luego es extruido secuencialmente con la ayuda de un extrusor Lipex termoajustado a 50°C, en un paso a través de una de una membrana de policarbonato que tiene una porosidad de 0.8 µm, después por un paso a través de una membrana que tiene una porosidad de 0.4 µm y finalmente un paso a través de una membrana que tiene una porosidad de 0.2 µm. Los liposomas DPPC/ER804057/R-848 (4:1:5.5 mol/mol/mol) asi se obtuvieron en agua en 91 µg/ml de DPPC, y 50 µg/ml de ER804057 y 50 µg/ml de R-848. 4. Preparación de las composiciones de vacuna Las composiciones de vacuna- se preparan las cuales comprenden, como antigeno de vacuna, una proteina recombinante capaz de ser utilizada en una vacuna contra el SIDA; es la proteina TAT III B destoxificada que se obtiene mediante la expresión en la E. coli y la purificación mediante varias etapas cromatográficas, seguido por la inactivación quimica, como es descrito en la solicitud de patente W099/33346, donde se identifica bajo el término Tat carboximetilada . Las composiciones se preparan en la manera descrita anterior. Las suspensiones liposomales de acuerdo a los ejemplos 1 al 3 son volúmenes mezclados para el volumen (0.9 ml + 0.9 ml) con una solución Tat concentrada a 200 µg/ml en 100 mM en solución reguladora de Tris que contiene 200 mM de NaCl, pH 7.4, a fin de obtener las preparaciones (1.8 ml finales) cuya composición se indica enseguida en las que las cantidades de antigenos y del adyuvante se indican 200 µl por dosis . 1) Tat (20 µg) 2) Tat (20 µg) + ER804057/DPPC (5 µg/9,1 µg, que es 3.1 nmol/12.4 nmol) 3) Tat (20 µg) + ER804057/DPPC/R-848 (5 µg/9.1 µg/5 µg, que es 3.1 nmol/12.4 nmol/16.7 nmol) 4) Tat (20 µg) + R-848/DPPC (5 µg/11.4 µg, que es 16.7 nmol/15.5 nmol). 5. Prueba de inmunización en ratones.

Hay 4 grupos disponibles de 6 ratones hembras BALB/c de 8 semanas de edad por lo cual una de las composiciones preparadas en el ejemplo 4 es inyectada subcutáneamente en la proporción de una dosis de 200 µl por ratón; las inyecciones se realizan en DO y D21. Las muestras de sangre se recolectan en el seno retro-orbital en D14 para estimar la respuesta primaria y en D32 para la respuesta secundaria. La determinación del nivel del Igl e IgG2a especifico se lleva a cabo en virtud de las pruebas ELISA estándares. Los ratones se sacrifican en D37; su bazo se -remueve y los esplenocitos se aislan. Los resultados obtenidos en cuanto a las respuestas humorales se resumen en la tabla enseguida y en las figuras 1 a la 4, donde los niveles se expresan como unidades ELISA arbitrarias (log 10) . Para cada grupo de ratones, el valor indicado en la tabla es el titulo geométrico principal de los valores obtenidos para cada uno de los ratones.

La relación IgGl/IgG2a hace posible estimar la orientación de la respuesta inmune inducida. En realidad, una respuesta de tipo Thl se manifiesta en los ratones mediante una porción más alta de IgGla, mientras que una respuesta de tipo Th2 se manifiesta mediante una proporción más alta de IgGl. Por lo tanto se puede observar, en virtud de la composición de acuerdo a la invención, la respuesta se orienta hacia el tipo Thl mucho más fuerte que si cada uno de los inmunoestimulantes se utiliza individualmente. Las gráficas representadas en las figuras 1 a la 4 hacen posible visualizar las respuestas obtenidas para cada uno de los ratones, y por lo tanto estiman la dispersión mayor o menor de los resultados. El desempeño de la composición de acuerdo a la invención es particularmente notable en el nivel de la respuesta IgG2a obtenida después de la inyección del refuerzo; en realidad, mientras que los niveles de respuesta obtenidos con las composiciones que tienen un inmunoestimulante solo, si R-848 o ER804057, están sobre un promedio satisfactorio, se observa que los resultados están en estos casos relativamente dispersados; mientras que con la composición de acuerdo a la invención todos los ratones produjeron un nivel IgG2a. Este desempeño es muy importante en el campo de la vacunación donde siempre se desea proteger todos los sujetos vacunados, pero donde las variabilidades generalmente observadas entre los individuos no hacen posible asegurar el mismo beneficio a cada uno de los individuos que reciben la vacuna. Estos resultados, que se observan al presentar a la misma composición de vacuna un adyuvante que comprende tanto un agonista de receptor 4 similar a Toll como un agonista de los receptores 7 similar a Toll y 8 similar a Toll, todos son los más sorprendentes puesto que las pruebas llevadas a cabo al combinar un agonista de los receptores 7 similar a -Toll y 8 similar a Toll y un agonista de otro receptor también presente sobre las células que presente antigenos, hubieran echo esto- posible para mejorar las respuestas comparadas con las respuestas obtenidas utilizando, como adyuvante, cada uno de los compuestos separadamente. Para estimar el efecto de las composiciones farmacéuticas de acuerdo a la invención sobre la respuesta celular, las cuentas se llevan a cabo de las células de bazo capaces de producir ?-interferón mediante una prueba ELISPOT. Esta prueba se lleva a cabo tanto en células frescas como sobre células reestimuladas. Para llevar a cabo la prueba, las células del bazo se cultivan en placas de cultivo celular en la proporción de 200 000 células por cavidad, en la presencia ya sea del medio solo o del antigeno TAT recombinante. Después de 16 horas de cultivo, la ELISPOT se visualiza, es decir el número de manchas correspondientes a las células que secretan ?- interferón se cuentan. Los resultados obtenidos se resumen en las tablas enseguida; los valores indicados son los valores principales (por grupo de ratones) , de las .diferencias calculadas para cada ratón entre número de manchas contadas por millón de células en las cavidades que tienen el TAT recombinante y el número de manchas contadas por millón de células en las cavidades que tienen solamente el medio. La tabla enseguida resume los resultados obtenidos sobre las células frescas.

La tabla enseguida resume los resultados obtenidos sobre las células reestimuladas in vitro durante 7 dias, en la presencia de IL2, mediante una acumulación de péptidos de sobreposición recuperando completamente la secuencia de la proteina TAT.

Además, se lleva a cabo en paralelo a la medición, mediante una prueba ELISA de la secreción de las citoquinas IL5 y del ?-interferón en los sobrenadantes de cultivo que comprenden esplenocitos cultivados en la presencia o de otra manera del recombinante TAT durante 5 dias. Los resultados obtenidos, expresados en pe/ l, se resumen en la tabla enseguida.

Estos resultados muestran el efecto particularmente benéfico obtenido sobre la respuesta THl, en virtud de las composiciones de acuerdo a la presente invención. 6. Preparación de las suspensiones de liposoma para las pruebas de estimulación de las células humanas. Hay disponibles dipal itoilfosfatidilcolina (DPPC) obtenida de Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL) , y 4-amino-2-etoximetil-a-a-dimetil-1-H-imidazol [4, 5c] quinolina-1-etanol (R-848) proporcionado por la compañía InVivogen. Estos compuestos . se proporcionan en forma pulverizada. 9.92 mg de DPPC (13.5 µmol), suplementados con 1 mg de R-848 (3.38 µmol), se disuelven en 2 ml de una mezcla de cloroformo/metanol 4:1 (vol/vol). La solución se seca en un matraz de vidrio de fondo redondo con la ayuda de un evaporador rotatorio a fin de dejar una película de lípidos homogénea sobre las paredes de matraz de fondo redondo. Esta película se seca adicionalmente bajo un vacio alto a fin de remover cualquiera de las pequeñísimas cantidades del solvente residual, y luego se llevan arriba en 4 ml de agua a 60°C. La suspensión liposomal resultante se homogeniza mediante la formación de un vórtice, la sonicación en un baño de ultrasonido y luego es extruída secuencialmente con la ayuda de un extrusor Lipex termoajustado a 50°C, en un paso a través de una membrana de policarbonato que tiene una porosidad de 0.8 µm, después por un paso a través de una membrana que tiene una porosidad de 0.4 µm y finalmente un paso a través de una membrana que tiene una porosidad de 0.2 µm. Los liposomas DPPC/R-848 (4:1 mol/mol) asi se obtienen en agua en 2.48 mg/ml de DPPC y 250 µg/ml de R-848.

Hay disponibles dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) obtenido de Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL) y ER804057 proporcionado por la compañía Eisai. Estos compuestos se proporcionan en forma pulverizada. 19 mg de DPPC (25 µmol) , suplementada con 11 mg de ER803057 (6.7 µmol), se disuelven en 5 ml de una mezcla de cloroformo/metanol 4:1 (vol/vol). La solución se seca en un matraz de vidrio de fondo redondo con la ayuda de un evaporador rotatorio a fin de dejar una película de lipidos homogénea sobre las paredes del matraz de fondo redondo. Esta película se seca adicionalmente bajo un vacío alto a fin de remover cualquiera de las pequeñísimas cantidades del solvente residual, y luego se llevan arriba de 11 ml de agua a 60°C. La suspensión liposomal resultante se homogeniza por un vórtice, la sonicación en un baño de ultrasonido y luego es extruída secuencialmente con la ayuda de un extrusor Lipex termoajustado a 50°C, en un paso a través de una de una membrana de policarbonato que tiene una porosidad de 0.8 µm, después por un paso a través de una membrana que tiene una porosidad de 0.4 µm y finalmente un paso a través de una membrana que tiene una porosidad de 0.2 µm. Los liposomas DPPC/ER-8o4057 (4:1 mol/mol) asi se obtuvieron en agua en 1.72 mg/ml de DPPC y 1 ml/ml de ER804057. 7. Prueba de estimulación de células humanas in vitro. La capacidad de las composiciones de acuerdo a la invención para inducir la maduración de las células denditricas derivadas de monocitos humanos in vitro se evalúan para 4 donadores independientes. Los monocitos se obtienen de las células mononucleares sanguíneas periféricas y se cultivan durante 5-6 dias en la presencia de IL4 y de GM-CSF. Estas células luego se cultivan durante 2 días en la presencia de 1 de las siguientes composiciones: medio de cultivo solo, que sirve como control negativo, - liposomas R-848/DPPC preparados de acuerdo al ejemplo 6 y diluidos a fin de obtener 2.96 µg/ml de R-848, liposomas ER804057/DPPC preparados de acuerdo al ejemplo 6 en una cantidad de 0.1 µg/ml, una combinación de las 2 preparaciones liposomales . Luego se lleva a cabo un análisis de fenotipo mediante la citometria de flujo, que hace posible medir la expresión de los marcadores de maduración CD25, CD80 y CD83, y una medición ELISA de las citoquinas (TNF-a, IL6 e IL12p70) secretadas por estas células. Los resultados indicados en las tablas enseguida « representan los valores principales calculados para los 4 donadores : Los resultados obtenidos muestran la alta capacidad de las composiciones de acuerdo a la invención para inducir la secreción de citoquinas que indican una respuesta orientada THl, tal como IL12p70; la sinergia obtenida al combinar los dos productos es notable. Las composiciones de acuerdo a la invención son por lo tanto particularmente recomendadas en todos los métodos de tratamiento en los que se busca obtener una respuesta del sistema inmune orientado Thl, y en particular todos los casos donde es deseable inducir la secreción de una de las siguientes citoquinas: TNF-a, IL-6 o IL12p70.

Claims (8)

1. REIVINDICACIONES 1. Una composición inmunoestimulante que comprende por lo menos un agonista de receptor 7 similar a Toll o del receptor 8 similar a Toll, caracterizada en que ésta adicionalmente comprende un agonista de receptor 4 similar a Toll.
2. 2. La composición inmunoestimulante de conformidad con la reivindicación precedente, caracterizada en que el agonista de receptor 7 similar a Toll o del receptor 8 similar a Toll es un compuesto diferente del agonista de receptor 4 similar a Toll.
3. 3. La composición inmunoestimulante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizada en que ésta adicionalmente comprende por lo menos un antigeno de vacuna.
4. 4. La composición inmunoestimulante de conformidad con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada en que el agonista de receptor 7 similar a Toll es un derivado de imidazoquinolinamina.
5. 5. La composición inmunoestimulante de conformidad con la reivindicación precedente, caracterizada en que el derivado de imidazoquinolinamina es 4-amino-2-etoximetil-a,a-dimetil-l-H-imidazo [4, 5c] quinolina-1-etanol.
6. 6. La composición inmunoestimulante de conformidad con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada en que el agonista de receptor 4 similar a Toll es ER804057.
7. 7. El uso de una composición inmunoestimulante de conformidad con una de las reivindicaciones precedentes, para la fabricación de un medicamento.
8. 8. El uso de una composición inmunoestimulante de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a la 6, para la fabricación de un medicamento capaz de inducir una respuesta inmune del tipo THl .