ES2323818T3

ES2323818T3 - Factor estimulador de las celulas dendriticas.

Info

Publication number: ES2323818T3
Application number: ES96936216T
Authority: ES
Inventors: Kenneth Brasel; Stewart D. Lyman; Eugene Maraskovsky; Hilary R. Mckenna; David H. Lynch
Original assignee: Immunex Corp
Current assignee: Immunex Corp
Priority date: 1995-10-04
Filing date: 1996-10-03
Publication date: 2009-07-24
Anticipated expiration: 2016-10-03
Also published as: BR9610802A; AU7392296A; IS4703A; CN1172718C; TR199800607T1; EP0871487A1; AU697539B2; NZ321039A; CA2232865A1; KR20040079421A; NO981374D0; SK40898A3; JPH11513389A; KR19990063818A; RO120579B1; KR100676792B1; PL187329B1; EP0871487B1; NO981374L; DE69637942D1

Abstract

EL FLT3 - LIGANDO PUEDE UTILIZARSE PARA GENERAR UN GRAN NUMERO DE CELULAS DENDRITICAS A PARTIR DE CELULAS PLURIPOTENCIALES Y PROGENITORAS HEMATOPOYETICAS. EL FLT3 - LIGANDO PUEDE UTILIZARSE PARA AUMENTAR LAS RESPUESTAS INMUNES IN VIVO, Y PARA EXPANDIR CELULAS DENDRITICAS EX VIVO. ENTONCES ESTAS CELULAS DENDRITICAS PUEDEN UTILIZARSE PARA PRESENTAR ANTIGENOS TUMORALES, VIRICOS U OTROS ANTIGENOS A CELULAS T PREINMUNES, Y PUEDEN RESULTAR UTILES COMO ADYUVANTES DE VACUNAS.

Description

Factor estimulador de las células dendríticas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a usos de un factor estimulador de las células dendríticas.

Fundamento de la invención

El objetivo de la vacunación es proporcionar una inmunidad efectiva mediante el establecimiento de niveles adecuados de anticuerpo y una población de células preparadas que puede dilatarse rápidamente en contacto renovado con un antígeno. El primer contacto con el antígeno durante la vacunación no debe ser perjudicial para el receptor y, por tanto, habitualmente, consiste en un antígeno deficiente desde el punto de vista patógeno.

Una dificultad frecuente con protocolos de inmunización activos es que el antígeno vacunal no posee suficiente inmunogenicidad para dar lugar a una respuesta inmunitaria fuerte, y, por consiguiente, un nivel suficiente de protección contra el enfrentamiento subsiguiente por el mismo antígeno. Además, ciertos antígenos pueden atraer solamente una respuesta débil mediada por células o una respuesta débil de anticuerpos. Para muchos antígenos es deseable tanto una respuesta humoral fuerte como una respuesta fuerte mediada por células.

Durante décadas los investigadores han experimentado con diversos compuestos para aumentar la inmunogenicidad de las vacunas. Los inmunopotenciadores de vacunas, conocidos también como adyuvantes, son composiciones que facilitan a la vacuna una respuesta inmunitaria fuerte. Además, la inmunogenicidad. relativamente débil de ciertos antígenos recombinantes nuevos, ha requerido adyuvantes más potentes. Los adyuvantes de las vacunas posee modos de acción diferentes que afectan a la respuesta inmunitaria tanto cuantitativa como cualitativamente. Tales modos de acción pueden tener lugar por movilización de células T, por actuación como depósitos, y por alteración de la circulación de linfocitos, por lo que estas células permaneces localizadas en los nódulos linfáticos de desagüe. También pueden servir para enfocar el antígeno en el lugar de inmunización, permitiendo con ello que las células T y las células B específicas del antígeno reaccionen más eficazmente con las células que presentan antígeno. Asimismo pueden estimular la proliferación y diferenciación de células T y tener efectos sobre las células B, tales como intensificación de la producción de isotipos diferentes de Ig. Además, los adyuvantes puede estimular y afectar al comportamiento de células que presentan antígeno, en particular macrófagos, haciéndolas más eficaces para presentar antígeno a las células T y las células B.

Las células dendríticas constituyen una población de células homogénea y poco común con una morfología distintiva y una amplia distribución en los tejidos. Una discusión del sistema de células dendríticas y su papel en la inmunogenicidad, ha sido proporcionado por Steinman R.M., Annu. Rev. Immunol., 9:271-296 (1991). Las células dendríticas ponen de manifiesto una superficie celular inusual y pueden ser caracterizadas por la presencia de los marcadores de la superficie celular CD1a^{+}, CD4^{+}, CD14^{-}, CD86^{+}, CD11c^{+}, DEC-205^{+}, CD14^{+} ó HLA-DR^{+}. Las células dendríticas poseen una capacidad elevada para sensibilizar células T con restricción MHC y proporcionan un camino eficaz para presentar antígenos a células T in situ, tanto auto-antígenos durante el desarrollo de células T como antígenos extraños durante la inmunidad. Por tanto, existe un interés creciente en el uso de células dendríticas ex vivo como adyuvantes de vacunas de tumores o enfermedades infecciosas. Véase, por ejemplo, la publicación de Romani et al., J. Exp. Med., 180:83 (1994). El uso de células dendríticas como agentes inmunoestimuladores ha sido limitado, debido a la baja frecuencia de células dendríticas en la sangre periférica, la limitada posibilidad de acceso a los órganos linfoides y el estado de diferenciación terminal de las células dendríticas. Las células dendríticas se originan a partir de progenitores de médula ósea CD34^{+} y la proliferación y maduración de las células dendríticas pueden ser intensificadas por las citoquinas GM-CSF (sargramostima, Leukine®, Immunex Corporation, Seattle, Washington), TNF-\alpha, ligando c-kit (conocido también como factor de células pluripotentes (SCF), factor de insensibilización (SF), o factor de crecimiento de células cebadas (mastocitos) (MGF) e interleuquina-4. Por consiguiente, sería de gran importancia un agente que estimulara la generación de cantidades grandes de células dendríticas funcionalmente maduras, in vivo o in vitro.

Sumario de la invención

Se sabe que el ligando flt3 ("ligando-fl3" o "flt3-L") afecta a las células pluripotentes hematopoyéticas y progenitoras. Se ha encontrado, sorprendentemente, que el ligando flt3 puede también, potencialmente, estimular la generación de células dendríticas partiendo de células progenitoras y células pluripotentes de médula ósea CD34^{+}. La presente invención es como se establece en las reivindicaciones.

La invención proporciona ligando flt3 para usar como un adyuvante de vacunas, para aumentar el número de células dendríticas. Aumentando la cantidad de las células dendríticas de un paciente, tales células pueden ser usadas por sí mismas para presentar antígeno a células T. Por ejemplo, el antígeno puede ser uno que ya exista dentro del paciente, tal como un antígeno tumoral, o un antígeno bacteriano o viral. El ligando flt3 puede ser usado, por consiguiente, para aumentar el número de células dendríticas in vivo, para reforzar la respuesta inmunitaria de un paciente contra antígenos existentes. Alternativamente, el ligando flt3 puede ser administrado antes, al mismo tiempo o después de la administración de un antígeno a un paciente, con fines de inmunización. Por tanto, como adyuvante de vacunas, el ligando flt3 puede generar cantidades grandes de células dendríticas y de otras células intermedias, in vivo, para presentar el antígeno más eficazmente. La respuesta global es una respuesta inmunitaria más fuerte y mejorada y una inmunización más eficaz para el antígeno.

La invención comprende, además, el ligando flt3 para usar en el aumento de células dendríticas de un huésped, un donante o ambos, que hayan sido sometidos a un procedimiento de trasplante, con lo que el número aumentado de células dendríticas inhibe el síndrome del injerto frente al huésped y del huésped frente al injerto.

La invención comprende también el ligando flt3 para usar en el tratamiento del fibrosarcoma.

La invención comprende asimismo el uso de una cantidad eficaz de una citoquina en combinación secuencial o concurrente con el ligando flt3. Tales citoquinas incluyen, aun cuando no se limita a ellas, las interleuquinas ("Ils")
IL-3 e IL-4, un factor estimulador de colonias ("CSF") seleccionado entre el grupo que consiste en el factor estimulador de colonias de macrófagos granulocitos ("GM-CSF") o fusiones de GM-CSF/IL-3, u otras citoquinas tales como TNFa o ligando c-kit.

La invención incluye además usos del ligando flt3 en combinación con una citoquina del grupo antes citado, en medios de expansión celular para generar células dendríticas in vitro.

Descripción detallada de la invención

La invención está dirigida hacia el uso de un ligando flt3 para generar gran número de células dendríticas para los usos que se definen en las reivindicaciones. Los grandes números de células dendríticas no se encuentran de modo natural in vivo y pueden ser generados mediante la administración de un ligando flt3. Tal intensificación del número global de células puede aumentar la respuesta inmunitaria a antígenos en el huésped y, por tanto, puede usarse el ligando flt3 como adyuvante de vacunas. La invención se dirige también al uso de ligando flt3 y una cualquiera de las citoquinas IL-3, IL-4, GM-CSF, TNF, ligando C-Kit y proteínas de fusión de GM-CSF/IL-3 en un medio de expansión celular, para generar células dendríticas in vitro.

Tal como se usa en esta memoria, la expresión "ligando flt3" se refiere a un género de polipéptidos descritos en la patente de Estados Unidos No. 5.554.512, y en los documentos EP 0627487 A2 y WO 94/28391. Un cDNA de un ligando flt3 humano fue depositado en la American Type Culture Collection, Rockville; Maryland, USA (ATCC) el 6 de Agosto de 1993, asignándole el número de catálogo ATCC 69382. El depósito se hizo bajo los términos del Tratado de Budapest. El ligando flt-3 puede prepararse según los métodos descritos en los documentos citados.

La expresión "IL-3" se refiere a un género de polipéptidos de interleuquina-3 según se describe en la patente de EE.UU. No. 5.108.910. Tales polipéptidos incluyen análogos que tienen secuencias de aminoácidos que son sustancialmente similares a las secuencias de aminoácidos nativas de la interleuquina-3 humana, descritas, por ejemplo, en las publicaciones de EP Nos. 275.598 y 282.185. La expresión "IL-3" incluye también análogos y alelos de moléculas de IL-3 que manifiestan al menos algo de la actividad biológica en común con la IL-3 humana nativa. Análogos ejemplares de IL-3 están descritos en la publicación de EP No. 282.185. Otras formas de IL-3 incluyen IL-3[Pro^{8}Asp^{15}Asp^{70}] humana, IL-3[Ser^{8}Asp^{15}Asp^{70}* humana e IL-3[Ser^{8}] humana. Una secuencia de DNA que codifica la proteína de
IL-3 humana, adecuada para usar en la invención, está disponible a consulta público en la American Type Culture Collection (ATCC) bajo el número de catálogo ATCC 67747. La nomenclatura utilizada en esta memoria con respecto a las secuencias de aminoácidos escritas entre corchetes, designa qué aminoácidos difieren de los de la forma humana nativa. Por ejemplo, IL-3[Ser^{8}Asp^{15}Asp^{70}] humana se refiere a una proteína de IL-3 humana en la que el aminoácido en posición 8 ha sido cambiado por un resto de serina, el aminoácido 15 ha sido cambiado por un resto de ácido aspártico y al aminoácido 70 ha sido cambiado por un resto de ácido aspártico.

La expresión "IL-4" se refiere a un polipéptido según ha sido descrito por Mosley et al., Cell 59:335 (1989), Idzerda et al., J. Exp. Med. 171:861 (1990) y Galizzi et al., Intl. Immunol. 2:669 (1990). Tal polipéptido de IL-4 incluye análogos que poseen una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente similar a las secuencias de aminoácidos de la IL-4 humana, nativa, descritas por Mosley et al., Idzerda et al., y Galizzi et al., y que son biológicamente activas puesto que son capaces de unirse a un receptor de IL-4, transducir una señal biológica iniciada por unión del receptor de IL-4, o capaces de reacción cruzada con anticuerpos anti-IL-4. La expresión "IL-4" incluye asimismo análogos de moléculas de IL-4 humana, nativa, suficientes para retener la actividad biológica de la IL-4 humana, nativa.

Tal como se usa en esta memoria, "GM-CSF" se refiere a un género de proteínas que se describe en las patentes de EE.UU. Nos. 5.108.910 y 5.229.496. Tales proteínas incluyen análogos de poseen una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente similar a las secuencias de aminoácidos de GM-CSF humanas, nativas (por ejemplo, como ATCC 53157 ó ATCC 39900 disponibles al público), y que son biológicamente activas ya que son capaces de unirse a un receptor de GM-CSF, transducir una señal biológica iniciada por la unión de un receptor de GM-CSF, o capaces de reacción cruzada con anticuerpos anti-GM-CSF. Secuencias de aminoácidos han sido descritas, por ejemplo, por Anderson et al., en Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82:6250 (1985). GM-CSF que puede adquirirse en el comercio (sargramostima, Leukine®), es obtenible de Immunex Corp., Seattle, WA). La expresión "GM-CSF" incluye también análogos de las moléculas de GM-CSF humana, nativa, descritas en las patentes de EE.UU. Nos. 5.108.910 y 5.229.496, suficientes para retener la actividad biológica de GM-CSF humana, nativa. Análogos ejemplares de GM-CSF incluyen por ejemplo, los descritos en los documentos de la Publicación de EP No. 212914 y WO 89/03881. Otros análogos de GM-CSF pueden ser usados también para construir proteínas de fusión con IL-3. Una secuencia de DNA que codifica una proteína de GM-CSF particularmente preferida, que posee sitios potenciales de glicosilación separados, está a disposición pública desde la ATCC con el número de catálogo ATCC 67231.

La expresión "proteína de fusión de GM-CSF/IL-3" significa una fusión del extremo C-terminal con el extremo N-terminal de GM-CSF e IL-3. Las proteínas de fusión son conocidas y figuran descritas en las patentes de EE.UU. Nos. 5.199.942, 5.108.910 y 5.073.627. Una proteína de fusión preferida es la PIXY321, descrita en la patente de EE.UU. No. 5.199.942.

La expresión "ligando c-kit" conocido también como Factor de Crecimiento de Células Cebadas (MGF), Factor de sensibilización o Factor de células Pluripotentes (SCF), se refiere a un polipéptido descrito en el documento EP 423.980 y que reivindica prioridad desde la solicitud de patente de EE.UU. Ser. No. 589.701, presentada el 1 de Octubre de 1990. Tal polipéptido del ligando c-kit incluye análogos que poseen una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente similar a las secuencias de aminoácidos del ligando c-kit humano, nativo, que están descritas en el documento EP 423.980, y que son biológicamente activos ya que son capaces de unirse a un receptor de c-kit, transducir una señal biológica iniciada por unión de un receptor de c-kit, o capaces de reacción cruzada con anticuerpo anti-ligando c-kit. La expresión "ligando c-kit" incluye también análogos de moléculas del ligando c-kit humano, nativo, suficientes para retener la actividad biológica del ligando c-kit humano, nativo.

El término "adyuvante" se refiere a una sustancia que intensifica, aumenta o potencia la respuesta inmunitaria del huésped a un antígeno de una vacuna.

El procedimiento operatorio de "expansión ex vivo" de células hematopoyéticas pluripotentes y progenitoras, está descrito en la patente de EE.UU. No. 5.199.942. En breve, la expresión significa un método que comprende (1) recoger células hematopoyéticas pluripotentes y progenitoras CD34^{+}, procedentes de la recogida desde sangre periférica o de explantes de médula ósea de un paciente; y (2) expandir tales células ex vivo. Además de los factores de crecimiento celular descritos en la patente 5.199.942, pueden ser usados otros factores tales como un ligando flt3, IL-1, IL-3 y ligando c-kit.

El término "inmunogenicidad" significa efectividad relativa de un inmunógeno o un antígeno para inducir una respuesta inmunitaria.

La expresión "sustancialmente similar" significa una secuencia de aminoácidos variante que es, preferiblemente, idéntica por lo menos en 80% a una secuencia de aminoácidos nativa, lo más preferible idéntica por lo menos en un 90%. El tanto por ciento de identidad puede determinarse, por ejemplo, comprando la información de secuencias usando el programa de ordenador GAP, versión 6.0, descrito por Devereux et al., Nucl. Acids Res. 12:387, 1984, y que puede obtenerse del Genetics Computer Group de la Universidad de Wisconsin (UWGcG). El programa GAP utiliza el método de alineación de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970), revisado por Smith y Waterman (Adv. Appl. Math 2:482, 1981). Los parámetros preferidos por defecto para el programa GAP incluyen: (1) una matriz unaria de comparación (que contiene un valor de 1 para identidades y de 0 para no identidades) para nucleótidos, y la matriz pesada de comparación de Gribskov y Burgess, Nucl. Acids Res. 14:6745, 1986 según ha sido descrito por Schwartz y Dayhoff, compiladores, Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, páginas 353-358, 1979; (2) una penalización de 3,0 para cada gap y una penalización adicional de 0,1 para cada símbolo de cada gap; y (3) no hay penalización para los gaps terminales. Las variantes pueden comprender secuencias sustituidas conservativamente, lo que significa que un resto de un aminoácido dado ha sido reemplazado por un resto que posee características fisicoquímicas similares. Los ejemplos de sustituciones conservativas incluyen la sustitución de un resto alifático por otro, tal como Ile, Val, Leu o Ala por otro, o sustituciones de un resto polar por otro, tal como entre Lys y Arg; Glu y Asp; o Gln y Asn. Otras sustituciones conservativas tales, por ejemplo, sustituciones de regiones enteras que poseen características similares de hidrofobicidad, son bien conocidas. Variantes que se presentan de modo natural están comprendidas también por la invención. Son ejemplos de tales variantes, proteínas que resultan de acontecimientos alternativos de corte y empalme de mRNA o de escisión proteolítica de la proteína nativa, en que están retenidas las propiedades biológicas nativas.

Tal como se usa en esta memoria, "vacuna" significa un organismo o un material que contiene un antígeno en una forma inocua. La vacuna está destinada a desencadenar una respuesta inmunoprotectora. La vacuna puede ser recombinante o no recombinante. Cuando se inocula en un huésped no inmune, la vacuna provocará en el organismo o el material una inmunidad activa, pero no ha de causar enfermedad. Las vacunas pueden tener la forma, por ejemplo, de un toxoide, que se define como una toxina que ha sido privada de su toxicidad pero que retiene todavía sus determinantes inmunogénicos principales, o un organismo muerto, tal como el causante de la fiebre tifoidea, el cólera y la poliomielitis, u organismos atenuados, que son las formas vivas, pero no virulentas, de organismos patógenos, o puede ser un antígeno codificado por tal organismo, o puede ser una célula tumoral viva o un antígeno presente en una célula tumoral.

Se conoce una diversidad de técnicas de selección celular para identificar y separar células hematopoyéticas pluripotentes y progenitoras CD34^{+} partiendo de una población de células. Se conocen métodos y materiales para identificar y seleccionar tales tipos de células. Por ejemplo, pueden usarse anticuerpos monoclonales para unirse a una proteína de un marcador o una proteína de un antígeno de superficie encontrado en células pluripotentes o progenitoras. Tales marcadores o antígenos de superficies celulares para células hemtopoyéticas pluripotentes incluyen el CD34 y el
Thy-1. En un método, se fijan anticuerpos a una superficie, por ejemplo, bolas de vidrio, y se ponen en contacto con una mezcla de células que se sospecha que contiene células pluripotentes. Esto permite que los anticuerpos se unan y fijen las células pluripotentes a las bolas de vidrio. Alternativamente, los anticuerpos pueden ser incubados con la mezcla de células y la combinación que resulta puede ponerse en contacto con una superficie que tenga afinidad para el complejo anticuerpo-célula. Se separan las células y la materia celular indeseadas, lo que proporciona una población relativamente pura de células pluripotentes. Las células pluripotentes o las células progenitoras que tienen el marcador CD34 constituyen solamente alrededor del 1% al 3% de la células mononucleares de la médula ósea. La cantidad de células pluripotentes o progenitoras CD34^{+} de la sangre periférica es, aproximadamente, 10 a 100 veces menor que la de la médula ósea.

En lo que respecta a los aspectos particulares de la invención, la elección de medio adecuados de selección de células pluripotentes o progenitoras significa depender del fenotipo deseado de la célula que haya de aislarse. Las células hematopoyéticas pluripotentes pueden ser seleccionadas en virtud de sus características físicas, tales como la expresión del receptor de flt3 unido a la membrana, o la posesión de los siguientes marcadores celulares; CD34 ó
Thy-1. Anticuerpos monoclonales que reconocen algunos de estos antígenos han sido descritos en la patente de EE.UU. No. 4.714.680 (anti-My-10); el anti-CD34 puede obtenerse comercialmente de Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) y anticuerpos monoclonales anti-Thy-1 pueden generarse fácilmente usando los métodos descritos por Dalchau et al., J. Exp. Med. 149:576 (1979). También puede usarse una proteína que se una al receptor de flt3, tal como anticuerpos monoclonales anti-flt3 o el ligando flt3. La proteína de unión celular se pone en contacto con la mezcla de células recogida y la combinación se deja incubar durante un período de tiempo suficiente para permitir la unión de la célula deseada a la proteína de unión celular.

Medios alternativos de seleccionar células pluripotentes inactivas son inducir la muerte celular en los tipos de células en división, más comprometidas por el linaje, usando un antimetabolito tal como el 5-fluorouracilo (5-FU) o un agente de alquilación tal como la 4-hidroxiciclofosfamida (4-HC). Las células no inactivas son estimuladas para proliferar y diferenciarse mediante la adición de factores de crecimiento que tienen poco efecto o que no tienen efecto sobre las células pluripotentes, haciendo que las células no pluripotentes proliferen y se diferencien, haciéndolas más vulnerables a los efectos citotóxicos del 5-FU o la 4-HC. Véase la publicación de Berardi et al., Science, 267:104 (1995).

El aislamiento de las células hematopoyéticas pluripotentes o progenitoras puede llevarse a cabo usando, por ejemplo, cromatografía de afinidad, bolas magnéticas revestidas con anticuerpos, o anticuerpos fijados a una matriz sólida tal como son bolas de vidrio, frascos, etc. Los anticuerpos que reconocen un marcador de superficie de células pluripotentes o progenitoras, pueden fusionarse o conjugarse con otros restos químicos tales como biotina- que pueden ser separados con un resto de avidina o estreptavidina fijado a un soporte sólido; fluorocromos útiles para la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), o semejante. Preferiblemente, el aislamiento se efectúa mediante una columna de inmunoafinidad. La columnas de inmunoafinidad pueden tomar cualquier forma. pero habitualmente comprende un reactor de lecho de relleno. El lecho de relleno de estos biorreactores está hecho, preferiblemente, con un material poroso que tiene un revestimiento sustancialmente uniforme de un sustrato. El material poroso, que proporciona una relación elevada de superficie específica a volumen, permite que la mezcla de células fluya sobre una zona grande de contacto al tiempo que no impide el flujo de células fuera del lecho. Los sustratos típicos incluyen avidina y estreptavidina, si bien pueden usarse otros sustratos convencionales. El sustrato, o bien debido a sus propiedades propia o bien debido la adición de un resto químico, debe poner de manifiesto alta afinidad para un resto encontrado sobre la proteína de unión celular tal como un anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos monoclonales reconocen un antígeno de la superficie celular situado sobre las células que han de ser separadas, y son modificados además, típicamente, para presentar un resto de biotina. Es bien sabido que la biotina posee alta afinidad para la avidina, y la afinidad de estas sustancias por ello fija de modo separable el anticuerpo monoclonal a la superficie del lecho de relleno. Tales columnas son bien conocidas en la técnica, véase la publicación de Berenson et al., J. Cell. Biochem. 10D:239 (1986). La columna se lava con una solución de PBS para retirar el material que no se ha unido. Las células diana pueden liberarse desde las bolas usando métodos convencionales. Columnas de inmunoafinidad del tipo antes descrito que utilizan anticuerpos monoclonales anti-CD34 biotinilados, fijados a un lecho de relleno revestido con avidina, están descritos por ejemplo, en la publicación PCT No. WO 93/08268. Una variación de este método utiliza proteínas de unión celular tales como los anticuerpos monoclonales o un ligando flt3 según se ha descrito antes, unidas de modo separable a una superficie fija de los medios de aislamiento. La proteína de unión celular unida, se pone en contacto luego con la mezcla de células recogida y se deja incubar durante un período de tiempo suficiente para permitir el aislamiento de las células deseadas.

Alternativamente, los anticuerpos monoclonales que reconocen los antígenos de la superficie celular, pueden ser marcados con un marcador fluorescente, por ejemplo, un cromóforo o un fluoróforo, y separados por clasificación de las células según la presencia de ausencia o de la cantidad de producto marcado.

Las células CD34^{+} recogidas, son expuestas después o bien a ligando flt3 solo o bien a ligando flt3 en combinación concurrente o secuencial con una o más de las citoquinas siguientes: GM-CSF, TNF-\alpha, IL-3, IL-4, ligando c-kit o proteínas de fusión de GM-CSF/IL-3. Las células CD34^{+} se dejan luego diferenciar y trasladarse a células del linaje dendrítico. Las células dendríticas son recogidas y pueden o bien ser (a) administradas a un paciente con objeto de aumentar el sistema inmunitario y las respuestas inmunitarias a un antígeno mediadas por células T o mediadas por células B, (b) expuestas a un antígeno antes de administrar las células dendríticas a un paciente, (c) transfectadas con un gen que codifique un polipéptido específico de un antígeno, o bien (d) exponerse a un antígeno y luego dejarse procesar y, reenviar el antígeno, ex vivo, a células T recogidas desde el paciente, seguido de administración al paciente de las células T específicas del antígeno.

Más específicamente, la invención proporciona el ligando flt3 para usar como adyuvante para aumentar el número de células dendríticas. Aumentando la cantidad de las células dendríticas de un paciente tales células pueden ser usadas por sí mismas para presentar antígeno a las células T. Por ejemplo, el antígeno puede ser uno que ya exista en el paciente, tal como un antígeno tumoral, o un antígeno bacteriano o viral. El ligando flt3 puede ser usado, por tanto, para reforzar la respuesta inmunitaria de un paciente mediada por, linfocitos (por ejemplo, mediada por células T y células B) o mediada por células mieloides, a los antígenos ya presentes, permitiendo potencialmente de este modo una presentación de antígeno más eficaz a las células T del paciente. Alternativamente, puede administrarse un ligando flt3 antes, al mismo tiempo o después de la administración de un antígeno a un paciente con fines de inmunización. Así pues, como adyuvante de vacunas, el ligando flt3 puede generar cantidades grandes de células dendríticas in vivo para presentar el antígeno más eficazmente. La respuesta global es una respuesta inmunitaria más fuerte y mejorada y una inmunización más eficaz al antígeno.

La administración sistémica de ligando flt3 no solamente es eficaz como adyuvante de vacunas, sino también, como se ha discutido anteriormente, es eficaz para aumentar una respuesta inmunitaria contra antígenos previamente existentes. Por ejemplo, los inventores han puesto de manifiesto que la administración de un ligando flt3 a ratones portadores de tumores, da como resultado, por lo menos, una disminución importante del grado de crecimiento del tumor, y puede resultar en el rechazo de los tumores en una gran proporción de los ratones. Los resultados obtenidos están presentados con más detalles en el Ejemplo 3. Por consiguiente el ligando flt3 es una citoquina importante para la generación de una respuesta inmunitaria eficaz, in vivo, contra un antígeno.

Debido a su capacidad de generación de células dendríticas, el ligando flt3 encuentra también uso para favorecer la supervivencia de un tejido o de órganos trasplantados. Cuando un órgano alogénico u otro tejido es trasplantado a un huésped, ellos pueden transferir células pluripotentes, células dendríticas inmaduras y células dendríticas maduras procedentes del donante. Estas células son llamadas células pasajeras y tales células pueden injertarse en el sistema hematopoyético del huésped. Adicionalmente, células pluripotentes, células dendríticas inmaduras y células dendríticas maduras procedentes del huésped pueden injertarse al órgano o al tejido del donante. Es posible entonces establecer una tolerancia entre el injerto y el huésped dado que las células dendríticas inmaduras procedentes del tejido del huésped y del donante interaccionan con las células T procedentes de la "otra parte". Tal interacción puede incluir la supresión de células T que reconocen el complejo principal de histocompatibilidad (MHC) que expresan las células dendríticas. De este modo, las células del donante son "seleccionadas" de modo que fallan en reconocer y reaccionar contra el huésped (es decir, no hay síndrome del injerto frente al huésped) y las células T del huésped son seleccionadas de modo que fallan en reconocer y reaccionar contra el injerto (es decir, no hay rechazo del injerto). Por tanto, puede conseguirse una tolerancia mutua y se mejora la aceptación del injerto. La administración de ligando flt3 al huésped o al donante antes del trasplante, podría generara un número creciente de células dendríticas en el huésped o el donante, y permitiría al injerto una tolerancia y una supervivencia
aumentadas.

Para el crecimiento y el cultivo de células dendríticas, puede usarse una variedad de medios de crecimiento y de cultivo, y la composición de tales medios puede determinarse con facilidad por una persona de habilidad ordinaria en la técnica. Los medios de cultivo adecuados son soluciones que contienen sustancias nutrientes o aditivos metabólicos, e incluyen aquellas sustancias o aditivos bajos en suero o a base de suero. Son ejemplos representativos de medios de cultivo los medios RPMI, TC 199, medio de Dulbecco modificado por Iscoves (Iscoves et al., F. J. Exp. Med., 147:923 (1978), DMEM, de Fischer, medio alfa, NCTC, F-10, L-15 de Leibovitz, MEM y de McCoy. Ejemplos particulares de sustancias nutrientes que serán evidentes para los expertos en la técnica, incluyen, albúmina sérica, transferrina, lípidos, colesterol, agentes reductores tales como el 2-mercaptoetanol o el monotioglicerol, piruvato, butirato y un glucocorticoide tal como el 2-hemisuccinato de hidrocortisona. Más particularmente, los medios estándar incluyen una fuente de energía, vitaminas u otros compuestos orgánicos de apoyo a las células, un tampón tal como el HEPES o Tris, que actúan estabilizando el pH de los medios y diversas sales inorgánicas. Se hace referencia particular a la Publicación PCT No. WO95/00632, en la que se describe una variedad de medios de cultivo celulares exentos de suero.

Las células progenitoras de sangre periférica (PBPC) y las células pluripotentes de sangre periférica (PBSC) son recogidas usando procedimientos operatorios de aféresis conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, la publicación de Bishop et al., Blood, vol. 83, No. 2, páginas 610-616 (1994). Brevemente, se recogen PBPC y PBSC usando dispositivos convencionales, por ejemplo, un dispositivo de aféresis Haemonetics, Modelo V50 (Haemonetics, Braintree, MA). Se efectúan, típicamente. recogidas de cuatro horas no más de cinco veces por semana hasta recoger, por ejemplo, aproximadamente 6,5 x 10^{8} células mononucleares (MNC)/kg del paciente. Las células se suspenden en un medio estándar y luego se somete a centrifugación para separar los hematíes y los neutrófilos. Las células situadas en la interfase entre las dos fases (lo que se conoce también en la técnica como la capa de leucocitos(buffy)) son retiradas y resuspendidas en HBSS. Las células suspendidas son predominantemente mononucleares y una parte sustancial de la mezcla de células son células pluripotentes precoces. La suspensión de células pluripotentes que resulta puede ponerse después en contacto con anticuerpos monoclonales anti-CD34 biotinilados u otros medios de unión celular. El período de contacto se mantiene durante un tiempo suficiente para permitir una interacción sustancial entre los anticuerpos monoclonales anti-CD34 y los antígenos CD34 situados sobre la superficie de las células pluripotentes. Típicamente, son suficientes tiempos de una hora al menos. La suspensión de células se pone después en contacto con los medios de aislamiento proporcionados en el kit. Los medios de aislamiento pueden comprender una columna rellena con bolas revestidas con avidina. Tales columnas son bien conocidas en la técnica, véase la publicación de Berenson, et al., J. Cell Biochem., 10D:239 (1986). La columna se lava con una solución de PBS para separar el material sin unir. Las células pluripotentes diana pueden ser liberadas desde las bolas y desde anticuerpos monoclonales anti-CD34 usando métodos convencionales. Las células pluripotentes obtenidas de este modo pueden ser congeladas en un congelador de velocidad regulada (por ejemplo, Cryo-Med, Mt. Clemens, MI), y almacenadas después en la fase vapor de nitrógeno líquido. Puede emplearse como crioprotector sulfóxido de dimetilo al diez por ciento. Después de haber llevado a cabo todas las recogidas del donante, las células pluripotentes son descongeladas y reunidas. Partes alícuotas que contienen células pluripotentes, medio de cultivo, tal como el medio 5A de McCoy, agar al 0,3% y al menos uno de los factores de expansión: GM-CSF recombinante, humana, IL-3, ligando flt3 recombinante, humano, y moléculas de fusión de GM-CSF/IL-3 humanas (PIXY321) en concentraciones de 200 U/ml aproximadamente, son cultivadas y expandidas a 37ºC en aire totalmente humidificado con CO_{2} al 5%, durante 14 días. Opcionalmente, puede añadirse a los cultivos IL-1\alpha ó IL-4, humanas. La combinación más preferida de factores de expansión comprende un ligando flt3 más o bien IL-3 o bien una proteína de fusión de GM-CSF/IL-3.

Para administrar in vivo a seres humanos, el ligando flt3 puede formularse según métodos conocidos utilizados para preparar composiciones útiles desde el punto de vista farmacéutico. El ligando flt3 puede ser combinado en mezcla, o bien como el único material activo o bien con otros materiales activos conocidos, con diluyentes farmacéuticamente adecuados. (por ejemplo, Tris-HCl, acetato, fosfato), agentes conservantes (por ejemplos, timerosal, alcohol bencílico, parabenos), agentes emulsionantes, solubilizantes, adyuvantes y/o excipientes. Excipientes adecuados y sus formulaciones están descritos en la publicación Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª edición, 1980 Mack Publishing Co. Además, tales composiciones pueden contener un ligando flt3 complejado con polietilenglicol (PEG), iones metálicos, o estar incorporado en compuestos poliméricos tales como poli(ácido acético), poli(ácido glicólico), hidrogeles, etc., o incorporado en liposomas, microemulsiones, micelas, vesículas monolamelares o multilamelares, eritrocitos fantasmas o esferoblastos. Tales composiciones pueden influir en el estado físico, solubilidad, estabilidad, velocidad de liberación in vivo, y velocidad de aclaramiento in vivo del ligando flt3.

El ligando flt3 puede ser administrado por vía tópica, parenteral o mediante inhalación. El término "parenteral" incluye inyección subcutánea, intravenosa, intramuscular, intracisternal, o técnicas de infusión. Estas composiciones contienen, típicamente, una cantidad eficaz del ligando flt3, solo o en combinación con una cantidad eficaz de cualquier otro material activo. Tales dosis y tales concentraciones medicamentosas deseadas contenidas en las composiciones, pueden variar dependiendo de muchos factores, que incluyen el uso pretendido, el peso y la edad del paciente, y la vía de administración. Dosis preliminares pueden ser determinadas según ensayos en animales, y la graduación de las dosis para administración humana puede ser llevada a cabo según prácticas aceptadas en la técnica. Teniendo en cuenta la descripción anterior, las dosis típicas del ligando flt3 pueden variar desde aproximadamente 10 \mug por metro cuadrado hasta aproximadamente 1000 \mug por metro cuadrado. El intervalo de dosis preferido es del orden de 100 \mug por metro cuadrado, aproximadamente, hasta 300 \mug por metro cuadrado, aproximadamente.

Además de lo anterior, se proporcionan los ejemplos que siguen para ilustrar realizaciones particulares y no para limitar el alcance de la invención.

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Ejemplo 1

Generación de células dendríticas

Este Ejemplo describe un método de uso de un ligando flt3 para generar gran número de células dendríticas ex vivo. Células que tienen el fenotipo CD34^{+} son aisladas según se ha descrito antes, por ejemplo, generando en primer lugar una capa de leucocitos de células usando el procedimiento operatorio descrito anteriormente. Células procedentes de la capa de leucocitos son incubadas luego con un anticuerpo monoclonal específico de CD34. Las células CD34^{+} que son seleccionadas se cultivan después en medio intensificado de McCoy con 20 ng/ml de cada una de GM-CSF,
IL-4, TNF-\alpha, o 100 ng/ml de ligando flt3 o ligando c-kit. El cultivo se continúa durante dos semanas aproximadamente, a 37ºC, en aire húmedo con CO_{2} al 10%. Las células son clasificadas después mediante citometría de flujo para expresión de CD1a^{+} y HLA-DR^{+}. La combinación de GM-CSF, IL-4 y TNF-\alpha, dio por resultado un aumento de seis a siete veces del número de células obtenidas al cabo de dos semanas de cultivo. La combinación de ligando flt3 y ligando c-kit dio por resultado un aumento aditivo de 12-13 veces en el número absoluto de células. Esto está correlacionado con una expansión de 18 veces o bien con el ligando flt3 o el ligando c-kit, o con una expansión de 34 veces con la combinación de ligando flt3 y ligando c-kit. El análisis fenotípico de las células puso de manifiesto que entre 60-70% de las células eran HLA-DR^{+}, CD86^{+}, con 40-50% de las células expresando CD1a en todas las combinaciones de factores examinadas. La adición de un ligando flt3 aumentó 5 veces el número absoluto de células CD1a^{+}. E l ligando c-kit aumentó aquellas células 6,7 veces y la combinación de ligando flt3 y ligando c-kit 11 veces. El análisis funcional de las células resultantes en una MLR reveló que la presencia de ligando flt3 o de ligando c-kit no afectaba a la capacidad estimuladora de las células dendríticas resultantes al tiempo que aumentaba los números
obtenidos.

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Ejemplo 2

Uso de Flt3-L en la expansión de células dendríticas

Este Ejemplo describe un método para usar un ligando-flt3 para la expansión de células dendríticas. Antes de la recogida de las células puede ser deseable movilizar o aumentar las cantidades de PBPC y de PBSC en circulación. La movilización puede mejorar la recogida de PBPC y de PBSC, y puede conseguirse mediante la administración intravenosa a los pacientes de ligando-flt3 o sargramostima (Leukine®, Immunex Corporation, Seattle, Washington), antes de la recogida de tales células. Otros factores de crecimiento tales como CSF-1, GM-CSF, ligando c-kit, G-CSF, EPO, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, proteínas de fusión de GM-CSF/IL-3, LIF, FGF y sus combinaciones, pueden ser administrados igualmente, en sucesión, o en combinación concurrente con el ligando flt3. Las PBPC y PBSC, movilizadas o sin movilizar, son recogidas usando procedimientos operatorios de aféresis conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, la publicación de Bishop et al., Blood, vol. 83, No. 2, páginas 610-616 (1994). Brevemente, se recogen PBPC y PBSC usando dispositivos convencionales, por ejemplo, el dispositivo de aféresis Haemonetics Modelo V50 (Haemonetics, Braintree, MA). Se llevan a cabo recogidas de cuatro horas típicamente no más de cinco veces por semana hasta recoger aproximadamente 6,5 x 10^{8} células mononucleares (MNC)/kg de peso del paciente. Partes alícuotas de PBPC y PBSC recogidas son analizadas para determinar el contenido de unidades que forman colonias de granulocitos-macrófagos (CFU-GM) diluyendo aproximadamente 1:6 con solución salina equilibrada de Hank sin calcio ni magnesio (HBSS) y depositando en capa sobre el medio de separación de linfocitos (Organon Teknika, Durham, Carolina del Norte). Después de centrifugar, se recogen las MNC de la interfase, se lavan y se vuelve a suspender en HBSS, Partes alícuotas de un mililitro que contienen, aproximadamente, 300.000 MNC, medio 5A de McCoy modificado, agar al 0,3%, 200 U/ml de GM-CSF recombinante, humana, 200 U/ml de IL-3 recombinante, humana, y 200 uEmL de G-CSF recombinante, humana, son cultivadas a 37ºC durante 14 días, en aire totalmente humidificado con CO_{2} al 5%. Opcionalmente puede añadirse a los cultivos ligando-flt3 o moléculas de fusión de GM-CSF/IL-3 (PIXY 321). Estos cultivos se someten a tinción con tinte de Wright y se cuentan las colonias de CFU-GM usando un microscopio de disección (Ward et al., Exp. Hematol., 16:358 (1988). Alternativamente, las colonias de CFU-GM pueden ser analizadas usando el método de citometría de flujo de CD34/CD33,
de Siena et al., Blood, Vol. 77, No. 2, páginas 400-409 (1991), o cualquier otro método conocido en la técnica.

Los cultivos que contienen CFU-GM son congelados en un congelador de velocidad regulada (por ejemplo, Cryo Med. Mt. Clemens, MI), y almacenadas después en la fase vapor de nitrógeno líquido. Puede emplearse como crioprotector sulfóxido de dimetilo al diez por ciento. Después de haber llevado a cabo todas las recogidas desde el paciente, los cultivos que contienen CFU-GM son descongelados y reunidos. La colección de células descongeladas se pone en contacto con ligando flt3 o bien solo, o sucesivamente o en combinación simultánea, con otras citoquinas enumeradas anteriormente. Tal exposición a ligando flt3 conducirá la CFU-GM al linaje de las células dendríticas. Las células dendríticas se infunden de nuevo al paciente por vía intravenosa.

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Ejemplo 3

Uso de Flt3-L para aumentar la respuesta inmunitaria antitumoral

Este Ejemplo describe un método de uso de flt3-L para aumentar la respuesta inmunitaria antitumoral in vivo. Ratones hembra C57BL/10J (B10) (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) fueron inyectados con 5 x 10^{5} células tumorales viables de fibrosarcoma B10.2 ó B10.5 mediante inyección intradérmica en posición ventral del plano medio del animal, en un volumen total de 50 \mul.. Las líneas de fibrosarcoma B10.2 y B10.5 son de origen B10 y han sido descritas previamente. (Véase la publicación de Lynch et al., Euro. J. Immunol., 21:1403 (1991). La línea de fibrosarcoma B10.2 fue inducida mediante implantación subcutánea de un glóbulo de parafina que contenía 5 mg de metilcolantreno, y la línea B10.5 fue inducida por exposición crónica a radiación ultravioleta. Las líneas celulares tumorales fueron mantenidas in vitro en MEM modificado en \alpha, que contenía FBS al 5%, L-glutamina 2 nM, 50 U/ml de penicilina y 50 \mug/ml de estreptomicina. Se administró flt3-L recombinante humano (10 \mug/inyección) diariamente durante un período de 19 días (a menos que se indique de otro modo) mediante inyección subcutánea, en un volumen total de 100 \mul. Ratones testigo fueron inyectados de modo semejante con un volumen similar de un tampón que contenía 100 ng de MSA. Las velocidades de crecimiento tumoral fueron determinadas representando gráficamente el tamaño de los tumores frente al tiempo transcurrido después del enfrentamiento. El tamaño tumoral se calculó como el producto de dos diámetros perpendiculares, medidos con calibres, y se expresa como el tamaño tumoral medio de solamente aquellos ratones que tenían tumores dentro de un grupo particular de tratamiento. El número de ratones con tumores comparado con el número de ratones enfrentados, para cada grupo de tratamiento al término del experimento, se muestra en los resultados que figuran a continuación.

De la Tabla I, los resultados son una recopilación de seis experimentos diferentes en los que los ratones con tumores habían sido tratados con ligando flt3 o con MSA. Se observó una regresión completa de los tumores en 19 de 50 ratones tratados con ligando flt3 en comparación con 1 de 30 ratones tratados con MSA (p<0,0001 usando el Fishers Exact Test). La observación de que la velocidad de crecimiento de los tumores en los ratones tratados con el ligando flt3 (tamaño tumoral medio en los ratones con tumores en la semana 5 después de la implantación de los tumores, fue 60 +/- 8 mm^{2}) estaba significativamente reducido en comparación con el tamaño de los de los ratones tratados con MSA (tamaño tumoral medio en la semana 5 después del enfrentamiento con el tumor, era 185 +/- 17 mm^{2}), fue confirmada también (p.0001 mediante análisis de la varianza).

TABLA 1 Tamaño tumoral (mm^{2})

Resultados de seis experimentos de fibrosarcoma +/- Flt3-L

1

El tamaño tumoral estaba acusadamente retardado con el ligando flt3 en comparación con el testigo. Por consiguiente, los resultados obtenidos ponen de manifiesto que el ligando flt3 es una citoquina importante en el aumento de la respuesta inmunitaria contra antígenos extraños, y en particular contra el cáncer.

Claims

1. Un ligando flt3 para usar como adyuvante de vacunas, para aumentar el número de células dendríticas.

2. El uso de un ligando flt3 para fabricar un adyuvante de vacunas, para aumentar el número de células dendríticas.

3. El ligando flt3 según la reivindicación 1, en el que el ligando flt3 es para usar antes, al mismo tiempo o después de la administración de un antígeno vacunal.

4. El ligando flt3 según la reivindicación 1 o la reivindicación 3, en combinación con una cualquiera de GM-CSF, IL-4, TNF-\alpha, IL-3, ligando c-kit y fusiones de GM-CSF e IL-3.

5. Un ligando flt3 para usar para aumentar las células dendríticas de un huésped, un donante o ambos, sometidos a un procedimiento de trasplante, por el que la cantidad aumentada de células dendríticas inhibe el síndrome del injerto frente al huésped y el síndrome del huésped frente al injerto.

6. El uso de un ligando flt3 para fabricar un medicamento para aumentar las células dendríticas de un huésped, un donante o ambos, sometidos a un procedimiento de trasplante, por el que la cantidad aumentada de células dendríticas inhibe el síndrome del injerto frente al huésped y el síndrome del huésped frente al injerto.

7. El uso de un ligando flt3 y una cualquiera de las citoquinas IL-3, IL-4, GM-CSF, TNF. ligando C-Kit y proteínas de fusión de GM-CSF/IL-3, en un medio de expansión celular para generar células dendríticas in vitro.

8. El ligando flt3 para usar para tratar el fibrosarcoma.

9. El uso de un ligando flt3 para fabricar un medicamento para tratar el fibrosarcoma.