CZ97798A3 - Použití ligandu flt3, adjuvants vakcíny, expanzní media, přípravek a populace buněk a způsob - Google Patents
Použití ligandu flt3, adjuvants vakcíny, expanzní media, přípravek a populace buněk a způsob Download PDFInfo
- Publication number
- CZ97798A3 CZ97798A3 CZ98977A CZ97798A CZ97798A3 CZ 97798 A3 CZ97798 A3 CZ 97798A3 CZ 98977 A CZ98977 A CZ 98977A CZ 97798 A CZ97798 A CZ 97798A CZ 97798 A3 CZ97798 A3 CZ 97798A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- cells
- dendritic cells
- antigen
- csf
- ligand
- Prior art date
Links
- 108700014844 flt3 ligand Proteins 0.000 title claims description 77
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 59
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 20
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 11
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 title description 9
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 claims abstract description 133
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 93
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 93
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 92
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 72
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 38
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 30
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 29
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 28
- 239000012646 vaccine adjuvant Substances 0.000 claims abstract description 10
- 229940124931 vaccine adjuvant Drugs 0.000 claims abstract description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 91
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 claims description 59
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 claims description 56
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 51
- 108010039445 Stem Cell Factor Proteins 0.000 claims description 37
- 102100020880 Kit ligand Human genes 0.000 claims description 36
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 claims description 27
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 claims description 27
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 27
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 25
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 claims description 21
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 20
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 claims description 19
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims description 19
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 19
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 19
- 101100335081 Mus musculus Flt3 gene Proteins 0.000 claims description 17
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 16
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 16
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 14
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 11
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 11
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 9
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 9
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 claims description 8
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 claims description 8
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 7
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 6
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 claims description 5
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 claims description 5
- 102000016971 Proto-Oncogene Proteins c-kit Human genes 0.000 claims description 5
- 108010014608 Proto-Oncogene Proteins c-kit Proteins 0.000 claims description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 5
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 3
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 claims description 2
- 102100039064 Interleukin-3 Human genes 0.000 claims 16
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 15
- 101710162577 Fms-related tyrosine kinase 3 ligand protein Proteins 0.000 abstract description 4
- 102100020715 Fms-related tyrosine kinase 3 ligand protein Human genes 0.000 abstract description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 abstract description 2
- 102000000646 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 39
- 229940076264 interleukin-3 Drugs 0.000 description 38
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 21
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 21
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 description 17
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 15
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 14
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 14
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- 101001033279 Homo sapiens Interleukin-3 Proteins 0.000 description 8
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 102000055276 human IL3 Human genes 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 6
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 6
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 6
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 6
- 108010038379 sargramostim Proteins 0.000 description 6
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 5
- 101000746373 Homo sapiens Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 5
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 5
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 5
- 102000046157 human CSF2 Human genes 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 238000002617 apheresis Methods 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 4
- RANONBLIHMVXAJ-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxycyclophosphamide Chemical compound OC1CCOP(=O)(N(CCCl)CCCl)N1 RANONBLIHMVXAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 201000008808 Fibrosarcoma Diseases 0.000 description 3
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000716729 Homo sapiens Kit ligand Proteins 0.000 description 3
- -1 IL- 4 Proteins 0.000 description 3
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 239000011149 active material Substances 0.000 description 3
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 229940087875 leukine Drugs 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- ZAHQPTJLOCWVPG-UHFFFAOYSA-N mitoxantrone dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.O=C1C2=C(O)C=CC(O)=C2C(=O)C2=C1C(NCCNCCO)=CC=C2NCCNCCO ZAHQPTJLOCWVPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 229960002530 sargramostim Drugs 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 3
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 3
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000016355 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010092372 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Receptors Proteins 0.000 description 2
- 101000932480 Homo sapiens Fms-related tyrosine kinase 3 ligand Proteins 0.000 description 2
- 101001002709 Homo sapiens Interleukin-4 Proteins 0.000 description 2
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 2
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 2
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 2
- 102000010787 Interleukin-4 Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010038486 Interleukin-4 Receptors Proteins 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 101150052863 THY1 gene Proteins 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 2
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 102000055229 human IL4 Human genes 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000001483 mobilizing effect Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M Butyrate Chemical compound CCCC([O-])=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Natural products CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 description 1
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 108010092408 Eosinophil Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102100028471 Eosinophil peroxidase Human genes 0.000 description 1
- 238000000729 Fisher's exact test Methods 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 101000746367 Homo sapiens Granulocyte colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 101000934338 Homo sapiens Myeloid cell surface antigen CD33 Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102100022297 Integrin alpha-X Human genes 0.000 description 1
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 1
- 108090000177 Interleukin-11 Proteins 0.000 description 1
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 1
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 102000000743 Interleukin-5 Human genes 0.000 description 1
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- 108010002335 Interleukin-9 Proteins 0.000 description 1
- 239000007760 Iscove's Modified Dulbecco's Medium Substances 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 102100033486 Lymphocyte antigen 75 Human genes 0.000 description 1
- 101710157884 Lymphocyte antigen 75 Proteins 0.000 description 1
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- PPQNQXQZIWHJRB-UHFFFAOYSA-N Methylcholanthrene Chemical compound C1=CC=C2C3=CC4=CC=C(C)C(CC5)=C4C5=C3C=CC2=C1 PPQNQXQZIWHJRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 description 1
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 208000000474 Poliomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000007022 RNA scission Effects 0.000 description 1
- 101710146873 Receptor-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- AXIKDPDWFVPGOD-UHFFFAOYSA-O [7-(dimethylamino)phenothiazin-3-ylidene]-dimethylazanium;2-(2,4,5,7-tetrabromo-3,6-dihydroxyxanthen-10-ium-9-yl)benzoic acid Chemical compound C1=CC(=[N+](C)C)C=C2SC3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21.OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C(C=C(Br)C(O)=C2Br)C2=[O+]C2=C1C=C(Br)C(O)=C2Br AXIKDPDWFVPGOD-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000340 anti-metabolite Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 229940100197 antimetabolite Drugs 0.000 description 1
- 239000002256 antimetabolite Substances 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 235000019445 benzyl alcohol Nutrition 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 208000028104 epidemic louse-borne typhus Diseases 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 210000000777 hematopoietic system Anatomy 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000000899 immune system response Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000002434 immunopotentiative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002480 immunoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 210000005210 lymphoid organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 239000004530 micro-emulsion Substances 0.000 description 1
- PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N monothioglycerol Chemical compound OCC(O)CS PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 239000004633 polyglycolic acid Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000037455 tumor specific immune response Effects 0.000 description 1
- 206010061393 typhus Diseases 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0639—Dendritic cells, e.g. Langherhans cells in the epidermis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/515—Animal cells
- A61K2039/5154—Antigen presenting cells [APCs], e.g. dendritic cells or macrophages
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55516—Proteins; Peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/125—Stem cell factor [SCF], c-kit ligand [KL]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/22—Colony stimulating factors (G-CSF, GM-CSF)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/24—Interferons [IFN]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/26—Flt-3 ligand (CD135L, flk-2 ligand)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Virology (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
(57) Anotace:
Použití ligandu flt3 k výrobě farmaceutického prostředku pro zesílení imunitní odpovědi zvýšením počtu dendritíckých buněk, zvláště v případě infekčního, nádorového nebo neoplastíckého onemocnění, přípravek a populace dendritíckých buněk, způsob řízení krvetvorných či progrenitorových buněk a způsob přípravy dendritíckých buněk a buněk T, jakož i adjuvants vakciny a expanzní media dendritíckých buněk.
TV • ·
Použití ligandu flt3, adjuvants vakcíny, expanzní media, přípravek a populace buněk a způsob
Oblast techniky
Tento vynález se týká stimulačního faktoru dendritických buněk, způsobů zvyšování imunitní odpovědi in vivo, způsobů expandování dendritických buněk ex vivo a příprav purifikovaných dendritických buněk a populací dendritických buněk použitelných při manipulaci imunitních odpovědí zprostředkovaných T buňkami a B buňkami.
Tento vynález se zvláště týká použití ligandu flt3 k výrobě farmaceutického prostředku pro zesílení imunitní odpovědi zvýšením počtu dendritických buněk, zvláště v případě infekčního, nádorového nebo neoplastického onemocnění, přípravek a populace dendritických buněk, způsob řízení krvetvorných či progenitorových buněk a způsob přípravy dendritických buněk a buněk T, jakož i adjuvants vakcíny a expanzní media dendritických buněk.
Dosavadní stav techniky
Cílem vakcinace je zajištění účinné imunity vytvořením adekvátních hladin protilátky a populace buněk imunologicky aktivované prvním stykem s antigenem, které mohou rychle expandovat při obnoveném styku s antigenem. První styk s antigenem během vakcinace nesmí příjemce poškozovat a proto se obvykle používá patogenně deficientní antigen.
Častou obtíží při aktivních způsobech imunizace je, že antigen očkovací látky nemá dostatečnou imunogenní schopnost • ·· ·· *♦ · · ·· · • · 9 9 « · > 9 <t Φ Φ · Φ 9 pro podporu silné imunitní odpovědi a tím ani dostatečnou hladinu ochrany proti následnému působení stejného antigenu. Navíc mohou některé antigeny vyvolat pouze slabou buňkami zprostředkovanou či protilátkovou odpověď. Pro mnohé antigeny se požaduje silná humorální odpověď a silná odpověď zprostředkovaná buňkami.
Výzkumníci po desetiletí prováděli experimenty s různými látkami pro zvýšení imunogenní schopnosti vakcín. Imunopotenciační látky, též uváděné jako adjuvantní látky vakcín, jsou prostředky, které napomáhají při vytvoření silné imunitní odpovědi na vakcínu. Navíc relativně slabá imunogenní schopnost některých nových rekombinačních antigenů vyžaduje účinnější adjuvantní látky. Adjuvantní látky vakcín vykazují různé způsoby působení a ovlivňují imunitní odpovědi kvantitativně i kvalitativně. Takové způsoby působení mohou mobilizovat T buňky působící jako depa a podmiňovat cirkulaci lymfocytů tak, aby tyto buňky zůstaly ve vyprazdňovaných lymfatických uzlinách. Mohou též sloužit pro zaměření antigenu na místo imunizace, čímž umožní účinnější interakci T buněk a B buněk specifických pro antigen s buňkami předkládajícími antigen. Mohou též stimulovat proliferaci a diferenciaci T buněk a mají účinky na B buňky, jako je zvýšení tvorby různých izotypů imunoglobulinů. Adjuvantní látky mohou dále stimulovat a ovlivňovat chování buněk předkládajících antigen, zejména makrofágů, zvyšováním jejich účinnosti při předkládání antigenu pro T buňky a B buňky.
Dendritické buňky jsou vzácnou a heterogenní buněčnou populací se zřetelnou morfologií a rozsáhlou tkáňovou distribucí. Diskusi systému dendritických buněk a jeho úlohy při vytváření imunity, která se zde uvádí formou odkazu, uveřejnil Steinman, R. M. v Annu. Rev. Immunol., 9, 271-296 • * (1991). Dendritické buňky mají neobvyklý buněčný povrch a mohou se charakterizovat přítomností markérů buněčného povrchu CDla+, CD4+, CD14“, CD86+, CDllc+, DEC-205+, CD14+ nebo HLA-DR+. Dendritické buňky mají vysokou schopnost sensibilizovať T buňky omezené hlavním histokompatibilitním komplexem a zajišťovat účinnou cestu pro předkládání antigenů T buňkám in šitu, jak vlastních antigenů během vývoje T buňky, tak cizích antigenů během imunitní odpovědi. Proto roste zájem o používání dendritických buněk ex vivo jako adjuvantních látek vakcin při tumorech nebo infekčních onemocněních, viz například Romani a kol., J. Exp. Med., 180, 83 (1994). Použití dendritických buněk jako imunostimulačních prostředků bylo omezené vzhledem k nízkému výskytu dendritických buněk v periferní krvi, omezené přístupnosti k lymfoidním orgánům a k terminálnímu stavu diferenciace dendritických buněk. Dendritické buňky vznikají z progenitorových buněk kostní dřeně CD34+ a proliferace a zrání dendritických buněk se může zvýšit cytokiny, jako je GM-CSF (sargramostim, LeukineR, Immunex Corporation, Seattle, Washington), TNF-α, ligand c-kit [též známý jako faktor kmenových buněk (SCF)], steel faktor (SF) nebo faktor růstu žírných buněk (MGF) a interleukin 4. Proto by měl prostředek stimulující vytváření velkého množství funkčně zralých dendritických buněk in vivo nebo in vitro značnou důležitost.
Je známo, že ligand flt3 (ligand flt3 neboli flt3-L) ovlivňuje krvetvorné kmenové a progenitorové buňky. Překvapivě se zjistilo, že ligand flt3 může též s vysokou účinností stimulovat tvorbu následně vytvářených či intermediárních buněk, jako jsou myeloidní prekurzorové buňky, monocyty, makrofágy, B buňky a dendritické buňky z progenitorových buněk kostní dřeně CD34+ a kmenových buněk.
• · • · · ·· • ♦ t · «· • 4 Φ ···· · • · · · · ······· ·· ·♦
- 3a Tento vynález se týká způsobu mobilizace dendritických buněk in vivo, expandování dendritických buněk ex vivo a purifikovaných přípravků dendritických buněk. Přípravky purifikovaných dendritických buněk podle tohoto vynálezu by mohly být použitelné jako adjuvantní prostředky pro vakcíny. Ztělesnění tohoto vynálezu také zahrnují způsob přípravy T buněk specifických pro antigen s použitím dendritických buněk mobilizovaných ligandem flt3.
Podstata vynálezu
Předmětem tohoto vynálezu je použití ligandu flt3 k výrobě farmaceutického prostředku pro zesílení imunitní odpovědi zvýšením počtu dendritických buněk. Při výhodném provedení jde o použití ligandu flt3, jakož i jedné nebo více látek vybraných ze skupiny zahrnující GM-CSF, IL-4, TNF-a, IL-3, ligand c-kit a fúze GM-CSF s IL-3 k výrobě farmaceutického prostředku pro zesílení imunitní odpovědi zvýšením počtu dendritických buněk.
Zvláštní forma použití ligandu flt3 podle tohoto vynálezu vede k výrobě farmaceutického prostředku pro zesílení imunitní odpovědi v případě infekčního onemocnění zvýšením počtu dendritických buněk, přičemž obzvláště výhodné je použití ligandu flt3, jakož i jedné nebo více látek vybraných ze skupiny zahrnující GM-CSF, IL-4, TNF-α, IL-3, ligand c-kit a fúze GM-CSF s IL-3 k výrobě farmaceutického prostředku pro zesílení imunitní odpovědi v případě infekčního onemocnění zvýšením počtu dendritických buněk.
* • · · « • ·
3b
Výhodná forma použití ligandu flt3 podle tohoto vynálezu, jakož i jedné nebo více látek vybraných ze skupiny zahrnující GM-CSF, IL-4, TNF-α, IL-3, ligand c-kit a fúze GM-CSF s IL-3 vede k výrobě farmaceutického prostředku pro zesílení imunitní odpovědi v případě infekčního onemocnění způsobeného HIV zvýšením počtu dendritických buněk.
Dalším znakem tohoto vynálezu je použití ligandu flt3 k výrobě farmaceutického prostředku pro zesílení imunitní odpovědi v případě nádorového nebo neoplastického onemocnění zvýšením počtu dendritických buněk. Výhodná forma spočívá v použití ligandu flt3, jakož i jedné nebo více látek vybraných ze skupiny zahrnující GM-CSF, IL-4, TNF-α, IL-3, ligand c-kit a fúze GM-CSF s IL-3 k výrobě farmaceutického prostředku pro zesílení imunitní odpovědi v případě nádorového nebo neoplastického onemocnění zvýšením počtu dendritických buněk.
Přípravek dendritických buněk pdle tohoto vynálezu obsahuje nejméně dva buněčné povrchové markéry zvolené ze skupiny CDla, HLA-DR a CD86 vytvořené stykem krvetvorných kmenových či progenitorových buněk s ligandem fit3.
V přípravku dendritických buněk podle vynálezu se tyto buňky s výhodou dále vytvářejí stykem krvetvorných kmenových či progenitorových buněk s látkou zvolenou ze skupiny GM-CSF, IL-4, TNF-α, IL-3, ligand c-kit a fúze GM-CSF s IL-3.
Podstata populace dendritických buněk exprimujících antigen podle vynálezu spočívá v tom, že se tyto buňky získají způsobem, který obsahuje kroky
3C (a) styku krvetvorných kmenových či progenitorových buněk s ligandem flt3 v množství dostatečném pro vytvoření populace dendritických buněk, (b) bud’ (i) expozice dendritických buněk peptidu specifickému pro antigen nebo (ii) přenosu genu kódujícího peptid specifický pro antigen na dendritické buňky, (c) umožnění dendritickým buňkám zpracovat a exprimovat antigen a (d) puřifikace dendritických buněk exprimujících antigen.
Výhodným znakem populace dendritických buněk podle tohoto vynálezu je, že krok (a) tohoto způsobu dále zahrnuje styk krvetvorných kmenových či progenitorových buněk s molekulou zvolenou ze skupiny GM-CSF, IL-4, TNF-α, IL-3, ligand c-kit a fúze GM-CSF s IL-3.
Způsob řízení krvetvorných či progenitorových buněk k vytváření linie dendritických buněk podle tohoto vynálezu zahrnuje styk těchto krvetvorných kmenových či progenitorových buněk s ligandem flt3.
Způsob přípravy populace dendritických buněk předkládajících antigen spočívá podle tohoto vynálezu v tom, že zahrnuje kroky (a) styku krvetvorných kmenových či progenitorových • ·
- 3d buněk s ligandem flt3 v množství dostatečném pro vytvoření populace dendritických buněk, (b) bud (i) expozice dendritických buněk peptidu specifickému pro antigen nebo (ii) přenosu genu kódujícího peptid specifický pro antigen na dendritické buňky, (c) umožnění dendritickým buňkám zpracovat a exprimovat antigen a (d) purifikace dendritických buněk exprimujících antigen.
Výhodným znakem způsobu podle tohoto vynálezu je, že krok (a) dále zahrnuje styk krvetvorných kmenových či progenitorových buněk s látkou zvolenou ze skupiny obsahující GM-CSF, IL-4, TNF-α, IL-3, ligand c-kit a fúze GM-CSF s IL-3.
Dalším znakem tohoto vynálezu je způsob přípravy T buněk specifických pro antigen, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje kroky (a) styku krvetvorných kmenových či progenitorových buněk s ligandem flt3 v množství dostatečném pro vytvoření populace dendritických buněk, (b) bud’ (i) expozice dendritických buněk peptidu specifickému pro antigen nebo (ii) přenosu genu kódujícího peptid specifický pro antigen na dendritické buňky,
- 3e - (c) umožnění dendritickým buňkám zpracovat a exprimovat antigen a (d) umožnění dendritickým buňkám presentovat antigen T buňkám.
Dalším znakem tohoto vynálezu je použití ligandů flt3, jakož i antigenu vakciny k výrobě farmaceutického prostředku k zesílení imunitní odpovědi na antigen vakciny.
Předmětem tohoto vynálezu také je adjuvans vakciny, který obsahuje látku vybranou jako ligand c-kit nebo ligand flt3.
Tento vynález je také zaměřen na použití ligandů flt3 k výrobě farmaceutického prostředku pro indukci tolerance tkáně štěpu zvýšením počtu dendritických buněk.
Konečně ještě dalším znakem tohoto vynálezu jsou expanzní média dendritických buněk, která obsahují účinné množství ligandů flt3 a cytokin zvolený ze skupiny IL-3, IL-4, GM-CSF, TNF, ligand c-kit a proteiny fúze GM-CSF/IL-3.
- 4 Tento vynález zajišťuje použití účinného množství ligandu flt3 pro zvýšení či mobilizaci množství intermediárních buněk in vivo, například v periferní krvi, tkáních nebo orgánech pacienta. I když vynález se vztahuje ke tvorbě velkého počtu těchto následně vznikajících a intermediárních buněk (například myeloidních buněk, monocytů a makrofágů) z buněk CD34+ s použitím ligandu flt3, hlavní zaměření vynálezu se týká dendritických buněk. Zvyšováním množství dendritických buněk pacienta lze využít tyto buňky samotné k tomu, aby předkládaly antigen T buňkám. Tímto antigenem může být například takový antigen, který již existuje u nemocného, jako je antigen tumoru, bakterie či viru. Ligand flt3 se tedy může využít pro zvýšení počtu dendritických buněk in vivo k posílení imunitní odpovědi nemocného proti existujícím antigenům. Alternativně může být ligand flt3 podáván před podáváním antigenu nemocnému za účelem imunizace nebo současně s tímto podáváním. Ligand fit3 jako adjuvant vakciny může tedy vytvářet velké množství dendritických buněk a ostatních intermediárních buněk in vivo k účinnějšímu předkládání antigenu. Celkovým výsledkem je silnější a zlepšená imunitní odpověď a účinnější imunizace proti danému antigenu.
Tento vynález též poskytuje způsob tvorby velkého množství dendritických buněk ex vivo. Po sběru pacientových krvetvorných progenitorových buněk CD34+ a kmenových buněk lze ligand flt3 použít pro expandování těchto buněk in vitro (též známo jako expandování ex vivo) a pro řízení těchto buněk CD34+ k diferenciaci na dendritické buňky lymfoidní či myeloidní linie. Výsledný zachycený materiál dendritických buněk se může podávat pacientům pro zajištění silnější a zlepšené imunitní odpovědi na antigen. Alternativně se mohou výsledné dendritické buňky používat jako adjuvans « 9 • ♦ · · ·
- 5 vakciny a mohou se podávat před podáváním antigenů, současně s tímto podáváním anebo následně po tomto podávání.
Tento vynález též poskytuje způsob tvorby velkých množství dendritických buněk předkládajících antigen ex vivo. Po odběru pacientových krvetvorných progenitorových buněk a kmenových buněk CD34+ lze použít ligand flt3 pro expandování těchto buněk in vitro a pro řízení těchto buněk CD34+ k diferenciaci na dendritické buňky. Výsledný materiál dendritických buněk se poté exponuje k antigenů a umožní se zpracování a předložení antigenů in vitro (tento postup se někdy v oboru nazývá pulsování antigenů). Alternativní metodou přípravy dendritických buněk předkládajících antigen je přenos dendritických buněk s genem kódujícím polypeptid specifický pro antigen. Když dendritické buňky exprimují antigen, mohou se tyto dendritické buňky předkládající antigen podávat pacientovi.
Tento vynález též poskytuje přípravu T buněk specifických pro antigen ex vivo. Podle výše uvedených způsobů přípravy velkého množství dendritických buněk předkládajících antigen ex vivo se používají odebírané dendritické buňky předkládající antigen pro vytváření T buněk specifických pro antigen z panenských T buněk, které byly pacientovi odebrány. Po adekvátním předložení antigenů vytvořeným T buňkám je možno pacientovi podat T buňky specifické pro daný antigen.
Tento vynález též poskytuje způsob zesílení imunitní odpovědi u pacienta, který má některé infekční onemocnění, který spočívá ve způsobu zahrnujícím krok podání množství ligandu flt3 dostatečného pro zvýšení počtu dendritických buněk pacienta.
99 9 9 9 9 9 9 99 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9
9999 9 9999 9 999
9 · 9 9 9 99 999 9 9 · · · · · ··· ······ · · ·· 99 9 9
- 6 Tento vynález též poskytuje způsob pro zesílení imunitní odpovědi u pacienta, který trpí rakovinovým nebo neoplastickým onemocněním, který spočívá ve způsobu zahrnujícím krok podávání množství ligandů flt3 dostatečného pro zvýšení počtu dendritických buněk pacienta. Tento způsob zajišťuje prostředky pro zvýšení imunitní odpovědi pacienta specifické pro daný nádor.
Způsob pro zvýšení autoimunitní tolerance pacienta spočívá v tom, že zahrne krok podávání množství ligandů flt3, které je dostatečné pro zvýšení počtu dendritických buněk pacienta. Dále zahrnuje způsoby podpory přežívání štěpů a transplantovaných tkání a orgánů.
Způsoby podle tohoto vynálezu mohou dále zahrnovat použití účinného množství cytokinů v následné nebo současné kombinaci s podáváním ligandů flt3. Takové cytokiny zahrnují, avšak bez omezení na tyto vyjmenované látky, interleukiny IL-3 a IL-4, faktor stimulující tvorbu kolonií (OSF) zvolený ze skupiny obsahující faktor stimulace tvorby kolonií granulocytů-makrofágů (GM-CSF) nebo fúze GM-CSF/IL-3 nebo další cytokiny, jako je TNF-α nebo ligand c-kit.
Tento vynález dále zahrnuje média pro expanzi dendritických buněk, autologní sérum a ligand flt-3, samotný či v kombinaci s některým cytokinem ze skupiny vyjmenované výše.
Následuje podrobný popis vynálezu.
Tento vynález se zaměřuje na použití ligandů flt3 pro vytvoření velkých počtů intermediárních buněčných typů • ·
- 7 z krvetvorných progenitorových buněk a kmenových buněk CD34+. Takové intermediární buněčné typy zahrnují myeloidní buňky, monocyty, makrofágy, B buňky a dendritické buňky. Velké počty těchto intermediárních buněčných typů se normálně in vivo nenacházejí a mohou se vytvářet podáváním ligandu flt3. Takové zvýšení celkového počtu buněk může u hostitele zesilovat imunitní odpověď na antigen. Dalším ztělesněním tohoto vynálezu je izolace a použití těchto intermediárních buněčných typů jako buněk předkládajících antigen nebo jejich použití jako adjuvantních prostředků vakcín. Tento vynález, i když se zvláště zaměřuje na ztělesnění týkající se dendritických buněk, je též použitelný na myeloidní, monocytární a makrofágní buněčné typy.
Termín ligand flt3, jak se zde používá, se vztahuje k rodu polypeptidů, který se popisuje v US patentu č.
554 512 a v publikacích EP 0 627 487 A2 a WO 94/28391, které se zde všechny uvádějí formou odkazu. Lidská cDNA ligandu flt3 byla uložena v Americké typové sbírce kultur (Američan Type Culture Collection, ATCC), Rockville, Maryland, USA dne 6. srpna 1993 s přidělením přírůstkového čísla ATCC 69382. Provedení tohoto uložení odpovídalo podmínkám Budapešťské dohody. Ligand flt3 se může připravit podle způsobů popsaných ve výše citovaných publikacích.
Termín IL-3 (interleukin 3) se vztahuje k rodu polypeptidů interleukinu 3, jak se popisuje v US patentu č. 5 108 910, který se zde uvádí formou odkazu. Takové polyptidy zahrnují analogy, které mají sekvence aminokyselin, které jsou podstatným způsobem podobné sekvencím aminokyselin nativního humánního interleukinu 3 uveřejněným například v publikacích EP č. 275 598 a 282 185, které se zde obě uvádějí formou odkazu. Termín IL-3 (interleukin 3) rovněž
- 8 zahrnuje analogy a alely molekul IL-3, které vykazují nejméně určitou biologickou aktivitu společnou s aktivitou nativního humánního IL-3. Příklady analogů interleukinu 3 jsou uveřejněny v publikaci EP č. 282 185. Ostatní formy IL-3 zahrnují lidský IL-3[Pro8Asp15Asp70], lidský
IL-3[Ser8Asp^^Asp7®] a lidský IL-3[Ser8]. Sekvence deoxyribonukleové kyseliny kódující lidský IL-3 vhodný pro použití podle tohoto vynálezu je veřejně dostupná u Američan Type Culture Collection (ATCC) pod přírůstkovým číslem ATCC 67747. Nomenklatura, která se zde používá vzhledem k sekvencím aminokyselin v hranatých závorkách, označuje, které aminokyseliny se liší od nativní humánní formy. Například lidský IL-3[Ser8Asp15Asp70] se vztahuje k lidskému proteinu IL-3, ve kterém se aminokyselina 8 změnila na serinový zbytek, aminokyselina 15 se změnila na zbytek kyseliny aspartové a aminokyselina 70 se změnila na zbytek kyseliny aspartové.
Termín IL-4 (interleukin 4) se týká polypeptidů popsaného v publikacích Mosley a kol., Cell 59., 335 (1989), Idzerda a kol., J. Exp. Med., 171, 861 (1990) a Galizzi a kol., Intl. Immunol., 2, 669 (1990), které se zde všechny zahrnují formou odkazu. Tento polypeptid IL-4 zahrnuje analogy mající sekvenci aminokyselin podobnou sekvenci aminokyselin nativního lidského IL-4 popsané autory Mosley a kol., Idzerda a kol. a Galizzi a kol·., které jsou biologicky aktivní v tom smyslu, že jsou schopné se vázat na receptor IL-4, přenášet biologický signál spouštěný vazbou na receptor IL-4 nebo způsobovat zkříženou reakci s protilátkami proti IL-4. Termín IL-4 též zahrnuje analogy lidských nativních molekul IL-4 postačující pro zachování biologické aktivity nativního humánního IL-4.
·· ·♦
Termín GM-CSF, jak se zde používá, se týká rodu proteinů popsaných v US patentech č. 5 108 910 a 5 229 496, které se zde oba zahrnují formou odkazu. Takové proteiny zahrnují analogy, které mají sekvenci aminokyselin, která se podstatným způsobem podobá nativním lidským sekvencím aminokyselin GM-CSF (přístupná pro veřejnost například pod přírůstkovými čísly ATCC 53157 nebo ATCC 39900), které jsou biologicky aktivní v tom smyslu, že jsou schopné se vázat na receptor GM-CSF, přenášet biologický signál spouštěný vazbou na receptor GM-CSF nebo zkříženě reagovat s protilátkami proti GM-CSF. Sekvence aminokyselin jsou například uveřejněné v práci Anderson a kol., Proč. Nati. Acad. Sci., USA 82, 6250 (1985). Komerčně dostupný GM-CSF (sargramostim, LeukineR) lze obdržet od Immunex Corp., Seattle, WA. Termín GM-CSF též zahrnuje analogy nativních humánních molekul GM-CSF popsaných v US patentech č. 5 108 910 a 5 229 496 dostatečné pro zachování biologické aktivity nativního humánního GM-CSF. Příklady analogů GM-CSF zahrnují látky popsané v publikacích EP č. 212 914 a WO 89/03881, které se zde obě uvádějí formou odkazu. Ostatní analogy GM-CSF se mohou též použít pro vytváření proteinů vzniklých fúzí s IL-3. Sekvence deoxyribonukleové kyseliny kódující zvláště upřednostňovaný protein GM-CSF s odstraněnými místy možné glykosylace je přístupná pro veřejnost u ATCC pod přírůstkovým číslem ATCC 67231.
Termín proteiny vzniklé fúzí GM-CSF/IL-3 znamená C-terminální až N-terminální fúzi GM-CSF a IL-3. Proteiny vzniklé fúzí jsou známé a popisují se v US patentech č.
199 942, 5 108 910 a 5 073 627, které se zde všechny uvádějí formou odkazu. Preferovaným proteinem vzniklým fúzí je PIXY321, jak se popisuje v US patentu č. 5 199 942.
• · · · · ·· · · · · · · ♦ · · · · · · · · · · · ··· · ··· • ··· ·· ·· ···· · • · ···· ··· ······ ·· ·· ·· ··
Termín ligand c-kit, též známý jako faktor růstu žírných buněk (MGF), steel faktor nebo faktor kmenových buněk (SCF), se vztahuje k polypeptidu popsanému v publikaci EP 423 980, která se zde zahrnuje formou odkazu, a která nárokuje prioritu z přihlášky, na kterou byl udělen US patent č. 589 701, podané dne 1. října 1990. Takový polypeptid ligandu c-kit zahrnuje analogy, které mají sekvenci aminokyselin, která je v podstatě podobá sekvencím aminokyselin nativního humánního ligandu c-kit popsaným v EP 423 980 a které jsou biologicky aktivní tím, že jsou schopné se vázat na receptor c-kit, přenášet biologický signál spouštěný vazbou na receptor c-kit nebo poskytovat zkříženou reakci s protilátkami proti ligandu c-kit. Termín ligand c-kit rovněž zahrnuje analogy molekul nativního humánního ligandu c-kit dostatečné pro zachování biologické aktivity přirozeného humánního humánního ligandu c-kit.
Termín adjuvans a výrazy od toho odvození se týkají látky, která zvyšuje, zesiluje nebo umocňuje imunitní odpověd’ hostitele na antigen vakciny.
Způsob expanze ex vivo krvetvorných kmenových a progenitorových buněk se popisuje v US patentu č.
199 942, který se zahrnuje zde formou odkazu. Tento termín ve stručnosti znamená způsob zahrnující:
(1) sběr krvetvorných kmenových a progenitorových buněk CD34+ od pacienta z odběru periferní krve nebo kostní dřeně a (2) expandování takových buněk ex vivo.
Navíc k buněčným růstovým faktorům popsaným v US • · • · ♦ ·
- 11 patentu č. 5 199 942 lze použít i jiné faktory, jako je ligand flt3, IL-1, IL-3 nebo ligand c-kit.
Termín imunogenní účinnost znamená relativní účinnost imunogenu nebo antigenu při indukci imunitní odpovědi.
Termín v podstatě podobný znamená variantu sekvence aminokyselin, přednostně takovou, která je alespoň z 80 % totožná se sekvencí nativních aminokyselin, ještě lépe, která je totožná z 90 %. Procentuální totožnost se může například stanovit srovnáním sekvenční informace s použitím počítačového programu GAP, verze 6.0, jak popsal Devereux a kol. [Nucl. Acids Res., 12, 387 (1984)], který je k dispozici u University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). Program GAP využívá způsob seřazení podle Needlemana a Wunsche [J. Mol. Biol., 48, 443 (1970)] ve formě revidované Smithem a Watermanem [Adv. Appl. Math, 2, 482 (1981)]. Preferované parametry standardního nastavení pro program GAP zahrnuj í:
(1) jednočlennou srovnávací matici (obsahující hodnotu 1 pro shody a 0 pro neshody) pro nukleotidy a matici váženého srovnávání podle Gribskova a Burgesse, Nucl. Acids Res., 14, 6745 (1986), jak se popisuje v publikaci Schwartz a Dayhoff (redakce), Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, str. 353 až 358 (1979 ) , (2) odečtení hodnoty 3.0 za každou mezeru a další hodnoty 0,10 za každý symbol v každé mezeře, a (3) žádné odečtení pro koncové mezery.
·· ·· ·· • · ·
Varianty mohou zahrnovat konzervativně substituované sekvence, což znamená, že daný zbytek aminokyseliny je nahrazen zbytkem, který má podobné fyzikálně chemické vlastnosti. Příklady konzervativních substitucí zahrnují nahrazení jednoho alifatického zbytku druhým, jako je záměna Ile, Val, Leu nebo Ala navzájem nebo substituce jednoho polárního zbytku druhým, jako například mezi Lys a Arg, Glu a Asp nebo Gin a Asn. Jsou dobře známé i jiné konzervativní substituce, například substituce celých oblastí majících podobné hydrofobní vlastnosti. Tento vynález též zahrnuje varianty, které se vyskytují přirozeně. Příklady takových variant jsou proteiny, které vznikají ze střídavých dějů štěpení informační ribonukleové kyseliny nebo z proteolytického štěpení nativního proteinu s podmínkou, že je zachována nativní biologická vlastnost.
Pojem vakcína (očkovací látka), jak se zde používá, znamená organismus nebo materiál, který obsahuje antigen v očkovací formě. Vakcína je určena pro spuštění imunoprotektivní odpovědi. Vakcína může být rekombinantní nebo nerekombinantní. Při naočkováni neimunnímu hostiteli vakcína provokuje aktivní imunitu organismu či materiálu, avšak nezpůsobí onemocnění. Vakcína může mít například formu toxoidu, který je definován jako toxin, který byl detoxifikován, avšak dosud si zachovává své hlavní imunogenní determinanty, nebo formu usmrceného organismu, jako jsou organismy způsobující tyfus, choleru a poliomyelitidu, nebo formu oslabených organismů, které jsou živé, avšak nejsou virulentní, formy patogenů nebo mohou mít zakódovaný antigen pomocí takového organismu, nebo může být ve formě živých nádorových buněk či antigenu přítomného na nádorové buňce.
Je známá řada způsobů selekce buněk pro identifikaci • φφφφ φ · ·· ·· φ · φφφ ··· ···· • · φ φ φ φφφφ · φ φ · • ··· ·· ·· · · · · · • · ···· ··· φφφ φφφ φφ ·· φφ φφ a separaci krvetvorných kmenových či progenitorových buněk CD34+ z populace buněk. Metody a materiály pro identifikaci a selekci těchto typů buněk jsou známé. Například lze použít monoklonální protilátky pro vazbu na protein markéru nebo povrchový antigenní protein přítomný na kmenových či progenitorových buňkách. Takové markéry nebo buněčné povrchové antigeny pro krvetvorné kmenové buňky zahrnují CD34 a Thy-1. V jednom způsobu se protilátky fixují na určitý povrch, například na skleněné kuličky a přivedou do styku se směsí buněk, o kterých se předpokládá, že obsahují kmenové buňky. To umožňuje, aby protilátky vázaly a zajistily kmenové buňky na skleněných kuličkách. Alternativně lze inkubovat protilátky se směsí buněk a výslednou kombinaci uvést do styku s povrchem majícím afinitu ke komplexu protilátka-buňka. Nežádoucí buňky a buněčná hmota se odstraní a získá se relativně čistá populace kmenových buněk. Kmenové nebo progenitorové buňky mající markér CD34 představují pouze okolo 1 až 3 % mononukleárních buněk v kostní dřeni. Množství kmenových nebo progenitorových buněk CD34+ v periferní krvi je zhruba desetkrát až stokrát menší než v kostní dřeni.
Vzhledem ke konkrétním aspektům tohoto vynálezu bude volba vhodných kmenových či progenitorových buněk záviset na žádaném fenotypu buňky, která se má izolovat. Krvetvorné kmenové buňky se mohou vybírat na základě jejich fyzikálních vlastností, jako je exprimování receptorů flt3 vázaného na membránu nebo přítomnost buněčných markérů CD34 nebo Thy-1. Monoklonální protilátky, které rozpoznávají kterýkoliv z těchto antigenů, se popisují v US patentu č. 4 714 680 (protilátka proti My-10), který se zde zahrnuje formou odkazu. Protilátka proti CD34 je komerčně dostupná u Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, a monoklonální protilátku proti Thy-1 lze snadno připravit s použitím způsobů popsaných ·· φ φφφ φφφφ • · · · · Φ Φ φ φ 9 φφφ • ··♦ Φ · φφ Φ Φ Φ φ φ • Φ ΦΦΦΦ ΦΦΦ ··· ··· ΦΦ ΦΦ ΦΦ φφ autory Dalchau a kol., J. Exp. Med., 149, 576 (1979), jak se uvádí zde formou odkazu. Lze též použít proteiny vázající receptor flt3, jako jsou monoklonální protilátky proti flt3 nebo ligand flt3. Protein vázající se na buňku se přivádí do styku s odebranou směsí buněk a tato kombinace se ponechá inkubovat po dobu dostatečnou pro umožnění vazby žádané buňky na protein, který se váže na buňku.
Alternativním způsobem selekce klidových kmenových buněk je usmrcení dělících se buněčných typů více zaměřených na tvorbu linie s použitím antimetabolitu, jako je 5-fluoruracil (5-FU), nebo alkylačního činidla, jako je 4-hydroxycyklofosfamid (4-HC). Neklidové buňky se stimulují k proliferaci a diferenciaci přídavkem růstových faktorů, které mají malý účinek nebo nemají žádný účinek na kmenové buňky a způsobují proliferaci a diferenciaci nekmenových buněk a činí je zranitelnějšími cytotoxickými účinky 5-FU nebo 4-HC, viz Berardi a kol., Science, 267, 104 (1995), která se zde zahrnuje formou odkazu.
Izolace krvetvorných kmenových nebo progenitorových buněk se může například provést s použitím afinitní chromatografie, magnetických kuliček potažených protilátkou nebo protilátek fixovaných na pevné matrici, jako jsou skleněné kuličky, baňky a tak dále. Protilátky, které rozpoznávají povrchový markér kmenové nebo progenitorové buňky, se mohou připojit nebo konjugovat k jiným chemickým zbytkům, jako je biotin, které se mohou odstranit pomocí avidinového nebo streptavidinového zbytku připojeného na pevnou podložku, fluorochromů použitelných pro fluorescenčně aktivované třídění buněk (FACS) či podobně. Přednostně se izolace provádí pomocí imunoafinitniho sloupce. Imunoafinitní sloupce mohou být v jakékoliv formě, avšak obvykle zahrnují ··
- 15 reaktor s náplňovou vrstvou. Náplňová vrstva v těchto bioreaktorech je přednostně zhotovena z porézního materiálu, který se opatří v podstatě jednotným povlakem substrátu. Tento porézní materiál, který poskytuje vysoký poměr plochy povrchu k objemu, umožňuje průchod směsi buněk velkou kontaktní plochou, aniž by bránil průchodu buněk mimo vrstvu. Typické substráty zahrnují avidin a streptavidin, i když lze použít i jiné konvenční substráty. Substrát by měl, buď díky svým vlastním vlastnostem nebo díky přídavku některého chemického zbytku, vykazovat vysokou afinitu ke zbytku přítomnému na proteinu vázajícího se k buňkám, jako je monoklonální protilátka. Monoklonální protilátky rozpoznávají buněčný povrchový antigen na buňkách, které se mají separovat, a jsou obvykle dále modifikovány na biotinový zbytek. Je dobře známo, že biotin má vysokou afinitu k avidinu a afinita těchto látek tak zajišťuje připojení monoklonální protilátky k povrchu náplňové vrstvy s možností jejího odstranění. Takové sloupce jsou v oboru dobře známy, viz Berenson a kol., J. Cell Biochem., 10D, 239 (1986).
Sloupec se promyje fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem pro odstranění nenavázaného materiálu. Cílové buňky se mohou z náplně uvolnit s použitím konvenčních způsobů. Imunoafinitiní sloupce výše popsaného typu, které používají biotinylované monoklonální protilátky proti CD34 připojené k náplňové vrstvě potažené avidinem, se popisují například v PCT publikaci č. WO 93/08268. Varianta této metody používá proteiny vázající se na buňky, jako jsou výše popsané monoklonální protilátky nebo ligand flt3, které jsou připojené v izolačních prostředcích na fixovaný povrch s možností jejich odstraněni. Navázaný protein vázající se na buňky je přiveden do kontaktu s odebranou směsí buněk a ponechán inkubovat po dobu dostatečnou k umožnění izolace žádaných buněk.
Alternativně lze monoklonální protilátky rozpoznávající buněčné povrchové antigeny značit fluorescenční značkou, jako je například chromofor či fluorofor a separovat tříděním buněk podle přítomnosti, nepřítomnosti či množství značeného produktu.
Odebrané buňky CD34+ se potom exponují buď k samotnému ligandů flt3 nebo ligandů flt3 v současné či následné kombinaci s jedním nebo více následujícími cytokiny: GM-CSF, TNF-α, IL-3, IL-4, ligand c-kit nebo proteiny vzniklé fúzí GM-CSF/IL-3. Buňky CD34+ se potom ponechají diferenciovat s tvorbou buněk dendritické linie. Dendritické buňky se sbíráj i a mohou se buď (a) podat pacientovi pro posílení imunitního systému a imunitních odpovědí na antigen zprostředkovaných T buňkami a B buňkami, (b) vystavit působení antigenu před podáním dendritických buněk pacientovi, (c) opatřit genem kódujícím polypeptid specifický pro antigen nebo (d) vystavit účinku antigenu a potom zpracovat a předložit antigen ex vivo T buňkám odebraným od pacienta a poté podat apcientovi T buňky specifické pro antigen.
Konkrétněji tento vynález poskytuje použití účinného množství ligandů flt3 pro zvýšení nebo mobilizaci dendritických buněk in vivo, například v periferní krvi nebo jiných tkáních či orgánech pacienta, jako je slezina. Zvýšením množství dendritických buněk pacienta se mohou tyto buňky • ·
- 17 samy o sobě použít pro předložení antigenu T buňkám. Antigenem může být například ten, který je již přítomen v těle pacienta, jako je antigen tumoru nebo bakteriální či virový antigen. Proto lze ligand flt3 použít pro posílení imunitní odpovědi pacienta zprostředkované lymfocyty (například zprostředkované T buňkami nebo B buňkami) nebo pro posílení imunitní odpovědi zprostředkované myeloidními buňkami na již přítomné antigeny, čímž se umožňuje účinnější předložení antigenu T buňkám pacienta. Alternativně lze ligand fit3 podat před podáním antigenu pacientovi za účelem imunizace nebo současně s tímto podáním či následně po tomto podání. Adjuvans očkovací látky, ligand flt3, může tedy vytvářet značné množství dendritických buněk in vivo pro účinnější předložení antigenu. Celkovým výsledkem je silnější a zlepšená imunitní odpověď a účinnější imunizace proti antigenu.
Systémové podání ligandu flt3 je nejen účinné jako adjuvantní prostředek očkovací látky, avšak, jak bylo diskutováno výše, je též účinné při posilování imunitní odpovědi proti dříve přítomným antigenům. Původci tohoto vynálezu například ukázali, že podání ligandu flt3 myším s tumorem vede nejméně k významnému poklesu rychlosti růstu tumoru a může vést u značného podílu zvířat k odhojení tumoru. Tyto údaje se podrobněji uvádějí v příkladu 3. Ligand flt3 je proto důležitým cytokinem při vytváření účinné imunitní odpovědi in vivo proti antigenům.
Vzhledem ke své schopnosti vytvářet dendritické buňky nachází ligand flt3 též své použití při podpoře přežívání transplantované tkáně či orgánů. Když jsou příjemci transplantovány alogenní orgány či jiné tkáně, mohou přenést kmenové buňky, nezralé dendritické buňky a zralé dendritické ·
• · · · · · • · · · · · · · buňky od dárce. Tyto buňky se nazývají passenger cells a mohou proniknout do krvetvorného systému příjemce. Navíc mohou kmenové buňky, nezralé dendritické buňky a zralé dendritické buňky z příjemce proniknout do orgánu nebo tkáně dárce. Potom je možno určit toleranci mezi štěpem a příjemcem, jelikož nezralé dendritické buňky z tkáně příjemce a dárce interagují s T buňkami z druhé strany. Tato interakce může zahrnovat vypuštění T buněk, které rozpoznávají hlavní histokompatibilní komplex (MHC), který předkládají dendritické buňky. Tímto způsobem jsou buňky dárce prosety, takže nejsou schopny rozpoznávání a reakce proti příjemci (to jest nedochází k onemocnění následkem reakce mezi štěpem a příjemcem) a T buňky příjemce jsou prosety takovým způsobem, že nejsou schopny rozpoznávat a reagovat proti štěpu (to jest nedochází k odmítnutí štěpu). Tím lze dosáhnout vzájemné tolerance a zlepší se přijetí štěpu.
Podání ligandu flt3 příjemci nebo dárci před transplantací by vytvořilo zvýšené počty dendritických buněk u tohoto příjemce či dárce a umožnilo zvýšenou toleranci a přežití štěpu.
Pro růst a pěstování dendritických buněk lze užít řadu růstových a živných prostředí a složení těchto prostředí může snadno určit ten, kdo má běžnou zkušenost v oboru. Vhodná růstová média jsou roztoky obsahující živiny nebo metabolické přídavky a zahrnují média ochuzená o sérum nebo založená na séru. Reprezentativními příklady růstových médií jsou RPMI, TC 199, Dulbeccovo médium modifikované Iscovem [Iscove a kol., F. J. Exp. Med., 147, 923 (1978)], DMEM, Fischerovo médium alfa, NCTC, F-10, Leibovitzovo médium L-15, MEM a McCoyovo médium. Konkrétní příklady živin, které jsou snadno zřejmé pro toho, kdo má zkušenost v oboru, zahrnují sérumalbumin, transferrin, lipidy, cholesterol, redukční přípravek, jako je 2-merkaptoethanol nebo monothioglycerol, • · · ·
- 19 pyruvát, butyrát a některý glukokortikoid, jako je hydrokortison-2-hemisukcinát. Ještě konkrétněji zahrnují standardní média zdroj energie, vitamíny nebo jiné organické sloučeniny podporující buňky, pufr, jako je HEPES nebo Tris, který působí stabilizaci pH prostředí, a různé anorganické soli. Zvláště se poskytuje odkaz na PCT publikaci č. WO 95/00632, ve které se popisuje řada buněčných růstových médií bez obsahu séra, přičemž tento odkaz se zahrnuje do stavu techniky.
Pro kterýkoliv ze způsobů ex vivo podle tohoto vynálezu se progenitorové buňky periferní krve (PBPC) a kmenové buňky periferní krve (PBSC) sbírají s použitím postupů aferézy známých v oboru, viz například Bishop a kol., Blood, 83(2) , 610-616 (1994). Stručně uvedeno se progenitorové buňky periferní krve a kmenové buňky periferní krve sbírají s použitím konvenčních zařízení, například zařízení pro aferézu Haemonetics Model V50 (Haemonetics, Braintree, MA). Čtyřhodinové sběry se obvykle neprovádějí častěji než 5x týdně až do obdržení například zhruba 6,5 x 108 mononukleárních buněk (MNC)/kg hmotnosti pacienta. Buňky se suspendují ve standardním prostředí a poté se centrifugují pro odstranění červených krvinek a neutrofilů. Buňky přítomné na rozhraní mezi dvěma fázemi (v oboru též známé jako buffy coat) se odeberou a resuspendují v HBSS. Suspendované buňky jsou převážně mononukleární a podstatný podíl v buněčné směsi představují mladé kmenové buňky. Výsledná suspenze kmenových buněk se potom může uvést do styku s biotinylovanými monoklonálními protilátkami proti CD34 nebo jinými prostředky pro vazbu buněk. Období kontaktu se udržuje po dostatečnou dobu, aby se umožnila podstatná interakce mezi monoklonálními protilátkami proti CD34 a antigeny CD34 na povrchu kmenových buněk. Obvyklé postačující časy činí nejméně 1 hodinu.
• ···· ·· ·Φφ· ·· ·· φ · · ♦φφφ· φφφφ φ ΦΦΦ· ···· • · · · β · φφ φφφφ · φ · φφφ»···
Buněčná suspenze se poté uvede do styku s izolačními prostředky, které jsou součástí soupravy. Izolační prostředky mohou zahrnovat sloupec plněný kuličkami potaženými avidinem. Tyto sloupce jsou v oboru dobře známy, viz Berenson a kol., J. Cell Biochem., 10D, 239 (1986). Sloupec se promývá fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem pro odstranění nenavázaného materiálu. Cílové kmenové buňky mohou být z kuliček a z monoklonální protilátky proti CD34 uvolněny s použitím konvenčních metod. Kmenové buňky obdržené tímto způsobem se mohou zmrazit v mrazicím zařízení s kontrolovanou rychlostí mrazení (například Cryo-Med, Mt. Clemens, MI) a potom se mohou uložit v parách kapalného dusíku. Jako kryoprotektivní látka se může použit 10% dimethylsulfoxid. Po provedení všech sběrů od daného dárce se kmenové buňky ponechají roztát a jednotlivé podíly se spojí. Alikvóty obsahující kmenové buňky, růstové prostředí, jako je McCoyovo médium 5A, 0,3% agar a nejméně jeden z expanzních faktorů [rekombinantní lidský GM-CSF, IL-3, rekombinantní lidský ligand flt3 a rekombinantní lidské molekuly vzniklé fúzí GM-CSF/IL-3 (PIXY321)] při koncentracích zhruba 200 jednotek/ml se pěstují a expandují při 37 °C v 5% oxidu uhličitém v plně zvlhčeném vzduchu po dobu 14 dnů. Ke kulturám lze přidat lidský IL-Ια nebo IL-4. Nejpreferovanější kombinací expanzních faktorů je ligand flt3 a buď IL-3 nebo protein vzniklý fúzí GM-CSF/IL-3.
Pro humánní podávání in vivo je možno ligand flt3 formulovat podle známých způsobů používaných pro přípravu farmaceuticky vhodných prostředků. Ligand flt3 se může kombinovat v přídavku, buď jako jediný aktivní materiál nebo s jinými známými aktivními materiály, s farmaceuticky vhodnými zřeďovacími látkami (například Tris-HCl, acetát nebo fosfát), s konzervačními látkami (například Thimerosal,
- 21 benzylalkohol nebo parabeny), s emulgátory, solubilizačními látkami, adjuvantnimi látkami a/nebo nosiči. Vhodné nosiče a jejich formulování se popisují v Remington's Farmaceutical Sciences, 16. vydání (1980), Mack Publishing Co. Navíc mohou takové prostředky obsahovat ligand flt3 v komplexu s polyethylenglykolem (PEG), s kovovými ionty nebo zabudovaný do polymerních sloučenin, jako je kyselina polyoctová, kyselina polyglykolová, hydrogely, a tak dále nebo může být zabudovaný do liposomů, mikroemulsí, micel, unilamelárních nebo multilamelárních puchýřků, zbytků erytrocytů nebo sféroblastů. Taková složení ovlivňují fyzikální stav, rozpustnost, stabilitu, rychlost uvolňování in vivo a rychlost clearance in vivo ligandu flt3.
Ligand flt3 se může podávat lokálně, parenterálně nebo inhalací. Termín parenterální zahrnuje subkutánní, intravenózní, intramuskulární, intracisternální injekce nebo infusní způsoby podávání. Tyto prostředky budou obvykle obsahovat účinné množství ligandu flt3 samotného nebo v kombinaci s účinným množstvím jakéhokoliv jiného aktivního materiálu. Dávkováni a požadované koncentrace léku obsažené v prostředcích se mohou lišit v závislosti na mnoha faktorech včetně zamýšleného použití, tělesné hmotnosti pacienta a stáří a způsobu podávání. Dávky lze předběžně stanovit na základě zkoušek na zvířatech a úvahy o dávkování pro humánní podávání lze provádět podle způsobů uznávaných v oboru. Na poměti při výše uvedeném popisu je třeba mít obvyklé dávkování ligandu flt3, které může být od zhruba 10 μg/m2 do zhruba 1000 μς/ιη2. Preferované dávkové rozmezí je řádu od zhruba 100 itg/m2 do zhruba 300 μ5/ιη2.
Příklady provedení vynálezu • · • ·
- 22 Následující příklady se popisují navíc k tomuto popisu pro ilustraci konkrétních ztělesnění, která neomezují předmět tohoto vynálezu.
Příklad 1
Získávání dendritických buněk
Tento příklad popisuje způsob použití ligandu flt3 pro vytváření velkých množství dendritických buněk ex vivo. Buňky mající fenotyp CD34+ se izolují podle předchozího popisu, například vytvořením buffy coat buněk s použitím způsobu popsaného výše. Buňky z buffy coat se potom inkubují s monoklonální protilátkou specifickou pro CD34. Buňky CD34+, které se selektují, se potom pěstují v McCoyově obohaceném médiu obsahujícím po 20 ng/ml GM-CSF, IL-4, TNF-a nebo 100 ng/ml ligandu flt3 nebo ligandu c-kit. Pěstování pokračuje zhruba po dobu 2 týdnů při 37 °C ve vlhkém vzduchu s 10 % oxidu uhličitého. Buňky se potom třídí průtokovou cytometrií pro expresi CDla+ a HLA-DR+. Kombinace GM-CSF, IL-4 a TNF-α vede k šestinásobnému až sedminásobnému vzrůstu počtu buněk obdržených po dvou týdnech pěstování. Kombinace ligandu flt3 a ligandu c-kit vede k dalšímu 12-násobnému až 13-násobnému vzrůstu absolutního počtu buněk. To koreluje s 18-násobnou expanzi bud' s ligandem flt3 nebo c-kit a s 34-násobnou expanzí s kombinací ligandů flt3 a c-kit. Analýza fenotypu buněk ukazuje, že 60 až 70 % buněk jsou HLA-DR+, CD86+ a 40 až 50 % buněk vykazuje expresi CDla při všech zkoumaných kombinacích faktorů. Přídavek ligandu flt3 zvyšuje absolutní počet buněk CDla+ na 5-násobek. Ligand c-kit zvyšuje tento počet buněk na 6,7-násobek a kombinace ligandů flt3 a c-kit na 11-násobek. Funkční analýza výsledných buněk v MLR ukazuje, že přítomnost ligandu flt3 nebo • · ligandu c-kit neovlivňuje stimulační schopnost výsledných dendritických buněk při dosažení zvýšených počtů.
Příklad 2
Použití flt3-L při expanzi dendritických buněk
Tento příklad popisuje způsob použití ligandu flt3 pro expanzi dendritických buněk. Před odebráním buněk může být vhodné zmobilizovat nebo zvyšovat počty cirkulujících progenitorových a kmenových buněk v periferní krvi. Mobilizace může zlepšit sběr progenitorových a kmenových buněk v periferní krvi a lze jí dosáhnout intravenózním podáním ligandu fit3 nebo sargramostimu (LeukineR, Immunex Corporation, Seattle, Washington) pacientům před odběrem těchto buněk. Je možno též podat ostatní růstové faktory, jako je CSF-1, GM-CSF, ligand c-kit, G-CSF, EPO, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4 , IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, proteiny vzniklé fúzí GM-CSF/IL-3, LIF, FGF a jejich kombinace, následně nebo v současné kombinaci s ligandem flt3. Mobilizované nebo nemobilizované progenitorové a kmenové buňky periferní krve se sbírají s použitím způsobů aferézy známých v oboru, viz například Bishop a kol., Blood, 83.(2), 610-616 (1994). Stručně uvedeno se progenitorové a kmenové buňky periferní krve sbírají s použitím konvenčních zařízení, například zařízení pro aferézu Haemonetics Model V50 (Haemonetics, Braintree, MA). Čtyřhodinové sběry se obvykle neprovádějí častěji než pětkrát týdně do obdržení zhruba 6,5 x 108 mononukleárních buněk/kg hmotnosti pacienta. Alikvóty sbíraných progenitorových a kmenových buněk periferní krve se analyzují na obsah jednotek vytvářejících kolonie granulocytů-makrofágů (CFU-GM) zředěním zhruba 1:6 Hankovým vyváženým roztokem soli
• · » · · · φ · · φ ·· · · bez vápníku či hořčíku (HBSS) a převrstvením separačního média lymfocytů (Organon Teknika, Durham, North Carolina). Po centrifugaci se mononukleární buňky na rozhraní sbírají, promývají a resuspendují v HBSS. Alikvóty 1 ml obsahující zhruba 300 000 mononukleárních buněk, modifikované McCoyovo médium 5A, 0,3% agar, 200 jednotek/ml rekombinantního lidského GM-CSF, 200 jednotek/ml rekombinantního lidského IL-3 a 200 jednotek/ml rekombinantního lidského G-CSF se pěstují při 37 °C v plně zvlhčeném vzduchu s 5 % oxidu uhličitého po dobu 14 dnů. Ke kulturám lze případně přidat ligand flt3 nebo molekuly fúze GM-CSF/IL-3 (PIXY 321). Tyto kultury se barví Wrightovým barvivém a kolonie CFU-GM se hodnotí s použitím preparačního mikroskopu [Ward a kol., Exp. Hematol., 16, 358 (1988)]. Alternativně lze kolonie CFU-GM analyzovat s použitím metody průtokové cytometrie CD34/CD33 podle Sieny a kol., Blood, 77(2), 400-409 (1991) nebo jakýmkoliv jiným způsobem známým v oboru.
Kultury obsahující CFU-GM se zmrazí v mrazicím zařízení s kontrolovanou rychlostí mrazení (například CryoMed, Mt. Clemens, MI) a potom se uloží v parách kapalného dusíku. Je možno použít 10% dimethylsulfoxid jako kryoprotektivní látku. Po provedení všech odběrů od pacienta se kultury obsahující CFU-GM ponechají roztát a jejich jednotlivé podíly se spojí. Soubor roztátých buněk se uvede do styku s ligandem flt3, buď samotným nebo v následné či současné kombinaci s ostatními cytokiny popsanými výše. Tato expozice ligandu flt3 řídí CFU-GM ke vzniku linie dendritických buněk. Dendritické buňky se podávají pacientovi zpět v intravenózní infúzi.
Příklad 3
- 25 Použití flt3-L při zesilování protinádorových imunitních odpovědí
Tento příklad popisuje způsob použití flt3-L pro zesílení protinádorových imunitních odpovědí in vivo. Myší samice kmene C57BL/10J (BIO) (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) obdrží v injekci 5 x 105 životných nádorových buněk fibrosarkomu BIO.2 nebo BIO.5 s použitím intradermální injekce podané v poloze středové čáry spodní části těla v celkovém objemu 50 μΐ. Linie fibrosarkomu BIO.2 a BIO.5 jsou původu BIO a jejich dřívější popis v práci Lynche a kol., Euro. J. Immunol., 21, 1403 (1991) uvádí se zde formou odkazu. Linie fibrosarkomu BIO.2 se indukuje subkutánní implantací parafinové pelety obsahující 5 mg methylcholanthrenu a linie BIO.5 se indukuje chronickou expozicí ultrafialovému záření. Nádorové buněčné linie se udržují in vitro v α-modifikovaném MEM obsahujícím 5 % FBS, 2 nM L-glutaminu, 50 jednotek/ml penicilinu a 50 μg/ml streptomycinu. Rekombinantní lidský flt3-L (10 μg/injekce) se podává denně po dobu 19 dnů (pokud se neuvádí jinak) v subkutánní injekci v celkovém objemu 100 μΐ. Kontrolním myším se současně podá injekce v podobném objemu pufru obsahujícím 100 ng MSA. Rychlosti růstu tumoru se stanoví vynesením rozměru tumoru proti času po vyvolání tumoru.
Velikost tumoru se vypočítá jako součin dvou navzájem kolmých průměrů měřených posuvnými měřítky a vyjadřuje se jako střední velikost tumoru pouze z hodnot pro myši mající tumor v dané léčebné skupině. Počet myší s tumorem ve srovnání s celkovým počtem v každé léčebné skupině na konci pokusu se popisuje níže.
V tabulce 1 je shrnutí údajů šesti různých pokusů, ve kterých se myši s nádorem léčily buď ligandem flt3 nebo MSA.
• ·
- 26 Úplná regrese nádoru nastala u 19 z 50 myší léčených ligandem flt3, v porovnání s 1 z 30 myší léčených MSA (p<0,0001 s použitím statistického testu Fishers Exact Test).
Pozorování, že rychlost růstu tumoru u myší léčených ligandem flt3 (střední velikost tumoru u myší s nádorem 5 týdnů po vyvolání nádoru byla 60 ± 8 mm2) se významně snížila ve srovnání se zvířaty léčenými MSA (střední velikost tumoru 5 týdnů po vyvolání tumoru byla 185 ± 17 mm2), se rovněž potvrdila (p<0,0001 na základě analýzy rozptylu).
Tabulka 1
Výsledná velikost tumoru (mm2) ze šesti pokusů s fibrosarko-
| mem s použitím nebo bez použití flt3-L | |||
| Týdnů po | Kontroly | Směrodatná Flt3-L | Směrodatná |
| vyvolání | s MSA | odchylka (10 μg/den) | odchylka |
| tumoru | (100 ng/den) |
| 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 1 | 25 | 2,6 | 24 | 2,2 |
| 2 | 62 | 7,5 | 49 | 3,6 |
| 3 | 98 | 10,6 | 49 | 3,9 |
| 4 | 149 | 14,5 | 50 | 5 |
| 5 | 185 | 16,8 | 60 | 8,4 |
Růst velikosti nádoru byl výrazně zpožděn při použití ligandu flt3 ve srovnání s kontrolní skupinou. Údaje tedy ukazují, že ligand flt3 je důležitým cytokinem při zesílení imunitní odpovědi proti cizím antigenům a zejména proti rakovině.
Claims (19)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Použití ligandu flt3 k výrobě farmaceutického prostředku pro zesílení imunitní odpovědi zvýšením počtu dendritických buněk.
- 2. Použití ligandu flt3 podle nároku 1, jakož i jedné nebo více látek vybraných ze skupiny zahrnující GM-CSF, IL-4, TNF-α, IL-3, ligand c-kit a fúze GM-CSF s IL-3 k výrobě farmaceutického prostředku pro zesílení imunitní odpovědi zvýšením počtu dendritických buněk.
- 3. Použití ligandu flt3 podle nároku 1, k výrobě farmaceutického prostředku pro zesílení imunitní odpovědi v případě infekčního onemocnění zvýšením počtu dendritických buněk.
- 4. Použití ligandu flt3 podle nároku 3, jakož i jedné nebo více látek vybraných ze skupiny zahrnující GM-CSF, IL-4, TNF-α, IL-3, ligand c-kit a fúze GM-CSF s IL-3 k výrobě farmaceutického prostředku pro zesílení imunitní odpovědi v případě infekčního onemocnění zvýšením počtu dendritických buněk.
- 5. Použití ligandu flt3 podle nároku 3, jakož i jedné nebo více látek vybraných ze skupiny zahrnující GM-CSF, IL-4, TNF-α, IL-3, ligand c-kit a fúze GM-CSF s IL-3 k výrobě farmaceutického prostředku pro zesílení imunitní odpovědi v případě infekčního onemocnění způsobeného HIV zvýšením počtu dendritických buněk.
- 6. Použití ligandu flt3 podle nároku 1, k výrobě farmaceutického prostředku pro zesílení imunitní odpovědi v případě nádorového nebo neoplastického onemocnění zvýšením počtu dendritických buněk.
- 7. Použití ligandů flt3 podle nároku 6, jakož i jedné nebo více látek vybraných ze skupiny zahrnující GM-CSF, IL-4, TNF-α, IL-3, ligand c-kit a fúze GM-CSF s IL-3 k výrobě farmaceutického prostředku pro zesílení imunitní odpovědi v případě nádorového nebo neoplastického onemocnění zvýšením počtu dendritických buněk.
- 8. Přípravek dendritických buněk, vyznačuj Ιοί se tím, že obsahuje nejméně dva buněčné povrchové markéry zvolené ze skupiny CDla, HLA-DR a CD86 vytvořené stykem krvetvorných kmenových či progenitorových buněk s ligandem flt3.
- 9. Přípravek dendritických buněk podle nároku 8, vyznačující se tím, že se tyto buňky dále vytvářejí stykem krvetvorných kmenových či progenitorových buněk s látkou zvolenou ze skupiny GM-CSF, IL-4, TNF-a, IL-3, ligand c-kit a fúze GM-CSF s IL-3.
- 10. Populace dendritických buněk exprimujících antigen, vyznačující se tím, že se tyto buňky získají způsobem, který obsahuje kroky (a) styku krvetvorných kmenových či progenitorových buněk s ligandem flt3 v množství dostatečném pro vytvoření populace dendritických buněk, (b) buď (i) expozice dendritických buněk peptidu specifickému pro antigen nebo (ii) přenosu genu kódujícího peptid specifický pro antigen na dendritické buňky, (c) umožnění dendritickým buňkám zpracovat a exprimovat antigen a (d) purifikace dendritických buněk exprimujících antigen.
- 11. Populace dendritických buněk podle nároku 10, vyznačující se tím, že krok (a) tohoto způsobu dále zahrnuje styk krvetvorných kmenových či progenitorových buněk s molekulou zvolenou ze skupiny GM-CSF, IL-4, TNF-α, IL-3, ligand c-kit a fúze GM-CSF s IL-3.
- 12. Způsob řízení krvetvorných či progenitorových buněk k vytváření linie dendritických buněk, vyznačující se tím, že zahrnuje styk těchto krvetvorných kmenových či progenitorových buněk s ligandem flt3.
- 13. Způsob přípravy populace dendritických buněk předkládajících antigen, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky (a) styku krvetvorných kmenových či progenitorových buněk s ligandem flt3 v množství dostatečném pro vytvoření populace dendritických buněk, (b) buď (i) expozice dendritických buněk peptidů specifickému pro antigen nebo (ii) přenosu genu kódujícího peptid specifický pro antigen na dendritické buňky, (c) umožnění dendritickým buňkám zpracovat a exprimovat antigen a • · · · to • · to ·· ·· (d) purifikace dendritických buněk exprlinujících antigen.
- 14. Způsob podle nároku 13, vyznačuj ící se t i m, že krok (a) dále zahrnuje styk krvetvorných kmenových či progenitorových buněk s látkou zvolenou ze skupiny obsahující GM-CSF, IL-4, TNF-α, IL-3, ligand c-kit a fúze GM-CSF s IL-3.
- 15. Způsob přípravy T buněk specifických pro antigen, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky (a) styku krvetvorných kmenových či progenitorových buněk s ligandem flt3 v množství dostatečném pro vytvoření populace dendritických buněk, (b) bud' (i) expozice dendritických buněk peptidu specifickému pro antigen nebo (ii) přenosu genu kódujícího peptid specifický pro antigen na dendritické buňky, (c) umožnění dendritickým buňkám zpracovat a exprimovat antigen a (d) umožnění dendritickým buňkám presentovat antigen T buňkám.
- 16. Použití ligandu flt3, jakož i antigenu vakciny k výrobě farmaceutického prostředku k zesílení imunitní odpovědi na ahtigen vakciny.
- 17. Adjuvans vakciny, který obsahuje látku vybranou jako ligand c-kit nebo ligand flt3.• · » ·· ·· ·· • Φ φφ φφ* * * φ φ * φ φ φ φ φ φ φφ φ φ φ · · · ··· · · • · ·· · · · φφφ φφφ ··· ···· ·· ··
- 18. Použití ligandů flt3 k výrobě farmaceutického prostředku pro indukci tolerance tkáně štěpu zvýšením počtu dendritických buněk.
- 19. Expanzní média dendritických buněk, vyznačující se tím, že obsahují účinné množství ligandů flt3 a cytokin zvolený ze skupiny IL-3, IL-4, GM-CSF, TNF, ligand c-kit a proteiny fúze GM-CSF/IL-3.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US53914295A | 1995-10-04 | 1995-10-04 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ97798A3 true CZ97798A3 (cs) | 1999-02-17 |
Family
ID=24149974
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ98977A CZ97798A3 (cs) | 1995-10-04 | 1996-10-03 | Použití ligandu flt3, adjuvants vakcíny, expanzní media, přípravek a populace buněk a způsob |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0871487B1 (cs) |
| JP (1) | JP3631496B2 (cs) |
| KR (2) | KR100514957B1 (cs) |
| CN (1) | CN1172718C (cs) |
| AT (1) | ATE432085T1 (cs) |
| AU (1) | AU697539B2 (cs) |
| BR (1) | BR9610802A (cs) |
| CA (1) | CA2232865A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ97798A3 (cs) |
| DE (1) | DE69637942D1 (cs) |
| EA (1) | EA199800272A1 (cs) |
| EE (1) | EE9800105A (cs) |
| ES (1) | ES2323818T3 (cs) |
| IS (1) | IS4703A (cs) |
| LV (1) | LV12085B (cs) |
| NO (1) | NO981374L (cs) |
| NZ (1) | NZ321039A (cs) |
| PL (1) | PL187329B1 (cs) |
| RO (1) | RO120579B1 (cs) |
| SI (1) | SI9620116A (cs) |
| SK (1) | SK40898A3 (cs) |
| TR (1) | TR199800607T1 (cs) |
| WO (1) | WO1997012633A1 (cs) |
Families Citing this family (31)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6429199B1 (en) | 1994-07-15 | 2002-08-06 | University Of Iowa Research Foundation | Immunostimulatory nucleic acid molecules for activating dendritic cells |
| US20030026782A1 (en) | 1995-02-07 | 2003-02-06 | Arthur M. Krieg | Immunomodulatory oligonucleotides |
| US6207646B1 (en) | 1994-07-15 | 2001-03-27 | University Of Iowa Research Foundation | Immunostimulatory nucleic acid molecules |
| US9068164B1 (en) * | 1995-02-02 | 2015-06-30 | Tristem Trading (Cyprus) Limited | Method of preparing an undifferentiated cell |
| CA2259140C (en) * | 1996-07-10 | 2008-09-30 | Immunex Corporation | Method of activating dendritic cells |
| AUPO388396A0 (en) * | 1996-11-27 | 1996-12-19 | Ludwig Institute For Cancer Research | Cellular adjuvant |
| AU7835898A (en) * | 1997-06-17 | 1999-01-04 | Immunex Corporation | A method of enhancing antigen-specific peripheral immune tolerance |
| FR2782524B1 (fr) * | 1998-08-21 | 2002-07-19 | Roussy Inst Gustave | Methodes d'activation de cellules tueuses naturelles (nk) et moyens de mise en oeuvre |
| US6849452B1 (en) * | 1998-03-03 | 2005-02-01 | Institut Gustave Roussy | Methods for activating natural killer (NK) cells and means for carrying out said methods |
| FR2775692B1 (fr) * | 1998-03-03 | 2000-06-16 | Roussy Inst Gustave | Methodes d'activation de cellules tueuses naturelles (nk) et moyens de mise en oeuvre |
| PT1077722E (pt) | 1998-05-22 | 2006-12-29 | Coley Pharm Group Inc | Produtos e composições para utilização na indução da imunidade mucosal |
| WO1999062537A1 (en) * | 1998-06-04 | 1999-12-09 | The Rockefeller University | Methods and agents for modulating the immune response and inflammation involving monocyte and dendritic cell membrane proteins |
| US6291661B1 (en) | 1998-07-02 | 2001-09-18 | Immunex Corporation | flt3-L mutants and method of use |
| AU5741699A (en) * | 1998-08-27 | 2000-03-21 | Universitatsklinikum Freiburg | Low-molecular fragments of hyaluronic acid for the preparation of vaccines |
| GB9827604D0 (en) * | 1998-12-15 | 1999-02-10 | Lorantis Ltd | Methods of immunosuppression |
| WO2001009303A2 (en) * | 1999-07-30 | 2001-02-08 | Vical Inc. | Flt-3 LIGAND-ENCODING POLYNUCLEOTIDE AS A POLYNUCLEOTIDE-BASED VACCINE ENHANCER |
| AU1358501A (en) * | 1999-11-03 | 2001-05-14 | Powderject Vaccines, Inc. | Nucleic acid vaccine compositions having a mammalian cd80/cd86 gene promoter driving antigen expression |
| AU2001239873A1 (en) * | 2000-02-24 | 2001-09-03 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Adjuvant treatment by in vivo activation of dendritic cells |
| DE60116075T4 (de) * | 2000-04-25 | 2007-06-06 | Immunex Corp., Thousand Oaks | Behandlung von tumoren mit photodynamischer therapie |
| US20040247563A1 (en) * | 2000-11-02 | 2004-12-09 | Lynch David H. | Method of enhancing lymphocyte-mediated immune responses |
| WO2002040044A2 (en) * | 2000-11-17 | 2002-05-23 | Immunex Corporation | Chemoattractant recruitment of dendritic cells for enhancement of immunization |
| KR101803702B1 (ko) * | 2001-09-06 | 2017-12-01 | 노쓰웨스트 바이오써라퓨틱스, 인크. | Ｔｈ-1 반응을 위한 단구성 수지상 세포 및 Ｔ 세포를 프라이밍하기 위한 조성물 및 방법 |
| KR100490308B1 (ko) * | 2002-02-25 | 2005-05-17 | 크레아젠 주식회사 | 면역 치료용 성숙화된 수지상 세포 백신의 제조방법 |
| EP1487477A4 (en) * | 2002-03-26 | 2006-07-19 | Immunex Corp | METHOD OF USE OF FLT3 LIGAND IN IMMUNIZATION PROTOCOLS |
| US20050084967A1 (en) | 2002-06-28 | 2005-04-21 | Xcyte Therapies, Inc. | Compositions and methods for eliminating undesired subpopulations of T cells in patients with immunological defects related to autoimmunity and organ or hematopoietic stem cell transplantation |
| KR100522526B1 (ko) * | 2002-11-28 | 2005-10-19 | 주식회사 바이넥스 | 면역 치료용 수지상 세포의 제조방법 |
| KR100614220B1 (ko) * | 2004-11-08 | 2006-08-21 | 고려대학교 산학협력단 | Ｆｌｔ3 리간드 유전자를 발현하는 살모넬라 균주 및 이를함유하는 항암 치료용 조성물 |
| DE102005016234B4 (de) * | 2005-04-08 | 2008-05-15 | Tgc Biomics Gmbh | Verfahren zur Einschleusung von exogenem Antigen in den MHC I-Präsentationsweg von Zellen |
| KR100818215B1 (ko) | 2006-10-11 | 2008-04-01 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | Ｃｄ３４양성 줄기세포로부터 ｔ 임파구 전구체를 제조하는 방법 |
| KR101264811B1 (ko) | 2011-05-20 | 2013-05-15 | 충남대학교산학협력단 | 마이코박테리움 압세수스의 ＭＡＢ０９８１ｃ 단백질을 이용한 수지상 세포의 성숙방법 |
| JP7146732B2 (ja) | 2016-07-13 | 2022-10-04 | オハイオ ステート イノベーション ファウンデーション | 宿主抗原提示並びに宿主抗腫瘍及び抗病原体免疫を最適化するためのプラットフォーム及び方法 |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US826250A (en) | 1905-12-20 | 1906-07-17 | Albert Huck | Switch for toy railways. |
| US4714680B1 (en) | 1984-02-06 | 1995-06-27 | Univ Johns Hopkins | Human stem cells |
| US5391485A (en) | 1985-08-06 | 1995-02-21 | Immunex Corporation | DNAs encoding analog GM-CSF molecules displaying resistance to proteases which cleave at adjacent dibasic residues |
| EP0790307A1 (en) | 1986-12-16 | 1997-08-20 | Gist-Brocades B.V. | Molecular cloning and expression of human IL-3 |
| OA09736A (en) | 1987-02-18 | 1993-11-30 | Schering Biotech Corp | "Human interleukin-3 and muteins thereof". |
| WO1989003881A1 (en) | 1987-10-30 | 1989-05-05 | Immunex Corporation | Nonglycosylated analogs of human colony stimulating factors |
| US5108910A (en) | 1989-08-22 | 1992-04-28 | Immunex Corporation | DNA sequences encoding fusion proteins comprising GM-CSF and IL-3 |
| US5073627A (en) | 1989-08-22 | 1991-12-17 | Immunex Corporation | Fusion proteins comprising GM-CSF and IL-3 |
| ATE194651T1 (de) | 1989-10-16 | 2000-07-15 | Amgen Inc | Stammzellenfaktor |
| US5199942A (en) | 1991-06-07 | 1993-04-06 | Immunex Corporation | Method for improving autologous transplantation |
| DK0614485T3 (da) | 1991-10-23 | 2002-10-28 | Nexell Therapeutics Inc | Fremgangsmåde til selektiv formering af CD34 positive celler |
| NZ314644A (en) * | 1993-05-24 | 2000-11-24 | Immunex Corp | Use of flt3-ligands as a growth stimulator of stem cells in the transplantation of tissue |
| US5554512A (en) | 1993-05-24 | 1996-09-10 | Immunex Corporation | Ligands for flt3 receptors |
| US5405772A (en) * | 1993-06-18 | 1995-04-11 | Amgen Inc. | Medium for long-term proliferation and development of cells |
-
1996
- 1996-10-03 AU AU73922/96A patent/AU697539B2/en not_active Ceased
- 1996-10-03 CZ CZ98977A patent/CZ97798A3/cs unknown
- 1996-10-03 EA EA199800272A patent/EA199800272A1/ru unknown
- 1996-10-03 PL PL96325964A patent/PL187329B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1996-10-03 JP JP51449097A patent/JP3631496B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1996-10-03 CN CNB96197351XA patent/CN1172718C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1996-10-03 ES ES96936216T patent/ES2323818T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-10-03 CA CA002232865A patent/CA2232865A1/en not_active Abandoned
- 1996-10-03 NZ NZ321039A patent/NZ321039A/en unknown
- 1996-10-03 DE DE69637942T patent/DE69637942D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-10-03 RO RO98-00824A patent/RO120579B1/ro unknown
- 1996-10-03 AT AT96936216T patent/ATE432085T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-10-03 SI SI9620116A patent/SI9620116A/sl unknown
- 1996-10-03 SK SK408-98A patent/SK40898A3/sk unknown
- 1996-10-03 BR BR9610802A patent/BR9610802A/pt unknown
- 1996-10-03 EP EP96936216A patent/EP0871487B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-10-03 KR KR10-1998-0702286A patent/KR100514957B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1996-10-03 EE EE9800105A patent/EE9800105A/xx unknown
- 1996-10-03 KR KR1020047011434A patent/KR100676792B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1996-10-03 TR TR1998/00607T patent/TR199800607T1/xx unknown
- 1996-10-03 WO PCT/US1996/015990 patent/WO1997012633A1/en not_active Application Discontinuation
-
1998
- 1998-03-26 IS IS4703A patent/IS4703A/is unknown
- 1998-03-26 NO NO981374A patent/NO981374L/no unknown
- 1998-04-02 LV LVP-98-63A patent/LV12085B/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0871487A1 (en) | 1998-10-21 |
| LV12085B (en) | 1998-09-20 |
| EE9800105A (et) | 1998-10-15 |
| WO1997012633A1 (en) | 1997-04-10 |
| SI9620116A (sl) | 1999-08-31 |
| PL325964A1 (en) | 1998-08-17 |
| ATE432085T1 (de) | 2009-06-15 |
| JP3631496B2 (ja) | 2005-03-23 |
| KR19990063818A (ko) | 1999-07-26 |
| BR9610802A (pt) | 1999-07-13 |
| DE69637942D1 (de) | 2009-07-09 |
| RO120579B1 (ro) | 2006-04-28 |
| AU7392296A (en) | 1997-04-28 |
| CN1172718C (zh) | 2004-10-27 |
| NO981374D0 (no) | 1998-03-26 |
| EP0871487B1 (en) | 2009-05-27 |
| NO981374L (no) | 1998-06-03 |
| AU697539B2 (en) | 1998-10-08 |
| PL187329B1 (pl) | 2004-06-30 |
| IS4703A (is) | 1998-03-26 |
| EA199800272A1 (ru) | 1998-10-29 |
| ES2323818T3 (es) | 2009-07-24 |
| NZ321039A (en) | 2001-03-30 |
| LV12085A (lv) | 1998-07-20 |
| KR100514957B1 (ko) | 2005-11-25 |
| JPH11513389A (ja) | 1999-11-16 |
| TR199800607T1 (xx) | 1998-06-22 |
| CN1229359A (zh) | 1999-09-22 |
| KR100676792B1 (ko) | 2007-02-02 |
| KR20040079421A (ko) | 2004-09-14 |
| CA2232865A1 (en) | 1997-04-10 |
| EP0871487A4 (en) | 2004-09-01 |
| SK40898A3 (en) | 1999-04-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ97798A3 (cs) | Použití ligandu flt3, adjuvants vakcíny, expanzní media, přípravek a populace buněk a způsob | |
| US20060292166A1 (en) | Vaccine composition comprising Flt3-ligand | |
| US20090075886A1 (en) | Dendritic cell stimulatory factor | |
| JP2023171524A (ja) | 未成熟な単球性樹状細胞の活性化を誘導するための組成物および方法 | |
| US20020155108A1 (en) | Method for ex vivo loading of antigen presenting cells with antigen, and a vaccine comprising the loaded cells | |
| US9518126B2 (en) | Vaccine comprising monocyte or immature myeloid cells (IMC) which were loaded with the ligand of natural killer T cell and antigen | |
| JP2002514047A (ja) | 樹状細胞を活性化する方法 | |
| US20090297541A1 (en) | Maturation of dendritic cells | |
| US20030124091A1 (en) | Endothelial cell derived hematopoietic growth factor | |
| AU3257999A (en) | Method for activating natural killer (nk) cells | |
| IL292009A (en) | In vitro methods and preparations for improving the activation of dendritic cells and t cells, and inducing a th-1 immune response | |
| US7150992B1 (en) | Methods of preparing dendritic cells with flt3-ligand and antigen | |
| WO2002040647A1 (en) | Method of establishing cultures of human dendritic cells and use thereof | |
| MXPA98002464A (en) | Dendrit cellular stimulating factor | |
| US20050048645A1 (en) | Method of treating or preventing disease characterized by cryptococcus neoformans infection |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic |