KR20040079421A

KR20040079421A - 수지상 세포 자극 인자

Info

Publication number: KR20040079421A
Application number: KR10-2004-7011434A
Authority: KR
Inventors: 케네쓰 브라셀; 스튜어트 디. 라이만; 유진 마라스코프스키; 힐러리 알. 맥케나; 데이비드 에이치. 린치
Original assignee: 임뮤넥스 코포레이션
Priority date: 1995-10-04
Filing date: 1996-10-03
Publication date: 2004-09-14
Also published as: BR9610802A; ES2323818T3; AU7392296A; IS4703A; CN1172718C; TR199800607T1; EP0871487A1; AU697539B2; NZ321039A; CA2232865A1; NO981374D0; SK40898A3; JPH11513389A; KR19990063818A; RO120579B1; KR100676792B1; PL187329B1; EP0871487B1; NO981374L; DE69637942D1

Abstract

조혈 기원세포 및 간세포로부터 다수의 수지상 세포를 생성시키는데 flt3-리간드를 사용할 수 있다. flt3-리간드는 또한 생체내에서 면역 반응을 증강시키는데, 생체외에서 수지상 세포를 증량시키는데 사용될 수 있다. 상기 수지상 세포는 천연 T 세포에 대한 종양성, 바이러스성 또는 기타 항원을 발현하는데 사용될 수 있고, 백신 증강제로서 유용할 수 있다.

Description

수지상 세포 자극 인자 {Dendritic Cell Stimulatory Factor}

<기술분야>

본 발명은 수지상 세포 자극 인자, 생체내에서의 면역 반응 증강 방법, 생체외에서의 수지상 세포의 증량 방법, 정제된 수지상 세포의 제제, 및 T-세포 매개 면역 반응 및 B-세포 매개 면역 반응의 조작에 유용한 수지상 세포 집단에 관한 것이다.

<배경기술>

백신 접종의 목적은 충분한 수준의 항체 및 항원과의 새로운 접촉시에 급속히 증량할 수 있는 프라이밍된 세포 집단을 확립함으로써 유효한 면역성을 제공하는 것이다. 백신 접종 동안의 항원과의 최초의 접촉은 수용체에 위해하여서는 안되며, 따라서 백신은 대개 병원성에 결함이 있는 항원으로 구성된다.

활성 면역화 프로토콜에 관련된 빈번한 난점은 백신 항원이 강한 면역 반응을 촉진하기에 충분한 면역성을 갖지 않는다는 점, 즉 동일 항원에 의한 차후의 공격에 대해 충분한 수준의 보호를 제공하지 못한다는 점이다. 이외에, 특정 항원은단지 약한 세포-매개 또는 항원 반응만을 유발할 수 있다. 많은 항원에 있어서, 강한 체액 반응 및 강한 세포-매개 반응이 둘다 바람직하다.

수십년 동안, 연구자들은 백신의 면역원성을 증가시키기 위하여 다양한 화합물을 가지고 실험해왔다. 증강제로서도 공지된, 백신의 면역 증강제는 백신에 대해 강한 면역 반응을 촉진시키는 조성물이다. 이외에, 상대적으로 약한 면역성을 갖는 특정의 신규 재조합 항원은 보다 강력한 활성을 위해 증강제를 필요로 한다. 백신 증강제는 상이한 작용 방식으로 면역 반응에 양적 및 질적으로 영향을 미친다. 그러한 작용 방식은 T 세포를 이동시키고, 축적질로서 작용하고, 림프구 순환을 변화시킴으로써 이러한 세포들이 유출 림프절에 편재하여 유지되도록 하는 것일 수 있다. 그들은 항원을 면역화 부위로 집중시키는데 도움이 되며, 따라서 항원 특이적 T 세포 및 B 세포가 항원-제공 세포와 더욱 효율적으로 상호작용하도록 한다. 그들은 또한 T 세포의 증식 및 분화를 자극할 수 있으며, 상이한 Ig 아이소타입의 생산 증진과 같은 영향을 B 세포에 미칠 수 있다. 또한, 증강제는 특히 매크로파지와 같은 항원-제공 세포의 거동에 영향을 미쳐서 항원을 T 세포 및 B 세포에 제공하는데 더욱 효과적이게 할 수 있다.

수지상 세포는 특이한 형태 및 광범위한 조직 분포를 갖는, 매우 희귀하고 비균질적인 세포군이다. 수지상 세포계 및 면역원성에서의 그의 역할에 관한 논의는 본 명세서에 그 내용이 포함되는 문헌 [Steinman, R.M., Annu. Rev. Immunol.,9:271-296 (1991)]에 기재되어 있다. 수지상 세포는 보편적이지 않은 세포 표면을나타내며, 세포 표면 마커 CD1a⁺, CD4⁺, CD14^-, CD86⁺, CD11c⁺, DEC-205⁺, CD14⁺또는 HLA-DR⁺의 존재에 의해 특징지워질 수 있다. 수지상 세포는 MHC-제한된 T 세포를 감작시키는 높은 능력을 갖고, T 세포 성장 동안의 자기 항원 및 면역화 동안의 외래 항원 모두를 계내의 T 세포에 제공하는 유효한 경로를 제공한다. 따라서, 종양 또는 감염성 질환의 백신 증강제로서 생체외 수지상 세포를 사용하는데 대한 관심이 증가하고 있다. 예를 들면, 문헌 [Romani et al., J. Exp. Med.,180:83 (1994)]을 참조할 수 있다. 면역 자극제로서의 수지상 세포의 사용은 말초 혈액에서의 수지상 세포의 낮은 빈도, 림프 기관에 대한 제한된 접근성 및 수지상 세포의 분화 말기 상태에 기인하여 제한된다. 수지상 세포는 CD34⁺골수 기원세포로부터 유래하고, 수지상 세포의 증식 및 성숙은 싸이토킨 GM-CSF (sargramostim, 등록상표 Leukine(등록상표), Washington Seattle 소재의 Immunex Corporation 제조), TNF-α, c-kit 리간드 (간세포 (Stem cell) 인자 (SCF), 스틸 (Steel) 인자 (SF), 또는 비만세포 성장 인자 (MGF)로서도 공지됨) 및 인터루킨-4에 의해 증진될 수 있다. 따라서, 생체내에서 또는 시험관내에서 기능적으로 성숙된 다수의 수지상 세포의 생성을 자극하는 제제는 널리 그 중요성을 가질 것이다.

<발명의 요약>

flt3-리간드 ("flt3-리간드" 또는 "flt3-L")는 조혈 간세포 및 기원세포에 영향을 준다고 알려져 있다. 놀랍게도, flt3-리간드가 또한 CD34⁺골수 기원세포 및 간세포로부터 골수 전구세포, 단핵세포, 매크로파지, B 세포 및 수지상 세포와 같은 하류 또는 중간 세포의 생성을 강력하게 자극함을 발견하였다. 본 발명은 생체내의 수지상 세포를 이동시키고, 생체외에서 수지상 세포를 증량시키는 방법 및 수지상 세포의 정제 제제에 관한 것이다. 본 발명에 따른 정제된 수지상 세포의 제제는 백신 증강제로서의 효능을 가질 것이다. 또한, 본 발명의 실시 양태에는 flt3-리간드로 이동된 수지상 세포를 사용하여 항원 특이적 T 세포를 제조하는 방법이 포함된다.

본 발명은 생체내, 예를 들면, 환자의 말초 혈액, 조직 또는 기관내에서의 중간 세포의 수를 증가시키거나 이동시키기 위한 유효량의 flt3-리간드의 용도를 제공한다. 본 발명이 flt3-리간드를 사용하여 CD34⁺세포로부터 다수의 하류 및 중간 세포 (예를 들면, 골수 세포, 단핵세포 및 매크로파지)를 생성시키는 것에 관한 것이지만, 본 발명의 중점은 특히 수지상 세포에 있다. 환자의 수지상 세포의 양을 증가시킴으로써, 그러한 세포 자체가 T 세포에 항원을 제공하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 항원은 종양성 항원과 같이 이미 환자 내부에 존재하는 것이거나, 또는 세균성 또는 바이러스성 항원일 수 있다. 따라서, flt3-리간드는 생체내에서 수지상 세포의 수를 증가시켜 존재하는 항원에 대한 환자의 면역 반응을 증강시키는데 사용될 수 있다. 별법으로는, flt3-리간드를 면역을 위해 항원을 환자에 투여하기 전에, 그와 동시에 또는 그에 후속하여 투여할 수 있다. 이와 같이, 백신 증강제로서의 flt3-리간드는 생체내에서 수지상 세포 및 기타 중간 세포를 다량으로 생성시켜 항원을 보다 효과적으로 제공할 수 있다. 전체 반응은 항원에 대해 보다 강하고 개선된 면역 반응이고, 보다 효과적인 면역이다.

본 발명은 또한 생체외에서 수지상 세포를 다량 생성시키는 방법도 제공한다. 환자의 CD34⁺조혈 기원세포 및 간세포를 수집한 후, flt3-리간드를 사용하여 그러한 세포를 시험관내에서 증량시키고 (생체외 증량으로서도 공지됨) CD34⁺세포가 림프 또는 골수계의 수지상 세포로 분화되도록 유도할 수 있다. 생성된 수지상 세포를 환자에 투여하여 항원에 대한 보다 강하고 개선된 면역 반응을 제공할 수 있다. 별법으로는, 생성된 수지상 세포를 백신 증강제로서 사용할 수 있으며, 항원 투여 전에, 그와 동시에 또는 그후에 투여할 수 있다.

본 발명은 또한 생체외에서 항원-제공 수지상 세포를 다량으로 생성시키는 방법을 제공한다. 환자의 CD34⁺조혈 기원세포 및 간세포를 수집한 후, flt3-리간드를 사용하여 생체내에서 상기 세포를 증량시키고, CD34⁺세포가 수지상 세포로 분화되도록 유도할 수 있다. 생성된 수지상 세포를 항원에 노출시켜, 시험관내에서 항원을 생산하여 제공하도록 한다 (이러한 방법은 때때로 당 기술 분야에서 "항원-펄싱"으로서 언급됨). 항원-제공 수지상 세포를 제조하는 다른 방법은 수지상 세포를 항원 특이적 폴리펩티드를 코딩하는 유전자로 형질 감염시키는 것이다. 일단수지상 세포가 항원을 발현하면, 항원-제공 수지상 세포를 환자에게 투여할 수 있다.

본 발명은 또한 항원 특이적 T 세포의 생체외 제조 방법을 제공한다. 생체외에서 항원-제공 수지상 세포를 다량으로 제조하는 상기 방법을 수행한 후, 수집된 항원-제공 수지상 세포를 사용하여 환자로부터 수집된 항원에 노출되지 않은 (naive) T 세포로부터 항원 특이적 T 세포를 생성시킨다. 항원을 생성된 T 세포에 충분히 제공한 후, 항원 특이적 T 세포를 환자에게 투여할 수 있다.

본 발명은 감염성 질환을 앓는 환자의 면역 반응을 증강시키는 방법도 또한 제공하며, 이 방법은 환자의 수지상 세포의 수를 증가시키는데 충분한 양의 flt3-리간드를 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명은 암 또는 신생물성 질병을 갖는 환자의 면역 반응을 증강시키는 방법도 또한 제공하며, 이 방법은 환자의 수지상 세포의 수를 증가시키는데 충분한 양의 flt3-리간드를 투여하는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 또한 환자의 종양 특이적 면역 반응을 증강시키는 수단도 제공한다.

본 발명은 환자의 수지상 세포의 수를 증가시키는데 충분한 양의 flt3-리간드를 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 자가면역 내성을 증가시키는 방법을 포함한다. 또한, 이식물 및 이식된 조직 및 기관의 생존을 증가시키는 방법이 포함된다.

본 발명의 방법은 또한 유효량의 싸이토카인을 flt3-리간드와 연속적으로 또는 동시에 사용하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 그러한 싸이토카인은 인터루킨("IL") IL-3 및 IL-4, 과립구 매크로파지 콜로니 자극 인자 ("GM-CSF") 또는 GM-CSF/IL-3 융합체로 이루어진 군 중에서 선택된 콜로니 자극 인자 ("CSF"), 또는 TNF-α 또는 c-kit 리간드와 같은 다른 싸이토카인을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 또한 세포 성장 배지, 자가 유래 혈청 및 flt3-리간드를 단독으로 또는 상기 열거된 군으로부터의 싸이토카인과 함께 포함하는 수지상 세포 증량 배지도 포함한다.

<발명의 상세한 설명>

본 발명은 CD34⁺조혈 기원세포 및 간세포로부터 다량의 중간 세포 유형을 생성시키는 flt3-리간드의 용도에 관한 것이다. 그러한 중간 세포 유형에는 골수 세포, 단핵세포, 매크로파지, B 세포 및 수지상 세포가 포함된다. 다량의 이들 중간 세포 유형은 생체내에서는 천연적으로 발견되지 않고, flt3-리간드를 투여함으로써 생성될 수 있다. 전체 세포의 수에서의 그러한 증가는 숙주에서 항원에 대한 면역 반응을 증강시킬 수 있다. 본 발명의 또다른 실시 양태는 항원-제공 세포로서의 그러한 중간 세포 유형의 단리 및 용도 또는 백신 증강제로서의 그의 용도이다. 본 발명이 특히 수지상 세포에 관계되는 실시 양태에 중점을 두고 있지만, 이는 골수세포, 단핵세포 및 매크로파지 세포 유형에도 또한 적용된다.

본 명세서에 사용된 용어 "flt3-리간드"는 본 명세서에 그 내용이 포함되는미국 특허 제 5,554,512호, EP 제 0627487 A2호 및 WO 제 94/28391호에 기재된 폴리펩티드 속을 이른다. 사람 flt3-리간드 cDNA는 ATCC (USA Maryland Rockville 소재의 American Type Culture Collection)에 1993년 8월 6일자로 기탁되어 수탁 번호 ATCC 69382를 받았다. 기탁은 부다페스트 조약에 의거하여 행해졌다. flt3-리간드를 상기 인용된 문헌에 기재된 방법에 따라 제조할 수 있다.

용어 "IL-3"은 본 명세서에 그 내용이 포함되는 미국 특허 제 5,108,910호에 기재된 인터루킨-3 폴리펩티드 속을 이른다. 그러한 폴리펩티드는 예를 들면, 본 명세서에 그 내용이 각각 포함되는 EP 제 275,598호 및 동 제 282,185호에 기재된, 천연 사람 인터루킨-3 아미노산 서열과 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 갖는 동족체를 포함한다. 용어 "IL-3"은 천연 사람 IL-3과 공통된 생물학적 활성의 적어도 일부를 나타내는 IL-3 동족체 및 대립 유전자형도 포함한다. IL-3 동족체의 예는 EP 제 282,185호에 기재되어 있다. IL-3의 다른 형태는 사람 IL-3[Pro⁸Asp¹⁵Asp⁷⁰], 사람 IL-3[Ser⁸Asp¹⁵Asp⁷⁰] 및 사람 IL-3[Ser⁸]을 포함한다. 본 발명의 용도에 적합한 사람 IL-3 단백질을 코딩하는 DNA 서열은 ATCC로부터 수탁 번호 ATCC 67747로 공개적으로 이용될 수 있다. 괄호 중의 아미노산 서열에 관해 본 명세서에 사용된 명칭은 어떠한 아미노산이 천연 사람 형태와 상이함을 나타낸다. 예를 들면, 사람 IL-3[Ser⁸Asp¹⁵Asp⁷⁰]은 사람 IL-3 단백질에서 아미노산 8이 세린 잔기로 변화되고, 아미노산 15가 아스파르트산 잔기로 변화되고, 아미노산 70이 아스파르트산 잔기로 변화된 것을 이른다.

용어 "IL-4"는 본 명세서에 그 내용이 포함되는 문헌 [Mosley et al., Cell 59:335 (1989), Idzerda et al., J. Exp. Med. 171:861 (1990) 및 Galizzi et al., Intl. Immunol. 2:669 (1990)]에 기재된 폴리펩티드를 이른다. 그러한 IL-4 폴리펩티드는 문헌 [Mosley et al., Idzerda et al. 및 Galizzi et al.]에 기재된 천연 사람 IL-4 아미노산 서열과 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 가지며, IL-4 수용체에 결합하거나, IL-4 수용체와 결합함으로써 개시된 생물학적 시그널을 전달하거나, 또는 항-IL-4 항체와 교차 반응한다는 점에서 생물학적으로 활성인 동족체를 포함한다. 용어 "IL-4"는 천연 사람 IL-4의 생물학적 활성을 유지하는데 충분한 천연 사람 IL-4 분자의 동족체를 포함한다.

본 명세서에 사용된 "GM-CSF"는 본 명세서에 그 내용이 각각 포함되는 미국 특허 제 5,108,910호 및 동 제 5,229,496호에 기재된 단백질의 속이다. 상기 단백질은 천연 사람 GM-CSF 아미노산 서열과 실질적으로 유사한 아미노산 서열 (예를 들면, ATCC 53157 또는 ATCC 39900으로서 공개적으로 이용가능함)을 가지며, GM-CSF 수용체에 결합하거나, GM-CSF 수용체와 결합함으로써 개시된 생물학적 시그널을 전달하거나, 또는 항-GM-CSF 항체와 교차 반응한다는 점에서 생물학적으로 활성인 동족체를 포함한다. 아미노산 서열은 예를 들면, 문헌 [Anderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA82:6250 (1985)]에 기재되어 있다. 상업적으로 구입할 수 있는 GM-CSF (sargramostim, 등록상표 Leukine)는 임뮤넥스 코프. (Washington Seattle 소재)로부터 구입할 수 있다. 용어 "GM-CSF"는 천연 사람 GM-CSF의 생물학적 활성을 유지하는데 충분한, 미국 특허 제 5,108,910호 및 동 제5,229,496호에 기재된 천연 사람 GM-CSF 분자의 동족체를 포함한다. GM-CSF 동족체의 예는 본 명세서에 그 내용이 각각 포함되는 EP 제 212914호 및 WO 제 89/03881호에 기재된 것들이다. GM-CSF의 다른 동족체는 또한 IL-3과의 융합 단백질을 작제하는데 사용될 수 있다. 글리코실화 가능 부위가 제거된, 특히 바람직한 GM-CSF 단백질을 코딩하는 DNA 서열은 ATCC로부터 수탁 번호 ATCC 67231로 공개적으로 이용가능하다.

용어 "GM-CSF/IL-3 융합 단백질"은 GM-CSF 및 IL-3의 C-말단에서 N-말단으로의 융합체를 의미한다. 융합 단백질은 공지되어 있고, 본 명세서에 그 내용이 각각 포함되는 미국 특허 제 5,199,942호, 동 제 5,108,910호 및 동 제 5,073,627호에 기재되어 있다. 바람직한 융합 단백질은 미국 특허 제 5,199,942호에 기재된 PIXY321이다.

용어 "c-kit 리간드"는 비만세포 성장 인자 (Mast Cell Growth Factor, MGF), 스틸 인자 (Steel Factor) 또는 간세포 인자 (Stem Cell Factor) (SCF)로서도 공지되어 있고, 본 명세서에 그 내용이 포함되는 1990년 10월 1일자로 출원된 미국 특허 출원 제 589,701호로부터 우선권을 주장하는 EP 제 423,980호에 기재된 폴리펩티드를 의미한다. 그러한 c-kit 리간드 폴리펩티드는 EP 제 423,980호에 기재된 천연 사람 c-kit 리간드 아미노산 서열과 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 가지며, c-kit 수용체에 결합하거나, c-kit 수용체와 결합함으로써 개시된 생물학적 시그널을 전달하거나, 또는 항-c-kit 리간드 항체와 교차 반응한다는 점에서 생물학적으로 활성인 동족체를 포함한다. 용어 "c-kit 리간드"는 천연 사람 c-kit리간드의 생물학적 활성을 유지하기에 충분한, 천연 사람 c-kit 리간드 분자의 동족체를 포함한다.

용어 "증강제"는 백신 항원에 대한 숙주의 면역 반응을 향상시키거나, 증진시키거나 또는 강력하게 하는 물질을 의미한다.

조혈 간세포 및 기원세포의 "생체외 증량"에 관한 방법은 본 명세서에 그 내용이 포함되는 미국 특허 제 5,199,942호에 기재되어 있다. 간략하게 설명하면, 이 용어는 (1) 환자의 말초 혈액 수집물 또는 골수 이식물로부터 CD34⁺조혈 간세포 및 기원세포를 수집하는 단계, 및 (2) 생체외에서 그러한 세포를 증량시키는 단계를 포함하는 방법을 의미한다. 미국 특허 제 5,199,942호에 기재된 세포의 성장 인자 이외에, flt3-리간드, IL-1, IL-3, c-kit 리간드와 같은 다른 인자들을 사용할 수 있다.

용어 "면역원성"은 면역 반응을 유도하는 면역원 또는 항원의 상대적인 유효성을 의미한다.

용어 "실질적으로 유사한"은 천연 아미노산 서열과 바람직하게는 80 % 이상, 가장 바람직하게는 90 % 이상이 동일한 다양한 아미노산 서열을 의미한다. 동일성 (%)은 예를 들면, 문헌 [Devereux et al., Nucl. Acids Res. 12:387, (1984)]에 기재되어 있고 유니버시티 오브 위스콘신 제네틱스 컴퓨터 그룹 (University of Wisconsin Genetics Computer Group, UWGCG)으로부터 구입할 수 있는 GAP 컴퓨터 프로그램, 버전 6.0을 사용하여 서열 정보를 비교함으로서 결정할 수 있다. GAP프로그램은 스미스 및 워터맨 (Smith and Waterman, Adv. Appl. Math 2:482, 1981)에 의해 개정된 니들맨 및 운쉬 (Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970)의 정렬 방법을 이용한다. GAP 프로그램에 대한 바람직한 디폴트 파라메터 (default parameter)는 (1) 뉴클레오티드에 대한 단일 비교 매트릭스 (동일한 경우는 1의 값을, 비-동일한 경우는 0의 값을 함유함) 및 문헌 [Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358, 1979]에 기재된 바와 같은, 그리브스코프 및 버게스 (Gribskov and Burgess, Nucl. Acids Res. 14:6745, 1986)의 가중 비교 매트릭스, (2) 각각의 갭에 대한 3.0의 벌점 및 각 갭에서의 각각의 부호에 대한 추가의 0.10 벌점, 및 (3) 말단 갭에 대해서는 벌점이 없음을 포함한다. 변이체는 보편적으로 치환된 서열, 즉 주어진 아미노산 잔기가 생리화학적 특성이 유사한 잔기로 대체된 서열을 포함할 수 있다. 보존적인 치환의 예는 Ile, Val, Leu 또는 Ala와 지방족 잔기의 다른 지방족 잔기로의 치환, 또는 Lys 및 Arg, Glu 및 Asp, 또는 Gln 및 Asn 사이의 치환과 같은 극성 잔기의 다른 극성 잔기로의 치환을 포함한다. 그러한 보존적인 기타 치환, 예를 들면, 유사한 소수성 특징을 갖는 전체 영역의 치환은 잘 알려져 있다. 천연적으로 존재하는 변이체도 본 발명에 또한 포함된다. 그러한 변이체의 예는 교대 mRNA 스플라이싱 또는 천연 단백질의 단백질 가수분해로부터 생성되는 것이고, 천연 생물학적 특성은 유지된다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "백신"은 무독 형태의 항원을 함유하는 유기체 또는 물질을 의미한다. 백신은 면역보호 반응을 유발시키도록 고안된다. 백신은 재조합체 또는 비-재조합체일 수 있다. 비면역 숙주내로 접종되었을 때, 백신은 유기체 또는 물질에 대해 활성 면역을 일으키나, 질병을 유발하지는 않는다. 백신은 예를 들면, 탈독은 되었으나 그의 주요 면역원성 결정인자를 여전히 유지하는 독소로서 정의되는 톡소이드 형태, 또는 티프스, 콜레라 및 회백수염 백신과 같은 치사 유기체, 또는 살아있기는 하지만 독성이 없는 병원체 형태인 약독화된 유기체일 수 있거나, 또는 그러한 유기체에 의해 코딩되는 항원일 수 있거나, 또는 살아있는 종양 세포 또는 종양 세포 상에 존재하는 항원일 수 있다.

세포 집단으로부터 CD34⁺조혈 간세포 또는 기원세포를 동정하고 분리하는 다양한 세포 선별의 기술이 공지되어 있다. 그러한 세포 유형을 동정하고 선별하는 방법 및 물질이 공지되어 있다. 예를 들면, 모노클론 항체를 사용하여 간세포 또는 기원세포 상에서 발견되는 마커 단백질 또는 표면 항원 단백질에 결합시킬 수 있다. 조혈 간세포에 대한 그러한 마커 또는 세포 표면 항원은 CD34 및 Thy-1을 포함한다. 한가지 방법으로, 항체를 표면, 예를 들면, 유리 비드에 고정시키고 간세포를 함유하는 것으로 의심되는 세포 혼합물과 접촉시킨다. 이것은 항체가 유리 비드에 간세포를 결합시키고 고정시키도록 한다. 별법으로는, 항체를 세포 혼합물과 함께 배양하고, 생성된 배합물을 항체-세포 결합체에 대한 친화도를 갖는 표면과 접촉시킬 수 있다. 바람직하지 않은 세포 및 세포 물질을 제거하여 상대적으로 순수한 간세포 집단을 제공한다. CD34 마커를 갖는 간세포 또는 기원세포는 골수에서 단핵세포의 단지 약 1 % 내지 3 %를 구성한다. 말초 혈액의 CD34⁺간세포 또는 기원세포의 양은 골수에서보다 약 10 내지 100배 적다.

본 발명의 특정 국면에 관련하여, 적절한 간세포 또는 기원세포 선별 수단을 선택하는 것은 단리될 세포의 바람직한 표현형에 따를 것이다. 조혈 간세포는 막에 결합된 flt3 수용체를 발현하거나, 또는 CD34 또는 Thy-1 등의 세포성 마커를 갖는 것과 같은 그들의 물리적 특성에 의해 선별할 수 있다. 임의의 이들 항원을 인식하는 모노클론 항체 (항-My-10)는 본 명세서에 그 내용이 포함되는 미국 특허 제 4,714,680호에 기재되어 있고, 항-CD34는 벡톤 딕킨슨 (NJ Franklin Lakes 소재의 Becton Dickinson)로부터 구입할 수 있고, 항-Thy-1 모노클론 항체는 본 명세서에 그 내용이 포함되는 문헌 [Dalchau et al., J. Exp. Med.149:576 (1979)]에 기재된 방법을 사용하여 쉽게 제조할 수 있다. 항-flt3 모노클론 항체 또는 flt3-리간드와 같은 flt3 수용체 결합 단백질도 또한 사용할 수 있다. 세포 결합 단백질을 수집된 세포 혼합물과 접촉시키고, 그 배합물을 목적하는 세포가 세포 결합 단백질에 결합하기에 충분한 시간 동안 배양시킨다.

휴지기 간세포를 선별하는 또다른 방법은 5-플루오로우라실 (5-FU)과 같은 항대사산물 또는 4-히드록시시클로포스파미드 (4-HC)와 같은 알킬화제를 사용하여, 분열하는 보다 계에 수임된 세포 유형에서 세포사를 유도하는 것이다. 비-휴지기 세포를 자극하여 간세포 상에 전혀 또는 거의 영향을 미치지 않는 성장 인자의 첨가에 의해 증식 및 분화시켜, 비-간세포가 증식 및 분화되고, 그들을 5-FU 또는 4-HC의 세포 독성 효과에 대해 더욱 취약하게 만든다. 본 명세서에 그 내용이 포함되는 문헌 [Berardi et al., Science, 267:104 (1995)]을 참조할 수 있다.

조혈 간세포 또는 기원세포의 단리는 예를 들면, 친화도 크로마토그래피, 항체-코팅된 자성 비드, 또는 유리 비드, 플라스크 등과 같은 고체 매트릭스에 고정된 항체를 사용하여 수행할 수 있다. 간세포 또는 기원세포 표면 마커를 인식하는 항체를 고체 지지체에 고정된 아비딘 또는 스트렙타비딘 잔기, 형광 활성화 세포 분류 (FACS)에 유용한 플루오로크롬 등으로 제거될 수 있는 비오틴과 같은 기타 화학 잔기에 융합시키거나 결합시킬 수 있다. 바람직하게는, 단리는 면역친화도 칼럼에 의해 수행된다. 면역친화도 칼럼은 임의의 형태일 수 있지만, 보편적으로는 충전된 베드 반응기를 포함한다. 이러한 생반응기 중의 충전된 베드는 바람직하게는 실질적으로 균일한 기질의 코팅을 갖는 다공성 물질로 제조된다. 다공성 물질은 높은 표면적-대-부피 비율을 제공하며, 베드로부터 세포의 흐름을 방해하지 않으면서 세포 혼합물이 넓은 접촉 면적에 걸쳐 흐르게 한다. 대표적인 기질은 아비딘 및 스트렙타비딘을 포함하는 반면, 다른 통상적인 기질을 사용할 수 있다. 기질은 그의 고유한 특성에 의하거나 화학적 잔기의 첨가에 의해, 모노클론 항체와 같은 세포 결합 단백질 상에서 발견되는 잔기에 대한 높은 친화도를 나타내어야 한다. 모노클론 항체는 분리될 세포 상의 모든 세포 표면 항원을 인식하며, 전형적으로는 추가로 변형되어 비오틴 잔기를 제공한다. 비오틴이 아비딘에 대해 높은 친화도를 가지며, 따라서 이러한 기질의 친화도가, 모노클론 항체를 충전된 베드의 표면에 제거가능하게 고정시킴이 잘 알려져 있다. 그러한 칼럼은 당 기술 분야에 잘 알려져 있고, 문헌 [Berenson et al., J. Cell Biochem.,10D:239 (1986)]을 참조할 수 있다. 칼럼을 PBS 용액으로 세척하여 결합되지 않은 물질을 제거한다.표적 세포는 통상적인 방법을 사용하여 비드로부터 방출될 수 있다. 아비딘-코팅된 충전된 베드에 고정된 비오티닐화 항-CD34 모노클론 항체를 이용하는 상기 기재된 유형의 면역친화도 칼럼은 예를 들면, PCT WO 제 93/08268호에 기재되어 있다. 이 방법의 변형은 단리 수단 중 고정된 표면에 제거가능하게 고정된, 상기한 바와 같은 모노클론 항체 또는 flt3-리간드와 같은 세포 결합 단백질을 이용한다. 이어서, 결합된 세포 결합 단백질을 수집된 세포 혼합물과 접촉시키고, 충분한 시간 동안 배양하여 목적하는 세포가 단리되도록 한다.

별법으로는, 세포 표면 항원을 인식하는 모노클론 항체를 형광 표지, 예를 들면, 발색단 또는 형광단으로 표지할 수 있으며, 표지된 생성물의 양의 존재 또는 부재에 따른 세포 분류에 의해 분리할 수 있다.

이어서, 수집된 CD34⁺세포를 flt3-리간드 단독 또는 하나 이상의 싸이토카인 (즉, GM-CSF, TNF-α, IL-3, IL-4, c-kit 리간드 또는 GM-CSF/IL-3 융합 단백질)과의 배합물에 동시에 또는 연속적으로 노출시켰다. 이어서, CD34⁺세포가 분화된 수지상 세포계로 되도록 하였다. 수지상 세포를 수집하고, (a) 환자에게 투여하여 면역계 및 항원에 대한 T-세포 매개 또는 B-세포 매개 면역 반응을 증강시키거나, (b) 수지상 세포를 환자에게 투여하기 전에 항원에 노출시키거나, (c) 항원 특이적 폴리펩티드를 코딩하는 유전자로 형질 감염시키거나, 또는 (d) 항원에 노출시키고 환자로부터 수집된 T-세포에 대해 생체외에서 항원을 제공하게 한 다음, 항원 특이적 T-세포를 환자에게 투여할 수 있다.

더욱 구체적으로는, 본 발명은 유효량의 flt3-리간드를 사용하여 생체내, 예를 들면, 환자의 말초 혈액 또는 비장과 같은 기타 조직 또는 기관에서 수지상 세포를 증가시키거나 이동시키는 것을 제공한다. 환자의 수지상 세포의 양을 증가시킴으로써, 그러한 세포를 사용하여 T 세포에 대한 항원을 제공할 수 있다. 예를 들면, 항원은 종양성 항원과 같이 환자에 이미 존재하는 것이거나, 세균성 또는 바이러스성 항원일 수 있다. 따라서, flt3-리간드를 사용하여 이미 존재하는 항원에 대한 환자의 림프구-매개 (예를 들면, T 세포 및 B 세포 매개) 또는 골수-매개 면역 반응을 증강시켜 환자의 T 세포에 대해 보다 효과적인 항원-제공을 강하게 할 수 있다. 별법으로는, flt3-리간드는 면역의 목적으로 환자에게 항원을 투여하기 전에, 그와 동시에 또는 그후에 투여될 수 있다. 따라서, 백신 증강제로서의 flt3-리간드는 생체내에서 수지상 세포를 다량으로 생성시켜 보다 효과적으로 항원을 제공할 수 있다. 전체 반응은 항원에 대한 보다 강력하고 개선된 면역 반응이며 보다 효과적인 면역화이다.

flt3-리간드의 전신 투여는 백신 증강제로서 효과적일 뿐만아니라, 상기 문헌에서 논의된 바와 같이 이미 존재하는 항원에 대한 면역 반응을 증강시키는데도 효과적이다. 예를 들면, 본 발명자들은 종양을 갖는 마우스에 flt3-리간드를 투여하는 것이 종양의 증식 속도를 적어도 상당히 감소시키며, 많은 비율의 마우스에서 종양 퇴치를 초래할 수 있음을 발견하였다. 데이터는 실시예 3에 더욱 상세히 기재되어 있다. 따라서, flt3-리간드는 항원에 대한 생체내에서의 유효한 면역 반응을 발생시키는데 있어서 중요한 싸이토카인이다.

수지상 세포를 발생시키는 그의 능력 때문에, flt3-리간드는 또한 이식된 조직 또는 기관의 생존을 증진시키는데 사용된다. 동종이계 기관 또는 다른 조직이 숙주내로 이식될 때, 그들은 공여자로부터 간세포, 미성숙 수지상 세포 및 성숙 수지상 세포를 전달할 수 있다. 이러한 세포들은 패신저 (passenger) 세포로 일컬어지며, 숙주의 조혈계내로 이식될 수 있다. 또한, 숙주로부터의 간세포, 미성숙 수지상 세포 및 성숙 수지상 세포를 공여자 기관 또는 조직으로 이식할 수 있다. 숙주 및 공여자 조직으로부터의 미성숙 수지상 세포가 "다른 쪽"으로부터의 T 세포와 상호 작용하기 때문에 이식물 및 숙주 사이의 내성을 확립하는 것이 가능하다. 그러한 상호 작용은 수지상 세포가 발현하는 주요 조직적합성 복합체 (MHC)를 인식하는 T 세포의 결실을 포함할 수 있다. 이러한 방식으로, 공여자 세포는 숙주를 인식하고 그에 반응 (즉, 이식물 대 숙주 질병)하지 못하도록 "스크리닝"되고, 숙주 T-세포는 이식물을 인식하고 그에 반응 (이식물 거부)하지 못하도록 스크리닝된다. 따라서, 상호 내성이 성취될 수 있으며, 이식물 순응이 개선된다. flt3-리간드를 숙주 또는 공여자에게 이식 전에 투여하는 것은 그러한 숙주 또는 공여자에 있어서 수지상 세포의 수를 증가시키고, 이식물의 내성 및 생존을 증가시킨다.

수지상 세포의 성장 및 배양을 위해, 다양한 성장 및 배양 배지를 사용할 수 있고, 그러한 배지의 조성은 당 기술 분야의 숙련인들에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 적합한 성장 배지는 영양소 또는 대사 산물 첨가제를 함유하는 용액이며, 혈청-고갈 또는 혈청-기재의 것을 포함한다. 성장 배지의 대표적인 예는 RPMI, TC199, 이스코브스 (Iscoves) 변형 둘비코 (Dulbecco's) 배지 (Iscove et al., F.J. Exp. Med.,147:923 (1978)), DMEM, 피셔 (Fischer's) 알파 배지, NCTC, F-10, 라이보피츠 (Leibovitz's) L-15, MEM 및 맥코이 (McCoy's) 배지이다. 당 기술 분야의 숙련인들에게 이미 명백할 것인 특정 영양소의 예는 혈청 알부민, 트랜스페린, 지방, 콜레스테롤, 2-머캅토에탄올 또는 모노티오글리세롤과 같은 환원제, 피루베이트, 부티레이트, 및 하이드로코티손 2-헤미숙시네이트와 같은 글루코코르티코이드를 포함한다. 보다 구체적으로는, 표준 배지는 에너지원, 비타민 또는 다른 세포-지지 유기 화합물, 배지의 pH를 안정화시키는 HEPES 및 Tris와 같은 완충액, 다양한 무기 염을 포함한다. 특히, 다양한 혈정-부재 세포 성장 배지가 기재된 PCT WO 제 95/00632호를 참조할 수 있고, 상기 개시는 본 명세서에 그 내용이 포함된다.

본 발명의 임의의 생체외 방법을 위해, 말초 혈액 기원세포 (PBPC) 및 말초 혈액 간세포 (PBPS)를 당 기술 분야에 공지된 분리반출법을 사용하여 수집한다. [참조: Bishop et al., Blood, vol. 83, No. 2, pp. 610-616 (1994)]. 간략히 설명하면, PBPC 및 PBSC를 통상적인 장치, 예를 들면, 헤모네틱스 (Haemonetics) 모델 V50 분리반출 장치 (MA Braintree 소재의 Haemonetics 제품)를 사용하여 수집한다. 환자 체중 ㎏ 당 약 6.5×10⁸개의 단핵세포 (MNC)가 수집될 때까지 전형적으로는 매주 5회 이하로 4시간 동안의 수집을 수행한다. 세포를 표준 배지 중에 현탁시킨 다음, 원심분리하여 적혈구 및 호중구를 제거한다. 2개의 상 (당 기술 분야에 버피 (buffy) 코트로서도 공지됨) 사이의 경계면에 위치한 세포를 회수하고 HBSS 중에 재현탁시킨다. 현탁된 세포는 주로 단핵성이고, 세포 혼합물의 상당한 부분은 초기 간세포이다. 생성된 간세포 현탁액을 비오티닐화 항-CD34 모노클론 항체 또는 다른 세포-결합 수단과 접촉시킬 수 있다. 접촉 시간을 충분하게 유지하여 간세포 표면에서의 항-CD34 모노클론 항체 및 CD34 항원 사이의 실질적인 상호 작용이 이루어지게 한다. 전형적으로는 1시간 이상의 시간이 충분하다. 이어서, 세포 현탁액을 키트내에 제공되는 단리 수단과 접촉시킨다. 이 단리 수단은 아비딘-코팅된 비드로 충전된 칼럼을 포함할 수 있다. 그러한 칼럼은 당 기술 분야에 잘 알려져 있다 [참조: Berenson et al., J. Cell. Biochem.,10D:239 (1986)]. 칼럼을 PBS 용액으로 세척하여 결합되지 않은 물질을 제거한다. 표적 간세포를 통상적인 방법을 사용하여 비드 및 항-CD34 모노클론 항체로부터 방출시킨다. 이러한 방법으로 수득된 간세포를 속도 제어 냉동기 (예를 들면, MI Mt. Clemens 소재의 Cryo-Med 제조) 중에서 동결시킨 다음, 액체 질소의 증기상 중에 보관할 수 있다. 10 % 디메틸술폭사이드를 동결보존제로서 사용할 수 있다. 공여자로부터 모두 수집한 후, 간세포를 해동시키고 합하였다. 간세포, 맥코이 5A 배지와 같은 성장 배지, 0.3 % 한천, 및 약 200 U/㎖ 농도의 하나 이상의 증량 인자 (즉, 재조합 사람 GM-CSF, IL-3, 재조합 사람 flt3-리간드 및 재조합 사람 GM-CSF/IL-3 융합 분자 (PIXY321))를 함유하는 분취액을 37 ℃, 5 % CO₂의 완전히 습윤된 공기에서 14일 동안 배양하고 증량시킨다. 임의로, 사람 IL-1α 또는 IL-4를 배양액에 첨가할 수 있다. 가장 바람직한 증량 인자의 배합물은 flt3-리간드 및 IL-3 또는 GM-CSF/IL-3 융합 단백질 중 어느 하나를 포함한다.

사람에 대한 생체내 투여를 위해, flt3-리간드를 약제학적으로 유용한 조성물을 제조하는데 사용되는 공지된 방법에 따라 제조할 수 있다. flt3-리간드를 약제학적으로 적합한 희석제 (예를 들면, Tris-HCl, 아세테이트 및 포스페이트), 보존제 (예를 들면, 티메로살, 벤질 알콜 및 파라벤), 유화제, 용해제, 증강제 및(또는) 담체와의 혼합물 중에 단독 활성 물질로서 또는 다른 공지된 활성 물질들과 함께 합할 수 있다. 적합한 담체 및 그들의 제제는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed. 1980, Mack Publishing Co.]에 기재되어 있다. 이외에, 그러한 조성물은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 금속 이온과 착물화되거나, 폴리아세트산, 폴리글리콜산 및 히드로겔 등과 같은 중합체 화합물 중으로 혼입되거나, 또는 리포좀, 마이크로에멀젼, 미셀, 단층 또는 다층 소포, 적혈구 고스트 또는 구상 아세포 중으로 혼입된 flt3-리간드를 함유할 수 있다. 그러한 조성물은 물리적 상태, 용해도, 안정성, 생체내에서의 방출 속도 및 flt3-리간드의 생체내에서의 제거 속도에 영향을 줄 것이다.

flt3-리간드를 국소적으로, 비경구적으로 또는 흡입에 의해 투여할 수 있다. 용어 "비경구적"은 피하 주사, 정맥내, 근육내, 조내 (槽內) 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 이들 조성물은 전형적으로 유효량의 flt3-리간드를 단독으로 또는 임의의 다른 활성 물질 유효량과의 배합으로 함유할 것이다. 조성물 중에 함유된 그러한 투여량 및 목적하는 약제 농도는 의도된 용도, 환자의 체중 및 연령, 및 투여 경로를 포함하는 다수의 인자에 의해 변할 것이다. 예비적 투여량은 동물 시험에 따라 결정될 수 있으며, 사람 투여를 위한 투여량의 범위는 당 기술 분야에 확립된 실시에 따라 수행될 수 있다. 이러한 사항들을 고려할 때, flt3-리간드의 전형적인 투여량은 m²당 약 10 ㎍ 내지 m²당 약 1000 ㎍의 범위일 수 있다. 바람직한 투여량 범위는 m²당 약 100 ㎍ 내지 m²당 300 ㎍ 정도이다.

상기 기술 이외에, 하기 실시예에 구체적인 실시 양태를 예시하나, 본 발명의 범주를 제한하는 것은 아니다.

<실시예>

<실시예 1>

수지상 세포의 발생

본 실시예는 flt3-리간드를 사용하여 생체외에서 다수의 수지상 세포를 발생시키는 방법을 기술한다. CD34⁺표현형을 갖는 세포를 상기한 바와 같이 단리시키는데, 예를 들면, 우선 상기 문헌에 기재된 방법으로 세포의 버피 (buffy) 코트를 생성시켰다. 이어서, 버피 코트로부터의 세포를 CD34 특이적 모노클론 항체와 배양시켰다. 선별된 CD34⁺세포를 각각 20 ng/㎖의 GM-CSF, IL-4, TNF-α, 또는 100 ng/㎖의 flt3-리간드 또는 c-kit 리간드를 함유하는 맥코이 강화 배지 중에서 배양하였다. 배양을 37 ℃, 10 % CO₂의 습윤 공기 중에서 약 2주 동안 계속하였다. 세포를 CD1a⁺및 HLA-DR⁺발현에 대한 유동 세포측정기에 의해 분류하였다. GM-CSF, IL-4 및 TNF-α의 배합물은 배양한 지 2주 후에 얻어진 세포의 수에 있어서 6 내지7배의 증가를 보였다. flt3-리간드 및 c-kit 리간드의 배합물은 세포의 절대수에 있어서 추가로 12 내지 13배 증가를 가져왔다. 이것은 flt3-리간드 또는 c-kit 리간드에 의한 18배 증가 또는 flt3-리간드 및 c-kit 리간드 배합물에 의한 34배 증가와 연관이 있다. 세포의 표현형 분석은 모든 인자 조합을 검사할 때 세포의 60 내지 70 %가 HLA-DR⁺, CD86⁺이고, 세포의 40 내지 50 %가 CD1a를 발현하는 것으로 나타났다. flt3-리간드를 가하면 CD1a⁺세포의 절대수가 5배 증가하였다. c-kit 리간드는 그러한 세포를 6.7배 증가시켰고, flt3-리간드 및 c-kit 리간드의 배합물은 11배 증가시켰다. MLR 중에서 생성된 세포를 기능 분석한 결과, flt3-리간드 또는 c-kit 리간드의 존재는 생성된 수지상 세포 자극 능력에 영향을 미치지 않는 반면, 수득되는 수를 증가시키는 것으로 나타났다.

<실시예 2>

수지상 세포 증량에서의 flt3-L의 사용

본 실시예는 수지상 세포 증량을 위해 flt3-리간드를 사용하는 방법을 기술한다. 세포를 수집하기 전에, PBPC 및 PBSC를 이동시키거나 순환하는 수를 증가시키는 것이 바람직할 수 있다. 이동은 PBPC 및 PBSC 수집을 향상시킬수 있고, 그러한 세포를 수집하기 전에 flt3-리간드 또는 사그라모스팀 (등록상표 Leukine, Washington Seattle 소재의 Immunex Corporation 제조)을 환자에게 정맥내 투여함으로써 성취될 수 있다. CSF-1, GM-CSF, c-kit 리간드, G-CSF, EPO, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14,IL-15, GM-CSF/IL-3 융합 단백질, LIF, FGF 및 이들의 배합물과 같은 기타 성장 인자도 마찬가지로 flt3-리간드와 순차적으로 또는 그와 함께 동시에 투여할 수 있다. 이동된 또는 비-이동된 PBPC 및 PBSC는 당 기술 분야에 공지된 분리반출법을 사용하여 수집될 수 있다 [참조: Bishop et al., Blood, vol. 83, No. 2, pp. 610-616 (1994)]. 간략히 설명하면, PBPC 및 PBSC를 통상의 장치, 예를 들면, 헤모네틱스 (Haemonetics) 모델 V 50 분리반출 장치 (MA Braintree 소재의 Haemonetics 제조)를 사용하여 수집할 수 있다. 환자 체중 ㎏ 당 약 6.5×10⁸개의 단핵세포 (MNC)가 수집될 때까지 전형적으로는 매주 5회 이하로 4시간 동안의 수집을 수행하였다. 수집된 PBPC 및 PBSC의 분취액을 칼슘 또는 마그네슘이 없는 행크 (Hank's) 평형 염 용액 (HBSS)으로 대략 1:6으로 희석하고, 림프구 분리 배지 (North Carolina Durham 소재의 Organon Teknika 제조) 위에 깔아서 과립구-매크로파지 콜로니-형성 단위 (CFU-GM) 함량에 대해 분석하였다. 원심분리 후, 경계면의 MNC를 수집하고, HBSS 중에서 세척하고 재현탁하였다. 약 300,000 MNC, 변형 맥코이 5A 배지, 0.3 % 한천, 200 U/㎖ 재조합 사람 GM-CSF, 200 U/㎖ 재조합 사람 IL-3, 및 200 U/㎖ 재조합 사람 G-CSF를 함유하는 1 ㎖ 분취액을 37 ℃, 5 % CO₂의 완전히 습윤된 공기 중에서 14일 동안 배양하였다. 임의로, flt3-리간드 또는 GM-CSF/IL-3 융합 분자 (PIXL 321)를 배양액에 가할 수 있다. 이들 배양액을 라이츠 스테인 (Wright's stain)으로 염색하고, CFU-GM 콜로니의 수를 해부 현미경으로 계산하였다 (Ward et al., Exp. Hematol., 16:358 (1988)). 별법으로는, CFU-GM 콜로니를문헌 [Siena et al., Blood, Vol. 77, No. 2, pp. 400-409 (1991)]의 CD34/CD33 플로우 싸이토메트리 또는 당 기술 분야에 공지된 기타 방법에 의해 분석할 수 있다.

CFU-GM 함유 배양액을 속도 제어 냉동기 (예를 들면, MI Mt. Clemens 소재의 Cryo-Med 제조) 중에서 동결시킨 다음, 액체 질소의 증기상 중에 보관하였다. 10 % 디메틸술폭사이드를 냉동보존제로서 사용할 수 있다. 환자로부터 모두 수집한 후, CFU-GM 함유 배양액을 해동시키고 합하였다. 해동된 세포를 flt3-리간드 단독, 또는 상기 열거된 다른 싸이토카인과 함께 연속적으로 또는 동시에 접촉시켰다. flt3-리간드에 대한 그러한 노출은 CFU-GM을 수지상 세포계로 유도할 것이다. 수지상 세포를 환자에게 정맥내로 재주입하였다.

<실시예 3>

항-종양 면역 반응의 증강에 있어서의 flt3-L의 사용

본 실시예는 생체내에서 flt3-L을 사용하여 항-종양 면역 반응을 증강시키는 방법을 기술한다. 암컷 C57BL/10J (B10) 마우스 (ME Bar Harbor 소재의 The Jackson Laboratory)에 5×10⁵개의 생존 B10.2 또는 B10.5 섬유육종 종양 세포를 복부 중심선 위치에 총 부피 50 ㎕로 피내 주사하였다. 섬유육종 B10.2 및 B10.5 계는 B10에서 유래하며, 본 명세서에 그 내용이 포함되는 문헌 [Lynch et al., Euro. J. Immunol., 21:1403 (1991)]에 전술되어 있다. 섬유육종 B10.2 계는 메틸콜란트렌 5 ㎎을 함유하는 파라핀 펠렛의 피하 이식에 의해 유도되었고, B10.5 계는 자외선에 장기간 동안 노출시켜 유도되었다. 종양 세포계를 시험관내에서 5 % FBS, 2nM L-글루타민, 50 U/㎖ 페니실린 및 50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 함유하는 α-변형 MEM 중에 유지시켰다. 재조합 사람 flt3-리간드 (10 ㎍/주입)를 (달리 언급이 없으면) 19일에 걸쳐 매일 총 부피 100 ㎕를 피하 주사로 투여하였다. 대조 마우스에 마찬가지로 100 ng MSA를 함유하는 완충액 유사량을 주사하였다. 종양 주입 후, 종양 성장 속도는 시간에 대한 종양의 크기를 플롯팅하여 결정하였다. 종양 크기를 캘리퍼에 의해 측정된 두 수직한 직경의 곱으로서 계산하였고, 특정 처리군 내에서 종양을 갖는 마우스만의 평균 종양 크기로서 표현하였다. 실험 종료시에 각 처리군에 대하여 종양 주입된 마우스에 비교한 종양을 갖는 마우스의 수를 하기 데이터에 나타내었다.

표 1에서, 데이터는 종양을 갖는 마우스가 flt3-리간드로 처리되거나 MSA로 처리된 6개의 상이한 실험의 종합 데이터이다. 완벽한 종양의 퇴화는 MSA-처리된 마우스에서 30 마리 중 1 마리와 비교할 때, flt3-리간드로 처리된 마우스에서는 50 마리 중 19 마리인 것으로 나타났다 (Fishers Exact Test를 사용할 때 p < 0.0001). flt3-리간드로 처리된 마우스 (종양 주입 후 제 5주 후에, 종양을 갖는 마우스의 평균 종양 크기가 60±8 ㎜²)의 종양 성장 속도는 MSA-처리된 마우스 (종양 주입 후 제 5주 후에, 평균 종양 크기가 185±17 ㎜²)와 비교할 때 상당히 감소하였다는 것을 확인할 수 있었다 (분산 분석에 의한 p=0.0001).

섬유육종 +/- flt3-L에 대한 6가지 실험, 종양 크기 (㎜²)

종양 주입후의 주	MSA 대조(100 ng/일)	표준 오차	Flt3-L(10 ㎍/일)	표준 오차
0	0	0	0	0
1	25	2.6	24	2.2
2	62	7.5	49	3.6
3	98	10.6	49	3.9
4	149	14.5	50	5
5	185	16.8	60	8.4

종양 크기는 대조군과 비교할 때 flt3-리간드에 의해 급격히 저지되었다. 따라서, 데이터로부터 flt3-리간드가 외래 항원 및 특히 암에 대한 면역 반응을 증강시키는 중요한 싸이토카인임을 알 수 있다.

Claims

flt3-리간드 및 종양 항원(들)을 포함하는, 암 또는 신생물성 질병을 갖는 환자의 면역 반응을 증강시키기 위한 제약 조성물.
제1항에 있어서, 과립구 매크로파지 콜로니 자극인자(GM-CSF), 인터루킨-4 (IL-4), 종양괴사인자-α(TNF-α), 인터루킨-3 (IL-3), c-kit 리간드 및 GM-CSF와 IL-3의 융합체로 이루어진 군중에서 선택된 분자(들)을 더 포함하는 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, flt3-리간드가 사람 flt3-리간드, 가용성 사람 flt3-리간드 및 재조합 가용성 사람 flt3-리간드로 이루어진 군중에서 선택되는 것인 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 종양 항원(들)이 상기 종양 항원(들)을 포함하는 종양 세포 및 단리된 종양 항원으로 이루어진 군중에서 선택되는 것인 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 종양 항원(들)이 flt3-리간드 사용 전에, 그와 동시 및(또는) 그 후에 사용되는 것인 조성물.
제3항에 있어서, 종양 항원(들)이 상기 종양 항원(들)을 포함하는 종양 세포 및 단리된 종양 항원으로 이루어진 군중에서 선택되는 것인 조성물.
제4항에 있어서, 종양 항원(들)이 flt3-리간드 사용 전에, 그와 동시 및(또는) 그 후에 사용되는 것인 조성물.
flt3-리간드 및 종양 항원(들)을 포함하는, 환자의 암 또는 신생물성 질병을 치료하기 위한 제약 조성물.
제8항에 있어서, 과립구 매크로파지 콜로니 자극인자(GM-CSF), 인터루킨-4 (IL-4), 종양괴사인자-α(TNF-α), 인터루킨-3(IL-3), c-kit 리간드 및 GM-CSF와 IL-3의 융합체로 이루어진 군중에서 선택된 분자(들)을 더 포함하는 조성물.
제8항 또는 제9항에 있어서, flt3-리간드가 사람 flt3-리간드, 가용성 사람 flt3-리간드 및 재조합 가용성 사람 flt3-리간드로 이루어진 군중에서 선택되는 것인 조성물.
제8항 또는 제9항에 있어서, 종양 항원(들)이 상기 종양 항원(들)을 포함하는 종양 세포 및 단리된 종양 항원으로 이루어진 군중에서 선택되는 것인 조성물.
제8항 또는 제9항에 있어서, 종양 항원(들)이 flt3-리간드 사용 전에, 그와 동시 및(또는) 그 후에 사용되는 것인 조성물.
제10항에 있어서, 종양 항원(들)이 상기 종양 항원(들)을 포함하는 종양 세포 및 단리된 종양 항원으로 이루어진 군중에서 선택되는 것인 조성물.
제11항에 있어서, 종양 항원(들)이 flt3-리간드 사용 전에, 그와 동시 및(또는) 그 후에 사용되는 것인 조성물.
조혈 간세포 또는 기원세포를 flt-3 리간드와 접촉시켜 제조되고, (CD1a 및 사람백혈구항원-DR(HLA-DR)), (CD1a 및 CD86), (HLA-DR 및 CD86), 또는 (CD1a 및 HLA-DR 및 CD86)의 세포 표면 마커를 갖는 세포를 포함하는, 수지상 세포 제제.
제15항에 있어서, 조혈 간세포 또는 기원 세포를 과립구 매크로파지 콜로니 자극인자(GM-CSF), 인터루킨-4 (IL-4), 종양괴사인자-α(TNF-α), 인터루킨-3(IL-3), c-kit 리간드 및 GM-CSF와 IL-3의 융합체로 이루어진 군중에서 선택된 분자와 더 접촉시키는 것인 제제.
조혈 간세포 또는 기원세포를 수지상 세포 집단을 발생시키는데 충분한 양의 flt3-리간드와 시험관 내에서 접촉시키는 것을 포함하는, 수지상 세포 제제의 제조방법.
제17항에 있어서, 조혈 간세포 또는 기원 세포가 CD34+ 표현형이 풍부한 것인 방법.
제17항에 있어서, 조혈 간세포 또는 기원 세포를 과립구 매크로파지 콜로니 자극인자(GM-CSF), 인터루킨-4 (IL-4), 종양괴사인자-α(TNF-α), 인터루킨-3(IL-3), c-kit 리간드 및 GM-CSF와 IL-3의 융합체로 이루어진 군중에서 선택된 분자와 더 접촉시키는 것인 방법.
제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, flt3-리간드가 사람 flt3-리간드, 가용성 사람 flt3-리간드 및 재조합 가용성 사람 flt3-리간드로 이루어진 군중에서 선택되는 것인 방법.
flt-3 리간드를 포함하는, 백신 항원에 대한 면역 반응을 증강시키기 위한 제약 조성물.
flt-3 리간드를 포함하는 백신 증강제.
제22항에 있어서, c-kit 리간드를 더 포함하는 증강제.
flt3-리간드를 포함하는, 숙주에서 이식 조직의 내성을 유도하기 위한 제약 조성물.
제24항에 있어서, 과립구 매크로파지 콜로니 자극인자(GM-CSF), 인터루킨-4 (IL-4), 종양괴사인자-α(TNF-α), 인터루킨-3(IL-3), c-kit 리간드 및 GM-CSF와 IL-3의 융합체로 이루어진 군중에서 선택된 분자(들)를 더 포함하는 조성물.
제24항 또는 제25항에 있어서, flt3-리간드가 사람 flt3-리간드, 가용성 사람 flt3-리간드 및 재조합 가용성 사람 flt3-리간드로 이루어진 군중에서 선택되는 것인 조성물.