ES2225839T3 - Kits de cultuvo extracorporeo y trasplante de celulas. - Google Patents
Kits de cultuvo extracorporeo y trasplante de celulas.Info
- Publication number
- ES2225839T3 ES2225839T3 ES95913602T ES95913602T ES2225839T3 ES 2225839 T3 ES2225839 T3 ES 2225839T3 ES 95913602 T ES95913602 T ES 95913602T ES 95913602 T ES95913602 T ES 95913602T ES 2225839 T3 ES2225839 T3 ES 2225839T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- cells
- kit according
- cell
- growth
- factor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/22—Colony stimulating factors (G-CSF, GM-CSF)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/26—Flt-3 ligand (CD135L, flk-2 ligand)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- External Artificial Organs (AREA)
- Prostheses (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
UN CULTIVO DE CELULAS MADRE EXTRACORPOREAS Y UN EQUIPO DE TRASPLANTES CONTIENEN MEDIOS PARA SELECCIONAR CELULAS QUE TIENEN UN FENOTIPO DESEADO EN UNA MEZCLA CELULAR OBTENIDA DE UN HUMANO; MEDIOS PARA AISLAR LAS CELULAS SELECCIONADAS DE LA MEZCLA; MEDIOS PARA INCUBAR LAS CELULAS AISLADAS; UNA COMPOSICION QUE CONTIENE UNA CANTIDAD EFICAZ DE UN FACTOR DE EXPANSION CELULAR, EN DONDE EL FACTOR DE EXPANSION ES SELECCIONADO DE UN GRUPO DE: GM-CSF, G-CSF, IL-1, IL-3, IL-6, TPO, EPO, UN LIGANDO FLT3, SF Y UNA PROTEINA DE FUSION GM-CSF/IL-3; Y UN MEDIO DE CRECIMIENTO CELULAR.
Description
Kits de cultivo extracorpóreo y trasplante de
células.
La invención se refiere a la tecnología de la
selección y expansión celulares y, en particular, a un kit de
cultivo extracorpóreo y trasplante de células.
Las terapias citorreductoras suponen la
administración de radiaciones ionizantes o de toxinas químicas que
matan rápidamente a las células de división. Los efectos
secundarios típicamente se deben a los efectos citotóxicos sobre
las células normales y pueden limitar el uso de las terapias
citorreductoras. Un efecto secundario frecuente es la
mielosupresión, o lesión de las células de la médula ósea que dan
lugar a leucocitos, eritrocitos y plaquetas. Como consecuencia de
la mielosupresión los pacientes presentan citopenia, o déficit de
células sanguíneas, que aumenta el riesgo de infección y de
trastornos hemorrágicos. Las citopenias producen un aumento de la
morbilidad y de la mortalidad y provocan la infradosificación del
tratamiento del cáncer. Por otro lado, la quimioterapia a dosis
elevadas es terapéuticamente beneficiosa porque puede producir una
mayor frecuencia de respuestas objetivas en pacientes con cánceres
metastásicos, particularmente, con cáncer de mama, cuando se
compara con una terapia a dosis estándar. Esto puede derivar en una
remisión libre de enfermedad prolongada incluso en algunos
pacientes de mal pronóstico. Sin embargo, la quimioterapia a dosis
elevadas es tóxica y muchas complicaciones clínicas resultantes se
relacionan con infecciones, trastornos hemorrágicos y otros efectos
que se asocian a períodos duraderos de mielosupresión.
Muchos investigadores clínicos han manipulado los
regímenes posológicos y las secuencias de las terapias
citorreductoras para aumentar la posología de la terapia contra el
cáncer a la vez que se limita la lesión de la médula ósea. Un
procedimiento alternativo aprovecha el hecho de que las células
sanguíneas se originan de células troncales hematopoyéticas que se
comprometen para diferenciarse a lo largo de ciertos linajes, es
decir, eritroide, megacariocítico, granulocítico, monocítico y
linfocítico. Por lo tanto, dirigirse específicamente a estas
células troncales para la separación celular es de gran interés en
el tratamiento de los pacientes con cáncer a los que se administran
terapias citorreductoras. Un enfoque terapéutico supone trasplantes
de células de la médula ósea o de sangre periférica en los que las
células progenitoras o troncales hematopoyéticas de la médula ósea o
circulantes se recogen y se hacen proliferar en un cultivo celular
antes de la terapia citorreductora. La población celular expandida
se puede entonces reinfundir después de la terapia para restaurar
la función hematopoyética completa. De manera opcional, se puede
usar una etapa de selección para aumentar el número relativo de
progenitores hematopoyéticos en el explante recogido. Al reinfundir
células troncales o progenitoras aisladas se puede minimizar en gran
medida la reinfusión de otros tipos de células, incluidas células
malignas. Además, durante un trasplante alogénico el número de
linfocitos T que se trasplantan se puede reducir en gran medida
seleccionando sólo las células troncales o progenitoras a fin de
minimizar el riesgo de inducir enfermedad del injerto frente al
huésped (EIFH) en el paciente.
Se conocen diferentes técnicas de selección
celular para identificar y separar las células troncales o
progenitoras hematopoyéticas a partir de una población de células.
Se conocen procedimientos y materiales para identificar y
seleccionar esas células. Por ejemplo, se pueden usar anticuerpos
monoclonales para unirse a una proteína marcadora o a una proteína
antígena de superficie que se encuentra en las células troncales o
progenitoras. Esos marcadores o antígenos de superficie celular de
las células troncales hematopoyéticas incluyen CD34,
My-10 y Thy-1. En un procedimiento,
los anticuerpos se fijan a una superficie, por ejemplo, cuentas de
cristal, y se ponen en contacto con una mezcla de células que se
sospecha que contiene células troncales. Esto permite que los
anticuerpos se unan a las células troncales y las fijen a las
cuentas de cristal. De manera alternativa, se pueden incubar los
anticuerpos con la mezcla de células, y la combinación resultante
se pone en contacto con una superficie que tiene afinidad por el
complejo anticuerpo-célula. Se eliminan las células
no deseadas y la materia celular, proporcionando una población
relativamente pura de células troncales. Las células troncales que
tienen el marcador CD34 constituyen sólo aproximadamente entre el
1% y el 3% de las células mononucleares de la médula ósea. La
cantidad de células troncales CD34^{+} en la sangre periférica es
aproximadamente entre 10 y 100 veces menor que en la médula ósea.
Por lo tanto, son deseables procedimientos para aumentar o expandir
el número de células troncales aisladas a fin de reducir el número
de células troncales obtenidas necesario para que la médula ósea o
la sangre periférica permitan una recuperación rápida y completa de
la médula ósea después de dosis ablativas de radioterapia o de
quimioterapia.
Otro procedimiento de selección celular supone la
eliminación de las células de división con el uso de ciertos
antimetabolitos. Se puede inducir la muerte celular en las células
que responden combinando la estimulación con citocinas con el
tratamiento con antimetabolitos. Por lo tanto, se pueden
seleccionar de manera positiva las células resistentes a los efectos
proliferativos de la(s) citocina(s). Véase Berardi y
col., Science, 267:104 (1995).
Bragger y col., Blood 81(10): 1993,
2579-2584, describen los efectos de varios factores
de crecimiento sobre la expansión ex vivo de las células
progenitoras CD34^{+} para su posible uso en la terapia de
trasplante. El documento U.S.5.199.942 describe un procedimiento
para el trasplante autólogo de células hematopoyéticas en un
paciente que recibe terapia citorreductora.
El uso de células troncales expandidas también
permite el trasplante en situaciones en las que no se puede obtener
un número adecuado de células troncales. Un procedimiento denominado
cultivo extracorpóreo y trasplante de células troncales (CETCT),
también conocido como expansión ex vivo, supone la retirada
de las células troncales autólogas o alogénicas, típicamente de la
sangre periférica, de la médula ósea o de la sangre del cordón
umbilical, y aislando las células troncales después de la expansión
in vitro de esas células. Después de la expansión, se
infunden las células en el paciente.
La invención se dirige a la tecnología de
selección y expansión celular y, en particular, al cultivo
extracorpóreo y trasplante de células troncales (CETCT). Más
específicamente, la invención se dirige a un kit de cultivo
extracorpóreo y trasplante de células que incluye, aunque no se
limita a ella, una proteína de unión a las células para las células
troncales o progenitoras hematopoyéticas en una mezcla de células
recogida de un ser humano. La proteína de unión a las células
comprende al menos una proteína de unión al receptor flt3 y un
anticuerpo monoclonal que se une a un marcador celular seleccionado
del grupo formado por CD34, Thy-1 y
My-10. El kit también incluye una matriz o
superficie sólida para aislar las células troncales y progenitoras
hematopoyéticas de la mezcla de células; una composición para
expandir las células hematopoyéticas y progenitoras aisladas que
comprende una cantidad eficaz de ligando flt-3 y un
factor de crecimiento seleccionado del grupo formado por:
GM-CSF, G-CSF, IL-1,
IL-3, IL-6, TPO, EPO, SF y una
proteína de fusión GM-CSF/IL-3.
De manera alternativa, la proteína de unión a las
células y la matriz o superficie sólida son remplazadas por un
factor de crecimiento para estimular la división celular en células
troncales y progenitoras no hematopoyéticas y un antimetabolito para
inducir la muerte celular en células de división. El antimetabolito
se puede seleccionar del grupo formado por
5-fluorouracilo y
4-hidroxiciclofosfamida, y el factor de crecimiento
se selecciona del grupo formado por SF y ligando flt3.
Opcionalmente, los kits según la invención pueden
comprender un contenedor para contener la mezcla de células
recogida, en el que el contenedor está adaptado para recibir las
células recogidas y, opcionalmente, los medios de selección.
El kit según la invención proporciona diversos
factores de expansión celular que son útiles en el CETCT para
estimular la proliferación de células troncales capaces
autorrenovarse, y la proliferación y diferenciación de células
progenitoras comprometidas con el linaje. Esos factores de
crecimiento celular incluyen las interleucinas 1 y 3
(IL-1 e IL-3, respectivamente), el
factor estimulante de las colonias de
granulocitos-macrófagos (GM-CSF),
fusiones moleculares de GM-CSF e
IL-3 (PIXY321), el ligando flt3 y el factor
estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF).
Otros factores de crecimiento hematopoyético incluyen el factor de
células troncales (SF) (también conocido como ligando c-kit,
factor de crecimiento de mastocitos y steel factor),
trombopoyetina (TPO), eritropoyetina (EPO) e IL-6.
Estos factores son útiles para promover la expansión in vitro
de las células troncales y progenitoras aisladas.
Los kits según la invención son útiles para
seleccionar y expandir cualquier población celular que tenga el
fenotipo deseado. Por ejemplo, los kits son útiles en la expansión y
el trasplante de células troncales o progenitoras hematopoyéticas,
en la expansión y el trasplante de linfocitos T o B y en la terapia
genética.
La invención se dirige a la tecnología de
selección y expansión celulares, en particular, al cultivo
extracorpóreo y trasplante de células. Como se describe en esta
solicitud, la invención comprende un kit de CETCT que
comprende:
- 1)
- una proteína de unión a células para seleccionar células troncales o progenitoras hematopoyéticas humanas en la mezcla de células que se recoge de un ser humano,
- 2)
- una matriz o superficie sólida para aislar las células troncales y progenitoras hematopoyéticas de la mezcla de células, y
- 3)
- una composición para expandir las células troncales y progenitoras hematopoyéticas aisladas que comprende una cantidad eficaz de ligando flt-3 y un factor de crecimiento seleccionado del grupo formado por GM-CSF, G-CSF, IL-1, IL-3, IL-6, TPO, EPO, SF y una proteína de fusión GM-CSF/IL-3.
El contenedor opcional está diseñado para recibir
inicialmente las células recogidas y, opcionalmente, el medio de
selección.
La mezcla celular se puede recoger de diferentes
fuentes. Para la selección de células troncales o progenitoras
hematopoyéticas las células se recogen típicamente de fuentes que
incluyen médula ósea, sangre periférica y sangre del cordón
umbilical.
Los términos "células troncales" y
"células progenitoras" se refieren a las células de linajes
tempranos que son pluripotenciales. Los términos se utilizan de
manera indistinta en esta solicitud, como es habitual en la técnica.
El término "células troncales o progenitoras" significa
células troncales, células progenitoras o una mezcla de células
troncales y progenitoras. Como se usa de manera habitual en la
técnica, las células troncales y progenitoras se identifican
típicamente por las siguientes características celulares:
CD34^{+}, CD33^{-}, CD38^{-}, Thy-1^{+} y
My-10^{+}.
El término "L-flt3"se
refiere a un género de polipéptidos que se unen y forman complejos
de manera independiente con el receptor flt3 que se encuentra en
las células progenitoras y troncales. El término
"L-flt3" abarca además las proteínas descritas
en el documento EP-A-627.487, que se
incorpora a esta solicitud como referencia. El término
"L-flt3" abarca proteínas que tienen la
secuencia de aminoácidos de 1 a 235 de la SEC. Nº 6, como se muestra
en el documento EP-A-627.487, así
como aquellas proteínas que tienen un alto grado de similitud o un
alto grado de identidad con las mismas, y que son biológicamente
activas y se unen al receptor flt3. Además, el término se refiere a
productos génicos biológicamente activos del ADN de la SEC. Nº 5,
como se muestra en el documento
EP-A-627.487. Además, el término
"L-flt3" abarca las proteínas unidas a la
membrana (que incluyen una región intracelular, una región de
membrana y una región extracelular) y proteínas solubles o
truncadas que comprende principalmente la porción extracelular de
la proteína, que mantienen actividad biológica y que pueden ser
secretadas. Son ejemplos específicos de esas proteínas solubles los
que comprenden la secuencia de aminoácidos 28-160 de
la SEC. Nº 6, como se muestra en el documento
EP-A-627.487.
El término "IL-1" se refiere
a una o a las dos formas de IL, IL-\alpha e
IL-\beta (March y col., Nature 315:
641, 1985). Tanto IL-\alpha como
IL-\beta se unen a los receptores de
IL-1 (de tipo I y de tipo II).
IL-\alpha es activa tanto en la forma de precursor
como en la forma madura, mientras que IL-\beta
sólo es activa en su forma madura (March y col., Ibid.). El término
"IL-1" también se refiere a fragmentos y
análogos activos con alteración de la secuencia de aminoácidos y a
sus derivados, como proteínas de fusión que tienen un componente de
IL-1 y actividad biológica de IL-1,
véase Mosley y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 84:4572
(1987).
El término "IL-3" se refiere
a un género de polipéptidos de interleucina-3 según
se describe en la patente de EE.UU. Nº 5.108.910, que se incorpora a
esta solicitud como referencia. Esos polipéptidos incluyen análogos
que tienen secuencias de aminoácidos que son sustancialmente
similares a la secuencia de aminoácidos de la
interleucina-3 que se describe, por ejemplo, en las
publicaciones EP Nº 275.598 y 282.185, que se incorporan a esta
solicitud como referencias. El término "IL-3"
también incluye análogos y alelos de las moléculas de
IL-3 que muestran al menos parte de la actividad
biológica en común con la IL-3 humana natural. En
la publicación EP Nº 282.185 se muestran ejemplos de análogos de
IL-3. Otras formas de IL-3 incluyen
IL-3 humana [Pro^{8}Asp^{15}Asp^{70}],
IL-3 humana [Ser^{8}Asp^{15}Asp^{70}] e
IL-3 humana [Ser^{8}]. Una secuencia de ADN que
codifica la proteína IL-3 humana para su uso en la
invención está a disposición del público en la American Type
Culture Collection(ATCC) con el número de acceso ATCC 67.747. La
nomenclatura que se usa en esta solicitud en lo referente a las
secuencias de aminoácidos entre corchetes indica que aminoácidos
difieren de la forma humana natural. Por ejemplo,
IL-3 humana [Ser^{8}Asp^{15}Asp^{70}] se
refiere a una proteína IL-3 humana en la que el
aminoácido 8 se ha sustituido por un residuo de serina, el
aminoácido 15 se ha sustituido por un residuo de ácido aspártico y
el aminoácido 70 se ha sustituido por un residuo de ácido
aspártico.
El término "IL-6"se refiere
a un género de proteínas según se describe en la publicación PCT WO
88/00206, en el documento EP-257.406 y en el
documento EP-A-331.640, cada uno de
los cuales se incorpora a esta solicitud como referencia.
IL-6 es idéntica a las proteínas denominadas
"interferón-beta-2"
(Zilberstein y col., EMBO J. 5:2529 (1986)) y
"proteína de 26 kd inducible en fibroblastos humanos"
(Haegeman y col., Eur. J. Biochem. 159:625 (1986)).
Esas proteínas incluyen análogos que tienen una secuencia de
aminoácidos que es sustancialmente similar a la secuencia de
aminoácidos de la IL-6 humana natural y que son
biológicamente activas en el sentido de que son capaces de unirse a
un receptor de IL-6, de transducir una señal
biológica iniciada por la unión a un receptor de
IL-6 o de dar reacción cruzada con anticuerpos
anti-IL-6. Las secuencias de
nucleótidos y las secuencias deducidas de aminoácidos de
IL-6 se describen, por ejemplo, en el documento WO
88/00206. El término "IL-6" también incluye
análogos de las moléculas de IL-6 humana natural
suficientes para mantener la actividad biológica de la
IL-6 humana natural.
Como se usa en esta solicitud,
"GM-CSF" se refiere a un género de proteínas
según se describe en las patentes de EE.UU. Nº 5.108.910 y
5.229.496, que se incorporan a esta solicitud como referencia. Esas
proteínas incluyen análogos que tienen una secuencia de aminoácidos
que es sustancialmente similar a la secuencia de aminoácidos del
GM-CSF humano natural (por ejemplo, como está a
disposición del público en ATCC 53.157 y ATCC 39.900) y que son
biológicamente activos en el sentido de que son capaces de unirse a
un receptor de GM-CSF, de transducir una señal
biológica iniciada por la unión a un receptor de
GM-CSF o de dar reacción cruzada con anticuerpos
anti-GM-CSF. Las secuencias de
aminoácidos se describen, por ejemplo, en Anderson y col., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 82;6250 (1985). Se puede conseguir
el GM-CSF comercializado (sargramostim) de Immunex
Sorp., Seattle, WA. El término "GM-CSF" también
incluye análogos de las moléculas de GM-CSF humanas
naturales suficientes para conservar la actividad biológica del
GM-CSF humano natural. Los ejemplos de análogos del
GM-CSF incluyen, por ejemplo, los que se describen
en la publicación EP Nº 212.914 y en el documento WO 89/03881, que
se incorporan a esta solicitud como referencia. Otros análogos de
GM-CSF también se pueden usar para construir
proteínas de fusión con IL-3. Está a disposición del
público en la ATCC, con el número de acceso ATCC 67.231, una
secuencia de ADN que codifica una proteína GM-CSF
que se prefiere particularmente y de la que se han eliminado
posibles puntos de glucosilación.
El término "proteína de fusión
GM-CSF/IL-3" significa una fusión
C-terminal a N-terminal de
GM-CSF e IL-3. Se conocen las
proteínas de fusión y se describen en las patentes de EE.UU. Nº
5.199.942, 5.108.910 y 5.073.627, que se incorporan a esta
solicitud como referencias. Una proteína de fusión preferida es
PIXY321, según se describe en la patente de EE.UU. Nº 5.199.942.
El término "sustancialmente similar"
significa que la secuencia de aminoácidos variante preferentemente
es idéntica en al menos el 80% a la secuencia de aminoácidos
natural, más preferentemente idéntica en al menos el 90%. Se puede
determinar la identidad porcentual, por ejemplo, comparando la
información de secuencias utilizando el programa de ordenador GAP,
versión 6.0, que describen Devereux y col. (Nucl. Acids Res.
12:387, 1984) y que está disponible en el University of
Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). El programa GAP
utiliza el procedimiento de alineación de Needleman y Wunsch (J.
Mol. Biol. 48:443, 1970), según la revisión de Smith y Waterman
(Adv. Appl. Math. 2:482, 1981). Los parámetros
predeterminados preferidos para el programa GAP incluyen: (1) una
matriz de comparación unaria (que contiene un valor de 1 para las
identidades y de 0 para la ausencia de identidades) para los
nucleótidos, y la matriz de comparación ponderada de Gribskov y
Burgess, Nucl. Acids Res. 14:6745, 1986, según la
descripción de Schwartz y Dayhoff., eds., Atlas of Proteín
Sequence and Structure, National Biomedical Research
Foundation, pág. 353-358, 1979; (2) una penalización
de 3,0 para cada brecha y otra penalización de 0,10 para cada
símbolo en cada brecha, y (3) ausencia de penalización para las
brechas de los extremos. Las variantes pueden comprender secuencias
sustituidas de manera conservadora, lo que significa que un residuo
dado de aminoácido es sustituido por un residuo que tiene
características fisicoquímicas similares. Ejemplos de sustituciones
conservadoras incluyen la sustitución de un residuo alifático por
otro, como Ile, Val, Leu o Ala entre sí, o sustituciones de un
residuo polar por otro, como entre Lys y Arg, Glu y Asp o Gln y
Asn. Se conocen bien otras sustituciones conservadoras similares,
por ejemplo, sustituciones de regiones enteras que tienen las mismas
características de hidrofobicidad. La invención también abarca las
variantes de los factores de expansión celular que aparecen de
manera natural. Los ejemplos de esas variantes son proteínas que se
deben a episodios de ayuste alternativo del ARNm o por escisión
proteolítica de la proteína natural, en la que se mantiene la
propiedad biológica natural.
El término "purificado o aislado" significa
que el material purificado o aislado esta sustancialmente libre de
asociación con otras células, proteínas o polipéptidos, por
ejemplo, como un producto de purificación de un cultivo de células
huésped recombinantes o como un extracto purificado.
El término "trasplante autólogo" se refiere
a un procedimiento en el que células que tienen el fenotipo deseado
se retiran de un paciente y se vuelven administrar al mismo
paciente.
El término "trasplante alogénico" se refiere
a un procedimiento en el que células que tienen un fenotipo deseado
se retiran de un ser humano y se administran a un ser humano
diferente. El término "trasplante singénico" significa que el
trasplante celular se produce entre seres humanos genéticamente
idénticos.
El término "expansión" y "en
expansión", según se usa en esta solicitud, significa un
enriquecimiento del número de células que tienen el fenotipo deseado
o que se enriquece, aumenta o se proporciona un aumento de éste.
El término "CETCT" se refiere a un
procedimiento que comprende (1) la recolección de células que tienen
un fenotipo deseado a partir de un ser humano, (2) la expansión de
las células ex vivo con una composición que contiene una
cantidad eficaz de un factor de crecimiento y de expansión celular
para dar lugar a una preparación celular que comprende un aumento
del número de las células deseadas, y (3) la administración de la
preparación celular al paciente junto a una terapia citorreductora
o después de la misma.
El término "cantidad eficaz", según se usa
para referirse a los factores de expansión celular, significa la
cantidad de factor de expansión necesaria para conseguir el nivel
deseado de expansión celular. Una persona con conocimientos
normales en la técnica verá fácilmente que una cantidad eficaz de
un factor de expansión celular particular depende de diversas
variables. Esas variables incluyen el nivel de expansión deseado, si
el factor se combina o no con otro factor, y los tipos de células
que se quiere expandir. La determinación de la cantidad eficaz se
encuentra dentro de la pericia en la técnica.
En una forma de realización preferida, el factor
de crecimiento y de expansión celular se selecciona del grupo
formado por una proteína de fusión
GM-CSF/IL-3,
IL-1\alpha y ligando flt3.
En una forma de realización alternativa, el kit
de cultivo extracorpóreo y trasplante de células según la invención
comprende una composición que comprende una cantidad eficaz de un
factor de expansión seleccionado del grupo formado por
G-CSF, IL-3, IL-6,
TPO, EPO y SF.
Además, los kits de la invención son útiles en
terapia génica. La terapia génica supone la administración a un
huésped de células transfectadas con un ADN exógeno a las que se
permite implantarse en el huésped. Véase, por ejemplo, Boggs.
Internacional J. Cell Cloning 8:80-96
(1990); Kohn y cols., Cancer Invest.
7(2):179-192,(1989); Lehn, Bone Marrow
Transp.. 5:287-293 (1990); y Verma,
Scientific American, pp. 68-84 (1990). Como
la transferencia genética del ADN exógeno en las células se produce
cuando las células se están dividiendo, se puede aumentar mucho la
eficiencia de esa transferencia usando los kits según la invención.
Usar una composición que comprende una cantidad eficaz de al menos
un factor de expansión celular seleccionado del grupo formado por
GM-CSF, G-CSF,
IL-1\alpha, IL-3,
IL-6, TPO, EPO, ligando flt3, SF y una proteína de
fusión GM-CSF/IL-3, facilitará que
los casos seleccionados tengan una proliferación y diferenciación
más rápidas. Por lo tanto, se puede potenciar mucho la captación
genética en las células recogidas. Generalmente, los procedimientos
de las terapias génicas son conocidos en la técnica de incluyen las
etapas de (a) cultivar células troncales aisladas en medios de
cultivo que comprenden al menos un factor de expansión celular
seleccionado del grupo que se ha enumerado más arriba, (b)
transfectar las células cultivadas de la etapa (a) con el gen
exógeno, y (c) administrar las células transfectadas al
mamífero.
En los casos en los que es deseable seleccionar,
aislar y expandir células troncales o progenitoras hematopoyéticas,
un kit preferido es aquél en el que el medio para aislar las
células troncales hematopoyéticas comprende al menos a) una
proteína de unión al receptor flt3 y b) un anticuerpo monoclonal que
se une a un marcador celular seleccionado del grupo formado por:
CD34, Thy-1 y My-10.
En relación con los aspectos particulares de los
kits de la invención, los kits comprenden medios para seleccionar
las células que tienen el fenotipo deseado a partir de la mezcla de
células recogidas. Elegir medios de selección adecuados dependerá
del fenotipo deseado de la célula que se quiere aislar. Las células
troncales hematopoyéticas se pueden seleccionar en virtud de sus
características físicas, como la expresión del receptor de
flt-3 unido a la membrana, o porque tengan los
siguientes marcadores celulares: CD34, Thy-1 y
My-10. Los anticuerpos monoclonales que reconocen
cualquiera de estos antígenos han sido descritos en la Patente de
EE.UU. Nº 4.714.680 (anti-My-10),
que se incorpora a esta solicitud como referencia,
anti-CD34 está comercializado por Becton Dickinson,
Franklin Lakes, NJ, y los anticuerpos monoclonales
anti-Thy-1 se pueden generar con
facilidad usando los procedimientos que describieron Dalchau y
cols., J. Exp. Med. 149:576(1979), que se
incorporan a esta solicitud como referencia. También se puede usar
una proteína de unión al receptor flt3, como anticuerpos
monoclonales anti-flt3 o ligando flt3 y que se
describen en el documento
EP-A-627.487, de modo que el ligando
flt3 está disponible en Immunex Corporation, Seattle, WA. La
proteína de unión a las células se pone en contacto con la mezcla
de células recogidas y se permite que la combinación se incube
durante un período de tiempo suficiente para permitir la unión de
la célula deseada a la proteína de unión a las células.
Un medio alternativo de seleccionar las células
troncales quiescentes es inducir la muerte celular en los tipos
celulares en división y más comprometidos de linaje usando un
antimetabolito como 5-fluorouracilo
(5-FU) o un fármaco alquilante como
4-hidroxiciclofosfamida (4-HC). Se
estimula a las células no quiescentes a que proliferen y se
diferencien mediante la adición de factores de crecimiento que
tienen poco o ningún efecto sobre las células troncales, haciendo
que las células no troncales proliferen y se diferencien y
haciéndolas más vulnerables a los efectos citotóxicos de
5-FU o 4-HC. Véase Berardi y cols.,
Science 267:104 (1995), que se incorpora a esta
solicitud como referencia.
Además en los kits de la invención se incluyen
medios para aislar las células seleccionadas que tienen el fenotipo
deseado. El aislamiento de las células se puede realizar usando,
por ejemplo, cromatografía de afinidad, cuentas magnéticas
recubiertas de anticuerpos, o anticuerpos fijados a una matriz
sólida, como cuentas de vidrio, matraces, etc. Los anticuerpos que
reconocen un marcador de superficie de una célula troncal se pueden
fusionar o conjugar con otras porciones químicas como biotina, que
se puede eliminar con una porción de avidina o estreptavidina
fijada a un soporte sólido; fluorocromos útiles en la selección
celular activada por florescencia (FACS), o similares.
Preferentemente el aislamiento se consigue mediante una columna de
inmunoafinidad. Las columnas de inmunoafinidad pueden adoptar
cualquier forma, aunque habitualmente comprenden un reactivo de
lecho empaquetado. El lecho empaquetado de estos biorreactivos está
hecho preferentemente de un material poroso que tiene un
recubrimiento sustancialmente uniforme de un sustrato. El material
poroso, que proporciona un elevado cociente área superficial:
volumen, permite que la mezcla de células fluya sobre una gran área
de contacto, a la vez que no dificulta el flujo de células fuera del
hecho. Los sustratos típicos incluyen avidina y estreptavidina,
mientras que se pueden usar otros sustratos convencionales. Por sus
propias propiedades o por la adición de una porción química, el
sustrato debe mostrar una elevada afinidad por una porción que se
encuentra en la proteína de fijación a las células, como un
anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos monoclonales reconocen un
antígeno de superficie celular de las células que se van a separar,
y típicamente se modifican adicionalmente para que presenten una
porción de biotina. Es bien sabido que la biotina tiene una elevada
afinidad por la avidina, y la afinidad de estas sustancias por lo
tanto fija de manera reversible el anticuerpo monoclonal a la
superficie de lecho empaquetado. Esas columnas son bien conocidas
en la técnica, véase Berenson y cols., J. Cell Biochem.
10D:239 (1986). La columna se lava con una solución de SSTF
para eliminar el material no unido. Las células diana se pueden
liberar de las cuentas utilizando procedimientos convencionales.
Las columnas de inmunoafinidad del tipo que se describe más arriba
y que utilizan anticuerpos monoclonales anti-CD34
biotinados fijados a un lecho empaquetado recubierto de avidina se
describen, por ejemplo, en la publicación PCT Nº WO 93/08268. Una
variación de este procedimiento utiliza proteínas de unión a
células, como anticuerpos monoclonales o ligando flt3, como se
describe más arriba, unidas de manera reversible a una superficie
fija del medio de aislamiento. Posteriormente, se pone en contacto
la proteína de unión a las células unida con la mezcla de células
recogidas y se permite que se incuben durante un período de tiempo
suficiente como para permitir el aislamiento de las células
deseadas.
De manera alternativa, los anticuerpos
monoclonales que reconocen los antígenos de superficie celular
pueden estar etiquetados con una etiqueta, por ejemplo, un cromóforo
o un fluoróforo, y se pueden separar mediante selección celular
según la presencia o ausencia o la cantidad del producto
etiquetado.
Otra forma de realización alternativa del medio
de aislamiento se basa en procedimientos y dispositivos de
separación magnética convencional. Un ejemplo de un procedimiento
para recubrir una matriz de gradiente de intensificación magnética
para su uso en un aparato de separación se describe en la patente de
EE.UU. Nº 5.385.707, que se incorpora a esta solicitud como
referencia.
Además, en los kits de la invención se incluyen
los medios de incubación. Esos medios están adaptados para recibir
y contener las células troncales aisladas, una composición que
comprende una cantidad eficaz de un factor de crecimiento y
expansión celular, y un medio de crecimiento celular. El medio de
incubación puede ser cualquier dispositivo o aparato que contiene
las células troncales aisladas en contacto con el factor de
expansión y con el medio de crecimiento durante el proceso de
expansión celular. Los medios de incubación adecuados incluyen, por
ejemplo, bolsas, fibras huecas, recipientes de vidrio, placas con
múltiples pocillos o placas de Petri. Muchos de esos medios de
incubación se pueden obtener fácilmente de diferentes fuentes
comerciales. Los medios de incubación particularmente preferidos
son bolsas estériles y fibras huecas.
Los factores de crecimiento y expansión celular
también se proporcionan en los kits según la invención. Esos
factores de expansión incluyen GM-CSF,
G-CSF, IL-1, IL-3,
IL-6, TPO, EPO, ligando flt3, SF y una proteína de
fusión GM-CSF/IL-3. Los factores de
expansión preferidos son GM-CSF, ligando flt3,
IL-1\alpha y una proteína de fusión
GM-CSF/IL-3. Los factores de
expansión se proporcionan en los kits en forma de una composición
que contiene los factores. Los ejemplos de esas composiciones son
aquéllos que comprenden un factor de expansión producido de manera
recombinante o purificado de otra manera y que está en una
formulación estabilizadora convencional. Otras composiciones que se
pueden incluir en el kit comprenden medios acondicionados obtenidos
de células de mamíferos que contienen una cantidad suficiente de un
factor de expansión como para expandir las células deseadas.
Los kits según la invención también comprenden un
medio de crecimiento celular. Se puede usar pueden usar diversos
medios de cultivo, y una persona que tenga conocimientos normales
de la técnica puede determinar fácilmente la composición de esos
medios. Los medios de crecimiento adecuados son soluciones que
contienen nutrientes o aditivos metabólicos, e incluyen aquéllos que
están desprovistos de suero o que se basan en suero. Son ejemplos
representativos de medios de cultivo RPMI, TC 199, medio de
Dulbecco modificado por Iscove (Iscove y cols., F. J. Exp.
Med. 147:923 (1978)), DMEM, medio de Fischer, medio
alfa, NCTC, F-10, medio L-15 de
Leibovitz, MEM y medio de McCoy. Los ejemplos particulares de
nutrientes que serán fácilmente evidentes para los técnicos
expertos en la técnica incluyen albúmina sérica, transferrina,
lípidos, colesterol, un agente reductor como
2-mercaptoetanol o monotioglicerol, piruvato,
butirato, y un glucocorticoide como 2-hemisuccinato
de hidrocortisona. Más particularmente, los medios estándar
incluyen una fuente de energía, vitaminas u otros compuestos
orgánicos que dan soporte a las células, un tampón como HEPES, Tris
que actúa como estabilizador del pH del medio, y varias sales
inorgánicas. Se hace particular referencia a la publicación PCT Nº
WO 95/00632, en la que se describe una variedad de medios de
cultivo celular sin suero; esa descripción se incorpora a esta
solicitud como referencia.
Como se ha afirmado más arriba, el contenedor
opcional para contener las células recogidas de un ser humano puede
ser cualquier aparato o dispositivo estéril adecuado para recibir o
contener inicialmente la mezcla de células. Preferentemente el
medio contenedor es una bolsa estéril que tiene una apertura para
recibir la mezcla de células recogidas.
Los kits de la invención se pueden usar, por
ejemplo, como se señala a continuación en el trasplante de células
troncales periféricas (CTP) o de células progenitoras de sangre
periférica (CPSP). Típicamente, el trasplante de CPSP y de CTP se
realiza en pacientes cuya médula ósea no es adecuada para la
recogida debido, por ejemplo, a alteraciones de la médula o a
afectación maligna de la misma. Las CPSP y las CTP se recogen
utilizando procedimientos de aféresis conocidos en la técnica.
Véase, por ejemplo, Bishop y cols., Blood, vol. 83, Nº 2,
pág. 610-616 (1994). Brevemente, las CPSP y las CTP
se recogen usando dispositivos convencionales, por ejemplo, un
dispositivo de aféresis Haemonetics Model V50 (Haemonetics,
Braintree, MA). Se realizan recogidas de cuatro horas típicamente
no más de cinco veces a la semana hasta que se han recogido
aproximadamente 6,5 x 10^{8} células mononucleares (CMN)/kg de
paciente. Las células se suspenden en medios estándar y
posteriormente se centrifugan para eliminar los eritrocitos y los
neutrófilos. Las células que están localizadas en la interfase
entre las dos fases (también conocida en la técnica como la capa
leucocítica) se retiran y se vuelven a suspender en HBSS. Las
células suspendidas son predominantemente mononucleares, y una
porción sustancial de la mezcla de células son células troncales
precoces. Entonces se pone en contacto la suspensión de células
troncales resultante con anticuerpos monoclonales
anti-CD34 biotinados. El período de contacto se
mantiene durante un tiempo suficiente como para permitir una
interacción sustancial entre los anticuerpos monoclonales
anti-CD34 y los antígenos CD-34 de
la superficie de las células troncales. Típicamente son suficientes
tiempos de al menos una hora. Entonces se pone en contacto la
suspensión celular con el medio de aislamiento que se proporciona en
el kit. El medio de aislamiento puede comprender una columna
empaquetada con cuentas recubiertas de avidina. Esas columnas son
muy conocidos en la técnica, véase Berenson y cols., J. Cell
Biochem. 10D:239 (1986). La columna se lava con una
solución de SSTF para eliminar el material no unido. Las células
troncales diana se pueden liberar de las cuentas y de los
anticuerpos monoclonales anti-CD34 usando
procedimientos convencionales. Las células troncales que se obtienen
de esta manera se pueden congelar en un congelador de velocidad
controlada (por ejemplo, Cryo-Med, Mt. Clemens,
MI), y posteriormente se almacenan en la fase de vapor de nitrógeno
líquido. Se puede usar dimetilsulfóxido al 10% como crioprotector.
Después de haber hecho todas las recogidas del donante, las células
troncales se descongelan y se mezclan en el medio de incubación.
Las alícuotas que contienen células troncales, el medio de cultivo
que se proporciona con el kit, como medio de cultivo de McCoy 5A,
agar al 0,3% y al menos uno de los factores de expansión que se
proporcionan en el kit (GM-CSF recombinante humano,
ligando flt3 recombinante humano y moléculas de fusión
GM-CSF/IL-3 recombinantes humanas
[PIXY321]) a concentraciones de aproximadamente 200 U/ml, se
cultivan y se expanden en el medio de incubación que se proporciona
con el kit a 37ºC en CO_{2} al 5% en aire saturado de humedad
durante 14 días. Ocasionalmente, se puede añadir los cultivos
IL-1\alpha humana. La combinación más preferida de
factores de expansión comprende flt-3 más
IL-3 o una proteína de fusión
GM-CSF/IL-3. Posteriormente las
células troncales expandidas se pueden reinfundir por vía
intravenosa al paciente.
Claims (23)
1. Un kit de cultivo extracorpóreo y trasplante
de células que comprende:
- (a)
- una proteína de unión a las células para seleccionar células troncales y progenitoras hematopoyéticas humanas en una mezcla de células recogida de un ser humano, en la que la proteína de unión a las células comprende al menos a) una proteína de unión al receptor flt3 o b) un anticuerpo monoclonal que se une a un marcador celular seleccionado del grupo formado por CD34, Thy-1 y My-10.
- (b)
- una matriz o superficie sólida para aislar las células troncales y progenitoras hematopoyéticas de la mezcla de células, y
- (c)
- una composición para expandir las células troncales y progenitoras hematopoyéticas aisladas que comprende una cantidad eficaz de ligando flt3 y un factor de crecimiento, en la que el factor de crecimiento se selecciona del grupo formado por: GM-CSF, G-CSF, IL-1, IL-3, IL-6, TPO, EPO, SF y una proteína de fusión GM-CSF/IL-3.
2. Un kit según la reivindicación 1, en el que la
proteína de unión a las células y la matriz o superficie sólida son
remplazadas por un factor de crecimiento para estimular la división
celular en células troncales y progenitoras no hematopoyéticas y
un antimetabolito para inducir la muerte celular de células de
división, en el que el antimetabolito se selecciona del grupo
formado por 5-fluorouracilo y
4-hidroxiciclofosfamida y el factor de crecimiento
se selecciona del grupo formado por SF y ligando flt3.
3. Un kit según las reivindicaciones 1 ó 2, que
además comprende un contenedor para contener la mezcla de células
recogidas.
4. Un kit según cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, que además comprende un
aparato para contener, como mínimo, las células troncales y
progenitoras hematopoyéticas aisladas y la composición para
expandir las células durante la incubación.
5. Un kit según cualquiera de las
reivindicaciones 1-4, en el que el aparato se
selecciona del grupo constituido por bolsas estériles, fibras
huecas, recipientes de vidrio, placas con múltiples pocillos y
placas de Petri.
6. Un kit según cualquiera de las
reivindicaciones 1-5, que además comprende un medio
de crecimiento celular.
7. Un kit según cualquiera de las
reivindicaciones 1-6, en el que el anticuerpo
monoclonal se etiqueta con una etiqueta fluorescente.
8. Un kit según cualquiera de las
reivindicaciones 1-7, en el que la mezcla de
células se recoge de una fuente humana, en el que la fuente humana
se selecciona del grupo constituido por médula ósea, sangre
periférica y sangre del cordón umbilical.
9. Un kit según cualquiera de las
reivindicaciones 1-8, en el que la proteína de
unión al receptor flt3 y/o el anticuerpo monoclonal están fusionados
o conjugados con biotina.
10. Un kit según cualquiera de las
reivindicaciones 1 y 3-9, en el que la matriz o
superficie sólida comprende además un sustrato seleccionado del
grupo formado por avidina y/o estreptavidina.
11. Un kit según cualquiera de las
reivindicaciones 1 y 3-10, en el que la proteína de
unión a las células para seleccionar las células troncales y
progenitoras hematopoyéticas está fijada a la matriz o superficie
sólida.
12. Un kit según cualquiera de las
reivindicaciones 1 y 3-11, en el que la matriz o
superficie sólida comprende una columna de cromatografía de afinidad
o cuentas magnéticas recubiertas de anticuerpos.
13. Un kit según cualquiera de las
reivindicaciones 1 y 3-12, en el que la proteína de
unión al receptor flt3 se selecciona del grupo constituido por el
ligando flt3 o un anticuerpo monoclonal que se dirige frente al
receptor flt3.
14. Un kit según cualquiera de las
reivindicaciones 1 y 3-13, en el que el factor de
crecimiento es una proteína de fusión
GM-CSF/IL-3.
15. Un kit según cualquiera de las
reivindicaciones 1 y 3-13, en el que el factor de
crecimiento es IL-1.
16. Un kit según cualquiera de las
reivindicaciones 1 y 3-13, en el que el factor de
crecimiento es GM-CSF.
17. Un kit según cualquiera de las
reivindicaciones 1 y 3-13, en el que el factor de
crecimiento es IL-3.
18. Un kit según cualquiera de las
reivindicaciones 1 y 3-13, en el que el factor de
crecimiento es G-CSF.
19. Un kit según cualquiera de las
reivindicaciones 1 y 3-13, en el que el factor de
crecimiento es IL-6.
20. Un kit según cualquiera de las
reivindicaciones 1 y 3-13, en el que el factor de
crecimiento es TPO.
21. Un kit según cualquiera de las
reivindicaciones 1 y 3-13, en el que el factor de
crecimiento es EPO.
22. Un kit según cualquiera de las
reivindicaciones 1 y 3-13, en el que el factor de
crecimiento es SF.
23. Un kit según cualquiera de las
reivindicaciones 1-22 para su uso en el trasplante
de células troncales periféricas o de células progenitoras de sangre
periférica.
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US20950294A | 1994-03-07 | 1994-03-07 | |
| US209502 | 1994-03-07 | ||
| US243545 | 1994-05-11 | ||
| US08/243,545 US5554512A (en) | 1993-05-24 | 1994-05-11 | Ligands for flt3 receptors |
| US39940495A | 1995-03-06 | 1995-03-06 | |
| US399404 | 1995-03-06 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2225839T3 true ES2225839T3 (es) | 2005-03-16 |
Family
ID=27395380
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES95913602T Expired - Lifetime ES2225839T3 (es) | 1994-03-07 | 1995-03-07 | Kits de cultuvo extracorporeo y trasplante de celulas. |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0749472B1 (es) |
| JP (1) | JP2002503942A (es) |
| CN (1) | CN1122716C (es) |
| AT (1) | ATE273383T1 (es) |
| AU (1) | AU702179B2 (es) |
| CA (1) | CA2184498A1 (es) |
| DE (1) | DE69533354T2 (es) |
| DK (1) | DK0749472T3 (es) |
| ES (1) | ES2225839T3 (es) |
| FI (1) | FI963373A (es) |
| NO (1) | NO963630L (es) |
| NZ (1) | NZ282999A (es) |
| PT (1) | PT749472E (es) |
| WO (1) | WO1995024469A1 (es) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6660257B1 (en) * | 1996-10-25 | 2003-12-09 | Pharmacia Corporation | Circular permuteins of flt3 ligand |
| US6749850B1 (en) | 1999-08-18 | 2004-06-15 | The General Hospital Corporation | Methods, compositions and kits for promoting recovery from damage to the central nervous system |
| CN1753686A (zh) * | 1999-08-18 | 2006-03-29 | 综合医院公司 | 用于促进从中枢神经系统损伤中恢复的方法、组合物和试剂盒 |
| JP2002315567A (ja) * | 2001-04-18 | 2002-10-29 | Yasuhiko Tabata | 細胞接着活性物質を含有してなる幹細胞培養用基材 |
| KR101099315B1 (ko) * | 2003-07-09 | 2011-12-26 | 워쏘우 오르쏘페딕 인코포레이티드 | 결합조직 성장 성분이 풍부한 골수 분절의 분리 및 결합조직의 형성을 촉진하기 위한 그 용도 |
| CN1993460A (zh) * | 2004-07-12 | 2007-07-04 | 索林集团意大利有限公司 | 用于培养人细胞的装置和方法 |
| CN101558409A (zh) * | 2005-06-02 | 2009-10-14 | 夸拉塔贸易有限公司 | 自动化细胞治疗系统 |
| CN100336907C (zh) * | 2005-09-29 | 2007-09-12 | 南京大学 | 重组人血小板生成素/干细胞因子融合蛋白及其制备 |
| KR20080037883A (ko) * | 2006-10-27 | 2008-05-02 | 세원셀론텍(주) | 메디컬 키트 및 이의 사용방법 |
| WO2010017224A2 (en) * | 2008-08-05 | 2010-02-11 | University Of South Florida | Methods of treating cognitive impairment |
| CN104745668A (zh) * | 2014-01-15 | 2015-07-01 | 上海吉泉生物技术有限公司 | 一种新型造血干细胞检测试剂制备方法和应用 |
| CN105112374B (zh) * | 2015-09-13 | 2018-07-10 | 广东美赛尔细胞生物科技有限公司 | 一种脐带血造血干细胞的体外扩增培养基及其应用 |
| JP6380868B1 (ja) * | 2017-06-05 | 2018-08-29 | オーソセル・リミテッド | 医療処置キットおよび関連の方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5199942A (en) * | 1991-06-07 | 1993-04-06 | Immunex Corporation | Method for improving autologous transplantation |
-
1995
- 1995-03-07 WO PCT/US1995/002886 patent/WO1995024469A1/en active IP Right Grant
- 1995-03-07 PT PT95913602T patent/PT749472E/pt unknown
- 1995-03-07 CN CN95191876A patent/CN1122716C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1995-03-07 EP EP95913602A patent/EP0749472B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-07 DE DE69533354T patent/DE69533354T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1995-03-07 ES ES95913602T patent/ES2225839T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-07 AT AT95913602T patent/ATE273383T1/de not_active IP Right Cessation
- 1995-03-07 DK DK95913602T patent/DK0749472T3/da active
- 1995-03-07 JP JP52361795A patent/JP2002503942A/ja not_active Withdrawn
- 1995-03-07 CA CA002184498A patent/CA2184498A1/en not_active Abandoned
- 1995-03-07 NZ NZ282999A patent/NZ282999A/en not_active IP Right Cessation
- 1995-03-07 AU AU20982/95A patent/AU702179B2/en not_active Ceased
-
1996
- 1996-08-29 FI FI963373A patent/FI963373A/fi unknown
- 1996-08-30 NO NO963630A patent/NO963630L/no unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1142247A (zh) | 1997-02-05 |
| EP0749472B1 (en) | 2004-08-11 |
| AU702179B2 (en) | 1999-02-18 |
| CA2184498A1 (en) | 1995-09-14 |
| EP0749472A1 (en) | 1996-12-27 |
| ATE273383T1 (de) | 2004-08-15 |
| PT749472E (pt) | 2004-11-30 |
| DK0749472T3 (da) | 2004-11-29 |
| CN1122716C (zh) | 2003-10-01 |
| AU2098295A (en) | 1995-09-25 |
| WO1995024469A1 (en) | 1995-09-14 |
| NZ282999A (en) | 1997-12-19 |
| DE69533354T2 (de) | 2005-08-11 |
| FI963373A0 (fi) | 1996-08-29 |
| FI963373A (fi) | 1996-08-29 |
| NO963630L (no) | 1996-11-07 |
| DE69533354D1 (de) | 2004-09-16 |
| JP2002503942A (ja) | 2002-02-05 |
| EP0749472A4 (en) | 1997-04-23 |
| NO963630D0 (no) | 1996-08-30 |
| MX9603788A (es) | 1997-12-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR100676792B1 (ko) | 수지상 세포 자극 인자 | |
| Nielsen | Bioreactors for hematopoietic cell culture | |
| ES2225839T3 (es) | Kits de cultuvo extracorporeo y trasplante de celulas. | |
| CN101400785B (zh) | T细胞群的制备方法 | |
| US20060292166A1 (en) | Vaccine composition comprising Flt3-ligand | |
| ES2356814T3 (es) | Proceso para producir linfocitos citotóxicos. | |
| JP2008119004A (ja) | 樹状細胞を活性化する方法 | |
| JPH11514879A (ja) | 原始ヒト幹細胞を有するＭｐ１リガンドの使用法 | |
| US20090075886A1 (en) | Dendritic cell stimulatory factor | |
| ES2409128T3 (es) | Procedimientos de mejora de anidamiento e injerto de células madre | |
| US20030124091A1 (en) | Endothelial cell derived hematopoietic growth factor | |
| CA2181547A1 (en) | Hematopoietic cell expansion and transplantation methods | |
| US7150992B1 (en) | Methods of preparing dendritic cells with flt3-ligand and antigen | |
| MXPA96003788A (es) | Equipos de cultivo y transplante celularextracorporal conteniendo ligando flt3 | |
| Holyoake | Investigation of the Effects of In Vitro Cytokine Exposure on Short and Long Term Reconstituting Haemopoietic Stem and Progenitor Cells in a Murine Model | |
| JP2003289856A (ja) | 造血細胞培養用培地 | |
| MXPA98002464A (es) | Factor estimulante de celula dendritica |