JP2003507349A

JP2003507349A - 中枢神経系への損傷からの回復を促進する方法、組成物およびキット

Info

Publication number: JP2003507349A
Application number: JP2001516579A
Authority: JP
Inventors: フィンクルスタイン，セス・ピー; スナイダー，エヴァン・ワイ
Original assignee: Childrens Medical Center Corp
Current assignee: Childrens Medical Center Corp
Priority date: 1999-08-18
Filing date: 2000-08-18
Publication date: 2003-02-25
Also published as: CA2380953A1; BR0013388A; AU6790300A; WO2001012236A9; NO20020779D0; EP1210106A2; WO2001012236A2; WO2001012236A3; MXPA02001719A; IL148175A0; NO20020779L; CN1753686A

Abstract

(57)【要約】本明細書はＣＮＳ傷害から患者が回復を改善する際の方法、キットおよび組成物に関する。ある側面では、本発明の方法は細胞および神経刺激剤を被験者に投与することを含む。回復は、例えば四肢の動きおよび制御または改善した言語能力などの感覚・運動能力または認識能力で明らかに分かる。ある態様では、対象の方法は虚血、低酸素症または外傷から生じた損傷に対する治療の一部として使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本出願はその全体を参照により本明細書中に援用される１９９９年８月１８提出の米国仮出願番号６０／１４９，５６１について優先権を主張する。

【０００２】１．背景中枢神経系（ＣＮＳ）は、ＣＮＳの細胞は修復の際の能力が限られているので
特に細胞死や部分的損傷に陥る外傷を受けやすい。その結果、ＣＮＳの異常はし
ばしば衰弱および患者の認識や感覚・運動機能の大きな非可逆的退化を生じる。
神経細胞死および損傷を生じる条件は、アルツハイマー病のような成人病から卒
中、外傷などの虚血エピソードまで及ぶ。

【０００３】中枢神経系（ＣＮＳ）への傷害は世界的に死亡および身体障害の重要な原因で
ある。例えば、卒中は米国の中で死亡および身体障害の第三番目に主要な原因で
、毎年の概算発生が７００，０００件である（Ｆｕｒｉｅ他．（１９９８）“
ＣｅｒｅｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒＤｉｓｅａｓｅ”ｉｎＴｈｅＡｔｌａｓ
ｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＮｅｕｒｏｌｏｇｙ，Ｒ．Ｎ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ
，Ｅｄ．ＣｕｒｒｅｎｔＭｅｄｉｃｉｎｅ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）。卒
中患者の３分の２は卒中後の１年目は生き残り、平均で７年間生存し、４．８百
万より多くの卒中生存者が米国に存在することになる。卒中により米国経済は医
療費および損失賃金に関して３００億ドルを上回る費用を費やしている。

【０００４】数時間過ぎると、ＣＮＳの異常から起きたＣＮＳへの直接的損傷を防ぐことは
殆どできない。例えば、卒中処置は発生の６時間以内に実施しなければならない
。脳の傷害発生個所により、他の症状の中では、患者の片側で麻痺が起こること
もあり、話すまたは見る能力を失い歩行困難となることもある。

【０００５】損傷した脳組織は再生しないので、回復は損傷で失われた機能の幾つかを補う
には、残っている元のままの脳が、そのものを再構成または新たに配線すること
により起さなければならない。確かに、動物やヒトでの研究では卒中の後にその
ような脳機能の再構成が生じている充分な証拠がある。詳しくは、損傷した半球
および反対のそのままである半球の両方にある残存ニューロンが新経路（軸索突
起および樹枝状突起の両方）を伸ばし、新しい結合（シナプス）を形成して回復
に寄与しているようである（Ｋａｗａｍａｔａ他．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：８１７９〜８１８４；Ｊｏｎｅｓ他
．（１９９４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１４：２１４０〜２１５２；Ｓｔｒｏ
ｅｍａｅｒ他．（１９９８）Ｓｔｒｏｋｅ，２９：２３８１〜２３９５；Ｃｒａ
ｍｅｒ他．（１９９７）Ｓｔｒｏｋｅ，２８：２５１８〜２５２７）。

【０００６】例として、卒中の処置はこれまで最初の数時間内で損傷の範囲を食い止めるこ
とに集中していた。卒中は一般的に脳へ続く動脈を封鎖することによりその動脈
が供給している脳細胞の死が生じる。卒中について現在の処置は動脈封鎖を防ぐ
処置（血圧、脂肪、心臓病などの調整）および一旦封鎖が起こったときは脳の損
傷を防ぐ治療に集中している。これら後者の治療には、動脈凝血塊をばらばらに
する“血栓溶解剤（ｔＰＡのような“凝血塊破壊剤”）および卒中において危険
に曝されている脳組織を保護するように作られた“神経保護剤”が含まれる。そ
のような血栓溶解および神経保護剤は効果的であるには卒中の発生後の数時間内
に投与しなければならない。

【０００７】現行では細胞死と傷害が起こった後の患者の回復促進において利用できる方法
は数少ない。損傷の初期後での卒中処置の方法は最初の数時間に用いる方法と機
構的に異なる。回復を促進する処置は典型的には神経の成長と再結合を助成する
ことに集中する。

【０００８】神経栄養性成長因子を直接に脳に与えると、卒中の動物モデルでは自発的機能
回復を増強できる（Ｋａｗａｍａｔａ他．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：８１７９〜８１８４；Ｋａｗａｍａｔａ他．（
１９９６）Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．ＢｌｏｏｄＦｌｏｗＭｅｔａｂ．，１６：５４
２〜５４７；Ｋａｗａｍａｔａ他．（１９９９）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１５８
：８９〜９６；Ａｌｐｓ他，米国特許番号５，７３３，８７１号，Ｆｉｓｈｅｒ
他．（１９９５）Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．ＢｌｏｏｄＦｌｏｗＭｅｔａｂ．，１５
：９５３〜９５９；Ｊｉａｎｇ他．（１９９６）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．，
１３９：１７３〜１７９）。例えば、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）は
生存およびニューロンからの軸索突起の伸長を支援するタンパク質である。ｂＦ
ＧＦを卒中後の１日以降に投与を開始すると、動物はより迅速に回復し、害した
手足（卒中の反対側）の感覚・運動機能試験で大幅に回復する。この回復は元の
脳損傷の大きさが減少したからではない。その代わり、この回復の増進は新ニュ
ーロン成長の増進および元のままに残った脳組織においてシナプスの形成による
ものであるとデータは示唆する。回復の他の機構には、脳内の内因的な神経幹細
胞の刺激でニューロンに分化してある程度まで卒中で失われたニューロンに置き
換わることを含むこともある。

【０００９】卒中回復用の処置へのもう一つの可能性ある方法は、神経幹細胞の利用が含ま
れる。これらは成長期および成熟した哺乳類の脳に既に存在している多分化能細
胞で、適切な刺激を加えると脳ニューロンおよび／またグリア細胞に分化できる
。幾人かの研究者はそのような幹細胞系統をげっ歯類およびヒトの脳の両方から
分離し、クローン化に成功している（Ｓｎｙｄｅｒ他．（１９９７）Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：１１６６３〜１１６６８；Ｇａｇ
ｅ他，（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：１
１８７９〜１１８８３；Ｋｕｈｎ他，（１９９７）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１
７：５８２０〜５８２９；Ｍｃｋａｙ他，米国特許番号５，２７０，１９１号；
Ｊｏｈｅ，Ｋ．，米国特許番号５，７５３，５０６号、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，Ｍ
．，米国特許番号５，９６８，８２９号；Ｗｅｉｓｓ他，米国特許番号５，７５
０，３７６号）。そのような幹細胞を成長期の脳または成熟した脳に再導入する
と、それらは分裂し、移動し、成長過程を経て、そして普通ニューロンが作り出
す神経伝達物質および成長因子の発現を含む神経表現型を呈することができる。
そこで、神経幹細胞を用いると少なくとも二つの点で卒中回復に際して有利とな
る：（１）幹細胞により部分的には死んだ領域を再形成し、卒中で失われた神経
結合を再確立し、（２）脳が必要とする重要な神経伝達物質および成長因子を分
泌することで卒中後に配線し直す。神経幹細胞を用いた動物における脳傷害から
の回復を促進する成果について記載がある（Ｐａｒｋ他．（１９９９）Ｊ．Ｎｅ
ｕｒｏｔｒａｕｍａ１６：６７５〜６８７；Ｐａｒｋ他．（１９９５）Ｓｏｃ
．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ａｂｓ．２１：２０２７；Ｓｔｒｏｅｍｅｒ他．（１９９
９）Ｓｏｃ，ＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅＡｂｓ．２５：１３１０）。奇形癌由
来細胞の系統を用いた結果も同様に動物（Ｂｏｒｌｏｎｇａｎ他．（１９９３）
Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｖｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ１１：５５５〜５６８）お
よびヒトにつき記載されている（Ｋｏｋａｉａ他．（１９９８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎ
ｅｕｒｏｓｃｉ．，１０：２０２６〜３６）。

【００１０】ＣＮＳ損傷からの回復の促進に利用できる現行の方法は、神経系機能の部分的
回復を行なうにすぎない。衰弱神経系欠損を患っている患者では、機能における
増大する回復は生活の質につき顕著な効果をもたらす。多数の罹病患者および現
行方法の限界を考えれば、神経系への損傷からの回復を促進する改良方法に対し
て緊急な要求がある。本明細書に示された処置の方式は、他の既知処置法で現在
利用できるものよりＣＮＳ損傷からのより高程度の回復を促進するものである。
２．本発明の要約本出願の一つの側面は，ＣＮＳの傷害または損傷から患者を回復させる方法に
関する。一つの態様では、本発明は被験者の細胞に、好ましくは幹細胞および神
経刺激を患者の感覚・運動または認識能力、例えば改良された手足の動き、話す
能力の調整または回復するのに充分な量投与することを含む。

【００１１】他の側面では、本発明はＣＮＳの損傷を処置するキットを提供する。ある態様
では、本発明のキットは幹細胞および神経刺激剤を含む。他の態様では、本発明
のキットは神経刺激剤および被験者からの幹細胞含有試料を得るための装置を含
む。好ましい態様では、当該キットは、ポリペプチド成長因子、より好ましくは
配列番号１〜３のポリペプチドの一つに少なくとも３０％だが、もっとも好まし
くは少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９
８％、９９％または１００％同一であるポリペプチドを含む。

【００１２】更なる側面では、本発明は幹細胞、神経刺激剤および一つ以上の製薬学上許容
できる試薬を含む医薬品製剤を提供する。好ましい態様では、本発明で使用する幹細胞は脳細胞、例えばニューロン、オ
リゴデンドログリアまたはアストログリアを生じることができる細胞である。特
に好ましい態様では、幹細胞は神経幹細胞、造血幹細胞、奇形癌由来細胞または
胚幹細胞である。他の好ましい態様では、幹細胞は被験者から得たもので、場合
により投与に先立ちｉｎｖｉｔｒｏで培養または濃縮する。

【００１３】他の態様では、本発明の幹細胞はｖｍｙｃ、ＳＶ４０Ｔ抗体、ポリオーマウ
イルスラージＴ抗体、ｎｅｕ癌遺伝子またはｒａｓ癌遺伝子のような一つ以上の
増殖促進因子をコードした遺伝子でトランスフェクションし、ｉｎｖｉｔｒｏ
で増殖するように誘発させてよい。好ましい態様では、当該遺伝子はｉｎｖｉ
ｔｒｏで強く発現させられて増殖を促進し、そして当該細胞が中枢神経系に侵入
した後は、細胞がｉｎｖｉｖｏで急速に増殖しないように弱く発現させる。

【００１４】更なる態様では、神経刺激剤はポリペプチド成長因子である。好ましいポリペ
プチド成長因子は、以下のポリペプチドファミリー：線維芽細胞成長因子ファミ
リーメンバー、ニュートロフィンファミリーメンバー、インスリン様成長因子フ
ァミリー、毛様体神経栄養性成長因子ファミリーメンバー；ＥＧＦファミリーメ
ンバー、ＴＧＦβファミリーメンバー、白血病阻止因子（ＬＩＦ）；オンコスタ
チンＭ，インターロイキン‐１１、インターロイキン‐６；血小板由来成長因子
ファミリーのメンバー、およびＶＥＧＦファミリーメンバーなどの中から選んだ
ポリペプチドを含む。ある態様では、因子の組合せを用いてよいことが意図され
る。好ましいポリペプチドは、配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配
列に少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９
５％、９８％、９９％または１００％同一の配列を有するポリペプチドを含む。

【００１５】更なる他の態様では、当該神経刺激剤は神経伝達物質活性の調節物質である（
例えば、アゴニストまたはアンタゴニスト）。好ましい態様では、当該神経刺激
剤はＰｒｏｓａｃのような抗うつ薬、Ｒｉｔａｌｉｎのようなアンフェタミン、
Ｅｌａｖｉｌのような三環式抗うつ薬またはそれらの組合せである。他の態様で
は、当該神経刺激剤はレチノイン酸のような神経分化の促進剤である。更に他の
態様では、当該神経刺激剤はネトリン、セマフォリン、ニューロピリンまたはエ
フリンのようないわゆるガイダンス分子である。更なる追加の態様では、神経刺
激は経頭蓋磁気刺激でよい。

【００１６】他の側面では、本発明は細胞と神経刺激剤ではない生物活性化合物との共同投
与を含む。好ましい生物活性化合物には、イムノフィリンのような免疫抑制剤（
例えば、シクロスポリン、ＦＫ５０６およびタリドマイド）およびテトラサイク
リンのような抗生物質が含まれる。

【００１７】本発明の当該細胞および神経刺激剤を投与する手法の範囲を十分検討する。細
胞および神経刺激剤は同じ方法あるいは同時に投与する必要はないが、それらの
効果が重複するように投与するのが好ましい。好ましい態様では、投与は傷害が
発生してから少なくとも６、１０、１２または２４時間目に実施する。４．本発明の詳細な記述４．１定義本明細書で使用する用語“脳細胞”は、ニューロン、アストログリア、オリゴ
デンドログリアおよびミクログリアを含有する細胞を称する。多くの特定細胞型
は各部門に属する。例えばニューロンは、少しだけ名を挙げるとドーパミン作動
性、コリン作動性およびグルタミン酸作動性ニューロンを含む。

【００１８】 “生物活性化合物”は、本発明の関連において用いるときに望ましい効果を有
する化合物を含むことを意図する。生物活性化合物は、数多くの神経刺激剤（下
を参照）と共に神経刺激剤とは考えられないが同様に望ましい効果を有する多く
の化合物を含む。例えば、イムノフィリン（例えば、ＦＫ５０６）のような免疫
抑制剤は移植された細胞の拒絶を防ぐ作用と神経保護活性の両作用を示すことが
可能である（Ｂｒａｖｅｔｔａ他．（１９９９）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１５８
：３８２〜３９３）。抗生物質、特にテトラサイクリンは感染を抑制できて神経
細胞に有益な効果も有する（Ｙｒｊａｎｈｅｉｋｋｉ他．（１９９８）ＰＮＡＳ
９５：１５７６９〜７４）。

【００１９】 “細胞培養”は活発に成長、分化または静止いずれの細胞の組成物も総称的に
称する。細胞培養は種々の形態で行なえる。例えば、“懸濁培養”は細胞が適し
た培地の中で懸濁されている培養を称する。“連続的フロー培養”は細胞成長ま
たは生育力を維持する際に新鮮な培地の連続流動の中で細胞を培養することを称
する。“連続的増殖”は連続的フロー培養で細胞を成長させる方法を称する。

【００２０】本明細書で用いる“中枢神経系”（ＣＮＳ）は、脳と精髄、当該細胞と細胞外
物質および液体を含む中枢神経のいずれの成分も称する。本明細書で用いる“共同投与”とは、細胞および神経刺激剤または生物活性化
合物の被験者への投与に関して用いる。用語“共同投与”とは、当該細胞と当該
神経刺激剤を同時投与しなければならないことを示さない。共同投与の構成物は
異なる時に、異なる時間間隔および異なる経路で送達してよい。当該投与は、し
かしながら、治療効果において重複させねばならない。

【００２１】用語“培養培地”は、当技術分野で認識されており、一般的には生きている細
胞の培養用に用いる全ての物質または調製物を称する。本明細書で用いられている用語“発育調整剤”は、脳細胞または脳細胞になる
能力を有する幹細胞の発育を制御する分子を称する。

【００２２】本明細書で中枢神経系に関して用いる“局所的脳虚血”は、脳または脊髄へ血
液を供給する単一動脈の封鎖から生じ、その動脈で供給を受けている分野の細胞
性要素の死を生じる状態を意味する。

【００２３】 “全体的脳虚血”は脳全体への血流減少であり、例えばしばしば心臓停止また
は低血圧により引き起こされる。全体的脳虚血では、虚血に対して特に傷つきや
すい細胞は死または傷害を受け、当該脳周辺にパッチ状の損傷が分布するように
なる。これは局所的脳虚血で生じる損傷の型とは異なる。

【００２４】 “ガイダンス分子”はタンパク質の種類で、普通細胞外マトリックスに見られ
、適当な機能をするのに必要な位置へ細胞または細胞突起（軸索）を導く機能を
果たす。例としては、セマフォリン、ネトリン、ニューロピリンおよびエフィリ
ンがある（Ｐｅｒｒｉｓ他．（２０００）Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．９５：３１〜２１
；Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ（２０００）Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１９６：１７
７〜２４４；ＶａｎＶａｃｔｏｒ他．（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．９：
Ｒ２０１〜４）。

【００２５】本明細書で使われる“造血幹細胞”（ＨＳＣｓ）は、均等な能力の娘細胞の生
産に加えて主な造血系統の少なくとも一つの細胞を生み出すことができる幹細胞
である。血液細胞の主な三つの系統には、例えばＢ細胞やＴ細胞のようなリンパ
系統、単球、顆粒球や巨核球のような骨髄性系統および赤血球のような赤血球系
統が含まれる。ある種のＨＳＣｓは脳細胞を含む多くの他の細胞を生じることが
できる。“多分化能”または“複分化能”ＨＳＣｓは、主な造血系統のすくなく
とも三つを生じさせることができるＨＳＣｓである。

【００２６】 “相同性”および“同一性”のそれぞれは、二つのポリペプチド配列間の配列
類似性を称し、同一性はより厳密な比較である。相同性および同一性はそれぞれ
、比較の目的で整列させた各配列での位置を比較して測定できる。比較した配列
における位置が同一アミノ酸残基で占められていると、ポリペプチドはその位置
で同一と称することができる；均等の部位が同じアミノ酸（例えば同一）または
類似のアミノ酸（例えば立体的および／または電気的性質で同等）で占められて
いる場合、当該分子はその位置で相同であると言うことができる。配列間の相同
性または同一性のパーセントは、当該配列が共有する合致或いは相同的位置の数
の関数である。“無関係”または“非相同性”配列は、本発明の生物活性ポリペ
プチドのポリペプチド配列と、４０％未満の同一性を共有するものだが、好まし
くは２５％未満の同一性である。

【００２７】用語“虚血性エピソード”は組織への血液供給不足が生じる全ての環境を意味
する際に用いる。脳虚血性エピソードは脳への血液供給の不足から生じる。中枢
神経系の一部でもある脊髄は、血液減少から生じる虚血に等しく影響を受けやす
い。虚血性エピソードは、血栓または塞栓に関して生じる血管の狭窄または閉塞
により引き起こされる。他には、虚血性エピソードは心臓停止を含む動脈機能低
下のいずれの状態からも生じる。

【００２８】用語“神経刺激（ｎｅｕｒａｌｓｔｉｍｕｌａｎｔ）”は、神経機能または
活性に作用する処置を称する。そのような処置は典型的にはポリペプチド成長因
子、例えばニュートロフィンまたは線維芽細胞成長因子である。そのような処置
には、神経伝達物質アンタゴニストまたはアゴニストおよび発育調整物質のよう
な脳にて活性な神経伝達物質である、ガイダンス分子および非ポリペプチド分子
が同じように含まれる。“神経刺激剤（ｎｅｕｒａｌｓｔｉｍｕｌａｎｔｓ）
”は、同様に、上に記載した薬剤が作用するのと同じような信号伝達経路に作用
する薬剤である。例えば、ｂＦＧＦ受容体信号伝達を活性化する化学物質は神経
刺激剤として使用できるであろう。“神経刺激”には同様に神経機能または活性
に作用する分子の産生を変化させる他の化学的或いは電気磁気的処置（例えば経
頭蓋磁気刺激）を含むことができる。

【００２９】 “神経幹細胞”（ＮＳＣ）は、以下の基礎的神経系統：ニューロン、オリゴデ
ンドログリアおよびアストログリアの少なくとも一つを生じさせることができる
中枢神経系または成長神経系の組織から由来する細胞を説明する際に用いる。加
えて、神経幹細胞は同様に類似した可能性を持つ新ＮＳＣｓを生じることができ
るにちがいない。“多分化能”または“複分化能”ＮＳＣｓは上記神経系統の全
てを、同等な発育可能性の細胞と共に生じさせることができる能力のＮＳＣｓで
ある。

【００３０】 “神経機能”は例えば感覚・運動機能および認識機能のような神経系の機能全
てを称する。 “神経上皮幹細胞”は、胚神経上皮組織から単離した幹細胞群である。そのよ
うな細胞は、本明細書で用いるように神経性幹細胞の部分集合と考えられるだろ
う。“神経上皮細胞”は多効能の傾向がある。

【００３１】 “神経伝達物質”はシナプス内での作用をする際に軸索から放出する小分子で
ある。例示的な神経伝達物質にはカテコールアミン（例えば、エピネフリン、ノ
ルエピネフリンおよびドーパミン）、セロトニン、アセチルコリン、グルタミン
酸およびＧＡＢＡが含まれる。

【００３２】主題の方法で処置される“患者”または“被験者”はヒトを含む哺乳類である
。本明細書で用いる“タンパク質”および“ポリペプチド”は、長さまたは翻訳
後修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）に関わらずアミノ酸残基の全て
の鎖を意味する。本明細書で使用する“生物活性ポリペプチド”は神経刺激剤の
ような活性を有するポリペプチドである。例としてはポリペプチド成長因子およ
びガイダンス分子である。“生物活性ポリペプチド類”には、同様にそれらの因
子の生物機能につき一つ以上を所有する生物活性ポリペプチドの活性断片および
類似体が含まれる。

【００３３】 “ポリペプチド成長因子”は、細胞成長または細胞突起（例えば、軸索、樹状
突起）を少なくとも細胞型において刺激する一般的には分泌ポリペプチドまたは
その活性断片である。

【００３４】生物活性ポリペプチドに関して使用されている“活性断片”は、少なくとも完
全長ポリペプチドの活性の一つを有するポリペプチドのいずれの部分も示す。多
くのポリペプチドが幾つかの異なる活性を有するが、これらの活性の一つのみま
たは部分を有する活性断片を用いるのが望ましいかもしれない。当該活性断片は
、完全長ポリペプチド活性の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも５０％、
より好ましくは少なくとも７０％および最も好ましくは少なくとも９０％（１０
０％を含む）を生じる。一例はｂＦＧＦで、多型でありえて、観測された分子量
は１７．８、２２．５、２３．１および２４．２ｋＤａで；これらの形の全てで
生物的活性があり、当該発明に使用することができる。

【００３５】用語“組換えタンパク質”、“異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）タンパク質
”および“外因性タンパク質”は、当該明細書を通じて相互交換的に使用し、一
般的には当該ポリペプチドをコードしたＤＮＡを適当な発現構造体に挿入して順
に宿主細胞が異種タンパク質を産生するように形質転換する組換えＤＮＡ手法に
より産生するポリペプチドを称する。これは、当該ペプチドが異種（ｈｅｔｅｒ
ｏｌｏｇｏｕｓ）核酸から発現されるということである。

【００３６】 “卒中”は脳に供している血液における異常が起こした機能の突然の低下であ
る。卒中は、“一時的虚血性発作”または“ＴＩＡ”（永続的障害なし）から“
部分的非進行性卒中”（持続性だが悲惨な損傷なし）、“完全卒中”（永続的で
、悲惨な神経欠損）まで重症度の異なる段階で現れる。虚血（血流の減少または
停止）および梗塞（虚血の領域内での細胞の損傷および死）は神経欠損へと導く
卒中における病理的過程である。“虚血性卒中”は脳に供給している血管での妨
害で起こる。主な虚血卒中の下位区分は、血栓性卒中、塞栓性卒中および陰窩性
卒中である。“出血性卒中”は脳に供給している血管の破裂により起こる。出血
性卒中の主な下位区分には、くも膜下出血（ＳＡＨ）および大脳内出血（ＩＣＨ
）がある。

【００３７】本方法に関して、例えば細胞または神経刺激の“治療的効果量”は、臨床的許
容標準による神経機能における回復を起こす望ましい投与方式の一部として適用
するときの治療での量（製剤中の）を称する。

【００３８】 “経頭蓋磁気刺激”（ＴＭＳ）は、頭に近づけたコイルを用いて２から４Ｔ間
の典型的電場による磁場を短い間生じさせて神経の刺激をする方法である（ＴＭ
Ｓコイルでの電流は８０００Ａ程度の強さにできる）。ＴＭＳはしばしばパルス
と遅延時間の変化を伴ったパルス刺激を必要とする。ＴＭＳは脳におけるモノア
ミンを上昇させる。

【００３９】４．２概観本発明は、細胞と神経刺激剤の共同投与が、一方だけの処置よりＣＮＳ損傷か
らの回復を大幅に促進するという驚くべき発見に一部は基づく。ある側面では、
本発明は損傷が局部的か全体的であるに拘わらず、損傷した脳組織の回復を刺激
する際の改善された方法、組成物およびキットを提供する。好ましい態様では、
本発明は虚血、低酸素症おゆび外傷からの回復に関連する。ある側面では、本発
明の方法は例えばポリペプチド成長因子或いは他の分子などの幹細胞および神経
刺激剤の共同投与を含む。当該共同処置はどちらか一方だけの処置でできたより
大きな回復程度を与える。本方法の有望さは最近ラット卒中モデルにおいてポリ
ペプチドの成長因子ＢＤＮＦを骨髄細胞と共同投与して回復を回復する研究で例
証された（Ｃｈｅｎ他，２０００，Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ３９：
７１１〜７１６）。ＣＮＳ損傷の衰弱効果は相当なものなので、回復における改
善が増加すれば患者の生活の質で大きな改善が見ることができる。

【００４０】本題の方法はＣＮＳ損傷の処置での広い応用性を有する。この点で、本題の方
法は虚血症、低酸素症、外傷、神経変性疾患、感染症、癌、自己免疫疾患および
代謝異常による脳および脊髄への損傷での治療に有効であるが、これらに留まら
ない。異常の例には、卒中、頭部外傷、脊椎外傷、低血圧、呼吸停止、心臓停止
、Ｒｅｙ‘ｓ症候群、脳血栓症、塞栓症、脳出血、脳腫瘍、脳脊髄炎、水脳炎、
手術および手術後の傷害、アルツハイマー病、ハンチントン病、クロイツフェル
ト‐ヤコブ病、パーキンソン病、多発性硬化症および筋萎縮性側索硬化症が含ま
れる。

【００４１】血栓、塞栓および全身性低血圧が脳虚血エピソードの最も普通の原因である。
脳虚血の他の原因には、高血圧症、高血圧脳血管病、動脈瘤の破裂、血管腫、血
液疾患、心臓不全症、心臓停止、心臓性ショック、敗血症ショック、頭部損傷、
脊髄損傷、てんかん、腫瘍からの出血または他の血液損失が含まれる。外傷に関
して、外傷は擦傷、切傷、打撲傷、刺傷、圧縮などで、頭部、首または脊柱のい
ずれかの部位またはその付属部と外部物体との外傷性接触により生じる組織外傷
が関わる。外傷性損傷の他の形式は、体液の不適切な滞留によるＣＮＳ組織の狭
窄または圧迫から生じる可能性がある（例えば、標準脳脊髄液または硝子体液生
産、代謝や容量制御の遮断または機能不全、或いは硬膜下や経頭蓋の血腫または
浮腫である）。同じように、外傷性の狭窄または圧迫は、転位性或いは初期腫瘍
のような異常組織の塊の存在から起こりうる。

【００４２】幾つかの場合では、上記の異常から起きた損傷は、例えば局所的虚血、ある種
の外傷およびパーキンソン病など脳の一つの領域に主として局在する。他の場合
では、例えば低酸素症や全体的虚血およびクロイツフェルト‐ヤコブ病のように
損傷は、脳のより広範囲または甚だしい領域に分布し得る。本発明のある細胞は
脳の全体に自由に移動することが知られており、成長因子は全脳の組織に広く役
立てられるように提供できるので、本発明の方法や組成物は全体的および局所的
脳損傷の双方からの回復を促進するのに有効であろうことは予測される。

【００４３】全体の大要において、本発明の治療計画にはＣＮＳ損傷を蒙った患者に神経刺
激剤および幹細胞を投与することを必要とする。好ましい態様では、ＣＮＳ損傷
は虚血症、低酸素症または外傷により引き起こされたものである。治療には患者
から細胞を得ること、場合により治療に有用な細胞の濃縮すること、そして細胞
の患者への投与が含まれる。この点では、当該患者はいかなる外部の細胞に曝さ
れることはなく、当該細胞への免疫反応を避けられる利点がある。

【００４４】本発明に従った治療方式は、投与方式、投与のタイミングおよび用量法に関し
ては、当該中枢神経系傷害の不利な結果から患者の機能回復が回復されるように
実施する；例えば、患者の運動技能（例えば、姿勢、バランス、握力または足取
り）、認識技能、言語能力、および／または感覚認識（視覚能、味覚、臭覚およ
び固有感覚を含む）は、本発明による処置の結果として回復する。

【００４５】作用の個々の機構に限られることは望まないが、本発明の方法はニューロンの
成長およびシナプス形成の刺激によりＣＮＳ損傷からの回復を促進すると信じら
れる。卒中の場合、本質的に全ての現行治療法は梗塞の減少および損傷の防止に
焦点を当てている。それ故、本発明はＣＮＳ損傷治療の従来にない新規な方法に
関する。４．３神経刺激剤および他の生物活性因子本発明の神経刺激剤には神経機能または活性に効果ある処置、化学薬品または
その他が含まれる。そのような処置は典型的には生物活性ポリペプチドであるが
、非ポリペプチド分子もあり、経頭蓋磁気刺激のような物理的処置も意図してい
る。

【００４６】好ましい態様の一組では、当該神経刺激剤はポリペプチド成長因子である。ポ
リペプチド成長因子は医薬品許容担体に入れて投与でき、細胞と混合または非混
合で投与しても同様によい。当該ポリペプチド成長因子は線維芽細胞成長因子（
ＦＧＦ）ファミリー；ニューロトロフィンファミリー；インスリン様成長因子（
ＩＧＦ）ファミリー；毛様体神経栄養性成長因子（ＣＮＴＦ）ファミリー；ＥＧ
Ｆファミリー；ＴＧＦ‐ベータファミリー；ＰＤＧＦファミリー；ＶＥＧＦファ
ミリー；白血病阻止因子（ＬＩＦ）ファミリー；インターロイキン（例えばＩＬ
‐１１、ＩＬ‐６、ＩＬ‐１）；またはオンコスタチン（例えば、オンコスタチ
ンＭ）のメンバーでありうる。これらのファミリーのそれぞれにおける特徴およ
び例示のメンバーは以下と表２に示す。好ましい態様では、ポリペプチド因子は
ヒトポリペプチド因子である。

【００４７】ＦＧＦファミリーは少なくとも１５の異なる因子があり、個々のファミリーメ
ンバーではお互いに高度分岐できるが（一般的に３０〜７０％配列同一性）、哺
乳類種の全体では高度に保存されている。ＦＧＦｓはベータ‐三つ葉型折り畳み
の中に１２のベータ鎖からなる塩基性第三級構造を共有している分泌タンパク質
である。多くのファミリーメンバーは種々の細胞型に分裂促進効果を持ち、そし
てヘパリンと結合する。ＦＧＦファミリーの例示のメンバーは：塩基性ＦＧＦ（
ｂＦＧＦ，ＦＧＦ‐２）、酸性ＦＧＦ（ａＦＧＦ，ＦＧＦ‐１）、ＦＧＦ‐３（
ｉｎｔ‐２）、ＦＧＦ‐４（ｈｓｔ／ｋＦＧＦ），ＦＧＦ‐５、ＦＧＦ‐６、Ｆ
ＧＦ‐７（ＫＧＦ）、ＦＧＦ‐８（ＡＩＧＦ）およびＦＧＦ‐９（ＧＡＦ）。（
Ｓｔａｕｂｅｒ他（２０００）ＰＮＡＳ９７：４９〜５４；Ｗｏｎｇ他．（１９
９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１８６１７〜１８６２２；Ｓｚｅｂｅ
ｎｙｉ他．（１９９９）Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１８５：４５〜１０６）
。

【００４８】ニューロトロフィンファミリーには、神経系に主な効果を行使する幾つかの関
連する分泌因子が含まれる。ニューロトロフィンは一般的に高度に処理されて成
熟形を与える前駆体タンパク質として産生される。成熟ニューロトロフィンは１
‐４、２‐５および３‐６の順序でジスルフィド結合になる６つのシステインの
一組を有する（即ち、一番と四番のシステインがジスルフィド結合を形成する）
。代表的には、ニュートロフィンファミリーメンバーは３つの逆平行ベータ鎖で
構成された表面を持ち、この表面に沿って二量体化が生じる。ニュートロフィン
ファミリーの例示のメンバーは：神経成長因子（ＮＧＦ），脳由来神経栄養因子
（ＢＤＮＦ），ニューロトロフィン３（ＮＴ３），ニューロトロフィン４／５（
ＮＴ４／５）およびニューロトロフィン６である。（Ｌｅｗｉｎ他（１９９６）
Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ１９：２８９〜３１７）。

【００４９】当該インスリン様成長因子は、配列および構造がインスリンと類似し、典型的
な分子量が５〜１０ｋＤａの範囲の分泌タンパク質を含む。これらの因子は血流
に、通常６種のＩＧＦ結合タンパク質と会合して見出すことができる。当該ファ
ミリーの例示のメンバーは、ＩＧＦ‐１およびＩＧＦ‐２を含む。ＩＧＦ‐１お
よびＩＧＦ‐２は脳への種々な傷害からの回復を促進することで知られている。
（Ｄａｕｇｈａｄａｙ他．（１９８９）Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．１０：６８〜９
１；Ｒａｊａｒａｍ他．（１９９７）Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．１８：８０１〜８
３１；Ｊｏｎｅｓ他．（１９９５）Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．１６：３〜３４）。

【００５０】上皮増殖因子ファミリーは関連分泌因子の大きなファミリーである。ＥＧＦフ
ァミリーのメンバーは少なくとも３０％の配列相同性と、当該タンパク質のＣ末
端に６種の保存したシステイン残基の一群を共有する。多くのそのようなタンパ
ク質は、多くの非ＥＧＦファミリーのメンバーのタンパク質にも存在する特有で
よく特徴付けられた領域であるＥＧＦ様領域を同様に含有する。ＥＧＦファミリ
ーのメンバーは普通より大きな前駆体が処理を受けたものである。ＥＧＦファミ
リーの例示のメンバーは、ＥＧＦ，ＴＧＦ‐アルファ、ＨＢ‐ＥＧＦ（ヘパリン
結合ＥＧＦ）、アンフィレグリン、ベタセルリン、ワクシニア成長因子およびｎ
ｅｕ分化因子を含む。（Ａｖｉｅｚｅｒ他．（１９９４）９１：１２１７３〜１
２１７７；Ｈｉｇａｓｈｙａｍａ他．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
６７：６２０５〜６２１２；Ｐｅｌｌｅｓ他．（１９９２）Ｃｅｌｌ６９：２
０５〜２１６）。

【００５１】当該ＴＧＦ‐ベータスーパーファミリーは、広い範囲の生物と細胞型における
細胞間の信号伝達および発育に関わる分子の重要な部類である。当該ファミリー
のメンバーは、初めにアミノ末端信号配列および種々の大きさのプロドメインを
有するより大きな前駆体分子として合成される（Ｋｉｎｇｓｌｅｙ，Ｄ．Ｍ．（
１９９４）ＧｅｎｅｓＤｅｖ．８：１３３〜１４６）。当該前駆体はそれから
分裂されて１１０〜１４０アミノ酸の成熟したカルボキシ末端分節が放たれる。
当該活性信号伝達部分はカルボキシ末端分節のヘテロまたはホモ二量体を含む（
Ｍａｓｓａｇｕｅ，Ｊ．（１９９０）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．
６：５９７〜６４１）。活性型の上記分子が、次に、このファミリーの分子に対
してI型およびＩＩ型受容体と呼ばれるわずかに関連をもつ膜貫通セリン／トレ
オニンキナーゼから構成されているその受容体と、相互作用する（Ｍａｓｓａｇ
ｕｅ，Ｊ．他（１９９２）Ｃｅｌｌ６９：１０６７〜１０７０；Ｍｉｙａｚｏ
ｎｏ，Ｋ．Ａ．他ＥＭＢＯＪ．１０：１０９１〜１１０１）。ＴＧＦ‐ベー
タは直接ＩＩ型受容体に結合し、それからＩ型受容体を漸加してリン酸化で修飾
する。Ｉ型受容体はそして信号を下流の成分に伝達する（Ｗｒａｎａ他，（１９
９４）Ｎａｔｕｒｅ３７０：３４１〜３４７）。一般的に、ＴＧＦ‐ベータス
ーパーファミリーのメンバーは、成熟した二量体化信号タンパク質の単量体内お
よび間の両方のジスルフィド結合に関与する、９種の高度に保存されたシステイ
ン残基セットを有する（Ｇｒｉｆｆｉｔｈ他（１９９６）ＰＮＡＳ９３：８７
８〜８８３；Ｌｕｏ他（１９９５）ＰＮＡＳ９２：１１７６１〜１１７６５；
Ｓｃｈｌｕｎｅｇｇａｅｒ他（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３１：４４
５〜６８；Ｄａｏｐｉｎ他（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ１７：１７６〜９２
；Ｍｕｒｒａｙ‐Ｒｕｓｔ他（１９９３）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ１５：１５３〜
９；Ａｒｃｈｅｒ他（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３２：１１６４〜
７１；Ｄａｏｐｉｎ他（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７：３６９〜３７３；
Ｓｃｈｕｌｎｅｇｇｅｒ他（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ３５８：４３０〜４３４
；Ｈｉｎｃｋ他．（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３５：８５１７〜３
４；Ｍｉｔｔｌ他（１９９６）ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉ．５：１２６１〜７１）
。

【００５２】形質転換成長因子ベータファミリーは、ＴＧＦ‐ベータサブファミリー、骨形
成タンパク質（ＢＭＰ）サブファミリー、アクチビンサブファミリーおよびその
他が含まれる非常に大きなファミリーである。ＴＧＦ‐ベータサブファミリーの
例示のメンバーは、ＴＧＦ‐ベータ‐１，２，‐３，‐４および‐５を含む。Ｂ
ＭＰサブファミリーの例示のメンバーは、オステオゲニンタンパク質１（ＯＰ‐
１，ＢＭＰ‐７）およびＢＭＰ‐９を含む。（Ｒｅｎ他．（２０００）Ｎｅｕｒ
ｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ３９：８６０〜８６５；Ｌｏｐｅｚ‐Ｃｏｖｉｅ
ｌｌａ他（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ２８９：３１３〜３１６；Ｗｉｔｈｅｒ
ｓ他（２０００）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１２：１０６〜１１６）。

【００５３】血管上皮成長因子（ＶＥＧＦ）ファミリーは、胚および体の血管形成における
強力な分裂促進因子として作用する分泌タンパク質群である。ＶＥＧＦ自身を含
むＶＥＧＦタンパク質はキナーゼドメイン受容体ファミリー（ＫＤＲ）およびｆ
ｍｓ様チロシンキナーゼ群（Ｆｌｔ受容体）の細胞表面受容体に結合する。ＶＥ
ＧＦタンパク質はシスチン節目（ノット）構造を持つホモ二量体を形成する。血
小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）はＶＥＧＦと類似性（１９％）の有限配列のみを
共有するが、実質上の構造類似性を有する。ＰＤＧＦおよび類縁ファミリーメン
バーは同様にシスチン節目タンパク質であり、類似様式にてそれらの受容体に結
合する。（Ｌｏｂｓｉｇｅｒ他（２０００）Ｇｉｌａ３０：２９０〜３００；Ｓ
ｕｎ他（１９９５）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃ．Ｓ
ｔｒｕｃｔ．２４：２６９〜２９１；Ｍｕｌｌｅｒ他．（１９９７）Ｓｔｒｕ
ｃｔｕｒｅ５：１３２５〜１３３８；Ｊｉａｎｇ他（２０００）ＥＭＢＯＪ．
１９：３１９２〜３２０３；Ｍｕｌｌｅｒ他（１９９７）ＰＮＡＳ９４：７１
９２〜７１９７）。

【００５４】インターロイキンは分泌ポリペプチド因子で、免疫細胞間の信号伝達を仲介す
る。多くのインターロイキン、特にＩＬ‐１αとβ、ＩＬ‐６およびＩＬ‐１１
は脳に効果を有することが知られている。（ＶａｎＷａｇｏｎｅｒ他（１９９
９）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．１００：１２４〜１３９；Ｌｉｎｇ他（１
９９８）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１４９：４１１〜２３；Ｍｅｈｌｅｒ他（１９
９３）Ｎａｔｕｒｅ３６２：６２〜５）。興味をそそるのは、ＩＬ‐６および
ＩＬ‐１１は両方とも毛様体神経栄養性因子（ＣＮＴＦ）、白血病阻止因子（Ｌ
ＩＦ）およびオンコスタチンＭに対する受容体として行動する受容体タンパク質
ｇｐ１３０を通してある程度作用することである。こうして全てのこれらの因子
は神経機能および発育を調整を行うのに同じような役割を果たす。（Ｂｅｎｉｇ
ｉ他（１９９５）Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１：５６８〜７５；Ｂｅｎｉｇｉ他（１９
９６）Ｂｌｏｏｄ８７：１８５１〜４；Ｍｕｒｐｈｙ他（１９９７）Ｐｒｏｇ
．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．５２：３５５〜７８）。

【００５５】

【表１】

【００５６】更に、ポリペプチド因子の分野では命名法は、主としては多くの因子が研究者
の異なるグループで独立に単離されたことおよび歴史的に当該因子の精製の過程
におけるアッセイとして用いた組織の型毎に名前を付けた理由により複雑である
。塩基性ＦＧＦは過去に科学的発表において多くの異なる名前で呼ばれており、
複数のファミリーメンバーであった。これらには白血病成長因子、マクロファー
ジ成長因子、胚腎臓由来血管新生因子２、前立腺成長因子、アストログリア成長
因子２、上皮成長因子、軟骨肉腫成長因子、軟骨由来成長因子１、眼由来成長因
子１、ヘパリン結合性成長因子１１型、筋形成成長因子、ヒト胎盤精製因子、子
宮由来成長因子、胎生期癌由来成長因子、ヒト脳下垂体成長因子、脂肪細胞成長
因子、前立腺骨芽細胞因子および哺乳類腫瘍由来成長因子が含まれる。こうして
、前記名前の一つで称されるいずれの因子も本発明の目的内と考えられる。更に
、因子につき通常受け入れられている名前を使うように努力したが、本明細書に
記載したいずれの因子も、異なる名前で他に知られているかどうかに関わらず本
発明の目的内と考える。

【００５７】本発明は同様に、それら因子の生物機能の一つ以上を有する上記成長因子の生
物活性類似体も使用できる。例としては多型でありえて、観測した分子量として
１７．８、２２．５、２３．１および２４．１ｋＤａであるｂＦＧＦ；これらの
形の全てが生物活性であり、本発明で使用できる。上記因子の生物活性類似体を
同定することは可能である。そのような類似体でも、ポリペプチドの天然で生じ
る形の一つ以上の活性を保持すれば機能的には同等とみなされる。生物活性類似
体には同様にポリペプチドではないにもかかわらずポリペプチド成長因子に良く
似た活性の分子を含んでもよい。生物活性類似体は強化した効率またはより望ま
しい安定性性質のような好ましい性質も有することがある（例えば、ｅｘｖｉ
ｖｏ保存性およびｉｎｖｉｖｏでのタンパク質分解への抵抗性）。例えば、当
該類似体は因子の破壊や他の不活性化を生じるタンパク質分解または他の過程に
対し、より安定であるとか、より不安定である性質を与えられていることもある
。短い半減期は、短い生物的効果を生じるのである組織の内または周囲でのタン
パク質レベルの厳重な制御を招くことができる。より長い半減期であれば当該因
子の有効性を増加できる。

【００５８】ある態様では、本発明の生物活性ポリペプチドは、配列番号１〜３で説明する
ｂＦＧＦ配列に少なくとも３０％の同一性であるアミノ酸配列であるポリペプチ
ドを含む。好ましい変異では、そのような生物活性ポリペプチドは配列番号１〜
３の一つと少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５
％、９８％、９９％または１００％同一性であるアミノ酸配列のタンパク質を含
む。

【００５９】そのような生物活性類似体を産生する方法は当技術分野ではよく知られている
。一般的には、ポリペプチド因子の変異は因子をコードした核酸配列に変化を導
入してできる。変化した核酸は変化したポリペプチドを産生するように発現させ
られることができ、種々の性質につき当該ポリペプチドを検定することができる
。核酸配列における変化で個々に特有で望ましい変化を導入することができる。
これに代わるものとして、半無作為に生じた変異細胞のライブラリーを作成して
活性をスクリーンしてもよい。

【００６０】潜在的生物活性類似体のライブラリーを生じることができる方法は数多くある
。例示的態様では、ｂＦＧＦ相同体または他の類似タンパク質の集団についての
アミノ酸配列を、好ましく最も高い同一性を可能にするように整列させる。その
ような変異細胞の集団は、例えばげっ歯類および鶏または同一種だが突然変異で
異なるｂＦＧＦ相同体のような一つ以上の種からのｂＦＧＦ類似体を含むことが
できる。整列させた配列の各位置において見られるアミノ酸を選択して組合せ配
列の縮重セットを作り出す。好ましい態様では、ｂＦＧＦ変異体の多様なライブ
ラリーを核酸レベルの組合せ突然変異誘発により作成し、多様な遺伝子ライブラ
リーによりコードする。例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物は酵素的に遺
伝子配列へと結合できるので、潜在的ｂＦＧＦ配列の縮重セットは個々のポリペ
プチドとして、またはそこにｂＦＧＦ配列のセットを含有するより大きな融合タ
ンパク質（例えば、展示ファージ）セットとして発現可能である。

【００６１】縮重遺伝子配列の化学合成は自動ＤＮＡ合成装置で実施でき、当該合成遺伝子
はそれから適当な発現ベクターに結合する。遺伝子の縮重セットの目的は、一つ
の混合物において望ましい生物活性類似体をコードしている配列のすべてを提供
することにある。縮重オリゴヌクレオチドの合成は当技術分野で良く知られてい
る（例として参照、Ｎａｒａｎｇ，ＳＡ（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ
３９：３；Ｉｔａｋｕｒａ他（１９８１）ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＤＮＡ，Ｐ
ｒｏｃ３ｒｄＣｌｅｖｅｌａｎｄＳｙｍｐｏｓ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕ
ｌｅｓ，ＡＧＷａｌｔｏｎ編，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒｐｐ
２７３〜２８９；Ｉｔａｋｕｒａ他（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａ他（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ１９８：
１０５６；Ｉｋｅ他（１９８３）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．１１：４
７７）。このような手法は他のタンパク質の直接的発生において使用されてきた
（参照、例えば、Ｓｃｏｔｔ他（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：３８６〜
３９０；Ｒｏｂｅｒｔ他（１９９２）ＰＮＡＳ８９：２４２９〜２４３３；Ｄ
ｅｖｌｉｎ他（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：４０４〜４０６；Ｃｗｉｒ
ｌａ他（１９９０）ＰＮＡＳ８７：６３７８〜６３８２；と共に米国特許番
号５，２２３，４０９号、５，１９８，３４６号および５，０９６，８１５号）
。

【００６２】上記組合せ突然変異誘発の代替も存在する。例えば、ｂＦＧＦ類似体は、例と
してアラニンスキャニング突然変異誘発およびその類により生成できる（Ｒｕｆ
他（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３３：１５６５〜１５７２；Ｗａ
ｎｇ他（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３０９５〜３０９９；Ｂ
ａｌｉｎｔ他（１９９３）Ｇｅｎｅ１３７：１０９〜１１８；Ｇｒｏｂｅｒｇ
他（１９９３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１８：５９７〜６０１；Ｎａｇ
ａｓｈｉｍａ他（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２８８８〜２８
９２；Ｌｏｗｍｅｎ他（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３０：１０８３
２〜１０８３８；およびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ他（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４４：１０８１〜１０８５）。リンカースキャニング突然変異誘発による（Ｇ
ｕｓｔｉｎ他（１９９３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１９３：６５３〜６６０；Ｂｒｏ
ｗｎ他（１９９２）Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１２：２６４４〜２６５２
；ＭｃＫｎｉｇｈｔ他（１９８２）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３２：３１６）；飽和突
然変異誘発による（Ｍｅｙｅｒ他（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３２：６１３
）；ＰＣＲ突然変異誘発による（Ｌｅｕｎｇ他（１９８９）ＭｅｔｈｏｄＣｅ
ｌｌＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１：１１〜１９）；または無作為突然変異誘発による
（Ｍｉｌｌｅｒ他（１９９２）ＡＳｈｏｒｔＣｏｕｒｓｅｉｎＢａｃｔ
ｅｒｉａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ，ＣＳＨＬＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎ
ｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ；およびＧｒｅｅｎｅｒ他（１９９４）Ｓｔｒａｔｅｇ
ｉｅｓｉｎＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：３２〜３４）。

【００６３】上記方法はｂＦＧＦに加えて他のポリペプチド因子に一般化してよい。生物活性因子の一つ以上の変異体を作成するなら、望ましい性質の変異体の同
定には種々な方法を使用してよい。ペプチドのアミノ酸配列における一つ以上の
変化が生物活性類似体に生じたかどうかは、変異体ペプチドが細胞中で野生型ペ
プチドと類似の様式で応答するかまたはその応答を競合的に阻害するかを評価し
て容易に測定できる。加えて、そのようなポリペプチドが受容体に結合する能力
も測定できる。例えば、ｂＦＧＦは普通受容体ＦＧＦＲ１およびＦＧＦＲ２と結
合する。この結合はヘパリンとの結合でも刺激される。これらの性質を点検して
、ｂＦＧＦ変種が活性であるかを実証できた。

【００６４】組合せライブラリーの遺伝子生産物についてのスクリーニングおよび一定の性
質を有する遺伝子生産物についてのｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングにつ
いては、当技術分野では広い範囲の手法がよく知られている。大きな遺伝子ライ
ブラリーをスクリーニングする際に最も広く用いられている手法は、典型的には
遺伝子ライブラリーを複製できる発現ベクターにクローン化し、生じたベクター
のライブラリーを有する適当な細胞を形質転換し、そして組合せ遺伝子の発現を
、その生産物を検出する遺伝子をコードしているベクターを比較的容易に単離で
きるようにする望ましい活性検出の条件下においてさせることを含む。以下に具
体的に説明する例示的検定の各々は、組合せ突然変異誘発手法で創出する多数の
変異配列をスクリーニングするのに必要な高処理量分析になじみやすい。

【００６５】可能性のあるスクリーニング検定において、当該遺伝子ライブラリーはウイル
ス粒子表面の融合タンパク質として発現する。例えば、線状ファージ系では外部
ペプチド配列は伝染性ファージの表面で発現させることができる。これらのファ
ージは非常に高濃度において親和性マトリックスに適用でき、多量のファージの
スクリーニングが同時に可能となる。もし一定のファージを低収率で親和性マト
リックスから回収すると、当該ファージは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような適し
た宿主の中における次回の感染で増幅できる。ほぼ同じ大腸菌線状ファージＭ１
３のｆｄとｆ１の群は、ファージｇＩＩＩまたはｇＶＩＩＩ被膜タンパク質のい
ずれのウイルス粒子の最終パッケージを破裂することなしに融合タンパク質を生
成するのに用いることができるので、ファージ展示ライブラリーにて使用される
（Ｌａｎｄｎｅｒ他ＰＣＴ公報ＷＯ９０／０２９０９；Ｇａｒｒａｒｄ他，Ｐ
ＣＴ公報ＷＯ９２／０９６９０；Ｍａｒｋｓ他（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２６７：１６００７〜１６０１０；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ他（１９９３）
ＥＭＢＯＪ１２：７２５〜７３４；Ｃｌａｃｋｓｏｎ他（１９９１）Ｎａｔ
ｕｒｅ３５２：６２４〜６２８；およびＢａｒｂａｓ他（１９９２）ＰＮＡＳ
８９：４４５７〜４４６１）。

【００６６】他の態様では、組合せライブラリーが細胞外に提示されるように設計される（
例えば、自然に起こるように）、または任意には分泌される（例えば、ライブラ
リーのポリペプチドが全て信号配列を含む）。当該ライブラリーは、望ましい生
物活性断片に対する機能受容体を発現する細胞と共培養できる真核細胞にトラン
スフェクションさせることができる。例えば、ｂＦＧＦの生物活性変異体を確認
するｂＦＧＦ受容体を発現する細胞が使用できるであろう。組合せライブラリー
を発現する細胞から分泌される生物活性類似体は受容体陽性細胞の近くに拡散し
、表現型変化を誘発するようになる。表現型変化は、例えば因子処理に対する応
答で作られるか壊されるかどちらかであるエピトープに導かれる抗体を用いて検
出することがある。

【００６７】これらの類似体の各々は従って更なる生物活性につきスクリーンされる。例え
ば、組合せライブラリーから単離した受容体結合類似体は、当該タンパク質の野
生型の形に関して細胞増殖へのそれらの効果を試験することができる。或いは、
ｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏにおける類似体の安定性をスクリーンで
きた。そのような類似体の活性は同じように動物モデルで評価できる。例えば、
ラット卒中モデルにおける神経機能を回復する類似体の能力で、類似体が適切な
生物活性を持つことを実証する評価ができるだろう。

【００６８】多くの異なる突然変異の型で生物活性類似体を生じることができる。例えば、
アミノ酸配列での保存された変化は生物活性を一つ以上保持する類似体を生じる
ことが期待できる。ロイシンのイソロイシンやバリンによる、アスパラギン酸の
グルタミン酸による、トレオニンのセリンによる置換または同様な構造的に関連
したアミノ酸によるアミノ酸の単離された置換体（即ち、保存された突然変異）
は、生じる分子の生物活性へは大きな効果は持たないと思うのは適切である。保
存された置換とは、側鎖に関してアミノ酸のファミリー内で起こる置換のことで
ある。遺伝的にコードしたアミノ酸は４つのファミリーに分けられる：（１）酸
性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リジン、アルギニン、ヒス
チジン；（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン
、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非電荷極性＝
グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロ
シン。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは度々一緒に芳香族ア
ミノ酸として分類される。同じようにして、アミノ酸全体を（１）酸性＝アスパ
ラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リジン、アルギニン、ヒスチジン、（
３）脂肪族＝グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、
トレオニンで、場合によりセリンおよびトレオニンは別に水酸基化脂肪族として
分類する；および（４）芳香族＝フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン
；（５）アミド＝アスパラギン、グルタミン；および（６）含硫黄＝システイン
およびメチオニン。（参照、例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第二版，Ｌ．
Ｓｔｒｙｅｒ，ＷＨＦｒｅｅｍａｎｄＣｏ．編：１９８１）。

【００６９】他の態様では、化学的に修飾した生物活性因子につき考慮する。ポリペプチド
は化学的に修飾して、グリコシル基、脂質、リン酸、アセチル基およびそれに類
似したものなど他の化学的一部と共有結合または集合的共役を形成して誘導体を
作成することがある。共有結合した誘導体は化学的一部を、アミノ酸側鎖やポリ
ペプチドのＮ末端またはＣ末端において官能基と結合させて調製することがある
。例えば、当該タンパク質と天然で会合している配列ではない一部を含んでいる
生物活性因子を産生することができ、それは細胞外マトリックスの成分を結合し
、細胞表面への当該類似体の局在化を促進する。例えば、テトラペプチド配列Ｒ
‐Ｇ‐Ｄ‐Ｓのようなフィブロネクチン“ＩＩＩ型反復”から誘導した配列（Ｐ
ｉｅｓｃｈｂａｃｈｅｒ他（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ３０９：３０〜３；およ
びＫｏｒｎｂｌｉｔｔ他（１９８５）ＥＭＢＯ４：１７５５〜９）をポリペプ
チド因子に加えて、ＥＣＭ成分に結合することによりキメラ分子の細胞への接着
を援助する（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ他（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３８：４９
１〜４９７；Ｐｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ他（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２６２：１７２９４空；Ｈｙｎｅｓ（１９８７）Ｃｅｌｌ４８：５４９〜
５４；およびＨｙｎｅｓ（１９９２）Ｃｅｌｌ６９：１１〜２５）。

【００７０】或いは、本発明で有用なポリペプチド成長因子は当該因子の活性断片から成り
立つことができる。与えられたいずれの断片の活性も、上で説明したような方法
で容易に測定できる。例えば、本明細書で説明した本発明の方法により投与した
ｂＦＧＦの断片は、全長ｂＦＧＦポリペプチドを投与して生まれる性能との比較
の機能試験において性能回復を示せば、それはｂＦＧＦの“活性断片”とされる
。そのような活性断片は、例えばＢａｉｒｄおよびＧｓｇｅ（１９９７）Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９４（１３）：７０４７〜５
２にて説明されている。サイズに関わり無くポリペプチド成長因子が完長野生型
ポリペプチド成長因子の機能活性を保持しているかどうかを測定することは、当
然熟練技術者の能力内である。

【００７１】本発明における有用なポリペプチド因子は、好ましくは細胞培養、組織試料、
生物液などの原材料から実質的な精製を行ったものである。実質的に精製したと
は、精製した材料が例えばｂＦＧＦポリペプチドなどの目的のポリペプチドが少
なくとも６０重量％（乾燥重量）であることを意味する。好ましくは、当該ポリ
ペプチド組成は目的のポリペプチドが少なくとも重量％で、７５％、より好まし
くは少なくとも９０％で、最も好ましくは少なくとも９９％である。純度はいず
れの標準的方法、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動
またはＨＰＬＣ分析で測定できる。実質的に精製したポリペプチドは担体または
細胞などの他の望ましい成分と組合せることができ、ポリペプチドが患者に投与
したときポリペプチドの効果に十分な濃度であれば６０％未満となる組成物を作
る。

【００７２】本発明で有用な当該ポリペプチド因子は天然発生、合成または例えば一部がｂ
ＦＧＦと一部が異なるポリペプチドであるハイブリッドまたは二つ目の部分が異
なるポリペプチドあるキメラポリペプチドで構成される組換え分子でありうる。
これらの因子は生物試料、標準手法による化学的合成物または組換え物から精製
することができる（参照。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ他，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏ
ｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ
，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，１９９３；Ｐｏｕｗｅｌｓ他，Ｃ
ｌｏｎｉｎｇＶｅｃｔｏｒｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，１
９８５，Ｓｕｐｐｌ．１９８７）。

【００７３】ポリペプチド成長因子は本発明により細胞と組合せて現在もっとも好ましく用
いられるが、他の治療形式も同じく本発明により細胞と組み合わせることができ
る神経刺激剤と見なされる。例えば、経頭蓋磁気刺激は脳内のモノアミンを増加
させるので、細胞との共同投与には良い効果があると期待される。

【００７４】神経刺激剤に用いることができる非ポリペプチド神経刺激剤の一つの群は、神
経伝達物質アゴニストまたはアンタゴニストである。例としてはＰｒｏｚａｃ，
アンフェタミン、Ｒｉｔａｌｉｎのような抗うつ剤およびＥｌａｖｉｌのような
三環式抗うつ剤である。

【００７５】他の有用な分子は、レチノイック酸のような細胞を準備刺激して機能化した神
経に分化することができる分化因子である。他の分子部類は、タンパク質の部類で通常細胞外マトリックスの中で見出され
るいわゆるガイダンス分子で、適した機能化が求められる位置に細胞または細胞
突起（軸索）を導く機能を果たす。例としてはセマフォリン、ネトリン、ニュー
ロピリンおよびエフリンがある。

【００７６】全て脳によく確立された効果を持つ上記神経刺激剤に加えて、神経刺激剤とは
考えられない他の生物活性化合物でも細胞との組合せが有用であろうことが予想
される。これらの代わりの化合物は概して体の他の部位に効果を持つよく知られ
た化合物で、最近見出された更なるＣＮＳの細胞への効果を有する。

【００７７】代わりになる化合物の一群には、現在同種移植片の拒絶を抑制するのに用いら
れている免疫抑制剤分子が含まれる。このような分子の好ましい部類は、サイク
ロスポリン、ＦＫ５０６およびタリドマイドのようなイムノフィリンである。こ
れらの分子は移植細胞の拒絶の防止および神経保護的機能の提供の二重作用を示
す。代わりの刺激剤としての他の一群はテトラサイクリン類で、古典的にはその
抗生物質効果で知られているが同時に望ましい神経保護効果を持っている。４．４細胞多くの異なる細胞型またはそれの混合物を患者に投与することがある。理論に
こだわらなければ、投与した細胞は多様な様式で脳に影響するだろうと仮定され
る。細胞はそれ自身が脳内で自立し、神経と機能的つながりを形成することがあ
る。加えてまたは或いは、細胞は内生的神経細胞を刺激して新しい突起と連係を
形成することがある。最終的に細胞はＣＮＳ損傷からの回復を阻害している化合
物を捕捉するか或いは除去するか不活性化する作用を行なうこともある。これら
の可能性を考慮すると、本質的に上記の特質の一つを有する全ての細胞および特
に潜在的さらに最終的に分化した細胞を除く幹細胞が脳機能に有益な効果を持つ
ことが理解される。有益な捕捉能力を有することが知られている最終的に分化し
た細胞型の例としては、活性化リンパ球およびマクロファージがある。

【００７８】ある態様では、本発明の細胞は好ましくはｉｎｖｉｖｏで脳細胞を生じる能
力を持つ幹細胞である。特に好ましい細胞は多分化能幹細胞である。そのような
細胞はｉｎｖｉｔｒｏで臨床使用用に生育できる。好ましい態様では、本発明
で用いることができる幹細胞型には神経幹細胞、造血性幹細胞、胚幹細胞、奇形
癌細胞系および他の幹細胞型が含まれる。

【００７９】本明細書で使われる用語“幹細胞”は、より分化した子孫の一つの型以上を生
じることができる無制限または延長された自己再生の能力を持つ細胞を称する。
好ましい幹細胞は少なくとも１０回の細胞分裂が実施でき（適当な条件で）、更
に幹細胞の特質を維持している。特に好ましい幹細胞は、幹細胞の特質を失うこ
となく少なくとも２５、５０または１００回の分裂を行なえる。細胞に関して言
えば、“生じる”および“生産する”という用語は直接の娘細胞だけでなく、そ
の細胞の起源を最終的には辿れる全ての細胞を意味する。“生じる”および“生
産する”は同じように細胞分裂事象なしに起こるような細胞型における変化も称
する。幾つかの分化した細胞は同じようにより大きな成長潜在性の細胞を生じる
能力を有する。そのような能力は特有な環境のもとでは自然であり、または種々
の因子で人工的に誘発されることがある。どちらの場合でも、当該細胞は本発明
の目的にとっては幹細胞の型と考えてもよい。そのような幹細胞は“誘発幹細胞
”または“分化幹細胞”と称することがある。“処理幹細胞”は、その自然な細
胞環境と違ういずれかの形の妨害を受けたことのある幹細胞を称する。これには
遠心分離、解離、分散または他の処理が含まれる。非処理の組織試料の中に含有
される幹細胞は“処理幹細胞”とは考えない。

【００８０】幹細胞は通常は他のより分化した細胞と混合している珍しい細胞である。本発
明の目的では、少数の幹細胞だけを含んだ細胞懸濁液を使用することが可能であ
る。そのような方法は例えば骨髄のような幹細胞の豊富な組織から由来した細胞
について有効である。好ましい態様では、幹細胞は濃縮するので少なくとも５０
％純度で、被験者に投与するときには幹細胞は少なくても細胞の５０％であるこ
とを意味している。特に好ましい態様では、幹細胞は少なくとも６０％、７０％
、８０％または９０％の純度であることである。４．４．１幹細胞培養および増殖用の一般的方法本発明の幹細胞を単離するには種々の手法が用いてよい。代表的には、望まし
い幹細胞が存在する細胞中に少ないパーセントを構成している組織試料（例えば
、血液、骨髄、胚または成人脳組織など）から得られることになる。好ましい態
様では、当該組織試料は分離して細胞懸濁液とし、場合により種々の方法を用い
て幹細胞を濃縮する。組織試料の分離する好ましい手順は細胞死ができるだけ少
ない方法である。例えば、幹細胞は例えばピペットを用いる機械的せん断のよう
な機械的方法で組織試料から分離できる。他の例では、酵素的消化で周囲の組織
から分離することも可能である。血液などの液体組織試料は遠心分離による分画
およびもし適当であればある画分の再懸濁ができる。異なる細胞型および細胞外
材料の分離は、遠心分離または例えばＦｉｃｏｌｌなどの濃度勾配中への投入に
より達成してもよい。幹細胞集団は、特異な細胞標識と共の連続細胞成長に関す
るそれらの傾向に基づいて、例えばアフィニティー分離手法または蛍光活性化細
胞ソーティング（ＦＡＣＳ）を用いて濃縮される。

【００８１】動物からの細胞を培養する際の培養培地は数多く存在する。それらの幾つかは
複雑で、幾つかは単純である。幹細胞は複雑な培地中で成長すると予想されるが
、外植片は単純な培地中、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓＭｉｎｉｍａｌＥｓｓｅｎ
ｔｉａｌＭｅｄｉａ（ＤＭＥＭ）で維持するのが、組織試料中のある細胞集団
の活性をより精密に制御するために一般的に好まれる。当該培養は１２または２
４穴マイクロプレートのようないずれかの適した培養容器で維持し、同一の動物
から単離する細胞用の典型的な、５％ＣＯ₂において３７℃のような培養条件で
維持することがある。当該培養基は改良された通気にて振とうしてよく、振とう
速度は例えば１２ｒｐｍである。

【００８２】一般的に、幹細胞は望ましい細胞の特質の確認に基づいて検出およびソーティ
ングして濃縮できる。例えば、モノクロナール抗体は、特定の細胞および／また
は分化の段階に関連した標識（表面膜タンパク質、例えば受容体）の確認に特に
有用である。被験者前駆細胞の分離用の手順には、抗体被覆磁気ビーズ、アフィ
ニティークロマトグラフィーおよび例えば平板のような固体マトリックスに付着
させた抗体による“パニング”または他の便利な手法を用いた磁気分離が含まれ
る。正確な分離を提供する手法には、例えば色チャネルの複数性、低角度と鈍角
光分散検出チャンネル、インピーダンスチャンネルなど精巧さにおいて種々の段
階を変化させることができる蛍光活性化細胞ソーティングが含まれる。

【００８３】抗体は、磁気ビーズなどの標識と共役してもよく、支持体と結合したアビジン
またはストレプトアビジンにて除去できるビオチン、蛍光活性化細胞ソーターま
たはその類と共に使用できる蛍光色素またはその類の直接分離を行なって特定の
細胞型の分離を容易にする。当該細胞の生育力を過度に損なわないのであればい
ずれの手法を使用してもよい。

【００８４】抗体の使用に加えて、望ましい細胞の表面に結合する他のタンパク質も使用可
能である。例えば、望ましい細胞が特異的にＥＧＦ受容体を発現するならば、標
識したＥＧＦを上記抗体につき説明したような同じ方法にてこれらの細胞を検出
するのに使用できる。ある色素は同様に特定の細胞集団を染色するので、望まし
い細胞を得る際の方法の一部として使用できる。幹細胞は同様に典型的に特有な
形態を有している。幹細胞は通常比較的少量の細胞質と共に大きな核を持つ。

【００８５】上部に説明した選択法は選択的成長条件と組合せてもよく、更なる濃縮がもた
らす。例えば、天然および組換工学の細胞は即時培養への支持細胞層として供す
ることができる。そのような細胞は、選択方法用の基質として使用できる細胞外
マトリックスを同じように生産できる。

【００８６】細胞混合物と細胞の一つ以上の集団を増殖させる試薬と接触させることは同様
に可能である。例えば、ある特有な幹細胞型の有糸分裂や細胞形質転換を誘発す
る物質である分裂促進因子は、その集団の増殖を起こすのに使用できる。このよ
うに、特有因子に応答性のない細胞は分裂する傾向はないが応答性がある細胞は
分裂し、細胞集団の大部分となる。

【００８７】濃縮後、得られた細胞が適切な特質を有していることを実証することは重要で
ある。本発明の細胞は成長因子、特異な遺伝子発現、それらの細胞の表面におけ
る抗原性標識、色素染色性および／または基本的な形態への応答性に基づいて特
性決定ができる。特異な幹細胞集団が生じる細胞型を決定するのは同様に価値が
ある。

【００８８】幹細胞は環境条件を変化することにより種々な細胞型に誘発することができる
。例えば、被験者の前駆細胞は相当する胚組織と組換えを行い、胚組織が成人細
胞に指令して共発育および共分化させることができるかを見ることができる。幹
細胞は、例えば神経幹細胞につき傷害を起こしたラットの脳に神経幹細胞を移植
し、分化させるような当技術分野で使用される数多くの再生モデルの一つに移植
することができる（Ｇａｇｅ他（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ，９２：１１８７９〜１１８８３；Ｆｌａｘ他（１９９８）Ｎａｔ
ｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１６：１０３３〜１０３９）。幹細胞は外
部ＤＮＡの一片をトランスフェクションさせて一般的に遺伝的標識をしてよい。
この標識で宿主細胞の中から幹細胞の子孫を確認できるようになる。或いは、前
駆細胞は、細胞の分化を誘発することができる成長または分化因子の一つ以上と
接触することができる。分化した細胞型は、例えば細胞表面標識、色素染色など
幹細胞を確認するのに用いられる同じ一般的な方法を用いて確認することができ
る。

【００８９】ある状況において、細胞増殖を測定することは望ましいことである。そのよう
な方法は、細胞複製の特徴であるＤＮＡ合成を測定することを最も共通に含む。
当技術分野ではＤＮＡ合成の測定には数多くの方法があり、いずれも本発明に従
って使用してよい。本発明の態様においては，ＤＮＡ合成は、放射性標識（³Ｈ
‐チミジン）または免疫蛍光を検出する標識ヌクレオチド類似体（ＢｒｄＵ）を
用いて定量した。

【００９０】成長因子は同じように培地の中に入れて一定の細胞集団を増殖させるか、分化
した細胞型の生産をうながすことがある。細胞は正および負の選択で選り分けることができる。例えば、正または負の選
択は、目的細胞の表面にある因子に特異的な一つ以上のビオチニル化抗体を用い
て達成することがある。当該ビオチニル化抗体は細胞培養に導入する。指定した
培養時間の後、目的細胞と複合体を形成していない全てのビチオニル化抗体を洗
い流す。固定化したアビジンマトリックスをそれから細胞懸濁液に添加する。固
定化アビジンマトリックスはビオチニル化抗体／抗原複合体に結合する。そして
本懸濁液は遠心分離してアビジンマトリックスを分離できる。或いは、アビジン
を磁気ビーズに結合してもよく、その結果抗体に結合している細胞は非結合細胞
から磁気的に分離する。選択が正の場合、抗体に結合した細胞は続けて成長させ
るため栄養培地で再懸濁させる。選択が負の場合、結合した細胞は捨てて、残っ
た非結合細胞を更に成長させるために再懸濁させる。

【００９１】明らかに、望ましい親和性が選択要素により用意される限り、多くの他の手法
を正および負の両方の選択のために利用してよい。造血幹細胞哺乳類の血液細胞は異常に多様な範囲の細胞型を提供する。血液細胞の３つの
主な系統には例えばＢ細胞およびＴ細胞のようなリンパ系統、単球、顆粒球およ
び巨核球のような骨髄系、赤血球のような赤血球系が含まれる。造血幹細胞（Ｈ
ＳＣｓ）は、同等な多分化能の娘細胞を製造すると共に上記系統の内少なくとも
二つの細胞を生じることができる。好ましい態様では、当該ＨＳＣｓは３つの主
な血液細胞系統を生じることができる。血液細胞を生じるのに加えて、ＨＳＣｓ
は脳細胞を含む多くの他の細胞型に分化できる（ＥｇｌｉｔｉｓおよびＭｅｚｅ
ｙ（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：４０８
０〜４０８５）。

【００９２】ＨＳＣｓは種々な組織型から単離できる。骨髄細胞はＨＳＣｓの良い源である
。骨髄細胞は例えば腸骨稜、脛骨、大腿骨、背骨および他の骨腔などの骨髄から
得ることがある。ヒト造血幹細胞の他の源には胚卵黄嚢、胎児肝臓、成人末梢血
液を含む胎児および成人の腎臓と血液が含まれる。

【００９３】ＨＳＣｓは、ＨＳＣｓが生じる細胞の型および種々の細胞学的標識で確認でき
る。ＨＳＣｓは度々Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３２４およびＲｈｏｄａｍｉｎｅ１
２３のようなある種の色素を放出する（Ｂｈａｔｉａ他（１９９８）Ｎａｔｕｒ
ｅＭｅｄ．４：１０３８）。そのような色素の染色性は、循環系にある他の細
胞中からＨＳＣｓを確認するのに用いることができる。ある種の細胞標識と反応
する抗体はＨＳＣｓの確認および精製に用いることができる。例えば、ｍＡｂ
ＡＣ１３３は特異的にＨＳＣｓに結合すると考えられている（Ｍｉｒａｇｌｉａ
他（１９９７）Ｂｌｏｏｄ９０：５０１３）。当該Ｔｈｙ‐１分子はラット、
マウスおよびヒトの脳および造血系に存在する高度に保存されたタンパク質であ
る。当該Ｔｈｙ‐１分子はラット、マウスおよびヒトＨＳＣｓで確認されていて
、ＨＳＣｓの確認で有用となりうる（米国特許番号５，９１４，１０８号）。多
くのＨＳＣｓもまたＣＤ３４＋および／またはＣＤ３８＋である（米国特許番号
５，８４０，５８０号）。ＨＳＣｓの集団はしばしば細胞表面標識において幾つ
かの変化を有するようで、正の確認は上記細胞学的標識の少なくとも二つの存在
に基づいて行なわれる。

【００９４】ＨＳＣｓはある種の標識がないことにより同様に他のより分化した細胞型から
識別できる。ＣＤ３，ＣＤ７，ＣＤ８，ＣＤ１０，ＣＤ１４，ＣＤ１５，ＣＤ１
９，ＣＤ２０およびＣＤ３３は全てＨＳＣｓには存在しない。上記標識の幾つか
の不在はＨＳＣｓの確認に信頼性を加える。形態学も上記のようにＨＳＣ識別を
同様に助けることがある。

【００９５】ＨＳＣｓは、形態、ある種の標識の存在、他の標識の不在および推定上のＨＳ
Ｃｓが生じることができる細胞型など複数の特質の集合により同定してよいこと
は認識される。正の確認では上記標識の全ての検出は典型的には必要としない。

【００９６】分化した幹細胞を生じるＨＳＣｓの培養は多くの方法で達成できる。例えば、
細胞は一般的に塩、アミノ酸、ビタミン、抗生物質およびウシ胎児血清から構成
されているＩｓｃｏｖｅ‘ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｅ
ｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）のような明確な濃縮培地中で培養してよい。ハイドロコー
チゾンを補助した培養基は骨髄性細胞を生じる傾向があるが、コルチゾンを欠い
た培養基はＢリンパ球を生じる傾向がある。ＨＳＣｓが赤血球系の細胞に発生で
きることを示すには、種々の従来法が使用できる。例えば、メチルセルロース培
養で培養すると赤血球細胞の形成を刺激することができる(米国特許番号５，８
４０，５８０号および５，９１４，１０８号；Ｍｅｔｃａｌｆ（１９７７）Ｉｎ
：ＲｅｃｅｎｔＲｅｓｕｌｔｓｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ６
１．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ‐ＶｅｒｌａｇＢｅｒｌｉｎ，ｐｐ．１〜２２７)。神経幹細胞神経幹細胞は、以下の基礎的神経系：ニューロン、オリゴデンドログリアおよ
びアストログリアなどの少なくとも一つに分化できる成人または成長神経系の組
織から由来する細胞である。加えて、神経幹細胞は同様な能力を持つ新ＮＳＣｓ
を生じることができる。好ましい態様では、神経幹細胞は多分化能を持ち、基
礎的神経系の多くまたは全ての細胞を生じる。

【００９７】当該基礎的神経系の各々は形態と共に系特異性タンパク質を検出して識別でき
る。ニューロンは例えば、微小管関連タンパク質２（ＭＡＰ２），タウ、ある種
のベータ‐チュブリン（例えば、ＴｕＪ１，ベータ‐チューブリンＩＩＩ型）、
ある種のニューロフィラメントタンパク質（例えば、ニューロフィラメントＬま
たはＭ）、神経特異エノラーゼまたはＮｅｕＮを検出して見分ける。オリゴデン
ドロサイトはガラクトセレブロシダーゼ（ＧａｌＣ）、ＣＮＰａｓｅ、ミエリン
塩基性タンパク質（ＧＦＡＰ）またはＯ４タンパク質を検出して見分ける。アス
トロサイトはグリア繊維酸性タンパク質の存在により見分けることができる。あ
る種のＮＳＣｓはビメンチンまたはネスチンの存在でそれ自身を見分けることが
できる。典型的な検出は、望ましいタンパク質を見分ける抗体を用いる標準免疫
染色手法により行なわれる（Ｖｉｌｌａ他（２０００）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌｏ
ｇｙ１６１：６７〜８４）。上記標識の各々に対する抗体は以下の会社の一つ以
上から入手できる：Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｂｏｈｅ
ｈｒｉｎｇｅｒ‐Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ、ＤａｋｏｐａｔｔｓＡＢ（Ｓｗｅｄｅｎ）。系統特異タンパク質
をコードしている遺伝子の発現は同様に異なる系統の細胞を識別するのに用いて
もよい。遺伝子発現の検出は同じように、インサイチュハイブリダイゼーション
、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション、定量的ｒｔＰＣＲ，ノザーンブロ
ットを含む良く知られている多様な手法により測定できる。

【００９８】ＮＳＣｓを単離および増殖する好ましい方法は以下の公報にて説明されている
：Ｓｎｙｄｅｒ他、米国特許番号５，９５８，７６７号；Ｍｃｋａｙ他、米国特
許番号５，２７０，１９１号；Ｊｏｈｅ，Ｋ．，米国特許番号５，７５３，５０
６号；Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，Ｍ．，米国特許番号５，９６８，８２９号、Ｗｅｉ
ｓｓ他、米国特許番号５，７５０，３７６号。これらの全ては参照により本明細
書中で援用される。

【００９９】一般的に、神経幹細胞は、例えば：ｂＦＧＦ、ＥＧＦ，ＴＧＦ‐アルファ、Ｌ
ＩＦまたはａＦＧＦなど一つ以上の成長因子存在下で増殖、未分化状態で維持さ
れる。好ましい因子はｂＦＧＦまたはＥＧＦである。そのような因子を抜き出す
と異なる系統の細胞に分化させてしまう。系統は環境に依存して形成する。例え
ば、脳に導入されたある種のＮＳＣｓは、各細胞が存在する特有の環境により異
なる脳細胞型の全てを形成することができる。培養において、発育経路は多くの
因子により影響を受ける。例えば、ＣＮＴＦはアストロサイトへの分化を誘発で
き、ＰＤＧＦはニューロンの形成を誘発し、甲状腺ホルモン（Ｔ３）はオリゴデ
ンドログリアル細胞を誘発することができる。

【０１００】好ましい態様では、神経幹細胞は米国特許番号５，９５８，７６７号に記述し
てあるように得られる。この方法はＮＳＣｓを調製する特異な方法として簡単に
明細書にて説明した。そのような方法は多く存在し、この方法の詳細は同様の結
果を与えるように修正することができると考えられる。簡単に言うと、最初に分
離神経細胞の懸濁液を妊娠１５週胎児の終脳から調製する。Ｎ２培地（Ｇｉｂｃ
ｏ）で補強したＦ１２培地を追加したＤｕｌｂｅｃｃｏ'ｓＭｏｄｉｆｉｅｄ
ＥａｇｌｅＭｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）（１：１）の非被膜細胞培養皿にｂＦ
ＧＦおよびヘパリンまたはＥＧＦ添加し、当該懸濁液を植え付ける。サイズが１
０細胞の直径より大きく発育したときに細胞集合を分散する。分散はトリプシン
で行ない、ＮＳＣ細胞懸濁液を成育培地に再度懸濁する。分散した幹細胞はＤＭ
ＥＭ＋ウシ胎児血清中のポリ‐Ｌ‐リジン被覆スライド上に植付けることができ
、分化を助長する。アストロサイト分化は、新生ＣＤ‐１マウス脳の初期分離培
養物と共培養することにより刺激できる。細胞は、細胞分裂を促進する遺伝子を
発現するように形質移入を行なうと、成長因子なしでｉｎｖｉｔｒｏでの細胞
増殖が行うことができる。形質移入細胞を生成する工程は当技術分野では良く知
られている。好ましい態様では、当該細胞を両種指向性複製無能レトロウイルス
ベクターで形質移入し、分裂促進因子遺伝子をウイルスＬＴＲ領域から発現させ
る。好ましくは、細胞分裂を促進する当該遺伝子は神経刺激剤をコードしていな
い。発現させる好ましい遺伝子はｖｍｙｃ、ＳＶ‐４０Ｔ抗原、ラス発癌遺伝子
、ポリオーマラージＴ抗原、ｎｅｕ発癌遺伝子またはそれらの組合せである。好
ましくは、そのような増殖促進遺伝子およびタンパク質は発現されまたはｉｎ
ｖｉｔｒｏで活性であるが、ｉｎｖｉｖｏでは発現は弱く、不活性である。当
該ｖｍｙｃ遺伝子はこの遣り方では自己制御しているように見える。或いは、遺
伝子発現を刺激するにはｉｎｖｉｔｒｏでは因子を必要とする誘発可能プロモ
ーターは使用できる。他の幹細胞ある種の胚芽腫は多くの多分化能細胞型を含有する。ある態様では、それらの
腫瘍から確立した細胞系はＣＮＳ損傷の治療する方法の一部として使用してよい
。胚芽腫から由来した有用な細胞系については説明されている。例えば、ＮＴ２
／Ｔｅｒａ細胞系の細胞は主要神経系統の全てに分化することができる（米国特
許番号５，１７５，１０３号）。

【０１０１】そのような細胞は胚芽腫から上記記載、および米国特許番号５，１７５，１０
３号やＡｎｄｒｅｗｓ（１９８４）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１０３：２８５〜２９３
での一般的方法のいずれかにより単離してもよい。端的に言うと、ヒト奇形癌細
胞系（Ｎｔｅｒａ２／ＣＩ．ＤＩまたはＮＴ２細胞）はレチノイン酸上に濃密な
多層培養物を形成して成長できる。これらの濃密な培養物をリプレートする。小
さく濃密なＮＴ２‐Ｎ細胞を下にある細胞層とゆるやかに会合させる。これらは
容易に移転し濃縮でき、幾つかの平らな混入細胞を有する小さな円状相で光る細
胞の培養物を生じる。ＮＴ２‐Ｎ細胞は、シトシンアラビノシッドのような有糸
分裂阻害剤との組合せで培養すると更に濃縮できる。望ましい円状細胞はこの処
理に抵抗性があり、平らな細胞は増殖しなかった。神経発育経路への傾向がある
ＮＴ２‐Ｎ細胞の濃縮物は抗‐ＮＦ‐Ｌ抗体（低分子量の神経細糸タンパク質）
で染色するが、非分化ＮＴ２細胞（平らな細胞）はケラチン８や１８と反応する
Ｃａｍ５．２に染色する。

【０１０２】非癌胚組織は同様に幹細胞の源である。早期胚細胞は分化全能で、全ての成人
器官を生じることができる。その結果、そのような細胞は培養すると分化全能ま
たは高度な多分化能の幹細胞を与えることがある。胚幹細胞はＣＮＳ損傷を治療
する器用な方法の一部として使用することがある。培養条件によりこれらの細胞
は結局、より明確な細胞型およびある種の最終的に分化した細胞型を生じること
がある。Ｔｈｏｍｓｏｎ他（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２８２：１１４５〜１
１４７；Ｅｖａｎｓ他（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ２９２：１５４；Ｍａｒｔｉ
ｎ，Ｇ．（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８：
７６３４などで説明されているように、胚幹細胞を得て培養してよい。４．５投与細胞の投与および他の処置は種々の方法で実施してよく、その方法は各成分で
同じである必要はない。一般的には、当該処置が化学化合物であるとき、当該分
子を静脈内、経口または大脳内（例えば、脳室内、鞘内または槽内または脳に直
接）などの既知投与経路で投与することができる。用量は投与の方法に依存して
変化してよい（表２参照）。ラットで決定した用量はヒト治療では例の如く増加
させる。使用する際の規準は送達の方法に依存する。当該刺激剤を全身送達する
のであれば（例えば、経口または静脈内）、規準は体重で行い、代表的なラット
は３００ｇで代表的なヒトは７０ｋｇである。当該化合物が脳脊髄液に送達する
場合であれば（例えば、槽内、脳室内）、規準は脳の表面積で行なう。代表的な
ラット脳の表面積は１ｃｍ²で、脳表面のひだに埋もれた種々なひだの全てを計
算するか或いはしないかに依存するが、代表的なヒト脳は１０００〜１０，００
０ｃｍ²である。化合物が脳組織に伝達されるのであれば、規準は脳の質量によ
り行なわれる。代表的なラットは２ｇの脳を持ち、一方代表的なヒトの脳は２ｋ
ｇである。そこで、ラットで０．５μｇの単回処置を槽内に与えると効果があれ
ば、ヒト患者であれば０．５ｍｇを槽内へ注射すれば効果がでることになる。当
然正確な用量は患者の体重および他の基準に従って調整する。３つの全ての一般
的投与経路についての効果用量は脊髄または脳組織への投与であれば０．００１
〜１０００ｍｇの範囲である。好ましい態様では、当該用量は０．０１〜１００
ｍｇ、０．１ｇ〜１０ｍｇまたは０．５〜５ｍｇの範囲となるだろう。

【０１０３】表２：細胞および刺激剤の用量における規準

【０１０４】

【表２】

【０１０５】化合物は単回で投与してもよく、またはより少ない用量の一連に分けてもよい
。例えば槽内投与は、例えば槽内投与は、単回注射を例えば損傷後６時間に投与
、一組の注射を例えば損傷後２４時間および４８時間後に投与、または必要であ
れば例えば０．１ｍｇ／注射の一連の注射または１ｍｇの注射週２回（例えば、
３〜４日毎に）を虚血エピソードの後少なくとも６時間で始めた治療計画に従っ
て行なう事ができる。治療方式は数週間続くことがある。

【０１０６】ある態様では、当該細胞は好ましくは直接卒中の腔、例えば脳室内、鞘内また
は槽内などの脊髄液に投与する。当該細胞は生物活性分子も含有できる製薬学上
許容できる液体媒質中に入れて運ばれる。その代わりとして、当該細胞は（単独
または刺激と共に）発作腔または脳を漬けている脊髄液（鞘内または槽内投与）
へ投与できる。細胞は同じように損傷区域を取り囲む脳の領域に注射することも
あり、細胞は全身的に与えることもあるが、これである種の幹細胞が脳内の適切
な部位に移動する能力を与える。当該細胞を卒中の腔、脳の室または脳組織中に
注射されるのであれば患者の頭部は標準定位固定性枠に固定し、細胞の投与部位
は標準ＣＴまたはＭＲＩスキャンで位置を定める。小内径の孔を頭蓋骨にドリル
で開け、細胞を望ましい位置に注射器を用いて注射する。細胞は表２に詳細を書
いたような投与の方法によって規準化する。一般的には、全体で１０⁶〜１０¹²
の細胞を投与するが、好ましくは１０⁷〜１０¹¹および更に好ましくは１０⁸〜１
０¹⁰である。複数細胞投与も用いることができるが、一般的には少なくとも２〜
７日間を空ける。

【０１０７】細胞の投与および治療はどこにおいても、好ましくは傷害後の数時間または数
日から数週間または卒中後数ヶ月実施するのが好ましい。好ましい態様では、投
与は傷害が起こってから少なくとも６，１０，１２または２４時間に実施する。
細胞および神経刺激剤の両方についての正確な用量は特有な必要性と患者の特質
に応じて医療実施者が調整するのは予期される。一般的には最適の用量は効果の
面において十分で、過剰な炎症反応を刺激するのを避ける最低限で対抗増殖性で
ありうることが望ましい。炎症反応の程度を測定すれば、その服用量の程度が適
した効果を与えるには多すぎることが決定できるだろう。本明細書に示した投与
の方法は、用量レベルの正確な制御および調整ができ、細胞や刺激剤が適用され
た範囲を慎重に制御できるので好まれる。好ましい態様では、神経刺激は投与し
た細胞の一つ上に含有されている導入遺伝子からは生産されない。

【０１０８】他の望ましい化合物は当該細胞および神経刺激剤と共に投与してもよい。例え
ば、免疫抑制剤および抗生物質は移植拒絶および感染のそれぞれに有効である。
更に、上で検討したようにこれらの型の化合物は追加的に有利な効果を示す。

【０１０９】本明細書で説明する本発明の細胞および生物活性因子を被験者、特にヒトの被
験者に投与する通常の方法には、被験者の目標部位への細胞および／または神経
刺激剤の注射または移植が含まれる。本発明の当該細胞および因子は被験者へ注
射または移植による導入を容易にする送達用装置に挿入することができる。その
ような送達用装置には細胞や液体をレシピエント被験者の体に注射するカテーテ
ルなどの管が含まれる。好ましい態様では当該管には例えばシリンジのような針
が付いており、それを通じて本発明の細胞を被験者の望ましい位置に導入できる
。本発明の細胞および因子は異なる形状で例えばシリンジのような送達用装置に
挿入することができる。例えば、当該細胞または因子が伝達用装置に含有されて
いる場合には、溶液に懸濁するかまたは支持体マトリックスに埋め込むことがで
きる。本明細書で用いる場合、用語“溶液”には本発明の細胞が生きたままでい
られる医薬品許容担体または希釈剤が含まれる。製薬学上許容できる担体および
希釈剤には食塩水、緩衝水溶液、溶媒および／または分散媒質が含まれる。その
ような担体および希釈剤の使用は当技術分野ではよく知られているものである。
当該溶液は好ましくは滅菌したもので、液体である。好ましくは、当該溶液は製
造および保存において安定であり、細菌および真菌などの微生物の混入作用に対
して例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロ
サルおよびその類の使用で保存されている。本発明の溶液は、本明細書で説明し
てあるような前駆細胞および必要があれば上に連ねた他の成分を医薬品許容担体
または希釈剤に組み入れることができ、その後にろ過での除菌を行なう。

【０１１０】場合により、細胞は支持マトリックスに載せて投与してもよい。細胞を組み込
みまたは埋め込むことができる支持マトリックスは、レシピエントに適合し分解
してもレシピエントに無害なものである。天然および／または合成生分解性のマ
トリックスがそのようなマトリックスの例である。天然生分解性マトリックスに
は、例えば哺乳類由来の血しょう凝塊およびコラーゲンマトリックスが含まれる
。合成生分解性マトリックスには、ポリ無水物、ポリオルトエステルおよびポリ
乳酸などの合成高分子が含まれる。他の合成高分子および細胞をこれらのマトリ
ックスに組み込みまたは埋め込み方法は当技術分野では公知である。参照、例え
ば米国特許番号４，２９８，００２号および米国特許番号５，３０８，７０１号
。これらのマトリックスは、ｉｎｖｉｖｏでの細胞の支持体および保護を行な
う。

【０１１１】本発明の細胞および神経刺激剤は同時に医薬品組成物に入れて投与することも
ある。適当な組成物には、通常全身または局所投与薬に使用される全ての組成物
が含まれる。医薬品許容担体は本質的に不活性で、活性成分と作用せずまたは細
胞生育を妨害しないものである。適した不活性担体には水、アルコール、ポリエ
チレングリコール、プロピレングリコールおよびその類が含まれる。

【０１１２】本発明の医薬品組成物を調製するには、活性成分としての特有な神経刺激およ
び細胞を医薬品許容担体と組み合わせるが、担体は投与に望ましい製剤の形状に
より幅広い種々な形状をとることもある。これらの医薬品組成物は、特に経皮投
与または非経口注射に適した単一剤形が望ましい。懸濁液、シロップ、エリキシ
ル剤および溶液のような経口液体製剤の場合は、例えば水、グリコール、油、ア
ルコールおよびその類；または粉末、丸薬、カプセルおよび錠剤の場合では澱粉
、砂糖、カオリン、滑沢剤、結合剤、崩壊剤およびその類などの固体担体など通
常の医薬品媒質はいずれも使用してもよい。非経口用組成物には、当該担体は通
常滅菌水を少なくとも大部分として含み、例えば溶解性および細胞生育を補助す
るための他の成分をふくむことがある。他の成分には抗酸化剤、粘度安定剤、緩
衝液、保存剤が含まれる。望めば、更なる成分、例えば抗炎症剤、抗菌剤、抗真
菌剤、消毒薬、ビタミン、抗生物質を組成物の中に組み入れてもよい。

【０１１３】抗酸化剤の例にはブチル化ヒドロキシトルエン、ブチル化ヒドロキシアニソー
ル、没食子酸プロピル、クエン酸およびエトキシキンを含み；キレート化剤の例
としてはエデト酸ジナトリウムおよびエタンヒドロキシジリン酸が含まれる；緩
衝液の例はクエン酸、クエン酸ナトリウム、ホウ酸、硼砂およびリン酸水素二ナ
トリウムが含まれる；保存料の例としてはパラヒドロキシ安息香酸メチル、パラ
ヒドロキシ安息香酸エチル、デヒドロ酢酸、サルチル酸および安息香酸である。
注射用溶液は例として担体は食塩水、グルコース溶液または食塩水とグルコース
溶液の混合液を含む。注射用懸濁液を調製してもよいが、それには同じように適
した液体担体、懸濁剤およびその類を使用することがある。同様に固体状製剤も
含まれるが、使用直前に液状製剤に変形させるようにする。経皮投与に適した組
成物においては、担体は場合により透過促進剤および／または適した湿潤剤を含
み、場合によっては皮膚に顕著な害を及ぼさない添加剤であればいかなる性質の
適当な添加剤の少量と組み合わせる。

【０１１４】投与の容易性および服用量の均一性のために対象組成物を服用量単位剤形に処
方するのが特に有用である。本明細書および請求項で用いる服用量単位剤形は単
位服用量として物理的に別個の単位を称し、各単位は必要とされる医薬品担体と
共同で望ましい治療効果を生み出すように計算した活性成分の前もって決定した
量を含有する。そのような服用量単位剤形はカプセル、注射用溶液または懸濁液
、茶さじ量、食さじ量およびその類およびそれを多数に分離したものである。

【０１１５】本発明の方法において用いる特別な組成物は、神経刺激剤をリポソーム含有組
成物中に処方したものである。リポソームは、例えばホスファチジルコリン、エ
タノールアミンとセリン、スフィンゴミエリン、カルジオリピン、プラスマロー
ゲン、フォスファチジン酸およびセレビオシドなどの極性脂質のような両親媒性
分子で形成する人工的小胞である。リポソームは、適した両親媒性分子を水また
は水溶性溶液で膨潤させ、通常水溶性物質で互いに分離している多くの二重層か
らなる多層構造の液晶を形成する（粗リポソームと称する）。水溶性物質をカプ
セル化している単一二重層からなることで知られている他の型のリポソームは単
一ラメラ小胞と称する。水溶解性物質は脂質が膨潤する間に水相中に含まれれば
、それらは脂質二重層の間の水相に捕集されている。

【０１１６】水溶性活性成分は分子層間の水空間に捕集される。有機模倣のような神経刺激
剤の脂質可溶性活性成分は脂質層に支配的に組み込まれるが、極性の頭部はその
層から水空間に突き出ている。これらの化合物のカプセル化は多くの方法により
達成される。通常多く使用されている当該方法は、有機溶媒から蒸発法でリン脂
質の薄膜をフラスコの壁でキャスティングすることを含む。本膜を適した水溶性
媒質に分散させると、多重層リポソームが生成する。適切な超音波を当てると粗
リポソームはより小さな同じような封鎖された小胞が形成する。

【０１１７】水溶性活性成分は通常化合物の水溶液を伴ったキャスト膜を分散することで組
み入れられる。非カプセル化化合物はその後遠心分離、クロマトグラフィー、透
析または他の当技術分野既知の操作で除去する。脂質可溶活性成分は通常膜をキ
ャスティングする前にリン脂質を入れた有機溶媒中に溶解して組み入れる。脂質
層中の材料の溶解度が限界を越えずまたは存在する量が脂質に結合する量より多
くなければ、上記方法で調製したリポソームは通常脂質二重層中に結合した材料
の殆どを含有することになる；非カプセル化材料のリポソームからの分離は必要
としない。

【０１１８】神経刺激剤を処方した形のリポソームを調製する特に便利な方法は、参照によ
り本明細書に援用している欧州特許‐Ａ‐２５３，６１９に記載された方法であ
る。本方法では、活性成分をカプセル化した単一二重層リポソームは、有機媒質
中に脂質成分を溶解し、加圧下で脂質成分の有機溶液を水溶性成分中に注入する
一方で、高速のホモジナイザーまたは混合方法にて有機および水溶性成分を攪拌
すると、リポソームが自然に形成して調製される。

【０１１９】カプセル化した神経刺激剤を含有する単一二重層リポソームは細胞と混合でき
、直接使用するか、局所投与用に適切な製薬学上許容できる担体中に使用するこ
とができる。リポソームの粘度は、例えばキサンタンガム、ヒドロキシプロピル
セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびその混合物のような一
つ以上の適切な増粘剤を添加して増加できる。水溶性成分は水単独からなるか、
または電解質、緩衝系および例えば保存剤などの他の成分を含有することもある
。使用できる適切な電解質には、アルカリ金属およびアルカリ土類金属塩のよう
な金属塩が含まれる。好ましい金属塩は塩化カルシウム、塩化ナトリウムおよび
塩化カリウムである。電解質の濃度はゼロから２６０ｍＭ、好ましくは５ｍＭか
ら１６０ｍＭである。水溶性成分は有機成分を注入するとき激しい乱れを起こし
均質化を生じるのに適応することができる適当な容器に入れる。二成分の均質化
は当該容器内で遂行することができるが、それに代わるものとしては、水溶性お
よび有機成分を容器外に設定した混合機に別々に注入して行なってもよい。後者
の場合、リポソームは混合機の中で形成し収集用の他の容器に移すことになる。

【０１２０】有機成分は、例えばエタノール、グリセロール、プロピレングリコールとポリ
エチレングリコールおよび溶媒に可溶な適切したリン脂質などの適切な無毒性、
製薬学上許容できる溶媒からなる。使用できる適切なリン脂質は、例えばレシチ
ン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノール
アミン、ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルコリンおよびホスフ
ァチジルグリセロールである。他の親油性添加剤は、リポソームの特質を選択的
に修飾するために使用することがある。そのような他の添加剤にはステアリルア
ミン、ホスファチジン酸、トコフェロール、コレステロールおよびラノリン抽出
物が含まれる。

【０１２１】加えて、ホスフォリピッドの酸化を防止できる他の原料を有機成分に加えるこ
とがある。そのような他の原料にはトコフェロール、ブチル化ヒドロキシアニソ
ール、ブチル化ヒドロキシトルエン、パルミチン酸アスコルビルおよびオレイン
酸アスコルビルが含まれる。安息香酸、メチルパラベンおよびプロピルパラベン
などの保存剤を添加してもよい。

【０１２２】導入手段は同じようにレチャージアブルまたは生分解性装置で提供してもよい
。種々な徐放性高分子の装置が開発されており、近年ｉｎｖｉｖｏでタンパク
質性生物薬剤を含む薬剤の制御送達につき試験が行なわれた。生分解性および非
分解性高分子を含む生体適合性高分子（ヒドロゲルを含む）は、特有な目的部位
において生物活性因子の持続放出用の移植物を形成するのに用いることができる
。移植物のある態様の重要な特徴は、高分子組成物および形態を操作することで
達成できる治療薬の直線的放出が可能であることである。モノマー組成または重
合手法を選択することで、水の量、多孔性および得られる透過特性が調整できる
。形状、サイズ、高分子および移植方法の選択は、治療する異常および個々の患
者の反応に従った個々の基礎により決定できる。そのような移植物の生成につい
ては当技術分野では一般的に知られている。参照、例えば、ＣｏｎｃｉｓｅＥ
ｎｃｙｌｏｐｅｄｉａｏｆＭｅｄｉｃａｌ＆Ｄｅｎｔａｌｍａｔｅｒ
ｉａｌｓ，ＤａｖｉｄＷｉｌｌｉａｍｓ編（ＭＩＴＰｒｅｓｓ：Ｃａｍｂｒ
ｉｄｇｅ，ＭＡ，１９９０）；およびＳａｂｅｌ他、米国特許番号４，８８３，
６６６号。

【０１２３】移植の他の態様では、細胞は移植できる中空繊維またはその類中にカプセル化
する。そのような繊維は前に引き伸ばし、次いで細胞源を負荷することができる
（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒ他、米国特許番号４，８９２，５３８号、Ａｅｂｉｓｃｈ
ｅｒ他、米国特許番号５，１０６，６２７；Ｈｏｆｆｍａｎ他（１９９０）Ｅｘ
ｐｔ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１１０：３９〜４４；Ｊａｅｇｅｒ他（１９９０）
Ｐｒｏｇ．ＢｒａｉｎＲｅｓ．８２：４１〜４６；およびＡｅｂｉｓｃｈｅｒ
他（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｃｈ．Ｅｎｇ．１１３：１７８〜１８３）、また
は細胞周囲に高分子被膜を形成の作用をする高分子と共に押出すことができる（
Ｌｉｍ米国特許番号４，３９１，９０９号；Ｓｅｆｔｏｎ米国特許番号４，３
５３，８８８号、Ｓｕｇａｍｏｒｉ他（１９８９）Ｔｒａｎｓ．Ａｍ．Ａｒｔｉ
ｆ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｏｒｇａｎｓ３５：７９１〜７９９；Ｓｅｆｔｏｎ他（１９
８７）Ｂｉｏｌｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．２９：１１３５〜１１４３；お
よびＡｅｂｉｓｃｈｅｒ他（１９９１）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ１２：５０
〜５５）。そのようなカプセル化細胞はこれから神経刺激剤と組合せることがで
きる。

【０１２４】便利にするには神経刺激剤および細胞をキットに一括すれば望ましいことが予
想される。キットには、用量サイズ特異なアンプルまたは細胞画分および／また
は神経刺激剤が含まれる。キットは同じように共同投与の成分を投与するのに用
いる装置も含有する。そのような装置は上記した通りである。ある態様では、患
者から得た細胞を培養して再度患者に投与する場合、当該キットはそこから幹細
胞を培養する細胞試料を患者から得る際の装置を含む。

【０１２５】ある態様では、本発明の実施者は他に指示がなければ当技術範囲の細胞生物学
、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ
および免疫学など当技術分野内である、従来手法を使用してもよい。そのような
手法は文献に記載されている。参照、例えば、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉ
ｎｇＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２ｎｄＥｄ．，Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇｈ
ａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ：１９８９）；ＤＮＡＣｌｏ
ｎｉｎｇ，ＶｏｌｕｍｅｓＩおよびＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５
）；ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ
編、１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓ他、米国特許番号４，６８３，１９５；Ｎｕｃｌ
ｅｉｃＡｃｉｄｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ
．Ｈｉｇｇｉｎｓ編１９８４）；ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＡｎｄＴｒ
ａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８
４）；ＣｕｌｔｕｒｅＯｆＡｎｉｍａｌＣｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈ
ｎｅｙ，ＡｌａｎＲ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚ
ｅｄＣｅｌｌｓＡｎｄＥｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬＰｒｅｓｓ，１９８６）
；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＧｕｉｄｅＴｏＭｏｌｅｃ
ｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；専門書、ＭｅｔｈｏｄｓＩｎＥｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｇ
ｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒＶｅｃｔｏｒｓＦｏｒＭａｍｍａｌｉａｎＣ
ｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒａｎｄＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７、
ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏ
ｄｓＩｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４ａｎｄ１５５（Ｗｕ
他、編）、ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓＩｎＣｅｌｌ
ＡｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ
編、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；Ｈａｎｄｂｏ
ｏｋＯｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ
ｓＩ〜ＩＶ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８
６）；ＭａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇｔｈｅＭｏｕｓｅＥｍｂｒｙｏ，（Ｃｏ
ｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，Ｃｏ
ｌｄｓｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）。

【０１２６】本発明はこれまで一般的説明をしているが、ある側面の解説および本発明の態
様の目的のみを含んだ以下の実施例を参照すればより容易に理解しやすいだろう
が、本発明をこれに限定することを意図するものではない。５．実施例実施例１：卒中の回復を促進する槽内神経幹細胞（ＮＳＣ）および成長因子。

【０１２７】本実施例では、ラットでの卒中回復のモデルにおいて、マウス胎児神経幹細胞
（ＮＳＣ）を塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）と共にまたは無しで槽内投
与を行った。体重３００〜３５０グラムの雄Ｓｐｒａｕｇｅ‐Ｄａｗｌｅｙラッ
トを手術の前一週間馴化した。抗生物質のセファゾリンナトリウム（４０ｍｇ／
ｋｇ，腹腔内）を卒中手術の１日前に与えた。卒中手術の日に、動物は２％ハロ
タンを入れた酸化窒素／酸素（２：１）混合物で麻酔をかけた。局所脳梗塞（卒
中）は脳動脈中央にて近位電気凝固法を以前記載のごとく起こした（Ｋａｗａｍ
ａｔａ他．（１９９９）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１５８，８９〜９６；Ｔａｍ
ｕｒａ他（１９８１）Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．ＢｌｏｏｄＦｌｏｗＭｅｔａｂ．１
，５３〜６０）。特定的には、当該動脈は顎骨弓または顔面神経の横断を取り出
すことなく臭覚経路の近位から下方脳静脈にかけて強く閉じた。本手法で脳皮質
背側面および下の線条体において、強く再現性ある梗塞または細胞死の領域が生
じる。手術直後、動物にセファゾリンナトリウム（４０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）を
もう一度注射した。それから動物は麻酔から覚ました。

【０１２８】発作手術後２４時間に、動物には以下のいずれかを槽内注射した：（１）賦形
剤、（２）ＮＳＣ（１０⁶細胞）、（３）ｂＦＧＦ（０．５μｇ）または（４）
ＮＳＣ＋ｂＦＧＦ。ハロメタン麻酔下、大槽への経皮注射を通して全量５０μｌ
を槽内注射した。これと同じ手順を２日後に繰り返し、動物は卒中後１日目およ
び３日目に処置を受けることになる。免疫抑制剤のシクロスポリンを実験の期間
中１０ｍｇ／ｋｇ腹腔内に投与した。

【０１２９】当該手順で起こした脳梗塞は対側性後肢および前肢の感覚・運動障害を起こす
。卒中の次の月、幾つかの神経系試験を対側性四肢の感覚・運動機能を評価する
ために行った。これらの試験には視覚、触覚、固有受容およびヒゲへの刺激に応
じて四肢を卓上に載せる動物の能力を試験する後肢および前肢動作試験を含まれ
る。加えて、動物の尾を持って卓上でつるしたときに右左への好みを測定して行
なう身体揺動試験。最後に、狭いガラス円筒の内部を探るために立ち上がるとき
において、自然に前肢を用いる際の動物の性癖を測定する自発的四肢使用試験を
行った。前肢および後肢動作試験は自発的四肢使用試験と共に皮質性および線条
体機能を反映している。身体揺動試験は主に線条体機能を測定する。

【０１３０】これらの試験結果は図１に示した。パネル（Ａ）およびパネル（Ｂ）は影響を
受けた前肢および後肢の動作活性を示す（脳における卒中側とは反対側）。パネ
ル（Ｃ）は身体揺動試験およびパネル（Ｄ）は自発的四肢使用試験を示す。各々
の場合、標準の挙動は手術の前日（−１日目）に得られたデータで示す。各事例
で、動物は手術の日には顕著な異常挙動を示した。それから僅かに自然な回復が
あったが不完全であった。図１は、四肢動作で全ての三つの処置：ＮＳＣ，ｂＦ
ＧＦおよび組合せがプラセボに比べ回復を顕著に促進した。自然四肢使用試験に
おいても同様な傾向があった。プラセボとの比較で処置が差が見えなかったのは
身体揺動試験であった。加えて、有意差はないがＮＳＣおよびｂＦＧＦ単独群に
比べ組合せの群で機能のより良い向上の傾向が見られた。

【０１３１】卒中の一ヶ月後、動物を屠殺し、脳を取り出して切断し、Ｈ＆Ｅで染色した。
梗塞の容量を以前記載の画像分析で測定した（Ｋａｗａｍａｔａ他（１９９６）
JＪ．Ｃｅｒｅｂ．ＢｌｏｏｄＦｌｏｗＭｅｔａｂ．１６，５４２〜５４７
；Ｋａｗａｍａｔａ他（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４
，８１７９〜８１８４）。群間に梗塞の容積で優位差は見られなかったが、ＮＣ
Ｓを受けた群で梗塞が僅かにより小さな容量への傾向があった。移植を行った当
該幹細胞はｌａｃＺレポーター遺伝子を含有し、β‐ガラクトシダーゼを発現す
る。Ｘ‐ｇａｌ組織化学で、これらの細胞につき移植後の存在位置を検査した。
まさに、当該細胞が大槽中に置かれた部位から右半球の局部卒中を取巻く位置に
移動していた。

【０１３２】要約すると、本実験は卒中の1日目に槽内に投与されたＮＳＣおよび／または
ｂＦＧＦは、対側性四肢の感覚・運動の回復を著しく促進したことを示した。こ
の回復は主として皮質機能を反映する試験に限られている。群間での梗塞容積で
は著しい差は見られなかったことから、ＮＳＣおよびｂＦＧＦは細胞死の防止以
外の他機構を通して回復促進効果を起こしていることを示している。これらの機
構には脳の損傷を受けない部分で新しい接続の確立が含まれているだろう。更に
はこの最初の実験で、ＮＳＣおよびｂＦＧＦの組合せは単独処置より少し優れて
いるように見えた。実施例２：ＮＳＣの直接的大脳内投与およびｂＦＧＦの槽内投与はラット卒中モ
デルで回復を促進する。

【０１３３】第二の実験では、ＮＳＣを直接脳および局所卒中周囲の組織へ注射した。ｂＦ
ＧＦは前と同じく槽内注射した。この実験では卒中後の1日目に一回のみＮＳＣ
またはｂＦＧＦ投与を行った。これらの条件下で、単独処置と比較してＮＳＣ＋
ｂＦＧＦの優位性が明らかに観察された。本実験では、動物は手術前一週間馴化
した。加えて、足伸長試験（下記参照）を手術前１０日間追加の試験につき訓練
した。前の如く、手術前にセファゾリンナトリウム（４０ｍｇ／ｋｇ，腹腔内）
を与えた。手術当日、以前記述のごとく近位脳動脈中央の電気凝固を行なった（
Ｋａｗａｍａｔａ他（１９９６）Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．ＢｌｏｏｄＦｌｏｗＭｅ
ｔａｂ．１６，５４２〜５４７；Ｋａｗａｍａｔａ他（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４，８１７９〜８１８４；Ｋａｗａｍａｔａ他（１
９９９）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏ．１５８，８９〜９６）。手術後、セファゾリンナ
トリウム、４０ｍｇ／ｋｇ腹腔内の注射を行った。

【０１３４】卒中1日目、動物は以下のいずれかを受けた：（１）賦形剤の注射を梗塞周辺
組織そして賦形剤の注射を大槽に、（２）ＮＳＣ（１０⁶細胞）を梗塞周辺組織
そして賦形剤を大槽に、（３）賦形剤を梗塞周辺組織にそしてｂＦＧＦ（０．５
μｇ）を大槽にまたは（４）ＮＳＣ（１０⁶細胞）を梗塞周辺組織およびｂＦＧ
Ｆ（０．５μｇ）を大槽への組合せ。

【０１３５】これらの注射は２％ハロメタン麻酔下で各２５μｌ容量を行った。ＮＳＣは局
所梗塞の縁の線条体に注射した。ｂＦＧＦは以前に記述の如く経皮的に大槽（槽
内注射）へ注射した（Ｋａｗａｍａｔａ他．（１９９６）Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌ
ｏｏｄＦｌｏｗＭｅｔａｂ．１６，５４２〜５４７；Ｋａｗａｍａｔａ他（
１９９７）Ｐｒｏ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４，８１７９〜８１８４；Ｋ
ａｗａｍａｔａ他（１９９９）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１５８，８９〜９６）。
ラットは同じように免疫抑制剤であるシクロスポリン（１０ｍｇ／ｋｇ，腹腔内
、１日当たり）を実験の期間中受けた。

【０１３６】以前のように、卒中後の次の月に幾つかの挙動試験を行った。これらの試験に
は実施例１で説明したように前肢および後肢動作試験、身体揺動試験および自発
的四肢使用試験が含まれる。動物はこの試験につき卒中手術の前に訓練し、そし
て実験の最後に一回試験を行った。本試験は損なわれていない前肢（対側性）で
ケージの柵を通して食物ペレットを捉えて食する能力を試みた。普通動物はこの
作業をなす際は約１００％の正確さを有する。卒中の後では、これが１０％まで
低下する。

【０１３７】これらの挙動試験の結果を図２および図３に示した。再度、全ての３処理群：
ＮＳＣ，ｂＦＧＦおよびＮＳＣ＋ｂＦＧＦの組合せにおいて、プラセボに比較し
て前肢および後肢動作試験における回復は優位を示した。再度、組合せ群におい
て最善の回復傾向が見られた。身体揺動試験では、ＮＳＣ処置だけがプラセボよ
り優位性を示さなかったが、ｂＦＧＦおよび組合せ群は示した。自発的四肢使用
試験では、組合せ群のみが改善結果への傾向を示した。最後に、足伸長試験では
組合せ群がどの単独処置に比較しても優位性を示すように見えた。これらの脳の
組織学的評価はまだ結果は出ていない。

【０１３８】要約すると、本実験ではＮＳＣを直接的に局所卒中周囲の組織に注射した。ｂ
ＦＧＦは槽内に投与した。これらの処置の各々で、単独送達のときは幾つかの試
験で改善した挙動の結果を得た。各試験において、組合せ処置は単独処置より良
い結果が見られた。これは特に自発的四肢使用および足伸長試験において明らか
であった。本実験は幹細胞および成長因子の組合せが卒中回復において単独処置
より優位であるという見解を支持した。上記の実施例は両方ともＮＳＣおよび成
長因子の一用量のみを用いて行った。更なる実験はこの相互作用の用量反応特性
を明確にするために実施している。均等物当業者であれば、本明細書で説明した本発明の特定な態様に対する多くの同等
物を認識するか或いは日常的実験にすぎないものを用いて確認ができる。そのよ
うな同等物は以下の請求項で網羅する積りである。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１では実施例１からのデータをグラフ形式で示す。図１Ａはラット卒中モデルにおける前肢動作試験の結果を表したグラフである
。ラットはｂＦＧＦのみ、幹細胞のみ、ｂＦＧＦと幹細胞または対照賦形剤のみ
で処置した。図１Ｂはラット卒中モデルにおける後肢動作試験の結果を説明するグラフであ
る。図１Ｃはラット卒中モデルにおける身体揺動試験の結果を説明するグラフであ
る。図１Ｄはラット卒中モデルにおける自発的四肢使用試験の結果を示すグラフで
ある。

【図２】図２は実施例２からのデータをグラフ形式で示す。図２Ａはラット卒中モデルにおける前肢動作試験の結果を描いたグラフである
。ラットはｂＦＧＦのみ、幹細胞のみ、ｂＦＧＦと幹細胞または対照賦形剤のみ
で処置した。図２Ｂはラット卒中モデルにおける後肢動作試験の結果を説明するグラフであ
る。図２Ｃはラット卒中モデルにおける体躯揺動試験の結果を説明するグラフであ
る。図２Ｄはラット卒中モデルにおける自発的四肢使用試験の結果を示したグラフ
である。

【図３】図３はラット卒中モデルにおける足伸長試験の結果を描いたグラフである。

【図４】図４はｂＦＧＦ（配列番号１〜３）の変異体のアミノ酸配列を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 38/27 Ａ６１Ｐ 25/00 45/00 25/14 48/00 25/16 Ａ６１Ｐ 25/00 25/28 25/14 Ａ６１Ｋ 37/02 25/16 37/24 25/28 37/36 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者フィンクルスタイン，セス・ピーアメリカ合衆国マサチューセッツ州02494，ニーダム，ハンネウェル・ストリート 308エイ (72)発明者スナイダー，エヴァン・ワイアメリカ合衆国マサチューセッツ州02130，ジャマシア・プレーン，ヒルクロフト・ロード 22 Ｆターム(参考） 4C084 AA02 AA03 AA13 AA19 BA35 BA44 CA62 DA12 DA18 DB52 DB53 DB54 DB55 DB58 DB59 DB60 DB61 MA17 MA22 MA23 MA24 MA28 MA35 MA36 MA37 MA41 MA43 MA52 MA63 MA66 MA67 NA06 NA14 ZA012 ZA152 ZA162 ZA222 4C087 AA01 AA02 AA03 BB34 BB44 BB57 BB65 CA04 MA17 MA22 MA23 MA24 MA35 MA36 MA37 MA41 MA43 MA52 MA63 MA66 MA67 NA06 NA14 ZA01 ZA15 ZA16 ZA22

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】細胞；および神経刺激剤の投与を含む、患者に細胞と神経刺激剤の共同投与でＣＮＳ損傷の影響を改善す
る、中枢神経系（ＣＮＳ）損傷被験者を治療する方法。
【請求項２】細胞がニューロン、オリゴデンドログリア、アストログリアお
よび／またはミクログリアを生じることができる、請求項１の方法。
【請求項３】細胞が幹細胞である、請求項１の方法。
【請求項４】細胞が神経幹細胞である、請求項１の方法。
【請求項５】細胞が造血性幹細胞である、請求項１の方法。
【請求項６】細胞がｖｍｙｃ遺伝子を発現し、ｉｎｖｉｔｒｏで発現され
る前記遺伝子は幹細胞を増殖し、細胞への移植後のｉｎｖｉｖｏでは前記遺伝
子が弱く発現されるのでｉｎｖｉｖｏにおける細胞増殖の速度は減少するか終
止する、請求項１の方法。
【請求項７】細胞が患者から得た細胞に由来する、請求項１の方法。
【請求項８】神経刺激剤が生物活性ポリペプチドを含む、請求項１の方法。
【請求項９】生物活性ポリペプチドがポリペプチド成長因子を含む、請求項
８の方法。
【請求項１０】線維芽細胞成長因子ファミリーメンバー、ニューロトロフィ
ンファミリーメンバー、インスリン様成長因子ファミリー、毛様体神経栄養性成
長因子ファミリーメンバー；ＥＧＦファミリーメンバー、ＴＧＦβファミリーメ
ンバー、白血病阻止因子（ＬＩＦ）；オンコスタチンＭ，インターロイキン‐６
、インターロイキン‐１１；血小板由来成長因子ファミリーのメンバーおよびＶ
ＥＧＦファミリーメンバーよりなる群から前記のポリペプチド成長因子を選択す
る、請求項９の方法。
【請求項１１】ポリペプチド成長因子が；ｂＦＧＦ，ａＦＧＦ，ＮＧＦ，Ｂ
ＤＮＦ，ＮＴ‐３，ＯＰ‐１，ＦＧＦ‐３，ＦＧＦ‐４，ＦＧＦ‐５およびＥＧ
Ｆよりなる群から選択するポリペプチドである、請求項９の方法。
【請求項１２】ポリペプチド成長因子がＦＧＦファミリーのメンバーである
、請求項９の方法。
【請求項１３】ポリペプチド成長因子が、配列番号１〜３の一つで示すｂＦ
ＧＦポリペプチドとの同一性が少なくとも３０％のポリペプチドである、請求項
９の方法。
【請求項１４】ポリペプチドが配列番号１〜３の一つで示したｂＦＧＦポリ
ペプチドと同一である、請求項１２の方法。
【請求項１５】神経刺激剤が、以下の群：神経伝達物質、神経伝達物質アゴ
ニスト、神経伝達物質アンタゴニスト、分化因子、ガイダンス分子および経頭蓋
磁気刺激から選択される、請求項１の方法。
【請求項１６】生物活性ポリペプチドは同時投与細胞の一つ以上の内に含有
される導入遺伝子から生産されるものではない、請求項８の方法。
【請求項１７】患者への細胞；および神経刺激剤の投与を含む、細胞および神経刺激剤の共同処置でＣＮＳ損傷の影響を回復でき
る、卒中で脳損傷を生じた被験者の処置をする方法。
【請求項１８】共同処置が、当該卒中の診断した後、少なくとも６時間で開
始される、請求項１７の方法。
【請求項１９】細胞がニューロン、オリゴデンドログリアおよび／またはア
ストログリアを生じることができる、請求項１７の方法。
【請求項２０】細胞が神経幹細胞である、請求項１７の方法。
【請求項２１】細胞が造血幹細胞である、請求項１７の方法。
【請求項２２】細胞が被験者から得た細胞に由来する、請求項１７の方法。
【請求項２３】生物活性ポリペプチドが、ポリペプチド成長因子を含む、請
求項１７の方法。
【請求項２４】ポリペプチド成長因子が、線維芽成長因子ファミリーメンバ
ー、ニューロトロフィンファミリーメンバー、インスリン様成長因子ファミリー
、毛様体神経成長因子ファミリーメンバー；ＥＧＦファミリーメンバー、ＴＧＦ
βファミリーメンバー、白血病阻止因子（ＬＩＦ）；オンコスタチンＭ，インタ
ーロイキン１１、インターロイキン６；血小板由来成長因子ファミリーのメンバ
ーおよびＶＥＧＦファミリーメンバーよりなる群から選択される、請求項２３の
方法。
【請求項２５】ポリペプチド成長因子が；ｂＦＧＦ，ａＦＧＦ，ＮＧＦ，Ｂ
ＤＮＦ，ＮＴ‐３，ＯＰ‐１，ＦＧＦ‐３，ＦＧＦ‐４，ＦＧＦ‐５およびＥＧ
Ｆよりなる群から選択したポリペプチドである、請求項２３の方法。
【請求項２６】ポリペプチド成長因子が当該ＦＧＦファミリーのメンバーで
ある、請求項２３の方法。
【請求項２７】ポリペプチド成長因子が、配列番号１〜３の一つで示したｂ
ＦＧＦポリペプチドと少なくとも３０％が同一であるポリペプチドである、請求
項２３の方法。
【請求項２８】ポリペプチドが、配列番号１〜３の一つで示したｂＦＧＦポ
リペプチドと同一である、請求項２３の方法。
【請求項２９】神経刺激剤が、以下の群：神経伝達物質アゴニスト、神経伝
達物質アンタゴニスト、分化因子、ガイダンス分子および経頭蓋磁気刺激から選
択する、請求項１７の方法。
【請求項３０】生物活性ポリペプチドが、同時投与した細胞の一つ以上の内
に含有されている導入遺伝子から生産されたものでない、請求項１７の方法。
【請求項３１】神経刺激剤を静脈内、大脳内、脳室内または槽内へ投与する
、請求項１の方法。
【請求項３２】細胞を静脈内、大脳内、脳室内または槽内へ投与する、請求
項１の方法。
【請求項３３】細胞を大脳内へ、そして神経刺激剤を槽内に投与する、請求
項１の方法。
【請求項３４】細胞および神経刺激剤の両方を槽内へ投与する、請求項１の
方法。
【請求項３５】ＣＮＳ損傷が、卒中、外傷、低酸素症、アルツハイマー病、
ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症またはパーキンソン病から
生じたものである、請求項１の方法。
【請求項３６】幹細胞；および神経刺激剤を含む、脳損傷の処置用キット。
【請求項３７】幹細胞の投与用器具および神経刺激剤を投与する器具を更に
含む、請求項３６のキット。
【請求項３８】神経刺激剤が配列番号１〜３のペプチドと少なくとも３０％
は同一なポリペプチドを含む、請求項３６のキット。
【請求項３９】神経刺激剤が配列番号１〜３のポリペプチドを含む、請求項
３６のキット。
【請求項４０】幹細胞がｖｍｙｓ遺伝子を発現する神経幹細胞を含み、前記
遺伝子はｉｎｖｉｔｒｏで発現されて前記幹細胞を急激に増殖するが、ｉｎ
ｖｉｖｏでの細胞への移植後では前記遺伝子は弱く発現されるのでｉｎｖｉｖ
ｏにおいては細胞増殖の速度は減少するか終止する、請求項３６のキット。
【請求項４１】被験者から試料を含有する幹細胞を得るための装置；および神経刺激剤を含む、脳損傷の処置用キット。
【請求項４２】神経刺激剤が配列番号１〜３のポリペプチドと少なくとも３
０％同一であるポリペプチドを含む、請求項４１のキット。
【請求項４３】神経刺激剤が配列番号１〜３のポリペプチドを含む、請求項
４１のキット。
【請求項４４】神経刺激剤、幹細胞および一つ以上の医薬品許容担体を含む
、医薬品組成物。
【請求項４５】神経刺激剤が、線維芽細胞成長因子ファミリーメンバー、ニ
ュートロフィンファミリーメンバー、インスリン様成長因子ファミリー、毛様体
神経栄養性成長因子ファミリーメンバー；ＥＧＦファミリーメンバー、ＴＧＦβ
ファミリーメンバー、白血病阻止因子（ＬＩＦ）；オンコスタチンＭ，インター
ロイキン‐６、インターロイキン‐１１；血小板由来成長因子ファミリーのメン
バーおよびＶＥＧＦファミリーメンバーよりなる群から選択される、請求項４４
の医薬品製剤。
【請求項４６】神経刺激剤が：ｂＦＧＦ，ａＦＧＦ，ＮＧＦ，ＢＤＮＦ，Ｎ
Ｔ‐３，ＯＰ‐１，ＦＧＦ‐３，ＦＧＦ‐４，ＦＧＦ‐５およびＥＧＦよりなる
群から選択したポリペプチドを含む、請求項４４の医薬品製剤。
【請求項４７】神経刺激剤が、ＦＧＦファミリーのメンバーであるポリペプ
チドを含む、請求項４４の医薬品組成物。
【請求項４８】ポリペプチドが、配列番号１〜３の一つで示す配列と少なく
とも３０％は同一であるポリペプチドを含む、請求項４４の医薬品組成物。