CZ2004852A3 - Materiály z buněk stromatu kostní dřeně pro použití při tvorbě cév a výrobě angiogenních a trofických faktorů - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález se týká terapeuticky použitelných způsobů a kompozic. Konkrétněji se vynález týká použití terapeutického vyvolání angiogeneze a produkce angiogenních a trofických faktorů.

Dosavadní stav techniky

Mrtvice je třetí nejběžnější příčina smrti u dospělé populace Spojených států amerických a představuje nejvážnější příčinu tělesné a duševní nezpůsobilosti. K mrtvici dochází, pokud je část mozku zasažena infarktem, a následkem toho dojde k odumření mozkové tkáně v důsledku přerušení dodávky krve do mozku. Mozkové infarkty související s akutní mrtvicí způsobují náhlé a dramatické neurologické poškození. Odumření tkáně a neurologické poškození může být způsobeno dalšími neurologickými onemocněními.

Farmakologické intervence si kladou za cíl maximalizovat průtok krve do mrtvicí zasažených oblastí mozku, které by mohly přežít, nicméně klinická účinnost se neprojevila. Jak je řečeno v Harrison's Principles of Internal Medicine (9. Ed., 1980, str. 1926), „navzdory experimentálnímu důkazu, že ... [cerebrální vasodílatátory] zvyšují cerebrální průtok krve, naměřeno metodou • · · ·

• ·· • · ··· J ! * * · · · • ·· · .

využívající oxid dusný, nebyl u pečlivě prováděných studií případů lidské mrtvice ve stádiu přechodných ischemických záchvatů, vývoje trombózy nebo u diagnózy mrtvice prokázán žádný terapeutický přínos. To platí u kyseliny nikotinové, Priscolinu, alkoholu, papaverinu a inhalace 5% oxidu uhličitého... Z použití těchto metod naopak vyplývá, že takové vasodilatátory jsou spíše než přínosné škodlivé, protože snížením systemického krevního tlaku omezují intrakraniální anastomotický průtok, nebo rozšiřováním krevních cév v normálních částech mozku odváděj i krev z místa infarktu.

Je třeba dodat, že kromě toho j sou onemocnění kardiovaskulárního systému celosvětově vedoucí příčinou mortality a morbidity. Došlo například ke zvýšení počtu srdečních selhání. Srdeční selhání je charakteristické neschopností srdce dopravovat dostatek krve do různých tělesných orgánů. Současné odhady naznačují, že přes 5 milionům Američanů bylo diagnostikováno srdeční selhání, přičemž každý rok je diagnostikováno téměř 500 000 nových případů a tomuto onemocnění je připisováno 250 000 úmrtí ročně. Navzdory významným terapeutickým úspěchům v posledních dvou desetiletích pokračuje zvyšování počtu výskytu srdečních selhání tak, že již dosahuje epidemických rozměrů a ve vyvinutých zemích reprezentuje hlavní ekonomickou zátěž.

Srdeční selhání je klinickým syndromem charakterizovaným distinktivními symptomy a znaky, které jsou způsobeny poruchami srdečního výstupu nebo zvýšeným venózním tlakem. Kromě toho srdeční selhání představuje progresivní poruchu, při níž dochází k postupnému pokračujícímu se zhoršování srdeční funkce bez ohledu na

absenci škodlivých událostí. Srdeční selhání má za následek neadekvátní srdeční výstup.

Obecně existují dva typy srdečního selhání. Pravé srdeční selhání je neschopnost pravé strany srdce pumpovat venózní krev do pulmonálního oběhu. Dochází k hromadění tekutiny v těle, což má za následek otoky a edémy. Levé srdeční selhání je neschopnost levé strany srdce pumpovat krev do systemického oběhu. Zadržování za levou komorou následně způsobuje akumulaci tekutiny v plicích.

Hlavním důsledkem srdečního selhání je městnání tekutiny. V případě, že srdce ztratí svou účinnost jako čerpadlo, se tělo snaží kompenzovat tento nedostatek například použitím hormonů a nervových signálů vyvolávajících zvýšení objemu krve.

Srdeční selhání má celou řadu příčin. Například onemocnění srdeční tkáně vede k odumírání myokardiálních buněk, které dále nezastávají svoji funkci. Vývoj dysfunkce levé komory přispívá částečně ke stále pokračující ztrátě těchto kardiomyocytů.

Pro léčbu a prevenci srdečního selhání existuje celá řada metod. Pro regeneraci srdečních buněk při akutní srdeční ischémii a/nebo infarktu nebo poranění se u zvířecích modelů například používají kmenové buňky. U jednoho konkrétního příkladu se životaschopné buňky stromatu kostní dřeně izolované z kostí nohy dárce množily, označily a následně vstřikovaly do myokardu příjemců, kterými byli isogenní dospělí potkani. Po odebrání srdečních svalů 4 dny až 12 dní po implantaci se místa implantace zkoumala a zjistilo se, že implantované buňky ·· ···· • ♦

stromatu vykazovaly růstový potenciál v amyokardiálním prostředí. (Wang, a kol.)

Ukázalo se, že se kardiomyocyty diferencují in vitro z pluripotentních embryonálních kmenových (ES) buněk linie D3 přes embryu-podobné agregáty (zárodečná těla). Tyto buňky byly charakterizovány za použití techniky „whole-buňka patch-clamp, morfologie a analogie genové exprese během celé diferenciační periody. (Maltsev, a kol., 1994). Kromě toho byly pluripotentní myší ES buňky schopné diferencovat se na kardiomyocyty exprimuj ící hlavní znaky srdce savců (Maltsev, a kol., 1993).

Kmenové buňky mají, bez ohledu na svůj původ (embryonální, kostní dřeň, kosterní svalstvo atd.), potenciál diferencovat se na různé, pokud ne všechny, buněčné typy těla. Kmenové buňky jsou schopny diferencovat se na funkční srdeční myocyty. Vývoj terapií založených na kmenových buňkách pro léčbu srdečního selhání má tedy oproti existujícím terapiím mnoho výhod.

Podstata vynálezu

Vynález poskytuje terapeutické činidlo pro použití při indukci angiogeneze a vaskulogeneze. Toto terapeutické činidlo může zahrnovat faktory indukující angiogenezi a vaskulogenezi izolované z kmenových buněk ve spojení s farmaceuticky přijatelným buněčným terapeutickým činidlem pro indukci angiogeneze a vaskulogeneze. Rovněž je poskytnut způsob amplifikační produkce faktorů indukujících angiogenezi a vaskulogenezi sekretovaných expozicí a kokultivací buněk stromatu se sloučeninou zvyšující produkci faktorů indukujících angiogenezi a vaskulogenezi.

Vynález rovněž poskytuje faktory indukující angiogenezi a vaskulogenezi izolované a purifikované z kmenových buněk, které jsou použitelné při léčbě. Vynález poskytuje způsob získání faktorů indukujících angiogenezi a vaskulogenezi, jak jsou definovány výše, přičemž tento způsob zahrnuje následující kroky izolace a purifikace lidských mezenchymálních kmenových buněk z tkáně před diferenciací a následnou kultivační expanzi těchto mezenchymálních kmenových buněk za vzniku nástroje pro neurologickou a muskuloskeletární terapii. Vynález rovněž poskytuje izolované a kultivačně expandované mezenchymální kmenové buňky, které jsou pod vlivem nezbytné sloučeniny schopny diferenciace a produkce požadovaného buněčného fenotypu potřebného pro opravu tkáně.

Přehled obrázků na výkresech

Další výhody vynálezu se stanou zřejmějšími a budou lépe pochopeny po prostudování následujícího podrobného popisu, který je třeba posuzovat v souvislosti s doprovodnými výkresy:

Obr. 1 A až 1E představují fotografie ukazující sekrece růstových faktorů BDNF (obr. 1A) , NGF (obr. 1B) , bFGF (obr. 1C), VEGF (obr. ID) a HGF (obr. 1E) ;

Obr. 2 znázorňuje grafy ukazující výsledky testů funkčního chování u potkanů před a po okluzi střední cerebrální artérie a léčbě intravenózními MSC nebo bez léčby;

Obr. 3A a 3B jsou fotografie ukazující použití modelu korneální neovaskularizace potkana při testu, jehož cílem • · » · ··· ·· φφ - · · · ’ • ·· ··· je zjistit, zda MSC sekrece indukuje angiogenezi in vivo, přičemž obr. 3A ukazuje slepě operovanou rohovku bez známky neovaskularizace a obr. 3B ukazuje MSC supernatant umístěný v kolagenové vodě vložený do korneálního pouzdra, kde je jasný důkaz robustní neovaskularizace rohovky;

Obr. 4 ukazuje ilustraci experimentů, které se prováděly ve snaze podpořit vynález, a při nichž se kostní dřeň extrahovala ze zvířete a MSC se separovaly a kultivovaly ve třech až pěti pasážích, MSC se vstříkly do těla zvířete s nervovým poškozením a buňky selektivně migrovaly do poškozené tkáně a lokalizovaly se do ohraničené zóny léze, MSC potom aktivovaly řadu ozdravných událostí, které jsou zprostředkovány MSC, tj. sekreci parenchymálních buněk a růstových a trofických faktorů, které takto zlepšují neurologickou funkci;

Obr. 5 ukazuje standardní koronální řez identifikovaný na úrovni předního spoje mozku potkana, který dělí pravou hemisféru na tři podoblasti a osm polí;

Obr. 6A a 6B jsou grafy, které ukazují výsledky testů funkčního chování před a po okluzi střední cerebrální artérie;

Obr. 8A a 8B jsou grafy ukazující reakcí smíšených lymfocytu mezi buňkami sleziny potkana a hMSC; a

Obr. 9 znázorňuje mikrofotografie ukazující morfologické charakteristiky exogenních lidských buněk stromatu kostní dřeně (hMSC) a endogenních mozkových buněk v mozku potkana.

44 ·· ···· • · • 444

44

•44

Obecně se vynález týká použití faktorů indukujících angiogenezi a vaskulogenezi z buněk stromatu kostní dřeně nebo dalších kmenových buněk jako součásti buněčné terapie pro indukci angiogeneze a vaskulogeneze. Konkrétněji vynález poskytuje způsob amplifikace produkce faktorů indukujících angiogenezi a vaskulogenezi (např. angiogenní, trofický a růstový faktor) sekretovaných stromálními nebo dalšími kmenovými buňkami pro použití při léčbě, faktorů indukujících angiogenezi nebo další prospěšný růst, po podání. K této amplifikaci dochází při expozici a kokultivaci buněk společně s mozkovým extraktem a/nebo kalciem.

Výraz „angiogeneze je definován jako způsob vaskularizace tkáně, který zahrnuje růst nových a/nebo vývoj již ve tkáni existujících cév, a rovněž je označován jako neo-vaskulárizace. Uvedený způsob je mediován infiltrací buněk endotelu a buněk hladkého svalstva. Způsob lze provádět jedním ze tří následujících způsobů: cévy mohou růst z již dříve existujících cév, de novo vyvinuté cévy mohou růst z prekurzorových buněk (vaskulogeneze) a/nebo již existující malé cévy mohou zvětšovat svůj průměr.

Výrazy „zesilovat nebo „zesílení, jak jsou zde použity, označují, neomezujícím způsobem, obohacení nebo obohacení přidáním nebo zlepšení nějaké požadované kvality nebo kvantity látky.

Výraz „mozkový extrakt, jak je zde použit, zahrnuje, neomezujícím způsobem, mozkové buňky nebo další podobné buňky získané z mozku. Tyto buňky lze rovněž kultivovat společně s médiem a získaný supernatant lze použít jako mozkový extrakt.

Výraz „poranění, jak je zde použit, zahrnuje, neomezujícím způsobem, fyzické nebo biologické poranění zahrnující genetické poruchy, různá onemocnění a poruchy nastupující s věkem. Toto poranění lze nalézt například u pacientů trpících neurologickými a funkčními deficity po mrtvici, CNS poraněním a neurodegenerativním onemocněním.

Výraz „buněčná terapie, jak je zde použit, zahrnuje, neomezujícím způsobem, terapeutické použití kmenových buněk. Kmenová buňka je generálizovaná mateřská buňka, jejíž potomci se specializují do různých buněčných typů. Kmenové buňky mají různý původ zahrnující, neomezujícím způsobem, embryo, kostní dřeň, játra, stromat, tukovou tkáň a další původy kmenové buňky, které jsou odborníkům v daném oboru známy.

Tyto kmenové buňky lze umístit do požadovaných oblastí, ve kterých se přirozeně vyskytují, nebo je lze uměle zpracovat libovolným způsobem, který je odborníkům v daném oboru znám. Pomocí různých genetických způsobů zpracování zahrnujících, neomezujícím způsobem, transfekci, deleci apod., lze tedy kmenové buňky zpracovat tak, aby se zvýšila jejich pravděpodobnost přežití nebo pro libovolný další požadovaný účel.

Kmenové buňky jsou schopné autoregenerace, pokud jsou poskytnuty lidskému subjektu in vivo, a mohou se stát liniově-omezenými progenitory, které se dále diferencují a expandují do specifických linií, Výraz kmenové buňky, jak je zde použit, označuje lidské buňky stromatu kostní dřeně a nekmenové buňky dalších buněčných typů.

Výhodně výraz „kmenové buňky označuje lidské buňky stromatu kostní dřeně.

·»«·

Výraz „kmenová buňka nebo „pluripotentní kmenová buňka jsou vzájemně zaměnitelně a používají se pro označení kmenových buněk majících (1) schopnost umožnit růst progenů ve všech definovaných krvetvorných liniích a (2) kmenových buněk schopných autoobnovou zcela rekonstituovat vážně imunokompromitováného hostitele ve všech typech krevních buněk a jejich progenech, včetně pluripotentní hematopoietické kmenové buňky.

Kostní dřeň je měkká tkáň obsazující medulární dutiny dlouhých kostí, některé Haversovy kanálky a prostory mezi trabekulami houbovité neboli spongiózní kosti. Existují dva typy kostní dřeně: červená, která se nachází v raném věku ve všech kostech a v dospělosti v omezených oblastech (tj. ve spongiózní kosti) a je spojována s produkcí krevních buněk (tj. krvetvorby) a hemoglobinu (tj. červené barvy); a žlutá, která sestává většinou z tukových buněk (tj . žlutá barva) a poj ivové tkáně.

Jako celek je kostní dřeň komplexní tkání zahrnující krvetvorné kmenové buňky, červené a bílé krvinky a jejich prekurzory, mezenchymální kmenové buňky, buňky stromatu a jejich prekurzory, skupinu buněk zahrnující fibroblasty, retikulocyty, adipocyty a endoteliální buňky, které tvoří síť. pojivové tkáně označovanou jako „stroma. Buňky stromatu morfologicky regulují diferenciaci krvetvorných buněk přímou interakcí přes proteiny buněčného povrchu a sekreci růstových faktorů a podílejí se na založení a tvorbě buněčné struktury.

Byly navrženy studie používající zvířecí modely, kde kostní dřeň obsahuje „pre-stromatální buňky, které mají schopnost diferencovat se na chrupavku, kost a další buňky pojivové tkáně. (Beresford, J. N. : Osteogenic Stem Cells ···· » ·>··· • · • « • » » and Stromal System of Bone a Marrow, Clin. Orthop. , 240: 270,1989). Nedávný důkaz naznačil, že tyto buňky, označované jako pluripotentní kmenové buňky stromat nebo mezenchymálni kmenové buňky mají schopnost se po aktivaci generovat se do několika různých typů buněčných linií (tj. osteocyty, chondrocyty, adipocyty atd.). Nicméně mezenchymální kmenové buňky jsou ve tkáni přítomny ve velmi malých množstvích spolu s širokým spektrem dalších buněk (tj . erythrocyty, krevní destičky, neutrofily, lymfocyty, monocyty, eosinofily, basofily, adipocyty atd.), a v inverzním vztahu ke stáří jsou v závislosti na vlivu celé řady bioaktivních faktorů schopny se diferenciovat do kolekce pojivových tkání.

Cílem vynálezu je použití buněk stromatu kostní dřeně, supernatantu z buněk stromatu kostní dřeně nebo sekretů vznikajících v důsledku interakce buněk stromatu kostní dřeně a dalších kmenových buněk pro léčbu onemocnění. Tyto sekrety zahrnují, neomezujícím způsobem, skupinu růstových, trofických a angiogenních faktorů. Způsob podle vynálezu podporuje zlepšení výsledku regenerace po neuronovém poranění, nebo dalších poraněních, rozšiřováním účinků léčby, například angiogenezí, a rozšiřováním produkce krevních cév vytvořených z neexistující nebo již dříve existující vaskulatury. Vynález lze rovněž použít pro poskytnutí prostředku pro posílení kompenzačního mechanizmu mozku, jehož cílem je zlepšit funkci mozku po poškození nebo degeneraci CNS. Kromě toho mohou způsoby a kompozice podle vynálezu zvýšit účinnost buněčné terapie.

Obohacení a/nebo repopulace poraněných buněk přes transplantované kmenové buňky, které se diferencují na poraněné buňky, zlepšuje funkci mozku. Pokud se například tato terapie použije při léčbě srdce, potom může posílit stažitelné jednotky v srdci. Posílení stažitelných jednotek zlepšuje srdeční funkci. Kmenové buňky mohou být dále zodpovědné i za uvolňování různých substancí, jakými jsou například trofické faktory. Uvolňování trofických faktorů tedy například indukuje angiogenezi (zvyšuje počet krevních cév) s cílem zvýšit srdeční funkcí a/nebo léčit srdeční selhání.

Kmenové buňky tedy pracují tak. aby posílily srdeční funkci a/nebo léčily srdeční selhání prostřednictvím různých mechanizmů jiných, než jakými jsou právě diferenciace na funkční buňky srdečního svalu.

Produkce trofických faktorů, růstových faktorů a angiogenních faktorů je zpravidla drahý a obtížný způsob. Způsob a kompozice podle vynálezu poskytují levný a jednoduchý způsob produkce čistých trofických faktorů, růstových faktorů a jiných příbuzných faktorů pouhým poskytnutím terapie podle vynálezu. Tyto faktory lze použít pro léčbu pacientů. Tyto faktory lze například použít pro indukci angiogeneze, vaskulogeneze a pro posílení funkce a pro opravu tkání jak in vivo, tak in vitro. Je tedy prospěšné stanovit, jaké buňky stromatu kostní dřeně lze použít jako buněčné faktory pro produkci a sekreci trofických, růstových a angiogenních faktorů. Tyto faktory mohou zahrnovat, neomezujícím způsobem, VEGF, HGF, BDNF, NGF, bFGF, atd. Způsoby podle vynálezu umožňují produkci těchto faktorů, které mají být upraveny kultivačními podmínkami. Kultivační podmínky lze například zmanipulovat kokultivací buněk společně s tkání a/nebo různými koncentracemi vápníku v kultivačním médiu.

Podstatou vynálezu je použití buněčné terapie pro léčbu onemocnění. I přesto, že mají kmenové buňky různý

• · · · » 9 9 » · 9 · 9 původ (embryo, kostní dřeň, játra, tukovou tkáň, atd.), je jejich společnou důležitou vlastností to, že jsou schopny diferencovat se do různých, pokud ne všech, buněčných typů těla. Jak již bylo zmíněno, je známo, že kmenové buňky jsou schopny se diferencovat do buněk srdečního svalu. (Maltsev et al., 1993; 1994).

V rámci vynálezu byl vyvinut způsob izolace a purifikace lidských mezenchymálních kmenových buněk z tkáně před diferenciací a následnou kultivací expandováním mezenchymálních kmenových buněk za vzniku hodnotného nástroje pro neurologickou a muskuloskeletární terapii. Cílem takové manipulace je podstatně zvýšit počet mezenchymálních kmenových buněk a použít tyto buňky pro přesměrování a/nebo posílení normální reparativní kapacity těla.

Mezenchymální kmenové buňky se sklízejí ve větších počtech a aplikují na plochy poškozené tkáně ve snaze zlepšit nebo stimulovat in vivo růst při regeneraci a/nebo opravě, ve snaze zlepšit adhezi implantátu k různým protetickým zařízením přes následnou aktivaci a diferenciaci, posílit produkci krvetvorných buněk atd.

Vynálezci uvažovali o různých metodách přenosu, imobilizace a aktivace kultury expandovaných, purifikovaných mezenchymálních kmenových buněk v místě opravy, implantace atd., včetně injektování buněk v místě kosterního defektu, inkubace buněk s protézou a implantace protézy atd. Isolací, purifikaci a výraznější expanzí určitého počtu buněk před diferenciací a následnou aktivní kontrolou diferenciačního způsobu lze jejich umístěním do místa poškození tkáně nebo in vitro ošetřením, které předchází jejich transplantaci, kultivací expandované, ··· ·· · · · · · · ··· nediferen-cované mezenchymální kmenové buňky použít pro různé terapeutické účely, jakými jsou například objasnění buněčných, molekulových a genetických poruch, k nimž dochází při mnoha neurologických onemocněních, neurálních poraněních, metabolických kostních onemocněních, kostní dysplazii, defektech chrupavky, poraněních vaziva a šlach a dalších poruch muskuloskeletálních a pojivových tkání.

Vynálezci uvažovali o různých postupech pro přenos, imobilizaci a aktivaci mezenchymálních kmenových nebo progenitořových buněk v místě opravy, implantace atd., přes použití různých porézních keramických vehikul neboli nosičů, včetně injektáže buněk do místa poranění.

Lidské mezenchymální kmenové buňky lze získat z mnoha různých zdrojů, včetně ucpávek femorální hlavice spongiózní kosti, získaných od pacientů s degeneratívním kloubním onemocněním během chirurgické náhrady kyčelního nebo kolenního kloubu, a z aspirované dřeně získané od normálních dárců a onkologických pacientů, kterým byla dřeň odebrána pro budoucí transplantaci kostní dřeně. Ačkoliv lze odebranou dře připravit pro separaci buněčné kultury celou řadou různých mechanických způsobů isolace, které se volí v závislosti na zdroji odebrané dřeni (tj . přítomnost kostních štěpů, periferní krve, atd.), je „kritickým a společným krokem všech izolačních způsobů, použití speciálně připraveného média, které má obsahovat činidla umožňující nejen růst mezenchymálních kmenových buněk bez diferenciace, ale rovněž přímé přilnutí výlučně mezenchymálních kmenových buněk k plastické nebo skleněné povrchové ploše kultivační misky. Výrobou média, které umožňuje selektivní přichycení požadovaných mezenchymálních kmenových buněk, které jsou přítomny ve vzorcích dřeně ve velmi malých množstvích, umožnila separovat mezenchymální ··« • · « ··· · · · · ·· ·· ··· kmenové buňky od ostatních buněk (tj . červených a bílých krvinek, dalších díferenco-vaných mezenchymálních buněk atd.) přítomných v kostní dřeni.

Jak je naznačeno výše, kompletní médium lze použít u celé řady různých způsobů isolace v závislosti na specifickém typu počátečních způsobů odběru použitém pro přípravu kostní dřeni získané pro separaci buněčné kultury. Pokud se používají ucpávky spongiózní kostní dřeni, potom se dřeň přidá do kompletního média a kde při vířivém pohybu vzniká disperze, která se následně odstřeďuje s cílem separovat buňky dřeně od kousků kosti, atd. Buňky dřeně (tvořené převážně červenými a bílými krvinkami a velmi malým množstvím mezenchymálních kmenových buněk, atd.) se následně disociují do jednotlivých buněk vedením kompletního média obsahujícího buňky dřeni přes injekční stříkačky opatřené jehlami číslo 16, 18 a 20. Předpokládá se, že výhoda, kterou přináší použití mechanického separačního způsobu, jako protiklad k libovolnému enzymatickému separačnímu způsobu, je to, že mechanický způsob přináší malé buněčné změny, zatímco enzymatický způsob by mohl vyvolat velké buněčné poškození, zejména proteinových vazebných míst potřebných pro přilnutí kultury a selektivní separací a/nebo proteinových míst potřebných pro produkci monoklonálních protilátek specifických pro uvedené mezenchymální kmenové buňky. Jediná buněčná suspenze (která je tvořena až přibližně 50 až 100 x 10⁶ nukleovaných buněk) se následně rozprostře do lOOmm misek za účelem selektivní separace a/nebo izolace mezenchymálních kmenových buněk od zbývajících buněk, které se v suspenzi nacházejí.

Pokud se použije aspirovaná dřeň jako zdroj lidských mezenchymálních kmenových buněk, potom se kmenové buňky ··· ·· ·· ·· ·· ·9· dřeně (které obsahovaly málo nebo žádné kostní třísky, ale mnoho krve) přidaly do kompletního média a frakcionalizoval pomocí gradientů Percoll (Sigma, St. Louis, Mo.), které budou podrobněji popsány níže. Gradienty Percoll separovaly vysoké procento červených krvinek a jednojaderných krvetvorných buněk z nízkohustotní frakce krevních destiček, která obsahovala ze dřeni odvozené mezenchymální kmenové buňky. Frakce krevních destiček, která obsahovala přibližně 30 x 10^δ až 50 x 10⁶ buněk, byla tvořena nestanoveným množstvím buněk krevních destiček, 30 x 10^e až 50 x 10⁶ nukleovaných buněk a pouze přibližně 50 až 500 mezenchymálních kmenových buněk v závislosti na věku dárce kostní dřeni. Nízkohustotní frakce krevních destiček se následně umístila do Petriho misky za účelem selektivní separace založené na buněčné přilnavosti.

Buňky kostní dřeně získané buď ze spongiózní kosti nebo kyčelní sondy (t j . primární kultury) se pěstovaly v kompletním médiu a nechaly během jednoho až sedmi dnů podle nastavených podmínek, které budou definovány níže, přilnout k povrchu Petriho misek. Protože po uplynutí tří dnů nebylo pozorováno žádní zvýšení, pokud jde o přichycení buněk, byly tři dny zvoleny jako standardní doba, po které se nepřichycené buňky odstranily z kultury tak, že se původní kompletní médium nahradilo čerstvým kompletním médiem. Potom se změny média prováděly každé čtyři dny až do okamžiku, kdy kultivační misky pokryla souvislá vrstva, k čemuž bylo zpravidla zapotřebí 14 až 21 dní. To reprezentuje 10³ až 10⁴násobný nárůst nediferencovaných lidských mezen-chymálních kmenových buněk.

Buňky se následně uvolnily z kultivačních misek za použití uvolňujícího činidla, jakým je například trypsin s EDTA (kyselina ethylendiaminetetraoctová) (0,25 % trysinu,

9999

9

999 w ···· · * · · • · · · · · • ♦ · » ···

999 99 99

9 9 99 mM EDTA (lx), Gibco, Grand Island, N.Y.) nebo chelatačního činidla, jakým je například EGTA (ethylenglykolbis(2-aminoethylether) kyseliny N,N'-tetraoctové, Sigma Chemical Co., St. Louis,Mo.). Výhodou použití chelatačního činidla oproti trypsinu bylo to, že trypsin mohl štěpit určitý počet navázaných proteinů mezenchymálních kmenových buněk. Protože tyto vazebné proteiny obsahují rozpoznávací místa, potom pokud mají být připraveny hledané monoklonální protilátky, se jako uvolňující činidlo použilo chelatační činidlo, jakým je například EGTA, jako protiklad k trypsinu. Uvolňující činidlo se následně zbavuje účinnosti a uvolněné kultivované nediferencované mezenchymální kmenové buňky se propláchly kompletním médiem pro následné použití.

Za určitých podmínek mají kultivací expandované mezenchymální kmenové buňky schopnost diferencovat se na buňky kosti, pokud se inkubovaly jako štěp v porézní keramice vyrobené z fosforečnanu vápenatého. Ačkoliv nejsou známy vnitřní faktory, které ovlivňují diferenciaci mezenchymálních kmenových buněk na buňky kosti a nikoliv na buňky chrupavky zdá se, že přímá dosažitelnost růstu mezenchymálních kmenových buněk a výživové faktory dodávané vaskulaturou v porézní keramice z fosforečnanu vápenatého, jako protiklad k difúzní komoře, ovlivnily diferenciaci mezenchymálních kmenových buněk na buňky kosti. Kromě toho mozkový extrakt způsobuje to, že kmenové buňky vytvářejí další trofické faktory, které dále posilují účinek kmenových buněk. V důsledku toho lze izolované a kultivací expandované mezenchymální kmenové buňky použít za určitých specifických podmínek a/nebo pod vlivem určitých faktorů k diferenciaci a produkci požadovaného buněčného fenotypu potřebného pro opravu tkáně.

*	ΦΦ ··	φφ	ΦΦ	φφ	ΦΦΦ5
• Φ	•	•	•	•	φ	•	Φ
♦	•	•	•	• φφ	φ	φ	ΦΦΦ
•	•	• Φ	•	φ Φ	φ φ	φ	4
φ ΦΦ	• ·	ΦΦ		Φ <	• Φ		Φ 9 Φ«

Podáním jedné dávky mezenchymálních kmenových buněk lze účinně omezit nebo zcela eliminovat odezvu T buněk na tkáň alogenní k T buňkám nebo na nevlastní tkáň, zejména v případě, kdy si T lymfocyty uchovají svůj neresponzivní charakter (tj ( tolerance nebo anergie) toalogenních buněk potom, co se separují od mezenchymálních kmenových buněk.

Obecný způsob transplantace kmenových buněk společně s mozkovým extraktem do myokardu se provádí podle následujícího postupu. Kmenové buňky a mozkový extrakt se podaj í pacientovi. Toto podání může být subkutánní, parenterální včetně intravenózního, intraarteriálního, intramuskulárního, intraperitoneální a intranazální podání stejně jako lze použít intratekální a infúzní techniky.

Dávka mezenchymálních kmenových buněk se mění v širokém rozsahu a přizpůsobuje se individuálním požadavkům v každém konkrétním případě. Obecně platí, že v případě parenterálního podání je běžné podávat přibližně 0,01 miliónu až přibližně 5 miliónů buněk na kilogram tělesné hmotnosti příjemce. Počet použitých buněk bude záviset na hmotnosti a zdravotním stavu příjemce, počtu nebo četnosti podání a dalších proměnných, které jsou odborníkům v daném oboru známy. Mezenchymální kmenové buňky lze podávat způsobem, který je vhodný pro tkáň, organ nebo buňky, které mají být transplantovány. Mohou být podávány systemicky, tj. parenterálně, intravenózní injekcí nebo cíleně do konkrétní tkáně nebo organu, například do kostní dřeně. Lidské mezenchymální kmenové buňky lze podávat přes subkutánní implantaci buněk nebo vstříknutím kmenové buňky do pojivové tkáně, například do svalu.

Buňky lze suspendovat ve vhodném ředidle, a to při koncentraci přibližně od 0,01 do přibližně 5xl0⁶ buněk/ml.

Excipienty vhodné pro injekční roztoky jsou ty excipienty, které jsou biologicky a fyziologicky slučitelné s buňkami a s příjemcem, takže vhodným excipientem je například pufrovaný solný roztok nebo další vhodné excipienty. Kompozice pro podání musí být formulována, vyráběna a uskladněna standardními způsoby splňujícími požadavky na příslušnou sterilitu a stabilitu.

Ačkoliv se vynález neomezuje pouze na tento postup, lze mezenchymální kmenové buňky izolovat výhodně z kostní dřeně, purifikovat a expandovat v kultuře, tj. in vitro, a tím způsobem získat dostatečné počty buněk pro použití při zde popsaných způsobech. Mesenchymální kmenové buňky, stavební pluripotentní blastové buňky, které se nacházejí v kostech, jsou v kostní dřeni a ostatních mezenchymálních tkáních zpravidla přítomny ve velmi nízké četnosti (1:100 000). Viz, Caplan a Haynesworth, patent US 5 486 359. Genová transdukce mezenchymálních kmenových buněk je popsána v Gerson et al, patent US 5 591 625.

Není-li stanoveno jinak, provádí se genetické manipulace způsobem popsaným v Sambrook a Maniatis, MOLEKULÁRN CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed. ; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) .

Tento vynález je hodnotný vzhledem k tomu, že bylo zjištěno, že jeden mechanizmus zhoršení funkce při srdečním selhání je podle etiologie částečně důsledkem přetrvávající smrtí buněk srdečního svalu (Sabbah, 2 000) . Řešením tohoto problému je obohacení a/nebo repopulace myocardu novými srdečními buňkami, které nahradí ztracené buňky nebo poskytnou další posílení současně fungujícím srdečním • · · · ► · · > 4 4·· • · · · · buňkám, čímž se dosáhne zlepšení čerpací funkce selhávajícího srdce.

Výhodou vynález oproti všem současně existujícím léčebným postupům je to, že nejsou známy žádné vedlejší účinky léčby, kterou vynález nabízí, a samotnou léčbu lze považovat za relativně neínvazívní. Například léčba srdečního selhání je v současné době založena převážně na použití léčiv, které interferují s neurohumorálními systémy. Kromě tohoto typu terapie existuje chirurgická léčba, která zahrnuje transplantaci srdce a rovněž použití ventrikulárních nebo biventrikulárních asistenčních zařízení. Výhodou, kterou vynález nabízí je schopnost léčit srdeční selhání přímým působením na primární příčinu onemocnění, konkrétně na ztrátu kontrakčních jednotek. Repopulace myokardu kmenovými buňkami, které se diferencují na kontrakční jednotky podílející se na celkové funkci selhávajícího srdce, je tedy nová a míří přímo do centra problému. Další výhody zahrnují absenci vedlejších účinků, které jsou často spojovány s použitím farmakologické terapie, a absenci imunitního odloučení (odhojení), které způsobuje problémy při srdeční transplantaci nebo v případě transplantace jiných orgánů, a schopnost posilovat tvorbu trofických faktorů kmenovými buňkami.

Vynález je schopný nahradit celou řadu současných chirurgických terapií a případně i farmakologických terapií. V současné době existují zařízení, která umožňují dopravu kmenových buněk spolu s mozkovým extraktem do selhávajícího srdce za použití způsobů založených na tzv. katétrech, a která tak eliminují nutnost otevření hrudní dutiny. Kromě toho lze vynález využít jak v humánní medicíně, tak při veterinární praxi.

Příklady způsobu a kompozice podle vynálezu jsou uvedeny v následujících části obsahující příklady provedení vynálezu. Zde uvedená konkrétní provedení mají pouze ilustrativní charakter a nelze je považovat za vyčerpávající. Vynález může zahrnovat další varianty, které se mohou lišit způsoby provedení a metodologiemi, přičemž tyto modifikace jsou odborníkům v daném oboru známé. V podstatě lze říci, že použití libovolných odlišných provedení, způsobů, struktur a materiálů, které jsou odborníkům v daném oboru známy, spadá do rozsahu vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Způsobů:

Obecné způsoby molekulární biologie:

Standardní molekulární biologické techniky, které jsou v daném oboru známé a nejsou zde specificky popsané, se zpravidla prováděly podle Sambrook et al., Molekular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989), podle Ausubel et al., Current Protocols in Molekulám Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989), podle Perbal, A Practical Guide to Molekulám Cloning, John Wiley & Sons, New York (1988), podle Watson et al. , Recombinant DNA, Scientific American Books, New York a podle Birren et al. (ed.) Genome

Analysis: A Laboratory Manual Series, Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998), přičemž metodologie je popsána v patentech US 4 666 828; US 4 683 202; US 4 801 531; US 5 192 659 a US 5 272 057, jejichž obsahy jsou zde začleněny formou odkazů. Polymerázová řetězcová reakce (PCR) se obecně prováděla způsobem popsaným v PCR Protokolech: A Guide To Methods And Applications, Academie Press, San Diego, CA (1990) . Pro detekci buněk obsahujících specifickou DNA a mRNA sekvenci lze použít in šitu (v buňce) PCR společně s průtokovou cytometrií (Testoni et al, 1996, Blood 87:3822.)

Obecné způsoby v imunologii:

Standardní imunologické způsoby, které jsou v daném oboru známé a nejsou zde konkrétně popsané, se obecně prováděly podle Stites et al. (eds), Basic a Clinical Imunology (8. edice), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994) a Mishell a Shiigi (ed.), Selected Methods in Cellular Imunology, W. H. Freeman a Co. , New York (1980).

Buňky podle vynálezu se podávají a dávkují v souladu s dobrými zásadami lékařské praxe, a přitom se bere v úvahu klinický stav jednotlivých pacientů, místo a způsob podání, časový rozvrh (režim) podání, věk, pohlaví a tělesná hmotnost pacienta a další faktory, které jsou praktickým lékařům známé. Farmaceuticky „účinné množství je, pro účely vynálezu definováno v daném oboru běžným způsobem.

Toto množství musí být účinné pro dosažení určitého zlepšení, neomezujícím způsobem včetně zvýšeného počtu přežívajících pacientů nebo rychlejšího uzdravení nebo zmírnění nebo eliminace příznaků a dalších indikátorů, které se zvolí odborníky v daném oboru jako vhodné měrné údaj e.

U způsobu podle vynálezu lze buňky podle vynálezu podávat různými způsoby. Je třeba upozornit, že mohou být podávány jako buňky nebo jako farmaceuticky přijatelná sůl a lze je podávat samotné nebo jako účinnou složku v

4 4 4 4 4 • 4

444 44 44 44 44 444 kombinaci s farmaceuticky přijatelnými nosiči, ředidly, adjuvansy a vehikuly. Buňky lze podávat orálně, subkutánně nebo parenterálně včetně intravenózního, intraarteriálního a intramuskulárního, intraperitoneálního a intranazálního podání, a stejně tak za použití intratekální a infúzní techniky. Lze použít i implantáty buněk. Léčenými pacienty jsou teplokrevní živočichové, a zejména savci včetně člověka. Jako farmaceuticky přijatelné nosiče, ředidla, adjuvansy a vehikula, stejně jako nosiče implantátu se zpravidla označuje inertní, netoxická pevná nebo kapalná plniva, ředidla nebo zapouzdřující materiál, které nereagují s účinnými složkami podle vynálezu.

Je třeba poznamenat, že léčba člověka trvá zpravidla déle než léčba myši nebo jiného zde exemplárně použitého pokusného zvířete, přičemž délka léčby je v určitém poměrnou k délce trvání onemocnění a účinnosti účinné látky. Dávkami mohou být jednorázové dávky nebo násobné dávky podávané během několika dnů, -nicméně jednorázové dávky se j eví j ako výhodné.

Dávkami mohou být jednorázové dávky nebo násobné dávky podávané během několika dnů. Léčba má zpravidla délku poměrnou k délce trvání onemocnění a účinnosti účinné látky a druhu léčeného pacienta.

Pokud se buňky podle vynálezu podají parenterálně, potom budou zpravidla formulovány v jednotkové dávkové vstřikovatelné formě (roztok, suspenze, emulze). Farmaceutické formulace vhodné pro vstřikování zahrnují sterilní vodné roztoky nebo disperze a sterilní prášky pro obnovení formy sterilních injektovatelných roztoků nebo disperzí. Nosičem může být rozpouštědlo nebo dispergační medium obsahující, například vodu, ethanol, polyol • · · 4 • · • · ·«

·· ·· • · · • · · · (například glycerol, propyleng1yko1, kapalný polyethylenglykol apod.), jejich směsi a rostlinné oleje.

Správnou tekutost lze udržovat například použitím povlaku, například lecithinového povlaku a/nebo pomocí požadované velikosti částic v případě disperze a/nebo použitím povrchově aktivních činidel. Rovněž lze jako rozpouštědlové systémy pro buněčnou kompozici použít bezvodá vehikula, jako jsou například olej ze semen bavlníku, sezamový olej, olivový olej, sojový olej, kukuřičný olej, slunečnicový olej nebo podzemnicový olej a estery, jako například isopropylmyristat. Dále lze použít různá aditiva, která zvyšují stabilitu, sterilitu a isotonicitu kompozice, včetně antimikrobiálních konzervačních látek, antioxidantů, chelatačních činidel a pufrů. Prevenci před účinkem mikroorganizmů lze zajistit pomocí různých antibakteriálních a antifungálních činidel, například parabenů, chlorbutanolu, fenolu, kyseliny sorbové apod. V mnoha případech bude požadováno, aby formulace zahrnovala izotonická činidla, například cukry, chlorid sodný apod. Prolongované absorpce injektovatelné farmaceutické formy lze dosáhnout použitím činidel zpožďujících absorpci, například použitím monostearatu hlinitého a želatiny. Nicméně podle vynálezu by libovolné použité vehikulum, ředidlo nebo aditivum muselo být slučitelné s buňkami.

Sterilní injektovatelné roztoky lze připravit zabudováním buněk použitých podle vynálezu do vhodného množství rozpouštědla, podle potřeby spolu s dalšími různými přísadami.

Farmakologickou formulaci podle vynálezu lze podávat pacientovi v injektovatelné formulaci obsahující libovolný • 99·· 99 99 99 9999

9 999 999

9 · 999· 9 9999 kompatibilní nosič, jakým jsou například různá vehikula, adjuvansy, aditiva a ředidla; nebo lze buňky použité v rámci vynálezu podávat pacientovi parenterálně ve formě pozvolna se uvolňujících subkutánních implantátů nebo cílených dopravních systémů, jakými jsou například monoklonální protilátky, vektorová doprava, iontoforetika, polymerní matrice, liposomy a mikrokuličky. Příklady dopravních systémů použitelných v rámci vynálezu zahrnují: 5,225, 182; 5,169, 383; 5,167, 616; 4,959, 217;4, 925,678; 4,487, 603; 4,486, 194; 4,447, 233; 4,447, 224; 4,439, 196; a 4,475, 196. Mnoho dalších takových implantátů, dopravních systémů a modulů je odborníkům v daném oboru známo.

Farmakologickou formulaci buněk použitých v rámci vynálezu lze podávat pacientovi orálně. V tomto případě lze použít konvenční způsoby, jako například podání buněk v tabletách, suspenzích, roztocích, emulzích, kapslích, prášcích, sirupech apod. Za výhodné jsou považovány známé techniky, které dopravují buňky orálně nebo intravenózně a zachovávají jejich biologickou aktivitu.

U jednoho provedení lze buňky podle vynálezu podávat nejprve intravenózní injekcí, která umožní dosáhnout krevním hladinám vhodné hodnoty. Hladiny účinné látky jsou následně u pacienta udržovány orální dávkovou formou, ačkoliv lze v závislosti na stavu pacienta a výše naznačených parametrech použít i další formy podání. Množství, které má být podáno, se bude u jednotlivých ošetřovaných pacientů lišit a bude se pohybovat přibližně od 100 ng/kg tělesné hmotnosti do 100 mg/kg tělesné hmotnosti na den, a výhodně se bude pohybovat od 10 mg/kg do 10 mg/kg na den.

• 4444 44 4· ·· ···· •4 4444 444

4 4 4444 4 4*44

444 44 4444 4

444 4444 44 4

444 44 44 44 44 444

Příklad 1:

Léčba traumatického poranění mozku (TBI) buňkami stromatu kostní dřeně (MSCs) zlepšuje funkční výstup u krys. Náhrada tkáně není pouze náhradní cestou terapie spočívající v transplantaci buněk. Protože se ukázalo se, že různé růstové faktory mediují opravu a náhradu poškozené tkáně, poskytují MSCs trofickou podporu, která hraje určitou úlohu při léčbě poškozené tkáně. Studovala se a testovala odezva lidských MSCs (hMSCs) na extrakt cerebrální tkáně z TBI s cílem určit, zda prostředí TBI indukuje hMSC diferenciaci a sekreci růstového faktoru. hMSCs Se kultivují spolu s TBI extrakty in vitro a provede se imunocytochemie a ELISA test („kvantitativní sendvičový enzyme-linked imunosorbent test). Výsledky ukazují, že TBI kondiciované hMSCs exprimovaly specifické markéry buněčných proteinů: NeuN pro neuronové jádro (0,2 až 0,5 % celkových hMSCs), Tuj-1 pro rannou neuronovou diferenciaci a neurit, tj. výběžek kmenové buňky (6 až 10 %), GFAP pro astrocyt (4 až 7%) a MBP pro oligodendrocyt (3 až 5%) . Kromě toho, hMSCs ošetřené TBI extrakty odpovídají zvýšením sekrece od mozku odvozeného neurotrofního faktoru (BDNF), nervového růstového faktoru (NGF), základního fibroblastového růstového faktoru (bFGF), vaskulárního endoteliálního růstového faktoru (VEGF) a hepatocytového růstového faktoru (HGF) časově-dependentním způsobem. Tato data demonstrují, že TBI extrakty řídí hMSCs k expresní neurální morfologii a proteinů fenotypických pro mozkovou tkáň. Kromě toho hodnoty ELISA ukazují, že transplantované hMSCs poskytují terapeutický přínos přes responzivní sekreci řady růstových faktorů, které mohou udržovat neuroprotekci a angiogenezi.

·· ···· » · · > · ··· ·· ··»

Buňky stromatu kostní dřeně (MSCs), pokud se transplantují intravenózně do těla krys, u kterých proběhlo traumatické poranění mozku (TBI), podporují neurologickou funkční regeneraci (Lu et al., 2001). Po transplantaci MSCs migrují přednostně do oblasti oslabené tkáně a některé buňky exprimují proteiny fenotypické pro buňky podobné mozkovým endogenním buňkám (Lu et al. , 2001b; Lu et al. , 2001a; Mahmood et al., 2001). Ačkoliv dlouhodobá strategie náhrady poraněných tkání populací kmenových buněk je přímočarým přístupem pro léčbu nervového poranění, nízká úroveň MSC diferenciace při akutní a krátkodobé terapeutické transplantaci TBI modelu pravděpodobně neposkytuje funkční přínos (Lu et al.,2001 b; Lu et al. , 2001a; Mahmood et al., 2001), a mechanizmy poskytující přínos zůstávají neznámé.

MSCs přirozeně produkuj í celou řadu cytokinů a růstových faktorů (Takai et al., 1997; Labouyrie et al., 1999; Bjorklund a Lindvall, 2000; Dormady et al. , 2001), jejichž sekreční vlastnosti jsou ovlivněny jejich mikroprostředím (Dormady et al., 2001). Neurotrofiny, jakými jsou například z mozku odvozený neurotrofní faktor (BDNF) a nervový růstový faktor (NGF) zvyšují přežívání poraněné CNS tkáně jak in vivo, tak in vitro (Hefti, 1986; Kromer, 1987; Koliatsos et al., 1993; Bullock et al., 1999; Gage, 2 000) . Růstovým faktorem, rozsáhlými studiemi zmapovaný v preklinických studiích, je základní fibroblastový růstový faktor (bFGF) (By et al., 1999). bFGF Podávaný intravenózně během několika hodin po vypuknutí ischémie redukuje rozsah infarktu, pravděpodobně v důsledku přímé ochrany buněk na okrajích (polostín) cerebrálního infarktu (mrtvice) (Ay et al. , 1999). Exprese vaskulárního endoteliálního růstového faktoru (VEGF) rovněž podporuje

9999

99

9999 999

9 9 9 999 9 9 999

999 99 999 9 9

999 9999 99 9

999 99 99 99 99 999 angiogenezi a neurální opravu (Papavassilio. u et al.,

1997). Léčba mrtvice pomocí VEGF zlepšuje funkční výsledek (Zhang et al., 2000b). Exprese hepatocytového růstového faktoru (HGF) je přirozeně v mozku po zranění regulována a vykazuje antiapoptotické účinky na mozkové neurony in vitro (Zhang et al., 2000a).

Materiály a metody

Reakční činidla

HBSS („Hankův balancovaný solný roztok), DMEM („Dulbecco's modifikované Eagle's medium), Knockout DMEM, Knockout sérový doplněk, FBS (fetál bovinní sérum), trypsin a EDTA (kyselina ethylendiamintetraoctová) se nakoupily u společnosti GIBCO (Grand Island, NY.). Ficoll se zakoupil u společnosti Pharmacia (Piscataway,NJ). Protilátky proti monoklonálnímu neuronovému nukleárnímu antigenu (NeuN), polyklonálnímu tubulinovému isotypu (Tuj-1), GFAP (gliového fibrilárního kyselého proteinu) a MBP (myelinový základní protein) se zakoupily u společnosti CHEMICON (Temecula,

CA). Souprava testu ELISA („sandwich enzyme-linked imunosorbent assays) pro BDNF, bFGF, VEGF a HGF se získala od společnosti R & D systems (Minneapolis, MN) . Sada NGF ELISA se vyrobila v laboratoři. Anti-β (2.5S, 7S) NGF monoklonální protilátka, anti-p(2.5S, 7S) NGF-p-gal, NGF-β standard se zakoupily u společnosti Roche Molekular Biochemicals (Indianapolis, IN) . Není-li stanoveno jinak, pochází všechna použitá reakční činidla od společnosti Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO).

9999

9 • *·9

Primární hMSCs Kultura

Primární kostní dřeň se získala z 15 ml až 16 ml aspirovaných z horního hřebene kyčelní kosti tří normálních lidských dárců. Každý odsátý vzorek se naředil 1:1 HBSS a překryl přibližně 10 ml Ficollu. Po 30 minutách odstřeďování při 2 500xG se mononukleární buněčná vrstva odstranila z rozhraní a suspendovala v HBSS. Buňky se odstřeďovaly 10 minut při 1 OOOxG a 5 χ 10⁶ buněk se resuspendovalo do jednotlivých lOOmm kultivačních misek (Falcon, Becton-Dickinson, NJ) v kompletním DMEM obohaceném 10% FBS. Buňky se inkubovaly při 37 °C v 5% CO₂ v baňkách po dobu 3 dnů a buňky, které nepřilnuly, se odstranily výměnou media. Potom co kultura dosáhla jednolité vrstvy, zpravidla po 2 až 3 týdnech, se buňky sklízely s 0,05 % hmotn./obj. trypsinu a 0,02 % hmotn./obj. EDTA ve fosfátem pufrovaném solném roztoku (PBS, pH 7,4) 5 minut při 37 °C, opět umístily do misek a ještě jednou kultivovaly 2 týdny a sklidily. Buňky se následně zamrazily pro pozdější použití. Buňky použité v těchto experimentech se sklízely 3 až 5 pasážemi.

Extrakty z traumaticky poraněného mozku

Experimenty se prováděly na samečcích potkana Wistar, jejichž hmotnost činila 250 g až 350 g (n=21). Anestézie se u potkanů indukovala intraperitoneálním podáním chloralhydrátu (35 mg/100 g tělesné hmotnosti). Rektální teplota se udržovala na 37 °C po celou dobu chirurgického zákroku za použití systému vodního topení se zpětnou regulací. Potkani se umístili do stereotaktického rámu.

·· ···· » · · » · ♦ · · ·· · · » · · » · · ··

Poranění se indukovalo zasažením levé kůry mozkové (ipsilaterální kůry mozkové) pneumatickým pístem majícím průměr dotekového konce 6 mm rychlostí 4 m/s a při 2,5mm kompresi (Dixon et al. , 1991) . Kontrolní zvířata podstoupila kraniotomii ale nebylo jim způsobeno žádné poranění. Potkani se utratili 1, 4 a 7 den (n = 6 na časový bod) po operaci. Experimentálním a normálním kontrolním (n = 3) potkanům se bezprostředně odebraly extrakty mozkové tkáně. Segmenty levé hemisféry jak experimentálních potkanů tak kontrolních potkanů se umístily na led a rychle se stanovila mokrá hmotnost v gramech. Následně se kousky tkáně homogenizovaly přidáním DMEM (150 mg tkáň/ml DMEM) a inkubovaly na ledu 10 minut. Homogenát se odstřeďoval 10 minut při 10 000 xG při 4 °C. Supernatant se jímal a skladoval při -80 °C pro ošetření hMSCs.

Buněčná diferenciace

Proteinové fenotypické studie se prováděly tak, že se naočkovalo 1,0 x 10⁶ buněk do 35mm misky a ošetřilo se čerstvým knockout DMEM s 20 % knockout sérovým doplňkem obsahujícím 10 %, 20 % nebo 40 % TBI supernatantu tkáňového extraktu. Všechny buňky se inkubovaly 7 dnů. Stanovení imunoreaktivních neuronových buněk se zakládala na sečtení buněk v 10 nahodilých vizuálních polích (10X objektiv) ve třech kultivačních miskách minimálně během tří různých experimentů. Procenta fenotypických neuronových buněk se vypočetla z celkového počtu buněk.

	··♦·	·· 94	99
• ·	•	9 9 9	4 9	•
•	•	4 9 444	9 *
• •				•
··»	• ·	4 9 4 4	• ·	···

Dvojitě a trojitě barvená imunocytochemie hMSCs se nanesly v hustotě 1,0 χ 10⁶ na skleněná krycí sklíčka (18 x 18 mm²) v 35mm miskách za použití různých výše uvedených ošetření. Buňky na skleněných krycích sklíčcích se použily pro imunocytochemii. Supernatant kultivačního média se použil pro kvantitativní ELISA měření, které bude podrobně popsáno níže. Buňky se propláchly PBS (pH 7,4) a fixovaly 4% paraformaldehydem po dobu 10 minut. Nespecifická vazebná místa se 1 hodinu blokovala 4% normálním koňským sérem, 2 % albuminem bovinního séra a 0,1% Tritonem X-100. Krycí sklíčka se opláchla PBS a 1 hodinu inkubovala primárními protilátkami proti Tuj-1, GFAP nebo MBP. Opět se propláchly PBS a inkubovaly 1 hodinu s fluorescein-isothiokyanátem (FITC) konjugovanou kozí proti-myší nebo proti-králičí IgG sekundární protilátkou. Tuj-1 obarvené hMSC krycí sklíčka se znovu opláchla a přes noc inkubovala s druhou primární protilátkou NeuN, potom se propláchla PBS a 1 hodinu inkubovala s kyaninem-5.18 (Cy5) konjugovanou proti-myší

IgG sekundární protilátkou. 4'b-Diamidin-2-fenylindol dihydrochloridové (DAPI) barvivo se použilo pro určení počtu buněk sečtením jader v poli.

Krycí sklíčka se následně spojila pomocí glycergelového lepícího média.

ELISA

ELISA se použila pro měření sekrece BDNF, NGF,bFGF, VEGF a HGF buňkami hMSCs po 1, 4 a 7 dnech v kultuře kondiciované TBI a supernatantem normálního mozkového ···· ·4 44 44 4444

4 444 444

4 4 4 444 4 4 444

444 44 444 4 4

4 4

444 44

4 4 4

44

4

444 extraktu. Stručně řečeno, všechna reakční činidla a pracovní standardy se připravily podle instrukcí výrobce, a 50 až 150 μΐ standardního nebo zkušebního ředícího roztok se přidalo do každé z 96 jamek ploten. Jamky se lehce promíchaly a inkubovaly 2 až 4 hodiny při teplotě místnosti. Každá jamka se odsála a vypláchla, přičemž celý proces se zopakoval třikrát. Po posledním propláchnutí se veškerý zbývající pufr odstranil odsátím nebo dekantaci jamky a do každé jamky se přidalo 200 μΐ různých konjugátů růstového faktoru. Plotna se následně inkubovala po dobu 2 až 4 hodin při teplotě místnosti. Odsátí a propláchnutí se zopakovaly. Do každé jamky se přidalo 200 μΐ roztoku substrátu inkubovalo 15 až 30 minut při teplotě místnosti. Přidalo se 50 μΐ stop roztoku vše se mírně promíchalo. Optická hustota každé jamky se určila během 30 minut za použití čtečky mikroploten nastavené na 450 nm až 620 nm.

Statistická analýza

Studentův t-test se použil pro hodnocení morfologických rozdílů mezi stimulovanými vzorky a jejich příslušnými kontrolami. Signifikance časových odpovědí se určovala opakovaným měřením analýzy rozptylu (ANOVA). Hodnoty získané analýzou ELISA se linearizovaly vynesením logaritmu různých koncentrací růstového faktoru v závislosti na logaritmu optické hustoty a nejlépe odpovídající linie se určila regresní analýzou, průměr dvou odečtů se provedl pro každý standard, kontrolu a vzorek a odečetla se průměrná nulová standardní optická hustota. Všechny hodnoty jsou vyjádřeny jako průměrná hodnota ± SD. p < 0,05 bylo považováno za statisticky signifikantní.

VÝSLEDKY

Morfologická diferenciace hMSCs na Neuronové buňky

Fázová kontrastní mikroskopie ukazuje normální morfologii fibroblastových hMSCs kultivovaných v kompletním DMEM obohaceném 10 % FBS. Po 7denní expozici, v knockout DMEM s 20 % knockout sérovým doplňkem, některé refrakční buňky vykazovaly krátké výběžky. Několik (přibližně 2 % až 3 % celkových buněk, tabulka 1) buněk vykazovalo neuronovou morfologii u hMSCs kultivovaných v supernatantu extraktu normální mozkové tkáně. Nicméně hMSC proliferace indukovaná normálními mozkovými extrakty (1,56 x 10⁴ ± 0,2 x 10⁴/ml) se porovnávala s hMSCs kultivovanými v knockout DMEM s 20 % knockout sérového doplňku (1,24 x 10⁴ ± 0,5 x 10⁴/ml) (p < 0,05). Diverzní morfologie, ale zpravidla detekovala v hMSCs kultivovaných v supernatantu 20% až 40% TBI extraktu refrakční buňky s dlouhými větvícími se výběžky (délka výběžku >10 pm) a růstovými kónickými koncovými strukturami (přibližně 13 % až 30 % neuronových buněk z celkových buněk, tabulka) a hvězdicovité buňky s malými a mnohopólovými výběžky. Byl zde určitý trend snižovat celkové počty buněk v kulturách TBI (1,08 x 10⁴ ± 0,3 x 10⁴/ml) extraktu, nicméně toto snižování nedosáhlo statistické signifikance. Všechny použité koncentrace TBI tkáňových extraktů indukovaly hMSCs k morfologickému napodobování neuronových buněk.

hMSCs Exprese neuronových markérů

Po 7 dnech v knockout DMEM s 20 % knockout sérového doplňku obsahujícím 10 %, 20 % nebo 40 % kultury TBI • · · • · · ·· · · · · • · · · · · • ····· · · tkáňového extraktu se hMSCs zpracovaly pro imunocytofluorescenci. Ta umožnila dvojité značení pomocí DAPI (purpurově modrá pro identifikaci jader), FITC (zelená) nebo trojité značení CY5 (červeň) hMSCs pro určení, zdali exprimují buňky pocházející z kostní dřeně neuronově specifické markéry pro neurony (NeuN, Tuj-1), astrocyty (GFAP), a oligodendrocyty (MBP). Buněčná jádra se obarvila DAPI. V kulturách obarvených pro imunoreaktivitu exprimovalo 0,2 % až 0,5 % hMSCs NeuN protein, a 6 % až 10 % hMSCs bylo značeno Tuj-1 fenotypem. NeuN a Tuj-1 imunoreaktivita se kolokalizovala ve stejných buňkách (růžová) . 4 % až 7 % z hMSCs odvozených buněk exprimovalo

GFAP imunoreaktivitu: 3 % až 5 % z hMSCs odvozených buněk exprimovalo MBP imunoreaktivitu. Všechny testované koncentrace TBI extraktů indukovaly hMSCs k expresi neuronového fenotypu imuno-reaktivity.

Sekrece růstových faktorů hMSCs ošetřenými supernatantem TBI tkáňového extraktu

Sekrece růstového faktoru buňkami hMSCs po 1, 4 a 7 dnech v knockout DMEM médiu s 20 % knockout sérového doplňku obsahujícího 20 % supernatantu TBI extraktu jsou znázorněny na obr. 1. Extrakt normální mozkové tkáně a TBI tkáně přiměl hMSC k sekreci BDNF (Obr. la) , NGF (Obr. lb) , bFGF (Obr. lc) , VEGF (Obr. Id) a HGF (Obr. Ie) in vitro. Extrakt normální mozkové tkáně zvýšil sekreci všech detekovaných růstových faktorů in vitro v porovnání s kontrolním vzorkem ošetřeným samotným médiem. V každé experimentální skupině se v kondiciovaných TBI extraktech sekrece BDNF, NGF a HGF zvyšovala od 1. dne až po 7. den. VEGF sekrece byla ve skupině normální mozkové tkáně a post • ···

TBI mozkové tkáně podobná. VEGF sekrece byla významně vyšší po 4 a 7 dnech v kultuře než po 1 dni v kultuře. Profily pro bFGF sekreci se lišily od profilů ostatních trofických faktorů, po 1 dnu v kultuře hodnoty bFGF sekrece, na rozdíl od ostatních růstových faktorů, přesahovaly hodnoty sekrece po 4 a 7 dnech, nebo jich alespoň dosahovaly. Tyto hodnoty naznačují, že TBI podporuje sekreci NGF a BDNF hMSCs in vitro a že všechny testované neurotrofiny a růstové faktory vykazuj í významné zvýšení hMSC sekrece v normální mozkové tkáni v porovnání s hMSCs v médiu sérového doplňku.

DISKUSE

Lidské buňky stromatu kostní dřeně ošetřené TBI extrakty se mohou morfologicky diferencovat na neuronové buňky a exprimovat proteiny fenotypické pro cerebrálně parenchymální buňky. hMSCs Sekretují BDNF, NGF, bFGF, VEGF, HGF, a úrovně sekrece závisí jak na době vystavení působení TBI extraktů v kultuře, tak na době, kdy se TBI tkáň extrahovala.

Tyto hodnoty demonstrují, že hMSCs mohou být řízeny k tomu, aby napodobily subpopulace morfologicky neuronových buněk, a to tak, že se vystaví působení TBI tkáňových extraktů in vitro. Ošetřené hMSCs rovněž exprimují markéry pro specifické cerebrální proteiny, jako například NeuN (pro neurony), Tuj-1 (pro ranou diferenciaci a neuritový výrůstek), GFAP (pro astrocyty) a MBP (pro oligodendrocyty).

hMSCs Jsou tedy schopny diferenciace podél několikanásobné buněčné linie. Byly zaznamenány studie, podle ·· ·♦ ·· · · · I • · * · · · • · · · · · · · ·« kterých mohou být MSCs řízeny reakčními činidly k diferenciaci na neuronové buňky v kultuře (Sanchez-Ramos et al., 2 000; Woodbury et al., 2000; Deng et al., 2001) a v poraněné CNS (Azizi et al., 1998; Kopen et al., 1999; Chopp et al. , 2000; Li et al. , 2000; Chen et al. , 2001; Lu et al., 2 001b; Lu et al. , 2 001 ; Mahmood et al. , 2 0 01) . Tyto hodnoty poprvé ukazují, že některé hMSCs, pokud se umístí in vitro do specifického mikroprostředí obsahujícího TBI tkáňový extrakt, odpovídají tím, že napodobují morfologické, a stejně tak fenotypické charakteristiky cerebrálních parenchymálních buněk. Po terapeutické transplantaci mohou tyto buňky poskytovat zdroj buněčné náhrady v TBI poškozeném mozku.

Buňky stromatu kostní dřeně j sou potřebné pro normální krvetvorbu. Byla charakterizována řada rozpustných faktorů sekretovaných MSCs, které mediuji krvetvorbu (Berezovskaya et al. , 1995; Majumdar et al. , 1998; Majumdar et al., 2000). MSCs produkují IL-6,-7,-8,-11,-12,-14,-15 a Flt-3 ligand a indukují ustálené hladiny M-CSF, G-CSF, GM-CSF a SCF. Nicméně je nepravděpodobné, že samotné tyto faktory poskytovaly mechanizmus tvořící základ terapeutického přínosu MSC ošetření TBI. Předpokládá se existence dalších, ještě neznámých faktorů stromatu. Ve zde prezentovaných experimentech, demonstrují data kvantitativní analýzy ELISA, že hMSCs ošetřené TBI tkáňovými extrakty souběžně sekretují BDNF, NGF, bFGF, VEGF a HGF způsobem závislým jak na době kultivace, tak na době, kdy se TBI tkáňový extrakt získal. Intravenózní podání BDNF redukuje rozsah poranění po TBI u potkanů a podporuje neuroprotektivní roli BDNF při poranění mozku (Koliatsos et al., 1993; Bullock et al., 1999). Neuroprotektivní potenciál po NGF injekci nebo skrze implantaci NGF-produkuj icích fibroblastů

NGF ·» · · » · · • · · · • · · neuroprotektivní potenciál transgeníckých myší byl demonstrován u různých příkladů experimentálního poranění mozku (Hefti, 1986; Kromer, 1987; Caneva et al. , 1995;

Gage, 2 000) . Intravenózní podání bFGF redukovalo rozsah infarktu na modelech fokální cerebrální ischémie u potkanů, myší a koček (Sugimori et al., 2001). VEGF, silný promotor angiogeneze, rovněž stimuluje axonální výrůstek, přežívání nervových buněk a proliferaci Schwannových buněk (Sondell et al., 1999) . Ze zvýšení koncentrace VEGF po poranění kyčelního nervu, které bylo způsobeno tlakem, vyplývá, že VEGF hraje určitou roli při regeneraci nervů (Sondell a Kanje, 2001) . Léčba experimentální mrtvice u potkana pomocí VEGF významně redukuje funkční deficity (Zhang et al. , 2000b). hMSCs Konstitutivně produkují HGF (Takai et al. , 1997), a HGF je důležitou molekulou pro opravu tkáně (Mizuno et al. , 2000). Tato zjištění tedy důrazně ukazují na to, že hMSCs jsou senzitivní na prostředí normálního mozku a na TBI prostředí a odpovídaj í významným zvýšením produkce mnoha faktorů. Dané přežívání transplantovaných MSCs v traumaticky poraněné neuronové tkáni (Lu et al.,2001 b; Lu et al., 2 0 01a; Mahmood et al., 2 001), kontinuální a mikroenvironmentálně responzivní sekrece neuroprotektivních a angiogenních faktorů buňkami MSCs při místní úrovní oslabené tkáně je klíčem k funkčnímu úspěchu, který poskytuje MSC transplantace.

Tato data ukazují, že dospělé MSCs lze přimět k tomu, aby překonaly svou mezenchymální povinnost a vytvořily bohatý a dostupný zásobník mozkových buněk a molekul pro léčbu různých neurologických onemocnění. Výsledky zde ukazují, že transplantované MSCs poskytují funkční přínos po TBI (Lu et al., 2001 b; Lu et al. , 2001 ; Mahmood et al., 2 001). Za přínos se považuje zejména to, že lze MSCs • · · · · « ► · ·

I · · · · • · · ·· snadno získat z malého objemu kostní dřeni z vlastního hřebenu kyčelního pacienta a expandovat je v kultuře. MSCs tedy poskytuje snadno přístupný a doplnitelný zdroj autologních buněk pro transplantaci. Tyto buňky poskytují v poraněné tkáni kontinuální zdroj pro život potřebných růstových faktorů nutných pro opravu a plasticitu poraněného mozku.

HGF (Obr. IE) z tkáňového extraktu

Obr. 1 ukazuje sekreci růstových faktorů BDNF (Obr. ΙΑ) , NGF (Obr. 1B), bFGF (Obr. ÍC) , VEGF (Obr. ID) a hMSCs ošetřených supernatantem TBI Sekrece jsou kvantifikovány ELISA testem. Extrakt normální mozkové tkáně zvýšil sekreci všech detekovaných růstových faktorů in vitro v porovnání se kontrolou tvořenou samotným médiem. Sekrece BDNF, NGF a HGF se zvyšovala od 1. dne do 7. dne v kondici ováných TBI extraktech ve všech experimentálních skupinách. VEGF sekrece byla podobná jak v případě skupiny s normálním mozkem, tak v případě skupiny s mozkem po TBI. Sekrece VEGF byla 4. a 7. den v kultuře podstatně vyšší než po 1 dnu v kultuře. Profily sekrece bFGF se lišily od ostatních trofických faktorů. Po 1. dnu v kultuře byly hodnoty sekrece bFGF v porovnání s ostatními růstovými faktory vyšší nebo alespoň stejné jako hodnoty sekrece po 4 dnech a po 7 dnech.

Příklad 2

Způsoby:

Potkani se podrobily přechodné okluzi střední cerebrální artérie a 1 den po mrtvici se jim intravenózně injektovalo 3 x 10^s hMSC. Funkční výsledek se měřil před • · • · · • ·♦ vyvoláním mrtvice a 1, 7 a 14 dní po mrtvici. Smíšená reakce lymfocytů a vývoj cytotoxických T lymfocytů byl mírou imunitní rejekce hMSC. Monoklonální protilátka specifická pro lidská buněčná jádra (mAbl281) se použila pro identifikací hMSC a pro změření neuronového fenotypu. ELISA analyzovala hladiny neurotrofinu v cerebrální tkáni odebrané z těla hMSC-ošetřených nebo neošetřených potkanů. Bromodeoxyuridinové injekce se použily pro identifikaci nově vytvořených buněk.

Výsledky:

Po 14 dnech byla u potkanů ošetřených hMSC zjištěna významná obnova funkce v porovnání s kontrolními potkany, u kterých byla vyvolána ischémie. Několik (1 % až 5 %) hMSC exprimovalo proteiny fenotypické pro mozkové parenchymální buňky. Hladina z mozku pocházejícího neurotrofního faktoru a nervového růstového faktoru se v ischemické okrajové zóně významně zvýšily, přičemž počty apoptotických buněk se významně snížily; podstatně více buněk reagujících s bromodeoxyuridinem se detekovalo v subventrikulární zóně ischemické hemisféry potkanů ošetřených hMSC. hMSC Indukovaly proliferaci lymfocytů bez indukce cytotoxických T lymfocytů.

Závěr:

Neurologický přínos léčby mrtvice u potkanů pomocí hMSC lze odvodit z rostoucí koncentrace růstových faktorů v ischemické tkáni, z redukce apoptózy v penumbrální zóně » · · · «

9 • ··>

·· · 99 poranění a z proliferace endogenních buněk v subventrikulární zóně.

Buňky stromatu kostní dřeně (MSC; rovněž označované jako mezenchymální kmenové a progenitorové buňky) jsou multipotentní a schopné cílené opravy tkání in vitro a in vivo. Obecně MSC dávají vzniknout buňkám kosti, chrupavky, a mezenchymálním buňkám, přičemž se MSC mohou diferencovat na myocyty, hepatocyty, gliové buňky a neurony. MSC mohou procházet hematoencefalickou bariérou a migrovat skrze celý přední mozek a mozeček. Buňky kostní dřeně odvozené z těla samečků zavedené systemicky pomocí infúze do těla samiček ischemických potkanů migrují přednostně do ischemické kůry mozkové. Samčí myší buňky kostní dřeně podávané ozařovaným samičkám myši vstoupí do mozku během dní až týdnů a diferencují se na mikroglie a astroglie. Žádné neuroprotektivní reakční činidlo nezlepšilo výsledek po mrtvici. Zdá se, že terapeutický přínos lidských MSC (hMSC) pro ischémii myokardu a srdeční onemocnění u potkanů je vyvolán náhradou tkáně a indukcí angiogeneze a vaskulogeneze. MSC sekretují celou řadu růstových faktorů a cytokinů, které zpravidla podporují krvetvorné progenitory v proliferaci a diferenciaci. Kostní dřeň obsahuje celou řadu různých primitivních buněk, které sekretují několik angiogenních růstových faktorů zahrnujících VEGF a bFGF. MSC mohou tedy vyvinout funkčně schopnou terapii pro léčbu neurologických onemocnění. Významná funkční obnova byla demonstrována na potkaním modelu okluze střední cerebrální artérie (MCAO) při léčbě MSC odvozenými z hlodavce.

Materiály a způsoby

Příprava hMSC a kinetika růstu in vitro

Pro účely hodnocení kinetiky růstu buňky a expanze hMSC in vitro, se vzorky kostní dřeně získaly punkcí zadního kyčelního hřebene tří zdravých lidských dárců pod lokální anestézií. Mononukleární buňky vzorků kostní dřeně (15 ml až 16 ml na osobu) se separovaly na hustotním gradientu Ficoll (Ficoll-Paque [hustota, 1,073], Pharmacia, CA). Izolování a založení hMSC kultury se provádělo způsobem, který popsal Digirolamo et al. Stručně řečeno, mononukleární buňky se umístily při koncentraci 1 χ 10⁶ buněk/75 cm² do baněk pro kultivaci tkáně ve 20 ml nízkoglukózového Dulbecco modified Eagle media (Gibco-BRL, Grand Island, NY) a doplnily 20 % fetálního bovinního séra (Gibco-BRL), 100 jednotek/ml penicilinu, 100 pg/ml streptomycinu, a 2 mmol/1 L-glutaminu. Po 72 hodinách inkubace se buňky, které nepřilnuly, z kultury odstranily a do baněk se přidalo čerstvé kultivační medium. hMSC, Které přilnuly k plastové stěně, se dělily po 14 dnech (90% spojitost vrstvy) a každých 7 dnu nato se testoval růst buněk a výtěžek buněk. Jaderné dřeňové buňky se sečetly za použití cytometru ve snaze zajistit odpovídající počet buněk pro transplantaci. Dávka 3 χ 10⁶ hMSC se injektovala do těla každého potkana. hMSC Sklizené z pěti pasáží a dále kultivované v knockout Dulbecco modified Eagle mediu (séra prosté; Gibco-BRL) s 20 % knockout média sérového doplňku (Gibco-BRL) se použily pro měření ELISA (n = 6) . hMSC Sekrece neurotrofního faktoru pocházejícího z mozku (BDNF) a nervového růstového faktoru (NGF) se měřila 1, 4 a 7 den v séru prostém Dulbecco modified Eagle mediu.

• 9999 99 9

99 99 999

Reakce smíšených lymfocytů mezi buňkami sleziny potkana a hMSC in vitro

Při studiu antigenem indukované proliferace lymfocytů se 2 x 10⁵ slezinných buněk odebraných zdravým potkanům nebo potkanům, kterým se o dva týdny dříve injektovalo 3 x 10⁶ hMSC, kultivovalo ve trojím vyhotovení s nebo bez ozařovaných (20 Gy) hMSC po dobu 96 hodin při poměru 10:1 respondér (slezinné buňky) - ku - stimulátoru (hMSC). Smíšené buňky se pulzovaly s 3H-thymidinem (0,25pCi/jamka) po dobu 16 hodin. Indukce hMSC proliferace slezinných lymfocytů se měřila tak, že se 3H-thymidin zabudoval do replikujících slezinných buněk. Kultury se sklízely pomocí automatického sklízecího stroje pro sklízení buněk a zabudování 3H-thymidinu se měřilo pomocí kapalinové scintilace.

Vložit rovnici

Cytotoxická odezva T lymfocytů na hMSC u potkana in vitro

T lymfocyty jsou zahrnuty jako iniciátor fatálního iatrogeního onemocnění „štěp-versus-hostitel. Odezva lidského štěpu-versus- hostitelská T buňka potkana se měřila za použití testu 51Cr určeného pro stanovení lytického účinku. Slezinné buňky zdravého potkana nebo slezinné buňky potkanů, kterým bylo o dva týdny dříve injektováno 3 x 10⁶ hMSC, se kultivovaly spolu s ozařovanými hMSC po dobu 5 dnů při poměru 10:1 respondér (slezinné buňky) - ku - stimulátoru (hMSC) . Na konci inkubační periody se životaschopné buňky izolovaly z

9999 • · • 999 · 9 · ·· ·» • 9 9 9 9

99999 9

99 99 kultury a testovaly na cytotoxicitu 51Cr-značených hMSC během 8hodinnového testu uvolňování 51Cr.

Zvířecí MCAO model

Dospělí samečci potkana Wistar (hmotnost 270 g až 300 g) se nakoupili u společnosti Charles River Breeding Company (Wilmington, MA) . Potkani se nejprve znecitlivěli pomocí 3,5% halothanu a v tomto stavu udržovali pomocí 1,0% až 2,0% halothanu v 70% N₂0 a 30% 0₂ za použití obličejové masky. Rektální teplota se udržovala na 37 °C během celého chirurgického zákroku za použití systému vodního topení se zpětnou regulací. Dočasná MCAO se indukovala pomocí způsobu intraluminální vaskulární okluze modifikované v laboratoři. Pravá společná krční tepna, vnější krční tepna a vnitřní krční tepna se obnažily. Délka 4-0 monofilní nylonové sutury (18,5 mm až 19,5 mm), stanoveno na základě hmotnosti zvířete, jejíž konce se zaoblily podržením v blízkosti plamene, se posouvala od vnější krční tepny do průsvitu vnitřní krční tepny, dokud nebyla blokována začátkem MCA. Dvě hodiny po MCAO se zvířata reanestetikovala pomocí halothanu, a reperfúze se provedla tak, že se sutura vytahovala až do okamžiku, kdy její konec opustil průsvit vnější krční tepny.

Experimentální skupiny

Skupina 1

Při měření neurotrofinů potkani podstoupili MCAO bez léčby (n = 3) nebo se jim injektovalo 3 x 10⁶ MSC (n = 3) nebo 3 x 10⁶ jaterních fibroblastů (n = 3) v 1 ml celkového

9999

9 9 9

9 9 9 9 9 • · 999 9 9 999

99 999 9 9 ·· ·9 99 999 objemu tekutiny do ocasní žily 1 den po mrtvici. Studie jaterních fibroblastu představovala omezenou kontrolní studii, při které se fibroblasty odebíraly potkanům stejného druhu Wistar, aby se vyloučila neočekávaná imunitní odezva kontrolních buněk na hostitelské potkany. Potkani se utratili 7 dní po MCAO a použili se k měření neurotrofinů. Jako kontrolní subjekty se rovněž použili tři zdraví potkani.

Skupina 2

Potkani podstoupili MCAO společně s 3 x 10⁶ hMSC (n = 9) nebo 3 x 10⁶ jaterních fibroblastů získaných z těla potkana (n = 9; kontrolní), které se injektovaly 1. den nebo podstoupili samotnou MCAO bez buněčných donorů (n = 10; kontrolní) . Potkani se utratili 14 dní po MCAO a použili pro měření buněčné morfologie. Protože MCAO indukuje proliferaci endogenních neuronových kmenových a progenitořových buněk v ependymální a subependymální zóně (rovněž označovaných jako ventrikulární zóna/subventrikulární zóna [VZ/SVZ]), 17 potkanů ve skupině 2 přijímalo denně intraperitoneální injekce bromodeoxyuridinu (Brdu, thymidinový analog, který označuje nově syntetizovanou DNA [50 mg/kg]; Sigma, St. Louis, MO) a následně po dobu 14 dnů po MCAO s nebo bez intravenózní injekce donorových buněk za účelem identifikace proliferace buněk. Jako kontrola se dalším dvěma zdravým zvířatům podávaly po dobu 14 dnů před smrtí denně intraperitoneální injekce 50 mg/kg Brdu.

4« · 4 • 4 • 4 4 444 444 • · 4 4444 4 4444

444 44 444 4 4

444 4444 44 4

444 44 44 44 44 444

Testování chování

Všechna zvířata se podrobila testům chování před MCAO a 1, 7 a 14 dnů po MCAO, přičemž test prováděla pověřená osoba naslepo, aniž by byla informovaná o složení testované skupiny. Pro měření somatosensorické asymetrie předních končetin se jako bilaterálně taktilní stimuly použily malé podlepené papírové body (113,1 mm²), které se aplikovaly na vřetenní stranu zápěstí každé přední končetiny při pěti pokusech denně v domácí kleci. Časy, kdy byly na potkana aplikovány a následně odstraněny stimuly, se zaznamenaly.

Mezi jednotlivými testy byla pauza alespoň 5 minut. Zvířata se učila odstraňovat adhezívní body 3 dny před chirurgickým zákrokem, potom, co se potkanům podařilo odstranit body během 10 sekund, se podrobily MCAO. Modifikované skóre neurologické závažnosti (mNSS) se použilo pro hodnocení různých aspektů neurologické funkce. mNSS je kombinací motorických (stav svalstva a abnormální pohyb), sensorických (zrakový, hmatový a proprioceptivní), a reflexních testů.

4444

44

4· > 4 · > 4 4 44 » 4 4 4 » 4 4 4

44

44

44 44

4 • 444 4 1

Tabulka 1: Test modifikovaného skóre neurologické závažnosti

Motorické testy Body

Zvedání potkana za ocas = Flexe předních končetin 1 = Flexe zadních končetin = Posun hlavy >10“vzhledem k vertikální 30 s

Chození po podlaze (normální = 0; maximum = 3) = Normální chůze ose během = Neschopnost rovné chůze = Stáčení se směrem k paretické straně = Pád na paretickou stranu

Sensorické testy 2 = Test umisťování (zrakový a hmatový test) = Proprioceptivní test (hluboké smyslové vnímání, tlačení tlapek proti hraně stolu ve snaze stimulovat svalstvo končetin)

Testy na ramenových vahách (normální = 0; maximum =6) 6 = Váhy v klidové poloze = postranní uchopení ramena váhy = Svírání ramene jedna končetina padá z ramene = Dvě končetiny padají z ramene nebo kloužou po rameni (> 60 s) = Pokusy o získání rovnováhy na rameni ale s pádem (> 40 s) = Pokusy o získání rovnováhy na rameni ale s pádem (> 20 s) = Pády: žádný pokus o získání rovnováhy na rameni nebo o zavěšení na rameno (< 20 s)

Absence Reflexů a abnormální pohyby ··»· <· · · • · · · 999 · · ··· • ···»··»·· · • ♦ · · · · 9 9 9 · ··· ·· 99 99 99 999 = Reflex ušního boltce (hlava se třese jakmile se dotýká

Test modifikovaného skóre neurologické závažnosti

Příprava extraktu z ischemického mozku:

Sedm dnů po MCAO, se potkani ve skupině 1 anestetikovali halothanem; mozky se odstranily a ischemické hemisféry se nařízkovaly na led. Vzorky se následně uskladnily při -80 °C. Potom se každý vzorek tkáně homogenizoval v 1 g/ml homogenátového pufru. Homogenát se odstřeďoval (10 000 G) 10 minut při 4 °C a supernatant se jímal za účelem měření sekrece.

Měření sekrece	růstových	faktorů	za	použití	ELISA
„sandwich
Sada BDNF	ELISA se	získala	od	R & D	Systems
(Minneapolis, MN)	, a ELISA	se připravila	podle instrukcí

výrobce. Roztok ELISA se připravil pro NGF. Anti-p(2.5S, 7S) NGF monoklonální protilátku, anti-β(2.5S,7S) NGF-p-gal a NGF-β standard se zakoupily u společnosti Roche Molekular Biochemicals (Indianapolis, IN). Ve stručnosti, supernatant jímaný z ischemické tkáň nebo séra prostého kultivačního media z hMSC se rozdělil do tří 100μ1 až 200μ1 vzorků. Monoklonální protilátky proti BDNF a NGF se použily podle instrukcí výrobce. Potom se ke každé primární protilátce přidala druhá specifická polyklonální protilátka.

Po inkubační periodě s chromogenním substrátem, se vyvíjela barva, a to úměrně množství růstových faktorů a

9 9 9 9

• · « • · 999 • · 999 9 • 9 · 9 9 ·

9 9 9 ·

9

999 měřila se za použití mikroplotnového čítače (450 nm až 620 nm).

Histologické, imunohistochemické a apoptotické stanovení

Příprava řezů

Potkani skupiny 2, kteří přežili do 14 dne po MCAO, se použili pro morfologickou analýzu. Tehdy se potkani anestetikovali ketaminem (44 mg/kg až 80 mg/kg intraperitoneálně) a xylazinem (13 mg/kg intraperitoneálně) a vaskulární systém se transkardiálně perfundoval heparinizovaným fosfátem pufrovaným solným roztokem (PBS) a následně 4% paraformaldehydem v PBS. Mozky se ponořily do 4% paraformaldehydu v PBS a v této lázni se ponechaly 2 dny, načež se mozkové tkáně nařezaly na sedm stejně odsazených (2 mm) koronárních bloků. Tkáně se zpracovaly a z každého bloku se vyřízl lOOpm silný koronální řez Vibratome (pět řezů Vibratome na blok). Všechny zbývající bloky mozku se zapouzdřily do parafínu a vyřízla se řada sousedních 6pm silných řezů.

Měření rozsahu infarktu

Vždy jedno z každého koronálního parafinového sklíčka (6pm tloušťka) ze sedmi bloků se zabarvilo hematoxylineosínem (H-E). Sedm mozkových sklíček se stopovalo za použití Global Lab Image analytického systému (Data Translation, Malboro, MA) . Vypočetla se oblast nepřímého poranění, ve které se byla nedotčená plocha ipsilaterální hemisféry odečtena od plochy kontralaterální hemisféry.

·· ·· » · · t · ··· •ft ftft·· • · · ftftft·

Rozsah poranění je prezentován jako objemové procento poranění vztaženo na kontralaterální hemisféru.

Imunohistochemické zabarvení

Po blokaci v normálním séru, se všechny řezy Vibratome ošetřovaly monoklonální protilátkou specifickou pro lidská jádra (mAbl281; Chemicon, Temecula, CA) naředěnou v poměru 1:100 v PBS po dobu 3 dnů při 4 °C. Po následné inkubaci fluoresceinisothiokyanátem-konjugované králičí protilátky proti myšímu IgG (ředění, 1:100; Dakopatts, CA), se sekundární protilátka navázala na první protilátku to k mAbl281. Buňky odvozené hMSC se identifikovaly za použití morfologických kritérií a imunohistochemického zabarvení pomocí mAbl281 přítomné v buňkách dárce ale nikoliv v parenchymálních buňkách. Pro vizualizaci buněčné kolokalizace mAbl281 a markérů specifických pro daný ve stejných buňkách, se použilo dvojité sériových referenčních řezech vibratome buněčný typ obarvení na (100 pm) vycentrovaných v ischemickém jádru (koordináty bregma -1,0 1,0 mm) . Každý koronální řez se ošetřil první primární protilátkou, mAbl281, výše popsaným způsobem, a následně se 3 dny při 4 °C specifickými sekundárními ošetřoval pro buněčný typ primárními protilátkami konjugovanými na cyanin-5.18 (Calbiochem, CA): neuronový nukleární antigen (NeuN pro neuronová jádra [ředění, 1:200]; Chemicon), se submikroskopickou strukturou související protein 2 (MAP-2 pro neuronové dendrity [ředění, 1:200]; Sigma), gliový fibrilní kyselý protein (GFAP pro astrocyty [ředění, 1:1000]; DAKO,Carpinteria, CA), a vWF (pro endotheliální buňky [ředění, 1:400]; DAKO). Na negativní kontrolní řezy každého zvíře se aplikovány • ·«·· 99· 99 99 9999 • 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 999 · · ··« • · * » · · 9 9 9 9

999 99 99 99 99 999 identické přípravky pro imunohistochemické zabarvení s tou výjimkou, že se vynechaly primární protilátky.

Laserová scannovací konfokální mikroskopie

Koronální řezy vibratome se analyzovaly pomocí laserového scannovacího konfokálního zobrazovacího systému Bio-Rad MRC 1024 (argon a krypton) namontovaného na mikroskop Zeiss (Bio-Rad, Cambridge, MA) . V případě imunofluorescencí-značených řezů se zelené (fluorescein isothiokyanát) a červené (cyanin-5.18) fluorochromy na řezech excitovaly laserovým paprskem při 488 nm a 647 nm, a emise se následně získaly pomocí trubice fotonásobiče přes 522nm a 670nm emisní filtry. Celkový počet mAbl281pozitivních buněk se určoval na pěti po sobě jdoucích řezech (lOOprn silných) každého bloku ze všech sedmi bloků za použití XYZ stupňového kódovacího zařízení pro sčítání buněk. 26 Celkový počet mAbl281-pozitivních buněk celého předního mozku se následně vypočetl sečtením počtů mAbl281pozitivních buněk pro všech sedm bloků. Dvojitým zabarvením se spočetlo celkem 500 mAbl281-pozitivních buněk na zvíře pro získání procenta mAbl281-pozitivních buněk kolokalizovaných markéry specifickými pro daný buněčný typ (NeuN, MAP-2, vWF a GFAP) .

Barvení apoptotických buněk

Pět koronálních parafinových řezů (6pm silných ; 25pm interval) z výše označeného bloku, koordinovaných na bregmatu -1,0 1,0 mm, se použilo pro analýzu apoptotických buněk. Tyto řezy se obarvily způsobem značení TUNEL ·«··

·· ···· • · · • · ··· • · ··· ·· ·· ··· (terminál deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end-labeling) pro in šitu detekci apoptózy (ApopTag kit; Oncor, Gaithersburg, MD). Po utlumení endogenní peroxidázové aktivity peroxidem vodíku v PBS se řezy umístily do terminální deoxynukleotidyltransferasy. Na řezy se aplikovala anti-digoxigenin-peroxidasa, přičemž peroxidasa se detekovala pomocí 3,3'-diaminobenzidinu. Po TUNEL obarvení se řezy obarvily kontrastní barvou Mayer hernatoxylinem. Negativní kontrolní řezy poházely z každého bloku. V preparátech TUNEL se pouze buňky obsahující tmavě hnědá apoptotická těla (> 2) označily jako apoptotické buňky.

Obr. 2 znázorňuje standardní koronální řez identifikovaná v hladině přední komisury mozku potkana, která dělí pravou hemisféru na tři podoblasti (ischemické jádro, ischemická okrajová zóna a VZ/SVZ). Měřily se exogenní hMSC (mAbl281), pro buněčný typ pozitivní buňky (NeuN, MAP-2, GFAP, a vWF) a apoptotické buňky (TUNEL-pozitivní buňky) v těchto oblastech ipsilaterální a kontralaterální hemisféry. Pro identifikaci těchto· tří oblastí: ischemické jádro (difúzní bledost eosinofilního pozadí) a vnitřní okrajová zóna (vakuolizace nebo houbovitost neuropilu) a vnější okrajová zóna (od houbovitosti ke zcela nepoškozené tkáni [většina buňky byla nepoškozených; nicméně bylo možné pozorovat roztroušené poraněné a mrtvé buňky]) ischemické léze se použily histologické znaky s rutinním H-E barvením a tvarové alterace a schopnost obarvení buněk. Obr. 2 ukazuje standardní koronální řez identifikovaný na úrovni přední komisury mozku potkana, která dělí pro účely analýzy odezvy na léčbu pravou hemisféru na tři podoblasti (ischemické jádro [IC]; ischemickou okrajovou zónu [IBZ]; a ventrikulární zónu/subventrikulární zónu [VZ/SVZ]) a osm • · · · • ··· · ·· ·· ·· • · · · · · · • · · · ··· · • ··· ·· · · · • · · ···· · ····· · · ·· · · 51 polí (1, kůra mozková v IC; 2, stratům v IC; 3-4, kůra mozková v IBZ; 5-6, stratům v IBZ; a 7-8, stratům v VZ/SVZ).

Statistická analýza

Všechna měření se prováděla naslepo. Skóre chování (získaná na základě testu odstraňování adhezívního bodu a mNSS) se hodnotila z pohledu normálnosti. Opakovaná analýza měření se s cílem určit vliv léčby na skóre chování. Analýza se zahájila hodnocením interakce léčba - čas při úrovni signifikance 0,1; hodnocení celkového vlivu léčby se provádělo, pokud nebyla na úrovni signifikance 0,05 detekována žádná interakce. Podskupinová analýza vlivu léčby na každé skóre chování v každém čase se prováděla na úrovni signifikance 0,05, pokud nebyla zjištěna žádná interakce léčba - čas na úrovni signifikance 0,1 nebo celkový vliv léčby na úrovni signifikance 0,05. Jinak se podskupinové analýzy prováděly pouze jako ověřovací. Studentovy t-testy se použily pro hodnocení diferencí mezi kontrolní skupinou a léčenou skupinou ve smyslu rozsahu poranění a počtu buněk. ELISA data se linearizovala vynesením logaritmu BDNF a NGF koncentrací v závislosti na logaritmu optické hustoty do grafu a regresní analýzou se určila nejlépe odpovídající přímka. Pro každý standard, kontrolu a vzorek se vytvořily průměrné duplicitní odečty a odečetla se průměrná nulová standardní optická hustota. Jsou prezentovány průměry (SD) a p hodnota pro testování diference mezi léčenou a kontrolní skupinou.

Výsledky

Kinetika růstu hMSC in vitro

U hMSC odvozených z kostní dřeně tří zdravých lidských dárců se testovala expanze kultury. U primární kultury rostly hMSC jako morfologicky homogenní populace fibroblastu-podobných buněk. Během následujících pasáží, zpravidla v 7denních intervalech, rostly hMSC jako závity of hustě shluklých vřetenovitě tvarovaných buněk. Po pěti týdnech (čtyři pasáže), se hMSC výtěžek pohyboval mezi 5,4 a 6,6 χ 10⁷ buněk (tabulka 2).

Tabulka 2 Kinetika růstu hMSC

Dárce č. Pasáž 1	Kostní dřeň, ml Pasáž 2	Jednoj aderné buňky, 10s, Pasáž 3	hMSC (106) (7 d na každou pasáž) Pasáž 4
1	16	100	1,65	9,0	18,9	53,6
2	16	130	3,21	14,3	35,8	64,3
3	15	16	10,8	18,9	28,8	66,6
hMSC = Lidské buňky stromatu kostní dřeně

Smíšená reakce lymfocytu a cytotoxická odezva T lymfocytu mezi slezinnými buňkami potkana a hMSC in vitro. hMSC Významně zvýšily proliferaci zdravých slezinných buněk potkana (stimulační index = 18,8) v porovnání s néstimulovánými slezinnými buňkami (obr. 2A). Proliferace slezinných buněk izolovaných z potkanů injektováných lidskými buňkami hMSC se rovněž po restimulaci lidskými buňkami hMSC in vitro zvýšila (stimulační index = 15,6); nicméně, proliferační odezva u ·· ·· • · • · · · těchto buněk se významněji nelišila od proliferační odezva slezinných buněk zdravého potkana. Tyto údaje naznačují, že ačkoliv jsou hMSC schopny indukovat primární proliferační odezvu u slezinných lymfocytů potkana, podání hMSC potkanům nesenzitivuje lymfocyty in vivo pro sekundární in vitro proliferační odezvu.

Obr. 8A ukazuje smíšenou reakci lymfocytů mezi slezinnými buňkami potkana a lidskými buňkami stromatu kostní dřeně (hMSC): 2 x 10⁵ slezinných buněk zdravého potkana (N-Spl) nebo slezinných buněk potkanů léčených o dva týdny dříve intravenózně hMSC (T-Spl) se 96 hodin kultivovalo ve trojím provedení s nebo bez ozářených (20 Gy) hMSC při 10:1 poměru respondér:stimulátor. Kultury se 16 hodin pulzovaly s 3H-thymidinem (0.25 pCi/jamka) a následně sklidily pomocí automatického stroje na sklízení buněk. Zabudování 3H-thymidinu se měřilo kapalinovou scintilací. Mezi slezinnými buňkami získanými z hMSCléčených potkanů a neléčených potkanů nebyly detekovány žádné rozdíly. SI = stimulační index. (B) Slezinné buňky potkana (1 x 10⁷) se kultivovaly s 1 x 10⁶ ozářenými (2 0 Gy) hMSC po dobu 5 dnů. Na konci inkubační periody se životaschopné buňky izolovaly z kultury a testovaly na cytotoxicitu pro 5lCr-značené hMSC v 8hodinovém testu uvolňování 51Cr při poměrech efektor:cíl (E:T). Slezinné buňky potkana negenerovaly cytotoxickou odezvu T lymfocytů vůči hMSC. Všechny hodnoty jsou vyjádřeny jako průměry SD. Obr. 8B demonstruje <4% lézi cílových buněk (hMSC) slezinnými buňkami zdravého potkana inkubovaných s nebo bez stimulátorů (hMSC). Podobně aktivace slezinných buněk in vivo podáním hMSC, po které následovala 5denní restimulace pomocí hMSC v kultuře v nich neevokovala cytotoxicitu, což

naznačuje, že hMSC neindukuje cytotoxickou odezvu T lymfocytu u slezinných buněk potkana.

Testování neurologické funkce

Dnů po mrtvici se u potkanů inj ektováných 3 χ 10⁶ hMSC 1 den po MCAO zjistila obnova funkce prokázaná testem odstranění adhezívního bodu (p <0,05; obr. 3A) a mNSS testem (p <0,05; viz obr. 3B) v porovnání s kontrolními potkany, u kterých byla vyvolána MCAO a potkany, kterým se injektovalo 3 χ 10⁶ jaterních fibroblastů potkana.

Obr. 3 ukazuje výsledky testu funkčního chování (A: test odstranění lepícího bodu; B: test modifikovaného skóre neurologické závažnosti [mNSS]) před a po okluzi střední cerebrální artérie (MCAO). U potkanů se způsobila buď pouze 2hodinová MCAO (n = 10) nebo se jim injektovaly kultivované lidské buňky stromatu kostní dřeně (hMSC) (n = 9) nebo jaterní fibroblastové buňky potkana (LC; n = 9) 1 den po MCAO. U potkanů léčených hMSC se v porovnání s kontrolními subjekty detekovala signifikantní funkční obnova. Prázdný kruh = MCAO; Plný kruh = +LC; trojúhelník = +hMSC.

Kvantifikace ELISA Sandwich

Za použití postupů ELISA sandwich se zjistilo zvýšení sekreční hladiny BDNF (969 ± 198 pg/ml vs. 434 ± 59 pg/ml a 498 + 76 pg/ml) a NGF (1,227 + 111 pg/ml vs. 834 + 123 pg/ml a 980 + 55 pg/mL) (p <0,05) v ischemické hemisféře hMSC-léčených potkanů v porovnání se zvířaty 7 dní po samotné MCAO bez buněčné léčby a s potkany, kteří se léčily jaterními fibroblasty potkana. In vitro data • ···· ·· ·· • · · · · · • · · · 999 naznačuj í, že hMSC sekretuj í BDNF a NGF časově dependentním způsobem. Signifikantní zvýšení BDNF a NGF bylo detekováno v séru prostém médiu po 4 a 7 dnech v kultuře v porovnání s 1. dnem (tabulka 3).

Tabulka 3 hMSC sekrece neurotrofinu v kultuře

Čas neurotrofinu, d	Průměrná hladina proteinu ± SD, pg/ml
BDNF
1	0 + 0
4	57 ± 12*
7	141 ± 28*
NGF
1	162 ± 22
4	321 ± 74*
7	581 ± 147*
Zvýšení BDNF a NGF se detekovalo v séru prostém mediu 4. a 7. den v kultuře a v porovnání s 1. den v kultuře *P < 0,05
hMSC - Lidské buňky stromatu kostní dřeně; BDNF = z mozku odvozený neurotrofní faktor; NGF = nervový růstový faktor

Morfologická analýza

Potkani, u kterých se navodila 2hodinová MCAO, se infundovaly 3 x 10⁶ hMSC 1 den po ischémie a utratili 14 dnů po MCAO za účelem morfologické analýzy. V koronálních řezech obarvených H-E, bylo možné pozorovat tmavé a červené neurony v ischemickém jádru všech potkanů, kteří podstoupili MCAO s i bez hMSC injekce. Žádná signifikantní redukce objemu ischemického poškození nebyla u hMSCléčených potkanů (rozsah zranění, 33,3% + 7,6%) detekována • · » ··· v porovnání s kontrolními potkany, kteří podstoupili pouze MCAO (36,3 % ± 10,5 %) nebo potkanů, kterým se injektovaly 14 dnů po MCAO jaterní fibroblasty potkana (34,6 % ± 9,1 %) .

V mozkové tkáni se buňky odvozené z hMSC charakterizovaly na základě kulatých-až-oválných jader identifikovaných lidskou specifickou protilátkou mAbl281. hMSC (124 x 10³ ± 46 x 10³; 4% 3 x 10^s hMSC) přežily a byly distribuovány v celém ischemickém poškozeném mozku potkanů, kterým byly aplikovány. Ačkoliv byly mAbl281-reaktivní buňky pozorovány ve více oblastech ipsilaterální hemisféry, včetně kůry mozkové a striata, většina mAbl281-značených hMSC (60% z celkového počtu 124 x 10³ ± 46 x 10³) byly lokalizovány v ischemické okrajové zóně. Pár buněk bylo rovněž možné pozorovat v kontralaterální hemisféře (9 x 10³ ± 2 X 10³; 0,3% 3 X 10^s hMSC) .

Imunohistochemie dvojitého barvení odhalila, že několik mAbl281-pozitivních buněk bylo reaktivní pro použité neuronové markéry. Procenta mAbl281-značených hMSC, které exprimovaly NeuN, MAP-2, GFAP, a vWF byla 1 %, 1 %, 5 % a 2 %. Obrazy laserové scannovací konfokální mikroskopie ukazovaly na kolokalizaci monoklonální protilátky specifické pro lidská jádra mAbl281 (zelená pro hMSC identifikaci) s NeuN, MAP-2, GFAP nebo vWF (červená pro markéry specifické pro daný buněčný typ) v mozku potkana, kterému byly aplikovány (obr. 4, a až h). Většina mAbl281pozitivních buněk obkružovala cévy, přičemž několik buněk se nachází v parenchymu.

Obr. 9 ukazuje mikrofotografii ukazující morfologické charakteristiky exogenních lidských buněk stromatu kostní dřeně (hMSC) a endogenních mozkových buněk v mozku potkana.

• ···· 44 ·· ·· 4··· • · · 444 444 • · · · 4 4 4 4 4444 • 444 44 444 4 4 <·· 4444 44 4

444 44 44 44 44 444

Za použití dvojitého imunofluorescenčního barvení se mAbl281 (monoklonální protilátka specifická pro lidská jádra)-reaktivní buňky nacházely v poškozené oblasti mozku.

Obrazy laserové scannovací konfokální mikroskopie ukazovaly mAbl281 (zelená pro hMSC [a, c, d, f-h]), neuronový nukleární antigen (NeuN) (b, c), s mikroskopickou strukturou související protein 2 (MAP-2) (e, f) , gliový fibrilový kyselý protein (GFAP) (g), a vWF (h) (červená pro markéry specifické pro buněčný typ) v mozku potkana, kterému se aplikovaly. Měřítko = 50 pm.

Za použití TUNEL (obr. 7 a, c a d) a H-E zabarvení (viz obr. 7b) se sečetly apoptotické buňky s typickými tmavě hnědými zakulacenými nebo oválnými apoptotickými těly v ischemické okrajové zóně. V referenční koronální 6 pm silné sekci byl zjištěn snížený počet apoptotických buněk (38,5 ± 3,4 vs. 82,6 ± 3,8 nebo 76,4 + 6,8; p <0,05) v ischemické okrajové zóně hMSC-léčených potkanů v porovnání se zvířaty 14 dnů po MCAO bez hMSC-léčby nebo ischemickými potkany ošetřenými jaterními fibroblasty.

Obr. 7 ukazuje, že apoptotické buňky (a: (terminál deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick endlabeling) [TUNEL]-pozitivní buňky [šipky]; b: hematoxylineosin [Η & E] zabarvení) jsou po samotné okluzi střední cerebrální artérie (MCAO) přítomny v ischemické okrajové zóně. Snížení apoptotických buněk (d: vyšší přežití modřhematoxylinovým protibarvivem zabarvených buněk; hroty šipek) se detekovalo u potkanů, kterým se aplikovaly injekcí lidské buňky stromatu kostní dřeně (hMSC), v porovnání s potkany, kterým se aplikovaly injekcí jaterní fibroblasty (c). Několik bromodeoxyuridin (BrdU; markér pro nově syntetizovanou DNA)-pozitivních buněk (šipky) se nacházelo ve ventrikulární zóně/subventrikulární zóně • 4·4 4 44 44

4 444 • 4 44444 • 4 4 4 4 4

4 4 4 4 4

444 44 44 44 ·· 4444 • 4

444 (VZ/SVZ) zdravého mozku (e). Zvýšení BrdU-pozitivních buněk se detekovalo ve VZ/SVZ ipsilaterální hemisféry potkanů, kteří podstoupili samotnou MCAO (f) a potkanů, kterým se aplikovaly injekcí jaterní fibroblasty (g) . Signifikantní zvýšení dBrdU-pozitivních buněk se detekovalo ve VZ/SVZ u potkanů léčených hMSC (h) v porovnání s potkanů, kteří podstoupili MCAO s nebo bez léčby jaterními buňkami. Měřítko = 15 pm.

Několik BrdU-pozitivních buněk bylo přítomno ve VZ/SVZ (viz obr. 7 e až h) . Signifikantně více BrdU-reaktivních buněk se detekovalo ve VZ/SVZ ipsilaterální hemisféry potkanů, kteří podstoupili MCAO s hMSC léčbou (viz obr. 7h) , než u potkanů, kteří podstoupili pouze MCAO (viz obr. 7f) , nebo potkanů léčených jaterními fibroblasty (viz obr. 7g) . Pět koronálních parafinových řezů (6 pm silných; 25pm interval) ze standardního referenčního řezu s koordinátami bregma -1,0 mm 1,0 mm se použilo pro analýzu BrdU-reaktivních buněk. Počet BrdU-pozitivních buněk na řez ve VZ/SVZ potkanů, kteří podstoupili MCAO s hMSC léčbou (95,3 ± 24,1) bylo významně vyšší než ve VZ/SVZ potkanů, kteří podstoupili pouze MCAO (27,5 ± 18,5), nebo ischemických potkanů léčených jaterními fibroblasty (37,8 ± 11,2). Vyšší počet BrdU-pozitivních buněk na řez 14 dnů po mrtvici exprimovaly NeuN (2,5 ±0,4 vs. 0,5 ±0,6 nebo 0,6 ± 0,4; p < 0,05) a GFAP (4,4 ± 2,3 vs. 1,4 ± 1,1 nebo 1,7 ± 0,5; p < 0,05) potkanů, kteří podstoupili MCAO s hMSC léčbou, než potkanů, kteří podstoupili pouze MCAO, nebo potkanů léčených jaterními fibroblasty.

• · · 9 9 99 99

9 9 9 9

9 · · 999

9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 • 99 99 99 99 ···· • 9 • 999

Diskuse

Intravenózní injekce hMSC aplikovaná 1 den po mrtvici významně zlepšila funkční výsledek, hodnoceno podle somatosensorického skóre a mNSS, v porovnání s hodnotami potkanů, kteří podstoupili pouze MCAO nebo jim byly injekcí aplikovány jaterní fibroblasty potkana. Tento přínos může odrážet produkci růstových faktorů, včetně neurotrofinů, které mohou podporovat opravu poškozených parenchymálních buněk, redukovat apoptózu v ischemické okrajové zóně a podporovat proliferaci a diferenciaci endogenních neuronových kmenových a progenitorových buněk ve VZ/SVZ u potkanů po mrtvici.

Neuronové štěpy zvrátily funkční nedostatky související s poškozením mozku. Prezentované hodnoty lidský štěp-versus-potkan hostitel odpovídají zjištěním, která byla pořizěna při jiných studiích ukazujících na preferenční usídlení alogenních intravenózně transplantovaných buněk kostní dřeň v místě poranění po zahájení permanentní MCAO u ozářených zvířat 7 a přechodně 2 hodiny MCAO u neozářených zvířat. Morfologická analýza naznačila, že hMSC mají schopnost selektivně migrovat do ischemicky poškozeného mozku potkana. hMSC přežívají a několik roztroušených exprimuje proteinové markéry pro parenchymální mozkové buňky.

Ačkoliv mohou mít hMSC schopnost nahrazovat ztracené neurony, je pravděpodobné, že mechanizmů poskytujících terapeutický přínos je více. Získaná data ukazují, že injekce 3 x 10⁶ hMSC aplikovaná 1 den po mrtvici zvyšuje funkční výsledek podle somatosensorického skóre a jejich NSS v porovnání s neléčenými potkany 7 a 14 dnů (p <0,01)

99 > · · ► 9 9 9 9 ·· ···· • * • ··· po podání. Nicméně pouze 1 %, 5 % a 2 % hMSC exprimuje proteiny neuronových, astrocytových a endoteliálních buněk a je příliš brzo pro úplnou buněčnou diferenciaci a integraci do tkáně. Je tedy pravděpodobnější, že mediátor krátkodobého přínosu je to, že hMSC doplňují oslabené tkáně řadou růstových faktorů, které podporují funkční regeneraci zbývajících neuronů a redukují apoptózu v ischemické okrajové zóně. MSC se mohou přímo podílet na podpoře plasticity ischemických poškozených neuronů nebo na stimulaci gliových buněk k sekreci neurotrofinů (např. BDNF a NGF). Interakce hMSC s mozkem hostitele může vést hMSC a parenchymální buňky k hojné produkci trofických faktorů, což může přispívat k obnově ztráty funkce, k níž došlo v důsledku léze. 30,31 Při použití způsobů ELISA sandwich v rámci této studie, se prokázalo, že úrovně sekrece BDNF a NGF 7 dnů po MCAO se v ischemické hemisféře hMSC-léčených potkanů významně zvýšily v porovnání se zvířaty, u kterých proběhla samotná MCAO bez buněčné léčby a u kterých proběhla MCAO s léčbou jaterními buňkami potkana. Měřila se sice přítomnost BDNF a NGF v ischemickém mozku, nicméně nebyla vyloučena možnost, že další růstové faktory (jako například angiogenní faktory VEGF32 a HGF33) mohou alespoň částečně zlepšovat funkční obnovu zvýšením angiogeneze. Angiogeneze je spojována s zlepšenou neurologickou regenerací po mrtvici.

MSC se chovají jako malé molekulární „továrny. Tyto buňky produkují řadu cytokinů a trofických faktorů. Tyto faktory navíc sekretuji po dlouho časovou periodu a nikoliv v jediné bolusové dávce. MSC exprimují mnoho cytokinů, o kterých je známo, že hrají určitou roli při krvetvorbě a rovněž dodávají autokrinní, parakrinní a juxtakrinní faktory, které ovlivňují buňky samotného mikroprostředí ·· ···· • · ♦· ·· ··♦· ·«« • · · · ··· · · ··« • · · ·.·· . . · ··· ·· ♦· ♦· .* ··» kostní dřeně. Je pravděpodobné, že MSC v cerebrální tkáni exprimuje tyto faktory, a je to právě vliv těchto cytokinů a trofických faktorů no mozkovou tkáň, co rychle a účinně podporuje obnovu funkce. Tyto buňky, pokud se kultivují v mikroprostředí různých iontových (např. vápníku) odpovídají konkrétnímu iontovému mikroprostředí přizpůsobením exprese růstových faktorů. Z toho vyplývá, že buňky v poraněné tkáni exprimují trofické a růstové faktory titrované pro potřeby tkáně. V mozku produkuje léčba mrtvice pomocí MSC celou řadu různých trofických faktorů a cytokinů anatomicky distribuovaným, tkáňově-senzitivním a přechodně probíhajícím způsobem, v ostrém kontrastu s do jednoho místa lokalizovanou injekcí specifického faktoru.

Neuronové kmenové buňky spočívají ve VZ/SVZ a migrují do místa svého určení ve vyvýjejícím se mozku, ve zdravém dospělém mozku může absence produkce neuronů v předním mozku odrážet nikoliv nedostatek vhodných neuronových prekurzorových buněk, ale spíše tonickou inhibici a/nebo nedostatek postmitotické trofické a migrační podpory. V této studii došlo ke zvýšení BrdU-reaktivních buněk ve VZ/SVZ po MCAO s hMSC léčbou v porovnání se samotnou MCAO, z čehož vyplývá, že intravenózně aplikované injekce hMSC mohou stimulovat endogenní mozkové buňky k proliferaci a mohou se podílet na opravě ischemicky poškozených mozků.

Tato zjištění odpovídají datům získaným při intravenózním podání MSC odvozených z těla potkana.

Intravenózní transplantace hMSC u potkanů nesenzitivuje potkany proti hMSC, jak ukázala smísená reakce lymfocytů in vitro. Podobně slezinné buňky zdravých potkanů nebo potkanů, kterým se injekcí aplikovaly hMSC negenerovaly cytotoxickou odezvu T buněk proti hMSC, tj . funkční imunitní odezvu, která se podílí na odhojení cizích • ···· ·· 99 99 999· ·· 9 999 999 • 9 9 99 9« 9 9999

999 99 999 9 9 • 99 9999 99 9 • 99 99 99 99 99 999 orgánových/buněčných transplantátech. Z těchto dat vyplývá, že imunologická rejekce hMSC potkany nepřipadá v úvahu při testování hMSC jako léčby mrtvice. Možné a důležitější je, že slezina potkana vykazoval malou nebo vůbec žádnou senzitivitu vůči injekcí aplikovaným hMSC. Neschopnost hMSC indukovat silnou imunitní odezvu může souviset se slabou imunogenicitou těchto buněk způsobenou absencí exprese nebo nízkou expresí hlavního komplexu hístokompatibility (třída I a třída II) a kostimulačních (CD40, CD80, a CD86) molekul. Kromě toho mohou hMSC rovněž sekretovat rozpustné mediátory, které snižují vývoj imunitních odpovědí podílejících se na rejekci xeno-implantátu. Tato data volají po dalších studiích, jejichž cílem by mělo být zjištění imunogenicity alogenních buněčně-adherentních populací MSC.

Tato data naznačují, že intravenózně podávané hMSC podporují neurologickou funkční regeneraci 2 týdny po mrtvici. hMSC Selektivně vstupují do cerebrální ischemické oblasti. Interakce mezi hMSC a ischemickým mozkem zvyšuje sekreci neurotrofinů, které mohou redukovat neuronovou apoptózu v ischemické okrajové zóně a podporovat buněčnou proliferaci z relativně nepoškozené SVZ v ischemickém mozku. Nicméně, jestliže nebyly zjištěny buňky pocházející z SVZ migrují a integrující se do ischemického mozku. V CNS může účinná léčba neuronových poranění vyžadovat aktivaci endogenních kompenzačních mechanizmů zahrnujících λ remodelaci cerebrálních okruhů, přičemž přesné mechanizmy jsou nejisté. Při objasněním mechanizmů, které jsou základem MSC-evokované redukce neurologických deficitů, a při prokázání dlouhodobého terapeutického přínosu, by mohly hMSC poskytovat účinnou molekulární a buněčnou terapie pro

* 9999 9 9 • 9	*9 99 9 9 9 • 9 999	9 9 9 9 9 9	99 9 9 9 • 99
			9
9 9 9 9	99 99	99	999

léčbu mrtvice a případně široké škály lidských neurologických poruch.

Příklad 3

Léčba nervového poškození: preklinické protokoly

Při prověřování hypotézy, že MSC podporuje funkční regeneraci po mrtvici, byly přihlašovatelé konfrontováni s různými možnostmi provádění preklinických protokolů buněčné terapie. Mezi otázky, kterými se zabývaly, patřilo kde a kdy implantovat buňky. Vzhledem k zájmu o obnovující terapii a na základě hypotézy, podle které není velikost ischemické léze ovlivňována efektivní obnovující terapií, přihlašovatelé nejprve zvolili léčbu zvířat 1 den nebo více po proběhnutí mrtvice. 31.32 Toto načasování je klinicky rozumné. Pokud deficity přetrvávají den po mrtvici, je událost klasifikována jako mrtvice a ne jako přechodný ischemický záchvat. První den mají pacienti tendenci stabilizovat se, přičemž závažnost neurologických deficitů lze snadno ověřit.

Nejpřímější cesta umístění buněk do mozku ve.de přes chirurgickou transplantaci. Mají být buňky umístěny do léze, do zdravé neischemické tkáně nebo do okrajové zóny? Obrázky pozorování mozku, zejména s okrajovou zónou léze, která se nachází ve vývojovém stádiu, vedly přihlašovatele v počátečních studiích k tomu, že zvolili umístění naivních celých buněk kostní dřeně do okrajové tkáně. 32 Buňky se tedy extrahovaly z dárcovských potkanů a operativně a stereotakticky implantovaly do okrajové zóny ischemické léze v subkortikální a kortikální tkáni. 31-33 Hlavní ověřovanou hypotézou bylo to, zda tyto buňky podporují • 9999 99 99 99 999·

9 9 9 9 9 · 9 ·

9 9 9999 9 9 9 9 9 • 999 99 999 * 9 • 99 9999 99 9

999 99 99 99 99 999 funkční regeneraci, takže se na zvířatech provedly neurologické a funkční testy. Provedlo se kompletní neurologické . ověřování (tabulka 1). Toto vyšetření modifikovaného skóre neurologické závažnosti (mNSS) poskytuje index motority, sensorický reflex a stav svalu.

34-38 Kromě toho přihlašovatelé použili somatosensorický test, který zahrnuje odstraňování lepicího štítku z tlapky,

9 a rota-rod test 40, jenž měří čas, po který potkan setrvá na zrychlujícím běžeckém pásu (treadmill). Měření se prováděla před mrtvicí a 7 dnů a 14 dnů po mrtvici. 21 Zvířata se utratila 14 dnů po mrtvici a transplantované buňky se hledaly v cerebrálních tkáních histologii. Jednou z otázek, na kterou měla tato histologická analýza odpovědět, bylo zda MSC se diferencují do mozkových parenchymálních buněk. Podobné experimenty se prováděly na myších, kteří podstoupili embolickou okluzi střední cerebrální artérie a které se léčili intracerebrální transplantací naivních celých buněk kostní dřeně získaných z dárcovských myši. Měření funkce se prováděly 28 dnů po transplantaci. Po umístění těchto buněk do okraje ischemické léze došlo ke značné a rychlé funkční obnově.

Podobná studie intraparenchymální transplantace MSC do striata myši, u které se indukovalo Parkinsonu podobné poškození pomocí 1-methyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridinem, ukázala signifikantní obnovu motorické funkce.

Podobně se MSC implantovaly vedle kontuzního poškození míchy, a signifikantní funkční přínos byl evidentní.

Variace těchto experimentů ukázaly, že souběžné podání MSC spolu s trofickými faktory, například z mozku odvozeného nervového růstového faktoru, podporuje funkční obnovu, a prekultivace těchto buněk v růstových faktorech napomáhá funkční přínosu stejně jako zvýšení počtu buněk,

9999

99*9

9» • 9 9« 999 • 9 9999 9 9999

999 99 999 9 4 »· 9999 99 4

99 99 99 999 které exprimuji pro mozkové buňky fenotypické proteiny. Zdá se, že přizpůsobení se buněk v kultuře prostředí mozku usnadní přechod z in vitro do in vivo. Mnoho transplantovaných buněk kostní dřeně podlehlo apoptóze v ischemickém mozku. Přihlašovatelé tedy souběžně podali spolu s buňkami kostní dřeně Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketon (Z-VAD), tj . kaspázovy inhibitor, hypotéza se potvrdila; počet apoptotických buněk se významně snížil a funkce měřená testem na rotační tyči ukázala vzrůstající přínos. Takže i v případě buněčné terapie může adjunktivní terapie zvýšit požadovaný výsledek.

Podobné terapeutické intervence byly účinné i na zvířecích modelech traumatického mozkového poranění, míšního poranění a Parkinsonovy choroby; kdy u všech tří modelů došlo k signifikantní redukci neurologických deficitů chirurgickou implantací MSC. Terapeutický přínos se stal zřejmým během dnů transplantace. Nicméně pouze 1 % až 3 % buněk exprimovaly proteiny fenotypické pro parenchymální buňky. Ačkoliv lze poměr buněk exprimujících tyto proteiny zvýšit prekultivací, transplantovaných buněk zanedbatelné v množstvím hemisférické mozkové tkáně postižené po okluzi střední cerebrální artérie infarktem (zhruba 40 %) . 14 Dnů po okluzi přežívá přibližně 50 000 buněk (SE 18 000) neboli

12,5 % z 400 000 transplantovaných; přičemž malé procento exprimuje neuronové proteiny - příliš málo na to, aby nahradily infarktem zasaženou tkáň.

jsou počty porovnání s

Úspěch přímé implantace těchto buněk do mozku navádí experimenty k testování méně invazivního vaskulárního způsobu podání. Potkani se cerebrální artérie, a krční hemisféře s ischemickou lézi podrobili okluzi střední artérie ipsilaterální k se kanylovala za účelem ···· ·*· *··· ·· · ··· ·< ·· ·« ·· ·*· aplikace buněk injekcí. Přibližně 2 miliony MSC se aplikovaly injekcí 1 den po mrtvici. Před léčbou a po léčbě se provedla celá řada neurologických testů. Histologická analýza ukázala nedostatek buněk exprimujících proteiny fenotypické pro parenchymální buňky. Signifikantní funkční přínos byl nicméně evidentní. Přihlašovatelé rovněž testovali potenciál arteriálního způsobu podání MSC při léčbě traumatického poranění mozku. Ačkoliv buňky vstoupily do mozku nepřinesly v případě podání přes krkovici žádný funkční přínos, a to pravděpodobně proto, že tento způsob podání vyžadoval ligaci interní krční artérie, což způsobilo vynucenou hypoperfúzi, která zhoršuje traumatické mozkové poranění.

Přihlašovatelé následně ověřoval proveditelnost klinicky relevantnějšího intravenózního způsobu podání.

Tento přístup je zcela jasně méně invazivní a má méně nežádoucích účinků než cesta přes krční artérii nebo injekce přímo do tkáně. Venózní cesta rovněž umožňuje násobnou a dlouhodobou buněčnou léčbu.

Další ukázaly, že buňky aplikované intravenózní injekcí našli svou cestu do mozku. Nicméně žádná ze studií neukazuje, že by při poraněních, jakými jsou například mrtvice nebo trauma, intravenózní injekcí aplikované buňky selektivně migrovaly do místa ischemického poranění a podporou funkčního přínosu. Přihlašovatelé tedy testovaly tuto hypotézu u potkanů, kteří podstoupili okluzi střední cerebrální artérie. Jeden den nebo více po mrtvici se 1 až 3 miliony MSC aplikovaly injekcí do ocasní žíly. Přihlašovatelé provedli řadu neurologických měření (tabulka 1). Zvířata, kterým se buňky podávaly 1 den po mrtvici, se usmrtila 14 dnů po mrtvici (obr. 1) a ta, která se léčila 7 dnů po mrtvici, se utratila po 35 dnech. Stejně • · φφφ jako v předcházejících experimentech se buňky značily bromodeoxyuridinem, markérem nově syntetizované DNA, s cílem indikovat generování nových buněk. Rovněž MSC ze samců potkana se aplikovaly injekcí do samic a buňky se identifikovaly pomocí in šitu hybridizace na Y chromosom. Léčená zvířata vykazovala signifikantní funkční zlepšení v důsledku léčby (obr. 2). Kontrolní populace buněk se rovněž použila pro test určující specificitu buněčného typu při podpoře zlepšení funkce. Mrtvé MSC a jaterní a plicní fibroblasty (jako nemezenchymální buněčné kontroly) nevykazovaly žádný terapeutický přínos a nebyly lepší než kontrolní fosfátem pufrovaný solný roztok. Intravenózní cesta tedy poskytuje signifikantní funkční zlepšení po mrtvici a úrazu. To rovněž platí pro léčbu iniciovanou 7 dní po mrtvici, přičemž funkční přínos byl podobný jak u samců, tak u samic potkanů.

Ve snaze napodobit blíže lidské testovací podmínky, použily se jako dárcovská buněčná populace lidské buňky stromatu kostní dřeně a nikoliv MSC potkana. Lidské buňky se extrahovaly punkcí zadního kyčelního hřebene zdravého dárce v lokální anestézii. Extrakty mononukleárních buněk kostní dřeně (15 až 16 ml) se separovaly. Dávka 3 milionů lidských MSC se intravenózní injekcí aplikovala do těla každého potkana 1 den po okluzi nebo po traumatickém poranění mozku. Výrazné funkční zlepšení bylo zjištěno jak po mrtvici, tak po úrazu. Lidské buňky se od dárce získaly snadno. Jsou schopny snadno expandovat do velmi vysokých počtů, a jsou k dispozici protilátky pro separaci průtokovou cytometrií nebo magnetickým tříděním buněk. Lidské MSC se použily pro léčbu pacientů trpících rakovinou a roztroušenou sklerózou. Informace týkající se bezpečnosti aplikace na člověka jsou tedy k dispozici.

Přihlašovatelé nepozorovali žádný náznak imunorejekce (nepublikované pozorováni). Sleziny neošetřených potkanů a zvířat ošetřených lidskými MSC se vyjmuly a kultivovaly spolu s lidskými MSC. Proliferace slezinných buněk potkanů, kterým se injekcí aplikovaly lidské MSC se po restimulaci těmito buňkami in vitro zvýšila; nicméně proliferační odezva se významně nelišila od odezvy slezinných buněk neléčených potkanů. Ačkoliv mohou tedy lidské MSC indukovat primární proliferační odezvu u slezinných lymfocytů potkana, nesenzitivuje podání těchto buněk potkanům lymfocyty in vivo pro sekundární proliferační odezvu in vitro. T lymfocyty jsou zahrnuty jako iniciátor onemocnění štěp-versus-hostitel.

Odezva hostitelských T buněk potkana na lidský štěp se tedy měřila pomoci standardního testu používajícího chrom51, jehož cílem bylo stanovit lytický účinek. Lidské MSC neindukují cytotoxickou odezvu T-lymfocytů u slezinných buněk potkana. Přihlašovatelé nemohou vyloučit možnost, že hlodavci a lidské bytosti mohou mít na MSC léčbu různě různou odezvu. Nicméně další možností je možnost použití pro léčbu pacientů univerzální buňky, alogenní buňky a nikoliv autologní buňky. Je zřejmé, že pro potvrzení této hypotézy je zapotřebí shromáždit více dat týkajících se odezvy u člověka. Počáteční klinická aplikace bude vyžadovat autologní transplantaci.

Existuje stále mnoho sporných bodů, mezi které patří například otázka jak jsou tyto buňky směrovány do míst poranění a jakým způsobem jsou prospěšné. Jak buňky vědí kam jít? Jaké mechanizmy usměrňují tyto buňky do konkrétních míst poranění? Nicméně nejzajímavější otázkou jak buňky působí na mozek a jak se tyto účinky přenášejí do terapeutického přínosu.

Navádění MSC do míst cerebrálního poranění

Kam intravenózní injekcí aplikované buňky putují? Nejprve se musí injekcí aplikované buňky označit tak, aby mohly být identifikovány ve tkáni. MSC lze identifikovat pomocí reaktivity protilátky proti různým značením. MSC lze označit bromdeoxyuridinem; ze samce izolované buňky lze injekcí aplikovat do těla samice a Y chromozom identifikovat in-situ hybridizací; nebo lze lidské buňky injekcí aplikovat do těla potkanů a pak použít protilátku proti lidským antigenům. Intravenózní injekcí aplikované buňky byly zjištěny v játrech, ledvinách, slezině a kostní dřeni. Nicméně většina identifikovaných MSC obkružuje mikrocévy v těchto orgánech, přičemž pár buněk bylo lokalizováno ve parenchymu. Velmi málo buněk (1,5 až 3,0 % ze 3 milionů injekcí aplikovaných MSC 14 až 3 5 dnů po léčbě) se detekovalo v parenchymu mozkové tkáně. V poraněném mozku, bez ohledu na to zda v důsledku mrtvice nebo traumatického poranění, byla převážná většina buněk naváděna do oblasti poranění. Například po mrtvici se více než 80 % buněk nacházelo v poraněné hemisféře, přičemž většina těchto buněk se shromažďuje v oblastech kolem léze. Mnoho buňky se rovněž nacházelo v sousedství cév nebo v cévách. Jak jsou buňky usměrňovány do poraněných tkání, a je lokalizace těchto buněk do mikrovaskulatury důležitá?

Navádění MSC do míst poranění je reminiscencí odezvy zánětlivých buněk na poraněnou tkáň. Neutrofily a monocyty určují jako cíl poraněnou a zanícenou tkáň pomocí sladěných sekvencí vaskulární a buněčné molekulární signalizace. Adhezivní molekuly a jejich receptory, exprimované na zánětlivých buňkách a vaskulatura, směrují buňky do poraněné tkáně a transportují tyto buňky přes vaskulární okraj, přičemž zpravidla procházejí skrze ·· ·· hematoencefalickou bariéru. Tyto směrovací a adhezivní molekuly pracují ve shodě s chemokiny. Přihlašovatelé tedy testovali, zdali adhezivní molekuly a chemoatraktivní činidla manipulují s MSC a usměrňují MSC do mozku. Přihlašovatelé použili Boydenovu komoru, přičemž prostor pro migraci buněk mezi dvěma komorami rozdělili propustnou membránou. MSC se nastavily na 5 x 10⁵ buněk/ml v migračním mediu IMDM [(Iscove's Modified Dulbecco's Medium) s 5 % albuminem bovinního séra]. 50 1 Buněčné suspenze se přidalo do každé horní jamky. Počet MSC, které migrovaly k povrchu dna se sečetly v pěti optických polích (0,12 mm² plocha). Protože ischemické mozková tkáň exprimuje chemotaktické proteiny, jakými jsou například monocytový chemotaktický protein 1 a makrofágový zánětlivý protein 1 (MIP-1) , umístili přihlašovatelé tyto látky do spodní komory, čímž dosáhli dávkově dependentního zvýšení migrace. Podobné odezvy byly zjištěny v případě, kdy se do spodní komory umístily adhezivní molekuly, jako například intercelulární adhezivní molekula 1 (ICAM-1). Zvýšená migrace byla úspěšně blokována přídavkem protilátek k adhezívním molekulám nebo chemokinů do spodní komory. Pokud se tkáň mozku, u které došlo k traumatickému poranění nebo mrtvici, umístila do spodních komor, potom došlo také k významnému zvýšení migrace. Tato zjištění umožnila získat představu o tom, jak si buňky osvojují identitu zánětlivé buňky a jak „vědí, že jejich cílem je právě poraněná tkáň. Takže jakékoliv poranění, které má zánětlivou odezvu, neurodegenerativních onemocnění, jakými jsou

Parkinsonova choroba a roztroušená skleróza, může navádět MSC do postižených míst. Závislost navádění na stupni poranění rovněž poskytuje formu titraceúčinné dávky buněk. Čím závažnější poranění a související zánětlivá včetně například odezva, tím vyšší počty buněk jsou naváděny do místa poranění.

• ···

Mechanizmy účinku

Jak buňky ovlivňují mozek a čím podporují funkční obnovu vznikající v důsledku poranění a patologických procesů? Možnost, že přínosem MSC pro mozkovou tkáň je fakt, že se stávají mozkovým buňkám podobnými buňkami, je vysoce nepravděpodobná. Při použití intravenózní injekce a maximálně několika set tisíc intraparenchymálních buněk existuje velmi málo buněk, a to i pokud se stanou mozkovými buňkami, pro nahrazení celého objemu tkáně představujícího více než pár kubických milimetrů. Přínos je v mnoha případech detekován již několik dnů po léčbě. V krajním případě pouze malé procento buněk exprimuje proteiny fenotypické pro parenchymální buňky. Exprese těchto proteinů neindikuje pravou diferenciaci a neuronovou funkci nebo funkci gliové buňky. Po takto krátké časové periodě je vysoce nepravděpodobné, že by se, a to i diferencované buňky, skutečně integrovaly do tkáně a tvořila komplexní spojení, která by zlepšovala funkci. Náhrada tkáně jako mechanizmus, pomocí kterého by MSC podporovaly své pozitivní účinky, je velmi nepravděpodobná. Mnohem rozumnějším vysvětlením pro tento přínos je teorie, podle které MSC indukují cerebrální tkáň k aktivaci endogenních opravných účinků mozku. MSC nohou spustit reakce a vzájemně reagovat s mozkem, a tak aktivovat obnovu a případné regenerační mechanizmy.

MSC Se chovají jako malé molekulární továrny, které produkují celou řadu různých cytokinů a trofických faktorů.

φφφφ

φφ φφ φ φ φ φ φφφφ • φ φ φ • φ φ φ • Φ φφ •Φ φφφφ φ

• Φφ φφφ

MSC v cerebrální tkáni nebo v mikrovaskulatuře poraněného mozku pravděpodobně exprimují tyto faktory a vliv trofických faktorů na mozkovou tkáň je mechanizmus, který rychle a účinně podporují opravu funkce. Přihlašovatelé dokázaly, že MSC produkují mezi dalšími trofickými a růstovými faktory hepatocytový růstový faktor, VEGF, nervový růstový faktor (NGF) a z mozku odvozený neurotrofní faktor (BDNF).

Takže celá řada faktorů a ne jediný konkrétní růstový faktor, usnadňuje blahodárný účinek. Za velmi důležité pozorování je považováno zjištění, že pokud se MSC kultivují v různých iontových mikroprostředích, potom odpovídaj i na toto konkrétní mikroprostředí úpravou exprese růstového faktoru. Toto zjištění vychází z faktu, že buňky v poraněné tkáni exprimují trofické a růstové faktory upravené pro potřeby tkáně. Různá prostředí ovlivni sekreci těchto faktorů. Takže stupeň poranění tkáně a odpovídající porušení iontového prostředí bude diktovat sekreci trofických faktorů. Přihlašovatelé testovali tuto hypotézu za několika experimentálních podmínek. Kultura MSC v tkáních extrahovaných z mozků zasažených mrtvicí nebo poraněním významně zvyšuje sekreci trofických faktorů. Odezvové sekrece MSC do poraněného mozku se liší podle časového okamžiku, kdy se tkáň extrahuje z poškozeného mozku. Tyto experimenty učinily krok dopředu ve smyslu měření exprese růstových faktorů v mozku ošetřovaném MSC. Přihlašovatelé použili kvantitativní analýzu ELISA sandwich, jejím cílem je měřit za použití imunologického značení expresi růstových faktorů v mozku. Exprese trofických faktorů byla u MSC léčených zvířat postižených mrtvicí nebo traumatem významně vyšší než u neléčených zvířat.

4444

4 4 444

Vezmeme-li předpoklad, že MSC selektivně vstupují do poraněného mozku a sekretují růstové a trofické faktory ve tkáňové zpětnovazebně smyčce, jako tyto faktory mění mozek, aby podpořily terapeutický přínos? Podle pracovní hypotézy je terapeutický přínos indukován sérií událostí spojovaných s plasticitou mozku; přičemž tento proces zahrnuje neomezujícím způsobem angiogenezi, neurogenezi, synaptogenezi, dendritickou arborizace a redukce apoptózy ve strategicky důležité tkáni v okrajové zóně tkáně.

VEGF a bazický fibroblastový růstový faktor jsou potentními angiogenickými činidly. Přihlašovatelé testovaly vliv MSC nebo supernatantu z MSC na indukci angiogeneze. Provedla se měření společně s testem prováděným na endotheliálních buňkách lidského mozku, při kterých se ukázalo, že supernatanty z MSC indukují rychlou tvorbu kanálků, což odráží strukturální a angiogenický proces. In vivo použitým testem byl klasický avaskulární korneální test. Chirurgické otevření vytvoří kapsu v rohovce a kolagen v plátcích potažených MSC supernatantem nebo samotnými MSC se vloží do vytvořené kapsy. Kontrolní podmínky byly vytvořeny chirurgickým otevřením a umístěným samotných kolagenových plátků nebo umístěním VEGF přímo do kapsy. Přihlašovatelé pozorovaly rychlou a robustní angiogenezi v rohovkách ošetřených plátky zatíženými supernatantem z MSC. Ačkoliv většina buněk přímo umístěných do otvoru v rohovce difundovalo z tohoto místa pryč, byla angiogeneze evidentní. U kontrolních zvířat k angiogenezi nedošlo (obr. 2). Indukce angiogeneze byla při použití MSC supernatantu robustnější než při přímém použití VEGF, z čehož vyplývá, že supernatant je vysoce účinným zdrojem angiogenních faktorů. Z předběžných studií indukce angiogeneze MSC léčbou mozkové tkáně rovněž vyplývá zvýšená tvorba

Ačkoliv funkce, ·· ·>·· to to to ··· nových krevních cév (nepublikované pozorování). indukce angiogeneze se přímo nepřenáší do podpory přihlašovatelé již dříve dokázaly, že léčba mrtvice pomocí VEGF den nebo více dnů po mrtvici významně zlepšuje funkční obnovu a zvýšení angiogeneze.

Indukce neurogeneze pomocí MSC může rovněž přispívat k funkčnímu zlepšení mrtvici. Důležitým místem neurogeneze je plocha sousedící s laterálními komorami - tzv. subventrikulární zóna, Neurogeneze se rovněž nalézá v bulbus olfactorius (čichový bulbus) a gyrus dentatus mozku hlodavců. Cerebrální poranění, jakým je například mrtvice, zesiluje produkci neuronů v určitých oblastech mozku. Funkční oprava, zejména v dlouhodobém horizontu po mrtvici, může souviset s produkcí nových mozkových buněk. Mechanizmy, které podporují produkci těchto buněk mohou zlepšovat obnovu. Přihlašovatelé testovaly účinky léčby mrtvice pomocí MSC na indukci neurogeneze. Signifikantní zvýšení počtu buněk se měřilo v subventrikulární zóně po mrtvici. Mnoho těchto buněk mělo markéry nově vytvořených progenitořovým buňkám podobných buněk, Jak prokázala exprese specifických molekulárních markérů, například TUJ-1. Cerebrální tkáň v ipsilaterální hemisféře rovněž ukazuje masivní zvýšení exprese markéru kmenových buněk, néstinu, což naznačuje aktivaci mozkové tkáně v progenitorovém nebo vývojovém stavu. Histologická analýza mozkové tkáň, do které byl zaveden transplantát MSC rovněž ukázala přítomnost neurosferických rozet v ischemické tkáni. Tyto rozety neuronových buněk j sou podobné rozetám, které se nacházejí ve vyvýjejícím se mozku. Migrace těchto buněčných systémů do mozkové tkáně lze navádět pomocí astrocytům podobných výběžků vycházejících z ventrikulární zóny, což se opět podobá událostem ve vyvýjejícím mozku.

♦* 99 99 9999 • · 9 9 9 ···· 9 9999 • · 9 9 9 9 9

99

999

Zdá se tedy, že přítomnost buněk kostní dřeně podporuje rychlou indukci a migraci nových buněk z primárního zdroje ve ventrikulární zóně a cévní pleteni do poraněného mozku. Tyto buňky se mohou podílet na funkční opravě, ačkoliv vztah mezi indukcí neurogeneze a migrace těchto buněk a opravou funkce nebyl přímo testován.

Růstový a trofický faktor, produkovaný MSC, může ovlivnit synaptogenezi a zvýšit dendritickou arborizaci v poraněném a ischemickém mozku. Pro ověření přímého účinku léčby mrtvice pomocí MSC na dendritickou arborizaci je zapotřebí dalších experimentů. V předběžných experimentech přihlašovatelé ověřili zvýšenou expresi synaptofysinu, tj . synaptického proteinu, v okrajové zóně ischemické leze po mrtvici.

Glióza může představovat překážku pro neuritový výrůstek a arborizaci po neuronovém poranění. Ne j důležitější pro léčbu zranění jsou proteiny transformačních růstových faktorů, které se podílejí na inhibici zjizvení v kůži a myokardu, přičemž oprava rány bez vzniku jizvy byla pozorována u zárodku. Protože MSC produkují tento růstový faktor, lze jejich terapeutický přínos rovněž odvozovat z redukce zjizvení a následného zlepšení synaptogeneze a dendritické arborizace.

Kromě cytokinů a růstových a trofických faktorů MSC exprimují faktory související s tvorbou kosti, jakými jsou například pro osteoblasty specifický faktor 2 a kostní morfogenetický protein 1. Rovněž exprimují neuronovou k buňka adhezní molekulu neurofilin a neurotrofní faktory včetně NGF a BDNF. Nedávné studie ukázaly, že kostní morfogenetické proteiny, sonic hedgehog, hormon příštítných tělísek, a fibroblastový růstový faktor osm zastávají během

444 • · 4 4

• 4 4 4 · • · 4 • 4 4

444 diferenciace embryonálních buněk regulační roli tím, že modifikují mezodermální a neuroektodermální dráhy. Ověření toho, jestli MSC sekrece této cytokinové kaskády v poraněném mozku přispívá k funkčnímu přínosu, vyžaduje důkladné uvážení a další experimenty.

Oblast periléze je vysoce citlivá na apoptickou buněčnou smrt. Apoptóza přetrvává měsíce po mrtvici nebo mozkovém traumatu. Její vlivy na obnovu nejsou známy. Přihlašovatelé ukázali, že léčba mrtvice a mozkového traumatu pomocí MSC významně redukuje apoptózu v této oblasti. Tento účinek lze zprostředkovat produkcí růstových faktorů, jakými jsou například NGF, v poraněném mozku. Přihlašovatelé spekulují, že selektivní redukce apoptózy v této oblasti může podporovat cerebrální převinutí.

Mechanizmus, pomocí kterého remodelace mozku, neurogeneze a neuroprotektivní mechanizmy evokují funkční zlepšení po poranění, není znám a je důležitým předmětem výzkumu. To, zda všechny tyto události, které jsou léčbou pomocí MSC zesíleny, skutečně přispívají ke zlepšenému výsledku po mrtvici a traumatu, je předmětem ověřování.

V tomto okamžiku nelze izolovat specifické události, které udržují obnovu neurologické. Nicméně přihlašovatelé spekulují, že proces, který podporuje obnovu funkce není jedinou modifikací tkáně (např. neurogeneze), ale je pravděpodobnější, že se jedná o protkaný soubor událostí, angiogeneze, neurogeneze, synaptogeneze a okrajových redukcí zjizvení a apoptózy, které se na zlepšování funkce podílejí nedílným, pokud ne synergickým způsobem. Ačkoliv ověřování této hypotézy a identifikace specifických faktorů, které přispívají ke zlepšení neurologické funkce stojí za to; přihlašovatelé mají omezenou schopnost ···· • ········· ·

9 9 9 9 9 9 9 9 9

99 99 99 99 99 999

Π zvyšovat apoptózu selektivně v okrajové zóně, a tak redukovat angiogenezi bez ovlivnění neurogeneze.

Poraněná mozková tkáň mnoha způsoby rekapituluje ontogeny. Po mrtvici nebo poranění se mozková tkáň vrací do ranějšího stádia vývoje a tak se stává vysoce responzivní ke stimulaci cytokiny a trofickými a růstovými faktory z vnikajících MSC. MSC Pravděpodobně stimulují v kvazi vyvíjející se mozkové tkáni strukturní a regenerační změny, včetně angiogeneze, vaskulogeneze, neurogeneze a dendritické arborizace. Převážně tkáň v primitivním stavu, která je vysoce senzitivní vůči různým stimulantům a růstovým faktorům, spíše než primitivní stav MSC, podporuje terapeutickou odezvu. MSC Mohou prostě poskytovat zdroje, které vyžaduje ontogenní mozková tkáň pro stimulaci cerebrální remodelace. Přihlašovatelé nevylučují možnost, že další buňky nebo sladěná sekvence titrovaných infuzi cytokinů a růstových faktorů mohou stimulovat oslabené mozkové buňky k odezvě a obnově funkce. Podobně nemohou přihlašovatelé vyloučit možnost, že subpopulace MSC jsou podobné kmenovým nebo progenitorovým buňkám a že tedy mohou synergicky reagovat s poraněnou tkání. Nicméně přihlašovatelé jsou přesvědčeni o tom, že MSC v mozku nenahrazují tkáň a nediferencují se do fungujících neuronů a podpůrných astrocytů, alespoň v časovém měřítku, ve kterém přihlašovatelé vidí funkční přínos. Primární přínos je dosažen aktivací poraněné tkáně k remodelaci a ke kompenzaci poranění. Obr. 4 ukazuje současné chápání procesu, pomocí kterého lze MSC sklízet a použít pro léčbu poraněné mozkové tkáně.

9» 9··· • 9 • 999 • 4» • 9 ·« · · 9 · 9 • · 99999 9 9 999 ·· 999 • 99 <999 99 9 *99 99 99 99 99 999

Transplantace pacientovi

Je zřejmé, že před využitím buněčné terapie při léčbě mrtvice u pacientů je třeba se věnovat otázkám bezpečnosti aplikace této metody. Ačkoliv je transplantace kostní dřeně běžným postupem při léčbě rakoviny a používá se jako adjunktivní terapie při léčbě roztroušené sklerózy, jsou studií fáze I bezpečnosti v případě mrtvice oprávněné.

Doposud při studiích téměř 2000 zvířat trpících mrtvicí přihlašovatelé nezjistili žádné nežádoucí účinky této terapie nebo indikací tvorby nádoru. Mají se pacienti léčit svými vlastními buňkami, HLA-sdruženými buňkami nebo populací univerzálního dárce? Z preklinických dat doposud vyplývá, že léčba buňkami dárce je možná. Nicméně pro zodpovězení této otázky je třeba provést nejen preklinické studie, ale klinické studie fáze I. Preklinické a základní studie popsané v tomto přehledu naznačují, že léčba mrtvice pomocí MSC může představovat životaschopnou a vysoce efektivní opravnou terapie.

Celá přihláška vynálezu obsahuje odkazy na různé publikace, včetně patentů US, které uvádějí autora, rok, resp. čísla patentů. Úplný seznam citací pro jednotlivé publikace je uveden níže. Obsah těchto publikací je v textu uveden formou odkazů, jejichž cílem je úplněji definovat relevantní stav techniky.

Vynález byl popsán ilustrativním způsobem a zde použitou terminologii nelze chápat limitně, ale pouze jako prostředek umožňující schematický popis vynálezu.

Výše uvedený popis má tedy pouze čistě ilustrativní charakter a nikterak neomezuje rozsah vynálezu, který je jednoznačně vymezen přiloženými patentovými nároky.

• er· • · • ···

9 9

9 · ··

9999

9

999 ·

• 9

999

Tabulka

Diferenciace hMSCs indukovaných TBI tkáňovými extrakty

Skupiny	TBI Ext. (%)	Neuronům podobné buňky (%)
Knockout DMEM		0
Extrakty normálního mozku	20	3,16 ± 1,97
	40	2,08 ± 1,19
TBI Extrakty	10	2,07 + 0,49
	20	29,60 ± 16,89*
	40	12,70 + 8,49*

Odkazy:

Burke and Olson,Preparation of Cloně Libraries in Yeast Artificial- Chromosome Vectorsin Methods in Enzymology, Vol. 194, „Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, eds. C. Guthrie and G. Fink, Academie Press, lne., Chap. 17, pp. 251-270 (1991) ;

Capecchi, „Altering the genome by homologous recombination 244: 1288-1292 (1989);

Davies et al.,Targeted alterations in yeast artificial chromosomes for inter- species gene. transfer,Nijrlpi; iri RPRparr : h, Vol. 20, No. 11, pp. 2693- 2698 (1992);

Dickinson et al.,High frequency gene targeting using insertional vectors, Human Molecular Genetics, Vol. 2, No. 8, pp. 1299-1302 (1993);

Duff and Lincoln,Insertion of a pathogenic mutation into a yeast artificial chromosome containing the human APP gene • · · · ···· and expression in ES cells, Research Advances in Alzheimer's Disease and Related Dísorders, 1995;

Huxley et al.,The human HPRT gene on a yeast artificial chromosome is functional when transferred to mouše cells by cell fusion, Gennmics, 9 : 742- 750 (1991);

Jakobovits etal.,Germ-line transmission and expression of a human-derived yeast artificial chromosome, Nátuře, Vol. 362, pp. 255-261 (1993);

Lamb et al.,Introduction and expression of the 400 kilobase precursor amyloid protein gene in transgenic mice, Nátuře Genetics, Vol. 5, pp. 22-29(1993);

Pearson and Choi, Expression of the humanb-amyloid precursor protein gene from a yeast artificial chromosome in transgenic mice. Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 1993.90: 10578-82;

Rothstein, „Targeting, disruption, replacement, and allele rescue: integrative DNA transformation in yeastinMethods inFn7ymnlnnr, Vol. 194,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, eds. C. Guthrie and G. Fink, Academie Press,lne., Chap. 19, pp. 281-301 (1991);

Schedl et al.,A yeast artificial chromosome covering the tyrosinase gene confers copy number-dependent expression in transgenic mice,Nstilr-, Vol. 362, pp. 258-261 (1993);

Strauss etal.,Germ line transmission of a yeast artificial chromosome spanning the murine a,(1) collagen locus, Vol. 259, pp. 1904-1907 (1993);

• · • 9

9»

Gilboa, E, Eglitis, MA, Kantoff, PW, Anderson, WF: Transfer and expression of cloned genes using retroviral vectors. BioTechniques 4 (6): 504-512,1986;

Cregg JM, Vedvick TS, Raschke WC: Recent Advances in the Expression of Foreign Genes in Pichia pastoris, Bio/Technology 11:905-910, 1993 Culver, 1998. Site-Directed recombination for repair of mutations in the human ADA gene. (Abstract) Antisense DNA & RNA based therapeutics, February, 1998, Coronado, CA;

Huston et al, 1991Protein engineering of single-chain Fv analogs andfusio, n proteinsin Methods in Enzymology (JJ Langone, ed.; Academie Press, New York, NY) 203: 46-88;

Johnson and Bird, 1991Construction of single-chain Fvb derivatives of monoclonal antibodies and their production in Escheríchia coli in Methods in Enzymology (JJ Langone, ed.; Academie Press, New York, NY) 203: 88-99;

Mernaugh and Mernaugh, 1995An overview of phage-displayed

recombinant antibodiesin	Molecuíar	Methods	In	Plant
Pathology (RP Singh and US	Singh, eds.	; CRC Presslnc.,	Boča
Raton, FL) pp. 359-365;
AY Η, AYI, KOROSHETZ WJ,et	al. (1999)	Potential	usefulness
of basic fibroblast growth factor	as a treatment	for
stroke. Cerebrovasc Dis 9:	131-135;

AZIZI SA, STORES D, AUGELLI BJ, etal. (1998) Engraftment and migration of human bone marrow stromal cells implanted in the brains of albino rats- -similarities to astrocyte grafts. Proč Nati Acad Sci USA 95: 3908-3913;

BEREZOVSKAYAO, MAYSINGER D, and FEDOROFF S (1995) The hematopoietic cytokine, colony-stimulating factorl, is also a growth factor in the CNS: congenital absence of CSF-1 in mice results in abnormalmicroglial response and iricreased neuron vulnerability to injury. Int J Dev Neurosci 13: 285299;

BJORKLUND A, andLINDVALL O (2000) Cell replacement therapies for centrál nervous systém disorders. Nat Neurosci 3: 537-544;

BULLOCK MR, LYETH BG, and MUIZELAAR JP (1999) Current status of neuroprotection trials for traumatic brain injury: lessons from animal models and clinical studies. Neurosurgery 45: 207-217; discussion 217-220;

CANEVA L, SOLIGO D, CATTORETTI G, et al. (1995) Immunoelectron microscopy characterization of human bone marrow stromal cells with anti-NGFR antibodies. Blood Cells Mol Dis 21: 73-85;

CHEN J,LI Y, WANG L, et al. (2001) Therapeutic benefit of íntravenous administration of bone marrow stromal cells after cerebral ischemia in rats. Stroke 32:1005-1011;

CHOPP M, ZHANG XH, LI Y, et al. (2000) Spinal cord injury in rat: treatment with bone marrow stromal cell transplantátion. Neuroreport 11: 3001-3005;

DENG W, OBROCKA M, FISCHER I, et al. (2001) In vitro differentiation of human marrow stromal cells into early progenitors of neural cells by conditions that increaseintracellular cyclic AMP. Biochem Biophys Res Commun 282: 148-152;

DIXONCE, CLIFTON GL, LIGHTHALL JW, et al. (1991) A controlled cortical impact model of traumatic brain injury in the rat. J Neurosci Methods 39: 253-262;

• · · ·

DORMADY SP, BASHAYANO, DOUGHERTY R, et al. (2001) Immortalized multipotential mesenchymal cells and the hematopoietic microenvironment. J Hematother Stem Cell Res 10 :125-140;

GAGE FH (2000) Mammalian neural stem cells. Science 287: 1433-1438;

HEFTI F (1986) Nerve growth factor promotes survival of šeptal cholinergic neurons after fimbrial transections. J Neurosci 6: 2155-2162;

KOLIATSOS VE, CLATTERBUCK RE, WINSLOW JW, et al . (1993) Evidence that brain-derived neurotrophic factor is a trophic factor for motor neurons in vivo. Neuron 10: 359367;

KOPEN GC, PROCKOP DJ, and PHINNEY DG (1999) Marrow stromal cells migrate throughout forebrain and cerebellum, and they differentiate into astrocytes after injection into neonatal mouše brains. Proč Nati Acad Sci U S A 96: 10711-10716;

KROMER LF (1987) Nerve growth factor treatment after brain injury prevents neuronal death. Science 235: 214-216;

LABOUYRIE E, DUBUS P, GROPPI A, et al. (1999) Expression of neurotrophins and their receptors in human bone marrow. Am J Pathol 154: 405-415;

LI Y, CHOPP M, CHEN J, et al. (2000) Intrastriatal transplantátion of bone marrow nonhematopoietic cells improves functional recovery after stroke in adult mice. J Cereb Blood Flow Metab 20: 1311-1319;

LU D, MAHMOOD A, WANG L, et al. (2001 a) Adult bone marrow stromal cells administered intravenously to rats after • · · · • · · · traumatic brain injury migrate into brain and improve neurological outcome. Neuroreport 12: 559-563;

LU D, Li Y, WANG L, et al. (2001b) Intraarterial administration of marrow stromal cells in a rat model of traumatic brain injury. J Neurotrauma 18: 813-819;

MAHMOOD A, LU D, YI L, et al. (2001) Intracranial bone marrow transplantation after traumatic brain injury improving functional outcome in adult rats. J Neurosurg 94: 589-595;

MAJUMDAR MK, THIEDE MA, MOSCA JD, et al. (1998) Phenotypic and functional comparison of cultures of marrowderivedmesenchymal stem cells (MSCs) and stromal cells. JCell Physiol 176: 57-66;

MAJUMDAR MK, THIEDE MA, HAYNESWORTH SE, et al. (2000) Human marrow-derivedmesenchymal stem cells (mscs) express hematopoietic cytokines and support long-term hematopoiesis when differentiated toward stromal and osteogenic lineages. J Hematother Stem Cell Res 9 :841-848,

MIZUNO S, MATSUMOTO K, KUROSAWA T, et al. (2000) Reciprocal balance of hepatocyte growth factor and transforming growth factor-beta 1 in renal fibrosis in mice. Kidney Int 57: 937-948;

PAPAVASSILIOU E, GOGATE N, PROESCHOLDT M, et al. (1997) Vascular endothelial growth factor (vascular permeability factor) expression in injured rat brain. J Neurosci Res 49: 451-460;

SANCHEZ-RAMOS J, SONG S, CARDOZO-PELAEZ F, et al. (2000) Adult bone marrow stromal cells differentiate into neural cells in vitro.ExpNeurol 164: 247-256;

• · ·· · · ·· ···· ϊ · * · · · • · ··· · » .,.

• ·· ··· · » • · · · · . · ·· ·· ·· ...

SONDELL Μ, and KANJE Μ (2001) Postnatal expression of VEGF and its receptor flk-1 in peripheral ganglia. Neuroreport 12: 105-108;

SONDELL M, LUNDBORG G, and KANJE M (1999) Vascular endothelial growth factor has neurotrophic activity and stimulates axonal outgrowth, enhancing cell survival and Schwann cell proliferation in the peripheral nervous systém. J Neurosci 19: 5731-5740;

SUGIMORI H, SPELLER H, and FINKLESTEIN SP (2001) Intravenous basicfibroblast growth factor produces a persistent reduction in infarct volume following permanent focal ischemia in rats. Neurosci Lett 300: 13-16;

TAKAI K, HARA J, MATSUMOTO K, et al. (1997) Hepatocyte growth factor is constitutively produced by human bone marrow stromal cells and indirectly promotes hematopoiesis.

Blood 89: 1560-1565;

WOODBURY D, SCHWARZ EJ, PROCKOP DJ, et al. (2000) Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. J Neurosci Res 61: 364-370;

ZHANG L, HIMI T,MORITA I, et al. (2 000a) Hepatocyte growth factor protects cultured rat cerebellar granule neurons from apoptosis via the phosphatidylinositol-3 kinase/Akt pathway. J Neurosci Res 59: 489-496;

ZHANG ZG, ZHANG L, JIANG'Q, et al. (2000b) VEGF enhances angiogenesis and promotes blood-brain barrier leakage in the ischemic brain. J Clin Invest 106: 829-838.

Claims (18)

1. NÁROKY ► ···· • · • ···

   1. Terapeutické činidlo pro použití angiogeneze a vaskulogeneze, vyznačující obsahuje faktory indukující angiogenezi a izolované z kmenových buněk ve spojení s přijatelným buněčným terapeutickým činidlem, přičemž terapeutické činidlo indukuje angiogenezi a vaskulogenezi u pacienta.

   pri se indukci tím, že vaskulogenezi farmaceuticky
2. 2. Terapeutické činidlo podle nároku 1, vyznačující se tím, že jsou faktory indukující angiogenezi a vaskulogenezi zvoleny z množiny sestávající v podstatě z angiogenních, trofických a růstových faktorů.
3. 3. Terapeutické činidlo podle nároku 1, vyznačující se tím, že buněčným terapeutický činidlem je kmenová buňka, která je zvolena z množiny sestávající v podstatě z mezenchymálních kmenových buněk, buněk stromatu a jejich prekurzorů, fibroblastů, retikulocytů, adipocytů a buněk endotelu.
4. 4. Způsob amplifikace produkce faktorů indukujících angiogenezi a vaskulogenezi sekretovaných z buněk stromatu expozicí a kokultivací buněk stromatu se sloučeninou indukující diferenciaci pro zvýšení produkce faktorů indukujících angiogenezi a vaskulogenezi.

   • · · · •· 9999 • · · 9 9 • · · · 9 9 • · 9 9 9 9 ··· ·♦ ··
5. 5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že zahrnuje expozici a kokultivaci buněk stromatu se sloučeninou indukující diferenciaci pro zvýšení produkce faktorů indukujících angiogenezi a vaskulogenezi, přičemž uvedená sloučenina indukující diferenciaci se zvolí z množiny sestávající v podstatě z mozkového extraktu a kalcia.
6. 6. Faktory indukující angiogenezi a vaskulogenezi izolované a purifikované z kmenových buněk použitelné jako terapie.
7. 7. Faktory indukující angiogenezi a vaskulogenezi podle nároku 6, vyznačující se tím, že indukují angiogenezi a vaskulogenezi po podání pacientovi, který takovou léčbu potřebuj e.
8. 8. Faktory indukující angiogenezi a vaskulogenezi podle nároku 6, vyznačující se tím, že faktory indukujícími angiogenezi a vaskulogenezi jsou faktory sekretované kmenovými buňkami, pokud jsou tyto buňky exponovány a kokultivovány se sloučeninou indukující diferenciaci pro zvýšení produkce požadovaných faktorů.
9. 9. Faktory indukující angiogenezi a vaskulogenezi podle nároku 8, vyznačující se tím, že sloučenina • φ φ ·

   99 9999 • · · ♦ · • · · · Φ ΦΦ·φ

   Φ Φ ΦΦΦ φ · • Φ Φ · · « ·· ΦΦ ··· indukující diferenciaci se zvolí z množiny sestávající v podstatě z mozkového extraktu a kalcia.
10. 10. Faktory indukující angiogenezi a vaskulogenezi podle nároku 9, vyznačující se tím, že se mozkový extrakt zvolí z množiny sestávající v podstatě z mozkových buněk, buňky získaných z mozku a supernatantu získaného z buněk stromatu kultivovaných s mediem.
11. 11. Způsob získání faktorů indukujících angiogenezi a vaskulogenezi podle nároku 6, vyznačující se tím, že zahrnuj e:

    isolaci a purifikaci lidských mezenchymálních kmenových buněk z tkáně před diferenciací; a kultivační rozmnožování mezenchymálních kmenových buněk pro výrobu nástroje pro neurologickou a muskuloskeletární terapii.
12. 12. Izolované a kultivací namnožené mezenchymální kmenové buňky pod vlivem sloučeniny indukující diferenciaci, vyznačující se tím, že jsou schopné se diferencovat a produkovat požadovaný buněčný fenotyp potřebný pro opravu tkáně.
13. 13. Kmenové buňky podle nároku 12, vyznačující se tím, že sloučenina indukující diferenciaci je zvolena z množiny sestávající v podstatě z mozkového extraktu a kalcia.

    ···· ·* ···· • · · · ··· · · ··· • _Λ ··· · · · · · · ·

    ·..··..·
14. 14. Kmenové buňky podle nároku 13, vyznačující se tím, že se mozkový extrakt zvolí z množiny sestávající v podstatě z mozkových buněk, buněk získaných z mozku a supernatantu z buněk stromatu kultivovaných s mediem.
15. 15. Kmenové buňky podle nároku 12 pro použití při přesměrování reparativní kapacity buněk.
16. 16. Terapie indukující angiogenezí a vaskulogenezi u pacienta, který uvedenou terapii potřebuje, podáním terapeutického činidla obsahujícího faktory indukující angiogenezí a vaskulogenezi izolované z kmenových buněk ve spojení s farmaceuticky přijatelným buněčným terapeutickým činidlem, přičemž terapeutické činidlo indukuje angiogenezí a vaskulogenezi u pacienta.
17. 17. Terapie podle nároku 16, vyznačující se tím, že podání zahrnuje podání terapeutické látky způsobem zvoleným z množiny sestávající v podstatě ze subkutánního, parenterálního, intravenózního, intraarteriálního, intramuskulárního, intraperitoneálního, intranazálního, intratekálního způsobu a z infúzních technik.
18. 18. Způsob indukce opravy tkáně podáním terapeutického činidla obsahujícího angiogenezí a vaskulogenezi indukující faktory izolované z kmenových buněk společně s farmaceuticky přijatelným buněčným terapeutickým činidlem,