ITUD20090202A1

ITUD20090202A1 - Metodo per la replicazione di cellule staminali mesenchimali e utilizzo terapeutico delle cellule staminali cosi' ottenute

Info

Publication number: ITUD20090202A1
Application number: IT000202A
Authority: IT
Inventors: Giovanni Cricini; Roberto Ferro
Original assignee: Giovanni Cricini; Roberto Ferro
Priority date: 2009-11-13
Filing date: 2009-11-13
Publication date: 2011-05-14

Description

Descrizione del trovato avente per titolo:

"METODO PER LA REPLICAZIONE DI CELLULE STAMINALI MESENCHIMALI E UTILIZZO TERAPEUTICO DELLE CELLULE STAMINALI COSÌ OTTENUTE"

CAMPO DI APPLICAZIONE

Il presente trovato si riferisce ad un metodo per la replicazione di cellule staminali mesenchimali ed all'utilizzo terapeutico delle cellule staminali così ottenute .

STATO DELLA TECNICA

È noto che le cellule staminali mesenchimali (MSC) formano il mesenchima, ovvero il tessuto connettivo embrionale che ha origine dallo staccamento delle cellule dai foglietti embrionali.

Le cellule staminali mesenchimali possiedono un'elevata capacità riproduttiva (tasso mitotico) e possono differenziarsi in diversi tessuti, sono quindi pluripotenti. Dal mesenchima, in particolare, hanno origine, tra i tessuti più importanti, il sangue, i connettivi propriamente detti, lo sclerotomo dal quale originano le vertebre, il tessuto osseo, il tessuto cartilagineo, il tessuto adiposo etc....

La richiesta di strategie terapeutiche biologiche è in costante crescita e lo sviluppo della bioingegneria e dell'ingegneria dei tessuti apre nuove prospettive alla realizzazione della medicina rigenerativa. In quest'ambito, una frontiera innovativa è rappresentata dalla possibilità di utilizzare cellule staminali adulte nella cosiddetta terapia di sostituzione cellulare.

Se adeguatamente trattate ed indirizzate, le cellule staminali mesenchimali possono dare origine, infatti, a cellule con caratteristiche di vari tessuti, come quello osseo, cartilagineo od adiposo, per citarne alcuni.

Le cellule staminali mesenchinali sono contenute, all'interno dello stroma midollare, dove svolgono un importante ruolo come cellule della nicchia ematopoietica.

Una delle maggiori difficoltà che si incontrano nell 'utilizzo in campo clinico di queste cellule è la loro scarsa presenza nel midollo. Quindi, per poter essere utilizzate, devono essere prelevate e moltiplicate in laboratorio, per raggiungere un numero clinicamente fruibile.

L'utilizzo di cellule staminali mesenchimali nel trattamento terapeutico è vantaggioso in quanto prevede l'impiego di cellule autologhe, ovvero prelevate, espanse e reimpiantate nello stesso paziente. Ciò evita, normalmente, problemi di attivazione del sistema immunitario, eliminando rischi di risposte "non-self". Inoltre, ciò semplifica le procedure sperimentali, in quanto permette di passare direttamente alla fase di sperimentazione in umano.

Al di fuori del corpo umano, le cellule staminali mesenchimali mantengono una buona capacità proliferativa e sono capaci di aderire a superfici quali vetro e plastica, comunemente usate per la coltura cellulare in laboratorio.

In un processo composto da prelievo, espansione o replicazione e reimpianto, la replicazione è un passaggio essenziale e deve essere sicuro, efficace, facile da ottenere e poco costoso.

Per ottenere la replicazione, è necessario non solo alimentare le cellule ma anche fornire loro segnali che le inducano a moltiplicarsi. Ciò viene fatto mediante l'esposizione delle cellule a proteine, classificate come fattori di crescita.

Al momento, non vi è alcun test che può essere svolto su una cellula singola per determinare se essa sia una cellula MSC. Esistono antigeni di superficie che possono essere utilizzati per isolare una popolazione cellulare che abbia capacità di autorinnovamento e differenziazione simili alle MSC ma, in effetti, la popolazione delle MSC, tipicamente non esprime tutti i marker suddetti e non vi è certezza, attualmente, di quali debbano essere espressi per classificare una cellula come MSC. In particolare, le MSC esprimono uno specifico pattern di molecole di adesione sulla membrana cellulare come SH2 (CD105), SH3 e SH4 (CD73), CD106, CD54, CD44, CD90, CD29 e STRO-1. Le MSC non esprimono, invece, marker propri delle cellule ematopoietiche. Ad ogni modo, allo stato attuale, vengono ancora identificate per combinazione di caratteristiche morfologiche, fenotipiche e funzionali .

La capacità di differenziazione, elevata nelle MSC che mantengono anche la loro multipotenza, può essere testata, tramite la differenziazione in osteoblasti, adipociti e condrociti, così come miociti e possibilmente cellule simil-neuronali o neuroblasti. In ogni caso, il grado di differenziazione di una coltura varia tra i soggetti ed in base a come la differenzia zione è indotta.

La maggioranza delle moderne tecniche di coltura mantiene l'approccio tradizionale CFU-f ("colonyforming unit fibroblasts" ) descritto in Friedenshtein A. J., Deriglazova U. F., Kulagina N. N. et al., "Precursor for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by thè in vitro colony assay method" Exp. Hematol. 1974 Voi. 2, pagg.

83-92., in cui il midollo osseo grezzo non purificato o monociti di midollo osseo purificati in Ficoll sono direttamente inoculati su piastre di coltura cellulare o fiasche. Le cellule staminali mesenchimali sono aderenti al tessuto di coltura plastico entro 24 — 48 ore .

E' noto anche il documento US-A-2008/0102506 che, oltre a fornire un interessante panorama sulle tecniche di coltivazione note per cellule staminali mesenchimali, propone di sottoporre un campione di tessuto umano, quale tessuto adiposo o placenta, ad un trattamento meccanico ed enzimatico, collagenasi in DMEM ( "Dulbecco 's Modified Eagle Medium"), per ottenere una sospensione, che viene filtrata sequenzialmente con filtri a pori di diametro compreso tra 50 micron e 150 micron, da cui si hanno cellule staminali mesenchimali.

E' noto pure US-A-200870176328 che descrive un metodo per indurre la differenziazione di cellule staminali mesenchimali derivanti dal midollo in neuroni maturi mediante coltura in un medium ottimale.

E' noto pure US-A-2009/0004661 che descrive un metodo per la coltura di cellule staminali mesenchimali usando CBS (cord blood serum).

Infine, è noto US-A-2009/0169527 che descrive un metodo per indurre fattori inducenti di angiogenesi e vasculogenesi da cellule staminali mesenchimali.

Uno scopo del presente trovato è quello di mettere a punto un procedimento per la replicazione o proliferazione di cellule staminali mesenchimali prelevate dal midollo osseo che fornisca un elevato numero di cellule staminali mesenchimali che siano efficaci quando utilizzate nel trattamento terapeutico di determinate patologie, direttamente oppure dopo differenziazione a seconda della specifica patologia che verrà trattata.

Per ovviare agli inconvenienti della tecnica nota e per ottenere questo ed ulteriori scopi e vantaggi, la Richiedente ha studiato, sperimentato e realizzato il presente trovato.

ESPOSIZIONE DEL TROVATO

Il presente trovato è espresso e caratterizzato nelle rivendicazioni indipendenti.

Le rivendicazioni dipendenti espongono altre caratteristiche del presente trovato o varianti dell'idea di soluzione principale.

In accordo con il suddetto scopo, un metodo per la replicazione di cellule staminali mesenchimali da midollo osseo, preferibilmente da cresta-iliaca — midollare, secondo il presente trovato comprende:

a) una fase di isolamento e trattamento di una porzione di frazione cellulare da midollo osseo;

b) una fase di piastratura di sospensione cellulare derivante dalla fase a), che prevede l'erogazione su piastra di una determinata quantità di Hanks (Hanks' Balanced Salt Solution HBBS), l'inoculo su piastra della suddetta porzione cellulare e la distribuzione su piastra di un terreno di coltura comprendente DMEM ("Dulbecco's Modified Eagle Medium"), FBS ("fetal bovine serum" ) ed uno o più aminoacidi essenziali, quali L-glutammina, per produrre una coltura primaria di cellule staminali mesenchimali adese;

c) una fase di incubazione della coltura di cellule della fase b) a 37 °C in un incubatore con aria al 5% di C02per un periodo di tempo compreso tra 24 e 96 ore .

Varianti di realizzazione del trovato prevedono che il DMEM utilizzato per preparare il terreno di coltura del presente trovato sia previsto ad alta ed a bassa concentrazione di glucosio.

Varianti di realizzazione prevedono anche l'aggiunta di aminoacidi non essenziali al terreno di coltura preparato per la fase b).

Varianti di realizzazione prevedono una concentrazione di aminoacido essenziale, ad esempio L-glutammina, compresa tra 180 mM e 220 mM, ad esempio 200 mM.

Varianti di realizzazione prevedono un'erogazione di Hanks su piastra in quantità compresa tra 4 e 12 cc, preferibilmente tra 6 e 10 cc, ad esempio 8 cc per circa 400 cc complessivi di terreno di coltura secondo il trovato. In termini di quantità percentuale, lo Hanks viene distributivo sulla piastra in quantità compresa tra 1% e 3% (in volume (cc)) della quantità complessiva di terreno di coltura che viene distribuito su piastra.

Prime forme di realizzazione del trovato prevedono, nella preparazione del terreno di coltura per la fase b), un'aggiunta di DMEM, ad alta concentrazione di glucosio, compresa tra 75% e 85% sul volume (in cc) di terreno di coltura.

in alcune di tali forme di realizzazione si prevede, nella preparazione del terreno di coltura per la fase b), un'aggiunta di DMEM, a bassa concentrazione di glucosio, compresa tra 7,0% e 8,0% sul volume (in cc) di terreno di coltura.

In alcune di tali forme di realizzazione si prevede, nella preparazione del terreno di coltura per la fase b), un'aggiunta di FBS compresa tra 9,5% e 10,5% sul volume (in cc) di terreno di coltura.

In alcune di tali forme di realizzazione si prevede, nella preparazione del terreno di coltura per la fase b), un'aggiunta di aminoacido essenziale, ad esempio L-glutammina, compresa tra 0,5% e 1,5% sul volume (in cc) di terreno di coltura.

In alcune di tali forme di realizzazione si prevede, nella preparazione del terreno di coltura per la fase b), un'aggiunta di aminoacidi non essenziali compresa tra 0,5% e 1,5% sul volume (in cc) di terreno di coltura.

Varianti alternative di realizzazione del presente trovato si prevede, nella preparazione del terreno di coltura per la fase b), che il terreno di coltura della fase b) comprenda anche medium F12.

Forme di realizzazione di tali varianti prevedono, nella preparazione del terreno di coltura per la fase b), un'aggiunta di DMEM, ad alta concentrazione di glucosio, compresa tra 35% e 40% sul volume (in cc) di terreno di coltura.

Forme di realizzazione di tali varianti prevedono, nella preparazione del terreno di coltura per la fase b), un'aggiunta di F12 compresa tra 40% e 50% sul volume (in cc) di terreno di coltura.

Forme di realizzazione di tali varianti prevedono, nella preparazione del terreno di coltura per la fase b), un'aggiunta di DMEM, a bassa concentrazione di glucosio, compresa tra 6,0% e 8,0% sul volume (in cc) di terreno di coltura.

Forme di realizzazione di tali varianti prevedono, nella preparazione del terreno di coltura per la fase b), un'aggiunta di aminoacido essenziale, ad esempio L-glutammina, compresa tra 0,5% e 1,5% sul volume (in cc) di terreno di coltura.

Forme di realizzazione di tali varianti prevedono, nella preparazione del terreno di coltura per la fase b), un'aggiunta di FBS compresa tra 9,5% e 10,5% sul volume (in cc) di terreno di coltura.

In forme realizzative del trovato, è prevista una fase di sottocoltura d) della coltura primaria derivante dalle fasi b) e c), ai fini di ottenere un voluto numero finale di cellule staminali.

Forme di realizzazione del presente trovato prevedono una fase e) di conta cellulare e di analisi della coltura cellulare derivante dalla fase c) per l'espressione di marker CD, vantaggiosamente ai fini di immunostaining e citofenotipizzazione.

Forme di realizzazione del presente trovato prevedono una fase f) di analisi, ad esempio morfologica, delle cellule derivate dalle cellule staminali mesenchimali in vitro ed in vivo.

Secondo una variante realizzativa del presente trovato, il suddetto metodo comprende, inoltre, una fase di indirizzamento delle cellule ottenute dalla fase c) o d) mediante acido retinoico in soluzione di etanolo, aggiunto in quantità di 50 microlitri per ogni milione di cellule, con concentrazione, in etanolo, compresa tra 0,60 e 1,10 g/1.

Forme di realizzazione del trovato prevedono che nella fase di indirizzamento si aggiunga una determinata quantità di siero del paziente da trattare alle cellule che vengono indirizzate. Ciò può avere il vantaggio di mantenere o provvedere i caratteri "self" delle cellule differenziate, per non avere risposte autoimmuni.

Un aspetto del presente trovato è relativo anche all 'utilizzo delle cellule staminali mesenchimali ottenibili secondo il metodo sopra descritto come medicemento per l'uso nel trattamento di patologie autoimmuni oppure neurodegenerative.

Forme realizzative del trovato prevedono l'uso delle cellule staminali mesenchimali direttamente ottenute dalla suddetta fase c) oppure dalla fase d) di sottocoltura come medicamento per l'uso nel trattamento terapeutico di patologie autoimmuni, quali psoriasi, artrite reumatoide, morbo di Crohn.

Forme di realizzazione del trovato per l'uso nel trattamento delle suddette patologie autoimmuni prevedono l'utilizzo del suddetto terreno di coltura come da fase b) aggiunto alla sospensione cellulare nella fase d) di sottocoltura cellulare, vantaggiosamente dopo il distacco delle cellule adese, ad esempio tramite tripsina, in quantità compresa almeno tra 4 e 5 cc.

In forme di realizzazione del trovato, la quantità cellulare di posologia, che viene somministrata come medicamento per l'uso nel trattamento delle malattie autoimmuni è compresa tra 2,5 e 4,5 milioni di cellule per somministrazione per paziente.

In forme di realizzazione del trovato, la suddetta somministrazione, nelle dosi indicate, è vantaggiosamente ripetuta, per paziente, un numero di volte compreso tra 2 e 5, ad intervalli di tempo, tra una somministrazione e l'altra, compresi tra 15 e 45 giorni, preferibilmente tra 20 e 40 giorni, ancor più preferibilmente tra 25 e 35 giorni.

In forme realizzative per l'uso nel trattamento della psoriasi l'aggiunta del suddetto terreno di coltura come da fase b) nella sottocoltura della fase d), vantaggiosamente dopo il distacco delle cellule adese, ad esempio tramite tripsina, è in quantità di 4 cc. In tal caso la quantità di posologia somministrata come medicamento, vantaggiosamente per endovena, è di 2,5 — 3,5 milioni di cellule staminali come ottenute dalla fase d) di sottocoltura.

In forme realizzative per l'uso nel trattamento dell'artrite reumatoide l'aggiunta del suddetto terreno di coltura come da fase b) nella sottocoltura della fase d), vantaggiosamente dopo il distacco delle cellule adese, ad esempio tramite tripsina, è in quantità di 5 cc. In tal caso la quantità somministrata come medicamento, vantaggiosamente per endovena, è di 3,0 — 4,0 milioni di cellule staminali come ottenute dalla fase d) di sottocoltura.

In forme realizzative di medicamento per l'uso nel trattamento del morbo di Crohn, l'aggiunta del suddetto terreno di coltura come da fase b) nella sottocoltura della fase d), vantaggiosamente dopo il distacco delle cellule adese, ad esempio tramite tripsina, è in quantità di 4,5 cc. In tal caso la quantità somministrata, vantaggiosamente per endovena, è di 2,5 — 4,5 milioni di cellule staminali come ottenute dalla fase d) di sottocoltura.

Forme di realizzazione del presente trovato prevedono che le cellule staminali mesenchimali ottenute siano sottoposte a differenziazione, ovvero indirizzamento, vantaggiosamente mediante aggiunta di acido retinoico, incubandole con siero derivante o prelevato dal paziente.

La differenziazione secondo il trovato permette di ottenere cellule staminali che morfologicamente sono di tipo neuronaie.

In forme di realizzazione, le cellule mesenchimali staminali ottenute dalla suddetta fase c), oppure dalla fase d) di sottocoltura, sono successivamente sottoposte direttamente alla suddetta differenziazione .

In altre forme di realizzazione, le cellule mesenchimali staminali ottenute dalla suddetta fase c), oppure dalla fase d) di sottocoltura, sono sottoposte a crioconservazione e successivamente, una volta scongelate, sottoposte alla suddetta differenziazione per ulteriori somministrazioni in voluti dosaggi.

in altre forme di realizzazione ancora, parte delle cellule mesenchimali staminali ottenute dalla suddetta fase c), oppure dalla fase d) di sottocoltura, sono sottoposte a crioconservazione per essere successivamente sottoposte alla suddetta differenziazione e parte di dette cellule staminali viene sottoposta direttamente alla suddetta differenziazione.

Forme realizzative del trovato prevedono l'uso delle cellule staminali mesenchimali indirizzate, vantaggiosamente con aggiunta di acido retinoico, come medicamento per l'uso nel trattamento terapeutico di patologie neurodegenerative, quali morbo di Parkinson, sclerosi laterale amiotrofica (SLA), sclerosi multipla (SM), atrofia multisistemica (MSA), morbo di Alzheimer.

In tal caso, forme di realizzazione del trovato per l'uso nel trattamento delle suddette patologie neurodegenerative prevedono l'utilizzo di acido retinoico in soluzione di etanolo con concentrazione compresa tra 0,60 e 1,10 g/1 aggiunto in quantità compresa tra 40 microlitri e 60 microlitri, vantaggiosamente tra 45 microlitri e 65 microlitri, ad esempio 50 microlitri, per ogni milione di cellule.

In forme di realizzazione per l'uso nel trattamento delle suddette patologie neurodegenerative la quantità cellulare di posologia che viene somministrata come medicamento è compresa tra 2,5 e 5 milioni di cellule per somministrazione per paziente.

In forme realizzative per l'uso nel trattamento del morbo di Parkinson, l'acido retinoico aggiunto è ad una concentrazione compresa tra 0,60 e 0,80 g/1. In tal caso la quantità somministrata come medicamento, vantaggiosamente per endorachidea al 70% e per endovena al 30%, è di 3,5 — 4,5 milioni di cellule staminali ottenute dopo 1'indirizzamento.

In forme realizzative per l'uso nel trattamento della sclerosi laterale amiotrofica (SLA), sclerosi multipla (SM) ed atrofia multisistemica (MSA), l'acido retinoico aggiunto è ad una concentrazione compresa tra 0,70 e 0,90 g/1. In tal caso la quantità somministrata come medicamento, vantaggiosamente per endorachidea al 65% e per endovena al 35%, è di 2,5 — 4,0 milioni di cellule staminali ottenute dopo 1'indirizzamento.

In forme realizzative come medicamento per l'uso nel trattamento del morbo di Alzheimer, l'acido retinoico aggiunto è ad una concentrazione compresa tra 0,85 e 1,10 g/1. In tal caso la quantità somministrata come medicamento, vantaggiosamente per endorachidea al 70% e per endovena al 30%, è di 3,0 — 5,0 milioni di cellule staminali ottenute dopo 1'indirizzamento .

In forme di realizzazione del presente trovato, il termine "medicamento" è utilizzato come sinonimo di "preparazione farmaceutica".

Nel presente trovato rientra anche l'uso delle cellule ottenibili secondo il presente trovato, pluripotenti o differenziate secondo le finalità terapeutiche, per la preparazione di un medicamento o composizione farmaceutica per il trattamento delle patologie autoimmuni o neurodegenerative come sopra espresse. In forme di realizzazione del trovato, i medicamenti, o preparazioni farmaceutiche di cui sopra, comprendono le cellule staminali, ottenibili secondo il trovato, pluripotenti o differenziate secondo le finalità terapeutiche, come principio attivo, insieme ad adiuvanti e/o eccipienti farmacologicamente accettabili.

In forme di realizzazione, il medicamento o preparazione farmacolgica del presente trovato è formulato per l'iniezione endovenosa.

In forme di realizzazione, il medicamento o preparazione farmacolgica del presente trovato è formulato per l'iniezione endorachidea.

In forme di realizzazione, il medicamento o preparazione farmacolgica del presente trovato è formulato per l'iniezione endocranica, ad esempio per patologie quali morbo di Parkinson od Alzheimer od altre patologie localizzate in zona cerebrale o midollare.

In altre forme di realizzazione, il medicamento o preparazione farmacolgica del presente può essere formulato per l'applicazione locale.

Nel presente trovato rientra anche l'uso dei medicamenti, o preparazioni farmaceutiche sopra descritti, vantaggiosamente nei dosaggi di cui sopra, per il trattamento delle patologie autoimmuni o neurodegenerative come sopra espresse.

In alcune forme di realizzazione, il presente trovato si applica vantaggiosamente a cellule staminali mesenchimali di tipo autologo, ovvero con prelievo e reimpianto dallo stesso paziente.

In altre forme di realizzazione, il presente trovato si applica anche all'utilizzo di cellule staminali di origine eterologa, preferenzialmente nella donazione tra consaguinei.

ESEMPIO: Replicazione di cellule staminali mesenchimali e loro usi terapeutici come medicamento

Le cellule staminali mesenchimali isolate da cresta iliaca in seguito alla replicazione secondo il trovato sono in grado di risolvere nell'arco di pochi mesi lesioni o patologie inguaribili o guaribili solo lentamente con la metodologia e/o i farmaci classici. Le cellule staminali mesenchimali secondo il trovato agiscono "in vivo" da cellule staminali pluripotenti (PSC) per l'uso nel trattamento di determinate patologie facenti parte della classe delle patologie autoimmuni, oppure vengono differenziate e successivamente agiscono "in vivo" da cellule specializzate, per l'uso nel trattamento di determinate patologie facenti parte della classe delle patologie neurodegenerative .

MATERIALI E METODI

Fase a)

Prelievo·.

Ogni campione di midollo deriva da biopsia della cresta iliaca — midollare da essere umano, a profondità di 10 mm, con carotatore di lunghezza di 15 — 20 mm, con diametro carotatore standard ad esempio diametro interno di circa 4 min e diametro esterno di circa 5 mm. Nel caso di non adulti, è possibile utilizzare un carotatore pediatrico, meno invasivo.

Il pezzo anatomico viene immesso in provetta contenente 15-20 cc di Hanks (Hanks' Balanced Salt Solution HBBS, soluzione salina con elevata capacità di buffer, Invitrogen Gibco) in ghiaccio e trasportato a 0 °C entro tre ore in camera bianca.

Contestualmente, vengono prelevati 10 cc di sangue venoso dal paziente, senza aggiunta di anticoagulanti, che viene sottoposto a centrifugazione per separare la parte corpuscolata dal siero. Successivamente, il siero viene aliquotato in lotti da 500 microlitri e stoccato in freezer.

Fase b) Trattamento Midollo e coltura cellulare·.

I materiali impiegati sono Hanks non modificato, piastre di coltura, provette, pinze etanolo assoluto. Le pinze vengono sterilizzate con etanolo ed alla fiamma bunsen per essere usate per la frantumazione del campione.

Per ciascuna piastra, si pipettano 8 cc di Hanks, tale valore può variare a seconda del diametro della piastra.

II campione di midollo viene prelevato con le pinze e frantumato e si crea una sospensione cellulare che verrà poi pilastrata su piastra di coltura.

Separatamente si prepara il terreno di coltura secondo il trovato (si veda paragrafo corrispondente), che verrà trasferito in provetta.

Lo Hanks del campione viene trasferito nella piastra e stoccato in frigo come riserva.

Successivamente, si prendono 4 camere incubatrici, o falcon, di coltura (mediamente di capienza tra 75 e 250 cc) per i campioni e si aggiungono 14,5 cc di terreno di coltura preparato, cadauna.

Le piastre sono svuotate, si aggiungono ulteriori 2 cc di DMEM (Invitrogen Gibco) e si mescola.

Si effettua controllo al microscopio ottico, per verificare l'assenza di impurità ed effettuare il controllo morfologico.

Si lascia incubare per 24 — 96 ore in atmosfera modificata al 5% di C02. Al termine si ottiene la coltura primaria.

Tale coltura primaria viene vantaggiosamente sviluppata in sottocolture.

A tal fine, si prevedono lavaggi delle camere incubatrici .

Lavaggi :

I materiali impiegati sono Hanks non modificato e DMEM.

Si svuotano le falcon, si aggiungono 10-12 cc di Hanks, si mescola e si svuota e si ripetono i passaggi precedenti.

Successivamente, per la sottocoltura successiva, si aggiungono 15 — 16 cc di terreno di coltura secondo il trovato e si lascia incubare.

Il lavaggio ed il cambio di terreno avviene preferenzialmente ogni 48— 72 ore.

Preparazione terreno di coltura secondo il trovato: - Prima alternativa

Si predispongono 330 cc di DMEM (Invitrogen Gibco), ad alta concentrazione di glucosio.

Si aggiungono 30 cc di DMEM (Invitrogen Gibco) a bassa concentrazione di glucosio, per arrivare ad un totale di 360 cc.

Si aggiungono 40 cc di FBS (fetal bovine serum, Invitrogen Gibco) (gmp) preliminarmente portato a 56 °C per 30' e poi raffreddato.

Si aggiungono 4 cc di aminoacido essenziale L-glutammina (200mM, Sigma).

Si aggiungono 4 cc di soluzione di aminoacidi non essenziali .

Si aggiungono 500 microlitri di gentamicina (50 mg/ml, Invitrogen Gibco). Alternativamente è utilizzabile streptomicina od altro principio antibiotico, sempre con finalità di impedire la crescita batterica.

Si filtra il tutto sottovuoto e si conserva a temperatura di 4°C.

Seconda alternativa

Si predispongono 150 cc di DMEM (Invitrogen Gibco), ad alta concentrazione di glucosio.

Si aggiungono 178 cc di terreno F12 (Invitrogen Gibco) .

Si aggiungono 28 cc di DMEM (Invitrogen Gibco) a bassa concentrazione di glucosio.

Si aggiungono 4 cc di aminoacido essenziale L-glutammina (200mM).

Si aggiungono 4 cc di soluzione di aminoacidi non essenziali.

Si aggiungono 500 microlitri di gentamicina (50 mg/ml). Alternativamente è utilizzabile streptomicina od altro principio antibiotico, sempre con finalità di impedire la crescita batterica.

Si filtra il tutto sottovuoto e si conserva a temperatura di 4°C.

Fase d): sottocoltura cellularei

Tale fase d) di sottocoltura si avvale dei lavaggi sopra descritti.

i) Si procede a svuotare le falcon, lasciandole dritte.

ii) Si aggiungono 4-5 cc di Hanks senza calcio Ca<2+>(EXP).

iii) Si attende circa 1— 2 minuti.

iv) Si svuotano le falcon e le si lascia dritte. v) Si aggiungono 4 cc di tripsina (Sigma), a freddo, si chiudono e si stendono le falcon. La tripsina, com'è noto, serve a staccare la cellule adese alla superficie delle falcon.

vi) Si lascia agire per 30 secondi.

vii) Si svuotano quasi completamente le falcon in altre falcon adatte, lasciando una certa quantità all'interno, e poi si richiudono.

viii) Si effettua un controllo al microscopio ottico per verificare quando le cellule si staccano.

ix) Successivamente si mettono le falcon riempite nell'incubatore per 6-7 minuti.

x) Si aggiungono 8 cc di terreno di coltura per inattivare la tripsina.

xi) Si aggiungono 4-5 cc di terreno di coltura secondo il trovato.

xii) Si sciacqua per due volte, si raccoglie il tutto e si travasa in una provetta da centrifuga. xiii) In seguito, si effettua una centrifugazione a 1600 - 1700 rpm per 10 minuti.

xiv) Nel frattempo, si preparano altre 10 falcon con 4-5 cc di medium (piccole) o 15 cc di medium (grandi ).

xv) Si svuotano le provette e si aggiungono 2,5 cc di medium (per 5 fiasche piccole).

xvi) Per stabilire la concentrazione, si mette una goccia di soluzione nella camera conta globuli: ad esempio in camera di Burker: 1 linea/60*IO<6>oppure 1 quadrato/ 4*IO<6>.

xvii) Si mescola con la pipetta 15 — 20 volte e si aggiungono 500 microlitri in una fiasca piccola, con l'accortezza che nelle falcon rimangano sempre 10 — 20 cc di materiale o terreno di coltura a coprire almeno il fondo.

xviii) Su ciascuna falcon si scrivono dati e concentrazione .

xix) Si controllano le falcon al microscopio per numero e morfologia.

xx) Si mette in incubatore.

Crioconservazione in etanolo·.

1) Si svuotano le fiasche.

2) Si aggiungono 10 cc di soluzione Versene (soluzione senza calcio Ca<2+>e magnesio Mg<2+>e riscaldata, Invitrogen Gibco) per ogni falcon, lasciando agire per 1-2 minuti.

3) Si svuotano delicatamente le falcon.

4) Si aggiungono 4-5 cc di tripsina fredda, senza farle toccare la parete. La tripsina, com'è noto, serve a staccare la cellule adese alla superficie delle falcon.

5) Dopo 30 secondi si svuotano le falcon lasciando sempre un po' di soluzione all'interno.

6) Inoltre, si scuotono le falcon per facilitare il distacco delle cellule.

7) Si mettono le falcon in incubatore per qualche minuto, controllando al microscopio ottico quando le cellule si staccano.

8) Si aggiungono 8 cc di medium per inattivare la tripsina.

9) Si aspira tutta la soluzione e si sciacquano le falcon per 2 volte.

10) Si aspira nuovamente tutta la soluzione e si mette in provette.

11) Si centrifuga a 1600 - 1700 rpm per 10 minuti e si elimina il surnatante.

12) Si svuota la provetta.

13) Per ciascuna provetta, si aggiungono 500 microlitri di FBS inattivato (trattato 30 minuti a 56 °C, per avere sicurezza di negatività a BSE) al 25% (8 cc di medium più 2 cc di FBS, la soluzione deve essere filtrata) .

14) Si aggiunge DMSO al 20% in pari quantità alla soluzione presente (1:1).

15) Si prepara una piastra di controllo con 10 cc di medium e qualche goccia di soluzione, e si mette in incubatore, per consentire i controlli di sterilità.

16) Si effettua la conta delle cellule, ai fini della successiva posologia, in particolare in connessione con 1 'indirizzamento mediante acido retinoico di cui si dirà in dettaglio nel prosieguo.

17) Successivamente, si lascia per 15 minuti in etanolo a temperatura di -32 °C (azoto ed etanolo sotto temperatura controllata).

18) Dopo 15 minuti si trasferisce a -190 °C.

In alternativa, si procede con congelamento con passi di -1 C° al minuto.

RISULTATI

Uso sistemico diretto, effetto locale

In forme di realizzazione, le cellule staminali ottenute, di tipo pulripotente, sono impiegate direttamente come medicamento, senza essere indirizzate e, secondo alcune forme di realizzazione, senza essere crioconservate, per l'uso nel trattamento di patologie autoimmuni mediante somministrazione in endovena.

- Posologia:

-) Psoriasi: il tal caso, il punto xi) della subcoltura cellulare prevede l'aggiunta di 4 cc di terreno di coltura secondo il trovato, e la somministrazione per endovena di 2,5 — 3,5 milioni di cellule staminali mesenchimali ottenute con il metodo sopra descritto.

-) Artrite reumatoide: il tal caso, il punto xi) della sub-coltura cellulare prevede l'aggiunta di 5 cc di terreno di coltura secondo il trovato, e la somministrazione per endovena di 3,0 — 4,0 milioni di cellule staminali mesenchimali.

-) Morbo di Crohn: il tal caso, il punto xi) della sub-coltura cellulare prevede l'aggiunta di 4,5 cc di e la somministrazione per endovena di 2,5 — 4,5 milioni di cellule staminali mesenchimali per endovena. Nel caso delle malattie autoimmuni, le somministrazioni sono preferibilmente costituite da due dosi in fialetta e l'intervallo tra la prima e la seconda somministrazione è preferibilmente di circa 30 giorni.

i/so sistemico dopo indirizzamento ed eventuale decrioconservazione , effetto locale

In forme di realizzazione, le cellule staminali ottenute, di tipo pulripotente, sono impiegate dopo essere state indirizzate e, secondo alcune forme di realizzazione, opzionalmente dopo essere state crioconservate e decrioconservate, per l'uso nel trattamento di patologie neurodegenerative, mediante somministrazione in endovena ed endorachidea.

- Decrioconservazione:

Si attende qualche minuto che l'azoto si dissolva e poi si mette la provetta a 38-39 °C per 3-5 minuti. Si aggiungono 2-3 cc di medium e si centrifuga a 1600 - 1700 rpm per 10 minuti. Successivamente si svuota e si diluisce in medium DMEM-F12 (1:1, 2-3 cc).

- Fase di Indirizzamento:

Tale fase può essere eseguita sulle cellule ottenute direttamente dalla coltura primaria, se il numero lo consente, oppure dalla fase di sottocoltura d). Oppure, tale fase può essere effettuata sulle cellule scongelate come sopra descritto.

1) Aggiungere 500 microlitri di diluizione al 5% in fisiologica del siero del paziente precedentemente prelevato.

2) Successivamente, incubare per 15 minuti a 37 °C, centrifugare a 1600-1700 rpm per 6 — 8 minuti, aspirare e controllare al microscopio ottico per verificare l'assenza di impurità ed effettuare il controllo morfologico.

3) Aggiungere 50 microlitri di soluzione di acido retinoico per milione di cellule (concentrazione tra 0,60 e 1,1 g/1 in etanolo, ad esempio: 0,65 — 0,70 — 0,80 — 0,90 — 1,00 — 1,10 g/1 in etanolo a seconda del diverso utilizzo terapeutico) e portare a 500 microlitri con fisiologica (500 microlitri totali).

4) Incubare 15 minuti a 37 °C, centrifugare, aspirare e controllare al microscopio ottico per verificare l'assenza di impurità ed effettuare il controllo morfologico.

5) Risospendere con 2-3 cc di soluzione fisiologica e mantenere in bagno di ghiaccio fino alla somministrazione, preferenzialmente entro un tempo massimo di 10 minuti per endorachidea, di 30 minuti per endovenosa. v) Prelevare una piccola aliquota per controllare 1'indirizzamento ed effettuare prove di sterilità. Le cellule staminali indirizzate sono impiegate dopo la decrioconservazione, per l'uso nel trattamento di patologie neurodegenerative mediante somministrazione endorachidea ed endovenosa.

- Posologia:

-) Morbo di Parkinson: il tal caso, il punto ii) dell'indirizzamento prevede l'utilizzo di acido retinico con concentrazione in etanolo tra 0,60 e 0,80 g/1, e la somministrazione di 3,5 — 4,5 milioni di cellule staminali mesenchimali come medicamento, di cui il 70% somministrato per via endorachidea ed il 30% per endovena.

-) Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA), Sclerosi Multipla (SM) e Atrofia Multisistemica (MSA): il tal caso, il punto ii) dell'indirizzamento prevede l'utilizzo di acido retinico con concentrazione in etanolo tra 0,70 e 0,90 g/1, e la somministrazione di 2,5 — 4,0 milioni di cellule staminali mesenchimali come medicamento, di cui il 65% somministrato per via endorachidea ed il 35% per endovena.

-) Morbo di Alzheimer: il tal caso, il punto ii) dell'indirizzamento prevede l'utilizzo di acido retinico con concentrazione in etanolo tra 0,85 e 1,1 g/1, e la somministrazione di 3,0 — 5,0 milioni di cellule staminali mesenchimali come medicamento, di cui il 70% somministrato per via endorachidea ed il 30% per endovena.

Nel caso delle malattie neurodegenerative, le soniministrazioni come medicamento sono preferibilmente costituite da cinque dosi in fialetta e l'intervallo tra le varie somministrazioni è preferibilmente di circa 30 giorni.

È chiaro che al metodo per la replicazione di cellule staminali mesenchimali ed all'utilizzo terapeutico delle cellule staminali mesenchimali così ottenute fin qui descritto possono essere apportate modifiche e/o aggiunte di parti e/o fasi, senza per questo uscire dall'ambito del presente trovato.

È anche chiaro che, sebbene il presente trovato sia stato descritto con riferimento ad alcuni esempi specifici, una persona esperta del ramo potrà senz'altro realizzare molte altre forme equivalenti di metodo per la replicazione di cellule staminali mesenchimali e utilizzo terapeutico delle cellule staminali mesenchimali così ottenute, aventi le caratteristiche espresse nelle rivendicazioni e quindi tutte rientranti nell'ambito di protezione da esse definito.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Metodo per la replicazione di cellule staminali mesenchimali da midollo osseo, preferibilmente da cresta iliaca — midollare, caratterizzato dal fatto che comprende: a) una prima fase di isolamento e trattamento di una porzione di frazione cellulare da midollo osseo; b) una seconda fase di piastratura di sospensione cellulare derivante dalla fase a), che prevede l'erogazione su piastra di una determinata quantità di Hanks, l'inoculo su piastra della suddetta porzione cellulare e la distribuzione su piastra di un terreno di coltura comprendente DMEM, FBS ed uno o più aminoacidi essenziali, per produrre una coltura primaria di cellule staminali mesenchimali adese; c) una fase di incubazione della coltura di cellule della fase b) a 37 °C in un incubatore con aria al 5% di C02per un periodo di tempo compreso tra 24 e 96 ore .
2. Metodo come nella rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che il DMEM utilizzato per preparare il terreno di coltura nella fase b) è previsto ad alta ed a bassa concentrazione di glucosio.
3. Metodo come nella rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che il terreno di coltura preparato per la fase b) prevede un'aggiunta di DMEM, ad alta concentrazione di glucosio, compresa tra 75% e 85% sul volume (in cc) di terreno di coltura.
4. Metodo come nella rivendicazione 2 o 3, caratterizzato dal fatto che il terreno di coltura preparato per la fase b) prevede un'aggiunta di DMEM, a bassa concentrazione di glucosio, compresa tra 7,0% e 8,0% sul volume (in cc) di terreno di coltura.
5. Metodo come in una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che il terreno di coltura preparato per la fase b) prevede un'aggiunta di FBS compresa tra 9,5% e 10,5% sul volume (in cc) di terreno di coltura.
6. Metodo come in una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che il terreno di coltura preparato per la fase b) prevede un'aggiunta di aminoacido essenziale compresa tra 0,5% e 1,5% sul volume (in cc) di terreno di coltura.
7. Metodo come nella rivendicazione 1 o 2, caratterizzato dal fatto che il terreno di coltura preparato per la fase b) comprende anche medium F12.
8. Metodo come nella rivendicazione 7 r, caratterizzato dal fatto che il terreno di coltura preparato per la fase b) prevede un'aggiunta di DMEM, ad alta concentrazione di glucosio, compresa tra 35% e 40% sul volume (in cc) di terreno di coltura.
9. Metodo come nella rivendicazione 7 o 8, caratterizzato dal fatto che il terreno di coltura preparato per la fase b) prevede un'aggiunta di F12 compresa tra 40% e 50% sul volume (in cc) di terreno di coltura.
10. Metodo come nella rivendicazione 7, 8 o 9, caratterizzato dal fatto che il terreno di coltura preparato per la fase b) prevede un'aggiunta di DMEM, a bassa concentrazione di glucosio, compresa tra 6,0% e 8,0% sul volume (in cc) di terreno di coltura.
11. Metodo come nella rivendicazione 7, 8, 9, o 10, caratterizzato dal fatto che il terreno di coltura preparato per la fase b) prevede un'aggiunta di FBS compresa tra 9,5% e 10,5% sul volume (in cc) di terreno di coltura.
12. Metodo come in una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detto uno o più aminoacidi essenziali comprendono L-glutammina.
13. Metodo come in una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che comprende, inoltre, una fase di sottocoltura d) della coltura primaria derivante dalle fasi b) e c), ai fini di ottenere un voluto numero finale di cellule staminali.
14. Metodo come nella rivendicazione 1 o 13, caratterizzato dal fatto che comprende una fase di indirizzamento delle cellule ottenute dalla fase c) o d) mediante acido retinoico in soluzione di etanolo aggiunto in quantità di 50 microlitri per ogni milione di cellule, con concentrazione, in etanolo, compresa tra 0,60 e 1,1 g/1.
15. Metodo come nella rivendicazione 14, caratterizzato dal fatto che la fase di indirizzamento prevede di aggiungere una determinata quantità di siero del paziente da trattare alle cellule che vengono indirizzate .
16. Uso di cellule staminali mesenchimali ottenibili secondo un metodo come ad una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, per la preparazione di un medicamento per l'uso nel trattamento di patologie autoimmuni oppure neurodegenerative.
17. Medicamento comprendente cellule staminali mesenchimali ottenibili secondo un metodo come ad una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti per l'uso nel trattamento di patologie autoimmuni oppure neurodegenerative .
18. Medicamento come nelle rivendicazioni 16 o 17, in cui le cellule staminali sono pluripotenti, per l'uso nel trattamento terapeutico di patologie autoimmuni, quali psoriasi, artrite reumatoide, morbo di Crohn.
19. Medicamento come nella rivendicazione 18, in cui la replicazione delle cellule prevede l'utilizzo del suddetto terreno di coltura come da fase b) aggiunto alla sospensione cellulare nella fase d) di sottocoltura cellulare, in quantità compresa almeno tra 4 e 5 cc .
20. Medicamento come nella rivendicazione 18 o 19, in cui la quantità cellulare di posologia è compresa tra 2,5 e 4,5 milioni di cellule per somministrazione per paziente.
21. Medicamento come nella rivendicazione 18, 19 o 20, per l'uso nel trattamento della psoriasi, in cui l'aggiunta del suddetto terreno di coltura come da fase b) nella sottocoltura della fase d), è in quantità di 4 cc.
22. Medicamento come nella rivendicazione 21, in cui la quantità di posologia somministrata è di 2,5 — 3,5 milioni di cellule staminali come ottenute dalla fase d) di sottocoltura.
23. Medicamento come nella rivendicazione 18, 19 o 20, per l'uso nel trattamento dell'artrite reumatoide, in cui l'aggiunta del suddetto terreno di coltura come da fase b) nella sottocoltura della fase d), è in quantità di 5 cc.
24. Medicamento come nella rivendicazione 23, in cui la quantità di posologia somministrata è di 3,0 — 4,0 milioni di cellule staminali come ottenute dalla fase d) di sottocoltura.
25. Medicamento come nella rivendicazione 18, 19 o 20, per l'uso nel trattamento del morbo di Crohn, in cui l'aggiunta del suddetto terreno di coltura come da fase b) nella sottocoltura della fase d), è in quantità di 4,5 cc.
26. Medicamento come nella rivendicazione 25, in cui la quantità di posologia somministrata è di 2,5 — 4,5 milioni di cellule staminali come ottenute dalla fase d) di sottocoltura.
27. Medicamento come nelle rivendicazioni 16 o 17, in cui le cellule staminali sono indirizzate come nella rivendicazione 14 o 15, per l'uso nel trattamento terapeutico di patologie neurodegenerative, quali morbo di Parkinson, sclerosi laterale amiotrofica (SLA), sclerosi multipla (SM) atrofia multisistemica (MSA), morbo di Alzheimer.
28. Medicamento come nella rivendicazione 27, in cui la quantità cellulare di posologia è compresa tra 2,5 e 5 milioni di cellule per somministrazione per paziente .
29. Medicamento come nella rivendicazione 27 o 28, per l'uso nel trattamento del morbo di Parkinson, in cui l'acido retinoico aggiunto nella fase di indirizzamento delle rivendicazioni 14 o 15 è ad una concentrazione compresa tra 0,60 e 0,80 g/1.
30. Medicamento come nella rivendicazione 28 e 29, in cui la quantità cellulare di posologia è compresa tra 3.5 — 4,5 milioni di cellule staminali ottenute dopo 1'indirizzamento.
31. Medicamento come nella rivendicazione 27 o 28, per l'uso nel trattamento della sclerosi laterale amiotrofica (SLA), sclerosi multipla (SM) ed atrofia multisistemica (MSA), in cui l'acido retinoico aggiunto nella fase di indirizzamento delle rivendicazioni 14 o 15 è ad una concentrazione compresa tra 0,70 e 0,90 g/1.
32. Medicamento come nella rivendicazione 28 e 31, in cui la quantità cellulare di posologia è compresa tra 2.5 — 4,0 milioni di cellule staminali ottenute dopo 1'indirizzamento.
33. Medicamento come nella rivendicazione 27 o 28, per l'uso nel trattamento del morbo di Alzheimer, in cui l'acido retinoico aggiunto nella fase di indirizzamento delle rivendicazioni 14 o 15 è ad una concentrazione compresa tra 0,85 e 1,10 g/1.
34. Medicamento come nella rivendicazione 28 e 33, in cui la quantità cellulare di posologia è compresa tra 3,0 — 5,0 milioni di cellule staminali ottenute dopo 1'indirizzamento .