MXPA04006771A

MXPA04006771A - Materiales de celulas estromaticas de medula osea para uso en la formacion de vasos sanguineos y en la produccion de factores angiogenicos y troficos.

Info

Publication number: MXPA04006771A
Application number: MXPA04006771A
Authority: MX
Inventors: Chen Xiaoguang
Original assignee: Ford Henry Health System
Priority date: 2002-01-14
Filing date: 2003-01-14
Publication date: 2005-04-25
Also published as: CN1615143A; US20090169527A1; US20050158397A1; CZ2004852A3; IL186229A0; ZA200405091B; EP1474156A4; EP1474156A2; KR20040081749A; RU2004124832A; JP2010018627A; RU2332223C2; BR0306902A; WO2003059272A3; JP2006502085A; HUP0501032A2; NZ533688A; WO2003059272A2; AU2003205141A1; CA2473108A1

Abstract

Una sustancia terapeutica para uso en la induccion de angiogenesis y vasculogenesis, la sustancia terapeutica incluye factores inductores de angiogenesis y vasculogenesis aislados de celulas precursoras junto con un tratamiento con celulas farmaceuticamente aceptable. Un metodo para amplificar la produccion de factores inductores de angiogenesis y vasculogenesis secretados al exponer las celulas precursoras a, y cultivar de manera conjunta las celulas precursoras con un compuesto para incrementar la produccion de factores que inducen angiogenesis y vasculogenesis. Los factores que inducen angiogenesis y vasculogenesis aislados y purificados de las celulas precursoras para uso en un tratamiento. Un procedimiento para obtener los factores inductores de angiogenesis y vasculogenesis que se establecen en lo anterior, el procedimiento incluye las etapas de aislar y purificar celulas precursoras del mesenquima humano para tejido antes de la diferenciacion y despues expandir en cultivo las celulas precursoras del mesenquima para producir una herramienta para tratamiento neurologico y musculoesqueletico. Las celulas precursoras del mesenquima aisladas y expandidas por cultivo estan bajo la influencia de un compuesto necesario, son capaces de diferenciarse y producir el fenotipo de celula deseado necesario para reparacion de tejido.

Description

MATERIALES DE CELULAS ESTROMATICAS DE MEDULA OSEA PARA USO EN LA FORMACION DE VASOS SANGUINEOS Y EN LA PRODUCCION DE FACTORES ANGIOGENICOS Y TROFICOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con métodos y composiciones para uso como una sustancia terapéutica. De manera más especifica, la presente invención se relaciona con el uso de la creación terapéutica de angiogénesis y la producción de factores angiogénicos y tróficos. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La apoplejía es la tercera causa principal de muerte en la población adulta en los Estados Unidos y es una causa principal de incapacidad. La apoplejía se presenta cuando se infarta una sección del cerebro, lo que resulta en la muerte del tejido cerebral por interrupción del suministro sanguíneo cerebral. Los infartos cerebrales relacionados con apoplejía aguda provocan daño neurológico súbito y notable. Otras enfermedades neurológicas también resultan en la muerte del tejido y daño neurológico. Las intervenciones farmacológicas han intentado maximizar el flujo sanguíneo a las áreas del cerebro afectadas por la apoplejía que pueden ser capaces de sobrevivir, pero no se ha demostrado a cabalidad su eficacia clínica. Como se establece en Harrison's Principies of REF: 156792 Internal Medicine (9 Ed. , 1980, p. 1926), "pese a las pruebas experimentales de que... [los vasodilatadores cerebrales] incrementan el flujo sanguíneo cerebral, medido por el método de óxido nitroso, no han demostrado ser benéficos en estudios a fondo en casos de apoplejía humana en la etapa de ataques isquémicos transitorios, trombosis en evolución o en apoplejía establecida. Esto es válido para el ácido nicotínico, Priscoline, alcohol, papaverina e inhalación de dióxido de carbono 5%... En oposición al uso de estos métodos se sugiere que los vasodilatadores son peligrosos en vez de benéficos dado que disminuye la presión sanguínea sistémica y reducen el flujo anastomótico intracraneal o al dilatar los vasos sanguíneos en las partes normales del cerebro y pueden robar sangre del infarto" . De manera adicional, las enfermedades del sistema cardiovascular son una causa mundial principal de mortalidad y morbilidad. Por ejemplo, la insuficiencia cardíaca presenta una prevalencia cada vez mayor. La insuficiencia cardíaca está caracterizado por la incapacidad del corazón para suministrar sangre suficiente a los diversos órganos del cuerpo. Los cálculos actuales indican que más de 5 millones de norteamericanos presentan un diagnóstico de fallo cardíaco con cerca de 500,000 casos nuevos diagnosticados cada año y 250,000 muertes por año atribuidas a esta enfermedad. Pese a los avances terapéuticos significativos en las últimas dos décadas, la insuficiencia cardíaca continúa incrementando su incidencia alcanzando proporciones epidémicas y representando una carga económica principal en los países desarrollados. La insuficiencia cardíaca es un síndrome clínico caracterizado por síntomas y signos distintivos que resulta de alteraciones en el gasto cardíaco o de una presión venosa aumenta. Además, la insuficiencia cardíaca es un desorden progresivo en el que la función del corazón continúa deteriorándose con el tiempo pese a la ausencia de eventos adversos. Debido al fallo, el resultado es un gasto cardíaco inadecuado . Generalmente, existen dos tipos de fallo cardíaco. La insuficiencia cardíaca derecho es la incapacidad del lado derecho del corazón para bombear sangre venosa a la circulación pulmonar. Se presenta un retroceso de fluido en el cuerpo y resulta en hinchazón y edema. La insuficiencia cardíaca izquierdo es la incapacidad del lado izquierdo del corazón para bombear sangre a la circulación sistémica. La acumulación detrás del ventrículo izquierdo provoca después la acumulación de fluido en los pulmones. El efecto resultante principal de fallo cardíaco es congestión de fluido. Si el corazón se vuelve menos eficiente como una bomba, el cuerpo intenta compensarlo, por ejemplo, utilizando hormonas y señales neurales para incrementar el volumen sanguíne La insuficiencia cardíaca tiene muchas causas. Por ejemplo, las enfermedades de tejido cardíaco resultan en células miocárdicas muertas que ya no funcionan. El avance en la disfunción ventricular izquierda se ha atribuido, en parte, a la pérdida continua de estos cardiomiocitos. Ha habido muchos métodos para tratar y evitar la insuficiencia cardíaca. Por ejemplo, se han utilizado células precursoras para regenerar células cardíacas en isquemia cardíaca aguda o en infarto o daño en modelos animales. En un ejemplo particular, las células estromáticas de médula viables aisladas de huesos de las piernas de donadores se expandieron en cultivo, se marcaron y después se inyectaron en el miocardio de ratas receptoras adultas isogénicas. Después de cosechar los corazones durante 4 días a 12 semanas después del implante, se examinaron los sitios de implante y se encontró que las células estromáticas implantadas muestran el crecimiento potencial en un ambiente del miocardio (Wang, et al.) Se ha demostrado que los cardiomicitos se diferencian in vitro de células precursoras embriónicas pluripotenciales (ES) de línea D3 por medio de agregados similares embriones (cuerpos embrioides) . Las células están caracterizadas por la técnica de patch-clamp de célula completa, morfología y analogía de expresión de genes durante la totalidad del período de diferenciación ( altsev, et . al., 1994). De manera adicional, las células ES pluripotentes de ratón son capaces de diferenciarse en cardiomiocitos que expresan características principales del corazón de mamíferos (Maltsev, et . al., 1993). Las células precursoras sin importar su origen (embriónicas , de médula ósea, de músculo esquelético, etcétera) tiene el potencial de diferenciarse en varios, si no en todos, los tipos de células del cuerpo. Las células precursoras son capaces de diferenciarse en miocitos cardíacos funcionales. De esta manera, el desarrollo de tratamientos basados en células precursoras para tratar la insuficiencia cardíaca tiene muchas ventajas con respecto a los tratamientos existentes. SUMARIO DE LA INVENCIÓN De acuerdo con la presente invención, se proporciona una sustancia terapéutica para uso en inducción de angiogénesis y vasculogénesis . La sustancia terapéutica puede incluir factores inductores de angiogénesis y vasculogénesis aislados de células precursoras junto con una sustancia terapéutica para inducir angiogénesis y vasculogénesis farmacéuticamente aceptable en las células. También se proporciona un método para amplificar la producción de factores inductores de angiogénesis y vasculogénesis secretados al exponer y al cultivar de manera conjunta células estromáticas con un compuesto para incrementar producción de factores inductores de angiogénesis y vasculogenesis. Los factores inductores de angiogénesis y vasculogénesis aislados y purificados de las células precursoras para uso en un tratamiento también se proporcionan. Se proporciona un procedimiento para obtener los factores inductores de angiogénesis y vasculogénesis que se establecen en lo anterior, el procedimiento incluye las etapas de aislar y purificar células precursoras de mesénquima humano de tejido, antes de la diferenciación y después expandir en cultivo las células precursoras de mesénquima para producir una herramienta para tratamiento neurológico y musculoesquelético . También se proporcionan células precursoras del mesénquima aisladas y expandidas en cultivo bajo la influencia de un compuesto requisito, capaces de diferenciarse y de producir un fenotipo celular deseado necesario para reparación de tejido. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Otras ventajas de la presente invención se apreciarán fácilmente conforme las mismas se comprenden mejor con referencia a la siguiente descripción detallada cuando se considere en relación con los dibujos anexos, en los que: Las figuras 1A a 1E son fotografías que muestran las secreciones de factores de crecimiento de BDNF (Figuras 1A) , NGF (Figura IB) , bFGF (Figura 1C) , VEGF (Figura ID) y HGF (Figura 1E) ; Las figuras 2A y 2B son gráficas que muestran el resultado de las pruebas de función de comportamiento en ratas antes y después de la oclusión de la arteria cerebral media y el tratamiento con MSC intravenoso o sin tratamiento. Las figuras 3A y 3B son fotografías que muestran el uso del modelo de neovascularización de córnea de rata para probar si la secreción de MSC induce angiogénesis in vivo, la figura 3A muestra una córnea operada en falso sin evidencia de neovascularización y la figura 3B muestra un sobrenadante de MSC colocado en agua con colágeno insertada dentro del saco córneo cuando es evidente neovascularización de córnea robust ; La figura 4 muestra una ilustración de los experimentos realizados para fundamentar la presente invención, en donde se extrae médula ósea de un animal y se separan las MSC y se cultivan en 3 a 5 pasajes, las MSC se inyectan en un animal con daño neural y las células migran selectivamente al tejido dañado y se ubican en la zona límite de la lesión, las MSC después activan un arreglo de sucesos restaurativos que son mediados por las MSC, secreciones de células de parénquima y factores de crecimiento y tróficos y de esta manera mejoran la función neurológica; La figura 5 muestra una sección estándar de corona identificada a nivel de la comisura anterior del cerebro de rata que divide el hemisferio derecho en tres regiones secundarias y ocho campos; Las figuras 6A y 6B son gráficas que muestran los resultados de las pruebas de función de comportamiento antes y después de la oclusión de la arteria cerebral media; Las figuras 7A - 7H muestran células apoptóticas; La figuras 8A y 8B son gráficas que muestran la reacción mixta de linfocitos entre células esplénicas de rata hMSC; y Las figuras 9A - 9H son fotomicrografías que muestran las características morfológicas de células estromáticas de médula ósea humanas exógenas (hMSC) y células de cerebro endógenas en cerebro de rata. DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCIÓN De manera general, la presente invención proporciona el uso de factores inductores de angiogénesis y vasculogénesis a partir de células estromáticas de médula ósea u otras células precursoras como parte del tratamiento con células para inducir angiogénesis y vasculogénesis. De manera más específica, la presente invención proporciona un método para amplificar la producción de los factores inductores de angiogénesis y vasculogénesis (por ejemplo factores angiogénicos , tróficos y de crecimiento) secretados por células estromáticas u otras células precursoras, para uso en un tratamiento, los factores que inducen angiogénesis u otro crecimiento benéfico cuando se administran. Esta amplificación se presenta con exposición y cocultivo de las células con extracto de cerebro o con calcio. El término "angiogénesis" se define como un procedimiento de vascularización de tejido que involucra el crecimiento de vasos sanguíneos nuevos o en desarrollo dentro de un te ido, y también se le denomina como neovascularización . El procedimiento es mediado por la infiltración de células endoteliales y células de músculo liso. El procedimiento puede llevarse a cabo en una de tres maneras: los vasos pueden brotar de vasos preexistentes, puede generarse el desarrollo de-novo de vasos a partir de células precursoras (vasculogénesis) , o los vasos pequeños existentes pueden agrandar su diámetro. Los términos "mejora" o "mejoría", como se utilizan en la presente significan la inclusión, pero no la limitación, de volver rico o más rico por la adición o incremento de la calidad o cantidad deseable de alguna sustancia. La frase "extracto de cerebro", como se utiliza en la presente, significa incluir, pero sin limitar, células de cerebro u otras células similares obtenidas del cerebro. Estas células también se pueden cultivar con un medio y se puede utilizar un sobrenadante como un extracto de cerebro. El término "daño" como se utiliza en la presente, se pretende que incluya, pero que no se limita a daños físicos o biológicos que incluyen desórdenes genéticos, enfermedades y desórdenes que surgen con la edad. Por ejemplo, los pacientes que padecen de deficiencias neurológicas y funcionales después de apoplejía, daños al SNC y enfermedades neurodegenerativas . El término "tratamiento con células" como se utiliza en la presente incluye, pero no se limita al uso terapéutico de células precursoras. Una célula precursora es una célula madre generalizada cuyos descendientes se especializan en diversos tipos de células. Las células precursoras tienen diversos orígenes que incluyen, pero que no se limitan a embriones, médula ósea, hígado, estroma, tejido graso y otros orígenes de células precursoras conocidos por los expertos en la técnica. Estas células precursoras se pueden colocar en áreas deseadas en las que habitualmente se encuentran o bien pueden ser manipuladas de cualquier manera conocida por los expertos en la técnica. De esta manera, de entre los diversos métodos de ingeniería genética se incluyen, pero no se limitan a transíección, supresión y similares, las células precursoras se pueden someter a ingeniería con el fin de incrementar su probabilidad de supervivencia o cualquier otro propósito deseado. Las células precursoras con capaces de autorregeneración que no se proporcionan a un sujeto humano in vivo y se pueden volver progenitores restringidos en cuanto a linaje. Lo cual diferencia y expande adicionalmente a linajes específicos. Como se utiliza en la presente, el término "células precursoras" se refiere a células estromáticas de médula ósea y no a células precursoras de otro tipo de células. Preferiblemente, las "células precursoras" se refiere a células estromáticas de médula humana . El término "célula precursora" o célula precursora "pluripotente" se utiliza de manera intercambiable para significar una célula precursora que tiene: (1) la capacidad de generar progenie en todas los linajes hematopoyéticos definidos, y (2) células precursoras capaces de reconstituir por completo un hospedador inmunodeprimido gravemente en todos los tipos de células sanguíneas y su progenie como incluyendo células precursoras hematopoyéticas pluripotentes (hemocitoblastos) , por autorenovación . La médula ósea es el tejido suave que ocupa las cavidades medulares de los huesos largos, algunos conductos de haversian y los espacios entre las trabéculas de huesos esponjosos. La médula ósea es de dos tipos: rojo la cual se encuentra en todos los huesos en las etapas tempranas de la vida y en lugares limitados en el período de adulto (es decir, en los huesos esponjosos) y se relaciona con la producción de células sanguíneas (es decir, hematopoyesis) y de hemoglobina (es decir, el color rojo) ; y la médula amarilla que consiste principalmente de células grasas (y por lo tanto de color amarillo) y tejido conectivo. En su totalidad, la médula ósea es un tejido complejo que incluye células precursoras hematopoyéticas , heritrocitos y leucocitos y sus precursores, células precursoras del mesénquima, células estromáticas y sus precursores y un grupo de células que incluyen fibroblastos, reticulocitos , adipositos y células endoteliales las cuales forman una red de tejido conectivo denominado el "estroma" . Las células del estroma regulan morfológicamente la diferenciación de células hematopoyéticas a través de interacción directa por medio de proteínas en la superficie celular y la secreción de factores de crecimiento, y están involucradas en la cimentación y el soporte de la estructura ósea. Los estudios que utilizan modelos animales han sugerido que la médula ósea contiene células "preestromáticas" que tiene la capacidad de diferenciarse en cartílago, hueso y otras células de tejido conectivo (Beresford, J. N. : Osteogenic Stem Cells and the Stromal System of Bone and Marrow, Clin. Orthop.; 240:270, 1989). La información reciente indica que estas células, denominadas células precursoras estromáticas pluripotentes o células precursoras del mesénquima tienen la capacidad de generar varios tipos diferentes de líneas celulares (es decir, hosteocitos, condorcitos, adipositos, etcétera) cuando se activan. No obstante, las células precursoras del mesénquima están presentes en el tejido en cantidades muy pequeñas con una amplia variedad de otras células (por ejemplo eritrocitos, plaquetas, neutrófilos, linfocitos, monocitos, eosinófilos, basófilos, adipocitos, etcétera) y, en una relación inversa con la edad, son capaces de diferenciarse en una gama de tejidos conectivos que dependen de la influencia de la cantidad de factores bioactivos. El propósito de la presente invención es utilizar células estromáticas de médula ósea, sobrenadantes de células estromáticas de médula ósea o las secreciones que resultan de la interacción de células estromáticas de médula ósea y otras células precursoras para el tratamiento de enfermedades. Estas secreciones incluyen, pero no se limitan a un arreglo de factores de crecimiento, tróficos y de angiogénesis . El método de la presente invención promueve un resultado mejorado para la recuperación a partir del daño neuronal, u otro daño, al aumentar los efectos del tratamiento, por ejemplo angiogénesis y al aumentar la producción de vasos sanguíneos formados a partir de vasculatura inexistente o preexistente. La presente invención también se puede utilizar para proporcionar un medio para mejorar el mecanismo compensador del cerebro para mejorar la función después de daño o degeneración del SNC. Adicionalmente , los métodos y composiciones de la presente invención pueden mejorar la eficacia del tratamiento con células.

El enriquecimiento o la repoblación de células dañadas mediante células precursoras transplantadas que se diferencian en células dañadas, incrementa la función. Por ejemplo, cuando se utiliza este tratamiento en el corazón, el tratamiento puede incrementar las unidades de contracción en el corazón. El incremento de las unidades de contracción incrementa la función del corazón. Adicionalmente , las células precursoras también pueden ser responsables de la liberación de diversas sustancias tales como factores tróficos. Así, por ejemplo la liberación de factores tróficos induce angiogénesis (un incremento en el número de vasos sanguíneos) con el fin de incrementar la función cardíaca o para tratar la insuficiencia cardíaca. Por lo tanto, las células precursoras operan incrementando la función cardíaca o tratando la insuficiencia cardíaca mediante diversos mecanismos diferentes a únicamente la diferenciación en células de músculo cardíaco funcionales. La producción de factores tróficos, factores de crecimiento y factores angiogénicos típicamente es un procedimiento costoso y difícil. El método y composición de la presente invención proporciona un método barato y sencillo de producir factores tróficos puros, factores de crecimiento y otros factores relacionados simplemente al administrar el tratamiento de la presente invención. Estos factores se pueden utilizar para el tratamiento de pacientes. Por ejemplo, los factores se pueden utilizar para inducir angiogénesis , vasculogénesis o para mejorar la función y reparar los tejidos tanto in vivo como in vi tro. Por lo tanto, es benéfico determinar cuáles células estromáticas de médula ósea se pueden utilizar como fábricas celulares para producir y secretar factores tróficos, de crecimiento y angiogénicos . Estos factores pueden incluir, pero no se limitan a VEGF, HGF, BDNF, NGF, bFGF, etcétera. Los métodos de la presente invención permiten que la producción de estos factores se manipule por las condiciones de cultivo. Por ejemplo, se pueden manipular las condiciones de cultivo al cultivar de manera conjunta células con tejido o con concentraciones de calcio diferentes en el medio de cultivo. La presente invención se basa en el uso del tratamiento con células para tratar enfermedades. Aunque las células precursoras tienen orígenes diferentes (embriónico, de médula ósea, y hepático, tejido graso, etcétera) su característica común importante es que tienen el potencial para diferenciarse en varios, si no en todos, los tipos de células del cuerpo. Como se ha mencionado previamente, se ha demostrado que las células precursoras son capaces de diferenciarse en células de músculo cardíaco (Maltsev et al., 1993 ; 1994) . Los solicitantes han desarrollado un procedimiento para aislar y purificar células precursoras del mesénquima humano a partir de tejido antes de la diferenciación y después expandir en cultivo las células precursoras del mesénquima para producir una herramienta útil para el tratamiento neurológico y musculoesquelético . El objetivo de tal manipulación es incrementar en gran medida el número de células precursoras del mesénquima y utilizar estas células para redirigir o reforzar la capacidad de represión normal del cuerpo. Las células precursoras del mesénquima se cosechan en grandes cantidades y se aplican a áreas de daño de tejido para mejorar o estimular el crecimiento in vivo para regeneración o reparación, para mejorar la adhesión de implantes a diversos dispositivos prostéticos mediante la activación y diferenciación subsecuentes, para mejorar la producción de células hemopoyéticas , etc. Se contemplan por los inventores diversos procedimientos para transferir, inmovilizar y activar las células precursoras de mesénquima expandidas por cultivo y purificadas en el sitio para reparación, implantación, etc., que incluye inyectar las células en el sitio de un defecto esquelético, incubar las células con una prótesis e implantar la prótesis, etc. De esta manera, mediante aislamiento purificación y expansión en gran medida del número de células antes de la diferenciación y después controlar activamente el procedimiento de diferenciación en virtud de su colocación en el sitio de daño de tejido o bien por tratamiento previo in vitro antes de su transplante, de las células precursoras del mesénquima no diferenciadas y expandidas en cultivo se pueden utilizar para diversos propósitos terapéuticos tales como dilucidar los desórdenes celulares, moleculares y genéticos en una gran cantidad de enfermedades neurológicas , daño neuronal , enfermedades óseas metabólicas, displacías esqueléticas, defectos de cartílagos, daños a ligamentos y tendones y otros desórdenes musculoesqueléticos y de tejido conectivo . Se contemplan por los inventores diversos procedimientos para transferencia, inmovilización y activación de las células precursoras del mesénquima o células progenitoras en el sitio para reparación, implantación, etc., mediante el uso de diversos vehículos cerámicos porosos o portadores que incluyen inyectar las células en el lugar del daño. Las células precursoras del mesénquima humano se puden obtener de muchas fuentes diferentes que incluyen tapones de piezas de hueso esponjoso de la cabeza de femoral, que se obtienen de pacientes con enfermedades degenerativas de las articulaciones durante la cirugía de sustitución de la cadera o la rodilla, y de aspirado de médula que se obtiene de donadores normales y pacientes oncológicos de quienes se ha cosechado médula para transplante futuro de médula ósea. Aunque la médula cosechada se prepara para separación de cultivo de células por muchos procedimientos de aislamiento mecánico diferentes que dependen de la fuente de la médula cosechada, (es decir, la presencia de trozos de hueso, sangre periférica, etc.), la etapa crítica involucrada en el procedimiento de aislamiento es el uso de un medio preparado especialmente que contiene agentes que permiten no solo el crecimiento sin diferenciación de las células precursoras del mesénquima sino también para la adherencia directa de únicamente las células precursoras del mesénquima al área de superficie de plástico o vidrio de una caja de cultivo. Al producir un medio que permite la unión selectiva de células precursoras del mesénquima deseadas que están presentes en las muestras de médula en cantidades muy pequeñas, es posible separar las células precursoras del mesénquima de otras células (es decir, eritrocitos y leucocitos, otras células de mesénquima diferenciadas, etc.) presentes en la médula ósea.

Como se indica en lo anterior, el medio completo se puede utilizar en muchos procedimientos de aislamiento diferentes que dependen del tipo específico de procesos de cosechado iniciales utilizados con el fin de preparar médula ósea cosechada para separación en cultivo celular. Cuando se utilizan tapones de médula ósea esponjosa, la médula se agrega al medio completo y se somete en remolino para formar una dispersión la cual después se centrifuga para separar las células de médula de las piezas de hueso, etc. Las células de médula (que consisten de manera predominante de eritrocitos y leucocitos y una cantidad muy pequeña de células precursoras del mesénquima, etc.) después se disocian en células solas al pasar el medio completo que contiene las células de médula a través de jeringas colocadas con una serie de agujas de calibre 16, 18 y 20. Se considera que la ventaja producida a través de la utilización del procedimiento de separación mecánica, en oposición a cualquier procedimiento de separación enzimática en donde el procedimiento mecánico produce poco cambio celular mientras que un procedimiento enzimático puede generar daño celular particularmente a los sitios de unión de proteína necesarios para adherencia del cultivo y separación selectiva o a los sitios de proteína necesarios para la producción de anticuerpos monoclonales específicos para células precursoras del mesénquima. La suspensión de células solas (la cual está constituida de aproximadamente 50-100 x 106 células nucleadas) posteriormente se siembra en placa, en recipientes de 100 mm con el propósito de separar selectivamente o aislar las células precursoras del mesénquima de la célula restantes que se encuentran en la suspensión. Cuando se utiliza médula aspirada como la fuente de células precursoras del mesénquima humano, las células precursoras de médula (las cuales contienen una cantidad pequeña o nula de trozos de hueso, pero una gran cantidad de sangre) se agregan al medio completo y se fraccionan con gradientes Percoll (Sigma, St . Louis, Mo . ) descritos de manera más particular en lo siguiente. Los gradientes Percoll separan un gran porcentaje de eritrocitos y de células hematopoyéticas mononucleadas de la fracción plaquetaria de baja densidad que contiene células precursoras del mesénquima derivadas de médula. La fracción plaquetaria, la cual contiene aproximadamente 30-50 x 106 células está constituida de una cantidad no determinada de células plaquetarias , 30-50 x 10s células nucleadas y únicamente aproximadamente 50-500 células precursoras del mesénquima, dependiendo de la edad del donador de médula. La fracción plaquetaria de baja densidad después se siembra en placa en cajas de Petri para separación selectiva en base en la adherencia celular. Las células de médula obtenidas ya sea esponjosa o de aspirado ilíaco (es decir, los cultivos primarios) se hacen crecer en medio completo y se permite que se adhiera a las superficies de la caja de Petri durante uno a siete días, de acuerdo con las condiciones que se establecen en lo siguiente. Dado que no se observa incremento en la unión de células después del tercer día, se seleccionan de tres días como el período estándar de tiempo en el cual las células no adherentes se remueven de los cultivos al sustituir el medio completo original con medio completo fresco. Los cambios subsecuentes de médio se realiza cada cuatro días hasta que las placas de cultivo se vuelven confluentes, lo cual habitualmente requiere 14-21 días. Esto representa un incremento de 103-104 veces en células precursoras del mesénquima humano no diferenciadas. Las células después se desprenden de los recipientes de cultivo utilizando un agente de liberación tal como tripsina con EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) (trisina 0.25%, EDTA 1 mM (1 vez), Gibco, Grand Island, N.Y.) o un agente quelante tal como EGTA (ácido etilenglicolbis- (2 -aminoetiléter) , ?,?' -tetraacético, Sigma Chemical Co., St . Luis, Mo.) . La ventaja producida mediante el uso de un agente quelante sobre la tripsina es que la tripsina posiblemente puede separar muchas de las proteínas de unión de las células precursoras del mesénquima. Dado que estas proteínas de unión contienen sitios de reconocimiento, cuando se busca cuando se produzcan anticuerpos monoclonales , se utiliza un agente quelante tal como EGTA en oposición a la tripsina como el agente de liberación. El agente de liberación después se inactiva y las células precursoras del mesénquima no diferenciadas cultivadas y desprendidas se lavan con medio completo para uso subsecuente . Bajo ciertas condiciones, las células precursoras del mesénquima expandidas en cultivo tienen la capacidad de diferenciarse en hueso cuando se incuban como un injerto en materiales cerámicos de fosfato de calcio poroso. Aunque los factores internos los cuales influyen en las células precursoras del mesénquima para diferenciarse en hueso, en oposición a las células del cartílago, no se conocen bien, al parecer la accesibilidad directa de las células precursoras del mesénquima a factores de crecimiento y nutrientes suministrados por la vasculatura en los materiales cerámicos de fosfato de calcio poroso, en oposición a la cámara de difusión, influyen en la diferenciación de las células precursoras del mesénquima en hueso. Además, el extracto de cerebro provoca que las células precursoras generen factores tróficos adicionales que mejoran adicionalmente el efecto de las células precursoras. Como un resultado, las células precursoras del mesénquima aisladas y expandidas en cultivo se pueden utilizar bajo ciertas condiciones específicas o bajo la influencia de ciertos factores para diferenciar y producir el fenotipo de células deseadas necesarias para preparación de tej ido . La administración de una dosis única de células precursoras del mesénquima puede ser eficaz para reducir o eliminar la respuesta de linfocitos T a tejido halogeneico a los linfocitos T o tejido "no propio" particularmente en el caso en donde los linfocitos T retienen su carácter carente de respuesta (es decir, tolerancia o alergia) a células halogeneicas después de ser separadas de las células precursoras del mesénquima. El método general de transplante de células precursoras con extracto de cerebro al miocardio se produce por el siguiente procedimiento. Las células precursoras y el extracto de cerebro se administran al paciente. La administración puede ser por vía subcutánea, parenteral, que incluye administración intravenosa, intraarterial , intramuscular, intraperitoneal e intranasal así como técnicas de intratecal e infusión. La dosificación de las células precursoras del mesénquima varía dentro de límites amplios y se ajusta a los requerimientos individuales en cada caso particular. En general, en el caso de administración parenteral, es habitual administrar de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 5 millones de células por kilogramo de peso corporal del receptor. El número de células utilizado dependerá del peso y condición del receptor, el número o la frecuencia de administraciones y otras variables conocidas por los expertos en la técnica. Las células precursoras del mesénquima se pueden administrar por una vía que sea adecuada para el te ido, órgano o las células que se van a transplantar . Se pueden administrar de manera sistémica, es decir, parenteralmente, por inyección intravenosa o se pueden dirigir a un tejido u órgano particular, tal como médula ósea. Las células precursoras del mesénquima humano se pueden administrar vía una implantación subcutánea de células o por inyección de las células precursoras en tejido conectivo, por ejemplo músculo. Las células se pueden suspender en un diluyente apropiado, a una concentración de 0.01 a aproximadamente 5 x 106 células/ml . Los excipientes adecuados para solucionse de inyección son aquellos que son compatibles biológica y fisiológicamente con las células y con el receptor, tal como solución salina amortiguada u otros excipientes adecuados. La composición para administración debe formularse, producirse y almacenarse de acuerdo con métodos estándar que cumplan con la esterilidad y estabilidad apropiadas. Aunque la invención no se limita a estas, las células precursoras del mesénquima se pueden aislar, preferiblemente de médula ósea, se pueden purificar y expandir en cultivo, es decir, in vitro para obtener cantidades suficientes de células para uso en los métodos que se describen en la presente. Las células precursoras del mesénquima, las células de blastos pluripotentes formadores que se encuentran en el hueso, normalmente están presentes en frecuencias muy bajas en médula ósea (1:100,000) y en otros tejidos del mesénquima. Véase, Caplan y Haynesworth, patente de E.U.A. No. 5,486,359. La transducción genética de células precursoras del mesénquima se describe en Gerson et al, patente de E.U.A. No. 5,591,625.

A menos que se indique de otra manera, las manipulaciones genéticas se realizan como se describe en Sambrook y Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed. ; Col Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) . La presente invención es útil debido a que se ha vuelto abundantemente claro que un mecanismo para el deterioro de la función en la insuficiencia cardíaca de cualquier etiología se debe, en parte, a la muerte progresiva de las células del músculo cardíaco (Sabbah, 2000) . La solución a este problema es enriquecer o volver a poblar el miocardio con células cardíacas nuevas las cuales toman el lugar de las células perdidas o proporcionan refuerzo adicional de las células cardíacas que funcionan actualmente, por lo que se mejora la función de bombeo del corazón deteriorado. La presente invención es ventajosa con respecto a todos los tratamientos existentes actualmente debido a que no hay efectos colaterales conocidos y el tratamiento es relativamente no invasivo. Por ejemplo, el tratamiento de la insuficiencia cardíaca actualmente se basa principalmente en el uso de medicamentos que interfieren con sistemas neurohumorales . Además, existe un tratamiento quirúrgico que incluye transplante cardíaco así como el uso de dispositivos de asistencia ventricular o biventricular . Las ventajas ofrecidas por la presente invención son la capacidad de tratar la insuficiencia cardíaca al corregir directamente la causa primaria de la enfermedad, específicamente la pérdida de unidades contráctiles. La repoblación del miocardio con células precursoras que se diferencian en unidades contráctiles puede contribuir a la función general del corazón deficiente y por lo tanto es novedosa y se dirige al centro del problema. Otras ventajas incluyen la ausencia de efectos secundarios que con frecuencia se relacionan con el uso de tratamientos farmacológicos y ausencia de rechazo inmunológico que es un problema común en el transplante de corazón o en el transplante de otros órganos, y la capacidad de incrementar los factores tróficos creados por las células precursoras . La presente invención tiene potencial de sustituir muchos tratamientos quirúrgicos actuales y posiblemente incluso tratamientos farmacológicos. Actualmente existen dispositivos que permiten el suministro de células precursoras junto con extracto de cerebro a un corazón dañado utilizando soluciones basadas en catéter, y de esta manera se elimina la necesidad de cirugía a pecho abierto. Adicionalmente , la presente invención es aplicable tanto en el ambiente médico humano como en una instalación veterinaria . El método y composición de la presente invención se ejemplifica en los ejemplos que se incluyen en la presente.

Aunque en la presente se describen modalidades específicas, estas no son exhaustivas y pueden incluir otros diseños adecuados que varían en diseño y metodologías conocidas por los expertos en la técnica. Básicamente, cualquier diseño, método, estructura y material conocido diferente, por los expertos en la técnica se puede utilizar sin apartarse del espíritu de la presente invención. EJEMPLOS MÉTODOS ; Métodos generales en biología molecular: Las técnicas de biología molecular estándar conocidas en el arte y que no se describen de manera específica se siguen generalmente como se indica en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989) y en Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley y Sons, Baltimore, Maryland (1989) y en Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons, New York (1988), y en Watson et al., Recombinant DNA, Scientific American Books, New York y en Birren et al (eds) Genome Analysis: A Laboratory Manual Series, Vols. 1-4 Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998) y la metodología como se establece en las patentes de E.U.A. Nos. 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 y 5,272,057 y que se incorporan en la presente como referencia. La reacción en cadena de polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) se lleva a cabo generalmente como se indica en PCR Protocole: A Guide To Methods And Applications, Academic Press, San Diego, CA (1990) . La PCR in situ (dentro de la célula) en combinación con la citometría de flujo se puede utilizar para la detección de células que contengan secuencias específicas de ADN y AR m (Testoni et al, 1996, Blood 87:3822) . Métodos generales en inmunología: Los métodos estándar en inmunología conocidos en la técnica y que no se describen específicamente son seguidos de manera general con Stites et al. (eds) , Basic and Clinical Immunology (8a. Edición), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994) y Mishell y Shiigi (eds), Selected Methods in Cellular Immunology, .H. Freeman and Co., New York (1980). Suministro de sustancias terapéuticas: Las células de la presente invención se administran y dosifican de acuerdo con la buena práctica médica, tomando en consideración la condición clínica del paciente individual, el sitio y método de administración, el protocolo de administración, la edad del paciente, sexo, peso corporal y otros factores conocidos por quienes practican la medicina. Para propósitos en la presente una "cantidad eficaz" farmacéuticamente es aquella determinada por consideraciones tales como las que se conocen en el arte. La cantidad debe ser eficaz para obtener una mejoría que incluye pero que no se limita a una tasa de supervivencia mejorada o una recuperación más rápida o una mejoría o eliminación de los síntomas u otros indicadores como se seleccionan como medidas apropiadas por los expertos en la técnica. En el método de la presente invención, las células de la presente invención se pueden administrar de diversas maneras. Debe hacerse notar que se puede administrar como las células o como una sal farmacéuticamente aceptable y se puede administrar solo o como un ingrediente activo en combinación con portadores, diluyentes, adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables. Las células se pueden administrar oralmente, por vía subcutánea o parenteral que incluyen la administración intravenosa, intraarterial , intramuscular, intraperitoneal e intranasal así como las técnicas intratecal y de infusión. También son útiles los implantes de células. El paciente que es tratado es un animal homeotermo y en particular, mamíferos que incluyen al hombre. Los portadores, diluyentes, adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables así como los portadores de implantes generalmente se refieren a materiales de relleno sólido o líquido inerte y no tóxico, diluyentes o material encapsulante que no reacciona con los ingredientes activos de la invención. Se hace notar que los humanos son tratados de manera general por un período más prolongado que los ratones u otros animales de experimentación ejemplificados en la presente, tratamiento el cual tiene una duración proporcional a la duración del proceso de la enfermedad y la eficacia del medicamento. Las dosis pueden ser una dosis única o dosis múltiples durante un período de varios días, pero se prefieren dosis únicas. Las dosis pueden ser dosis únicas o dosis múltiples durante un período de varios días. El tratamiento generalmente tiene una duración proporcional a la duración del procedimiento de enfermedad y la eficacia del medicamento y la especie del paciente que se trate. Cuando se administran las células de la presente invención por vía parenteral, generalmente se formulan en una forma inyectable de dosificación unitaria (solución, suspensión, emulsión) . Las formulaciones farmacéuticas adecuadas para inyección incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para reconstitución en soluciones o dispersiones inyectables estériles. El portador puede ser un solvente o un medio de suministro que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo glicerol, propilenglicol , polietilenglicol líquido y similar), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales. Se pude mantener fluidez apropiada, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos .

Los vehículos no acuosos tales como aceite de semilla de algodón, aceite de ajonjolí, aceite de oliva, aceite de frijol de soya, aceite de maíz, aceite de girasol o aceite de cacahuate y ésteres tales como miristato de isopropilo también se pueden utilizar como sistemas solventes para las composiciones de células. Adicionalmente , diversos aditivos los cuales mejoran la estabilidad, esterilidad y isotonicidad de las composiciones, que incluyen conservadores antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y amortiguadores pueden agregarse. Se puede asegurar evitar la acción de microorganismos por diversos agentes antibacterianos y antimicóticos por ejemplo parabenos, clorobutanol , fenol, ácido sórbico y similares. En muchos casos será deseable incluir agentes isotónicos, por ejemplo azúcares, cloruro de sodio y similares. La absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede llevarse a cabo mediante el uso de agentes que retrasen la absorción, por ejemplo monoestearato de aluminio y gelatina. De acuerdo con la presente invención, no obstante, cualquier vehículo, diluyente o aditivo utilizado tendrá que ser compatible con las células. Se pueden preparar soluciones inyectables estériles al incorporar las células utilizadas en la práctica de la presente invención en la cantidad requerida del solvente apropiado con los diversos ingredientes adicionales, según se desee . Se puede administrar una formulación farmacológica de la presente invención a un paciente en una formulación inyectable que contenga cualquier portador compatible, tal como diversos vehículos, adyuvantes, aditivos y diluyentes; o las células utilizadas en la presente invención se pueden administrar parenteralmente al paciente en forma de implantes subcutáneos de liberación lenta o sistemas de suministro dirigidos tales como anticuerpos monoclonales , suministro vectorizado, iontoforético, matrices poliméricas, liposomas y microesferas . Los ejemplos de sistemas de suministro útiles en la presente invención incluyen los documentos Nos . 5,225,182; 5,169,383; 5,167,616; 4,959,217; 4.925,678; 4,487,603; 4,486,194; 4,447,233; 4,447,224; 4,439,196; y 4,475,196. Muchos otros de tales implantes, sistemas de suministro y módulos son bien conocidos por los expertos en la técnica. Una formulación farmacológica de las células utilizada en la presente invención se puede administrar oralmente al paciente. Son utilizables métodos convencionales tales como administración de las células en tabletas, suspensiones, soluciones, emulsiciones , cápsulas, polvos, jarabes y similares. Se prefieren técnicas conocidas que suministren el medicamento por vía oral o intravenosa y que retengan la actividad biológica.

En una modalidad, las células de la presente invención se pueden administrar inicialmente por inyección intravenosa al llevar las concentraciones en sangre a un nivel adecuado. Los niveles del paciente después se mantienen mediante la forma de dosificación oral, aunque se pueden utilizar otras formas de administración, que dependen de la condición del paciente, como se indica en lo anterior. La cantidad que se va a administrar variará para el paciente que es tratado y puede cambiar desde aproximadamente 100 ng/kg de peso corporal a 100 mg/kg de peso corporal al día y de manera preferible será de 10 mg/kg a 10 mg/kg al día. Ejemplo 1: El tratamiento de daño cerebral traumático (TBI) con células estromales de médula ósea (MSC) mejora el resultado funcional en rata. El reemplazo de tejido no es la única manera compensatoria en el tratamiento de transplante de células. Dado que se ha demostrado que diversos factores de crecimiento median la reparación y la sustitución de tejido dañado, las MSC proporcionan soporte trófico que juega un papel en el tratamiento del tejido dañado. La respuesta de las MSC humanas (hMSC) al extracto de tejido cerebral a partir de TBI se ha investigado y probado para determinar si el ambiente TBI induce diferenciación de hMSC y secreción de factor de crecimiento. hMSC se cultivan en extractos de TBI in vitro y se realizan pruebas de inmunocitoquímica y ensayo inmunoabsorbente unido a enzima de interposición o indirecto cuantitativo (ELISA) . Los resultados muestran que las hMSC acondicionadas con TBI expresan marcadores de proteína celular específicos: NeuN para neuronal nuclear (0.2-0.5% de las hMSC) totales, Tuj-1 para la diferenciación neuronal temprana y el crecimiento de neuritas (6-10%) , GFAP para astrocitos (4-7%) y MBP para oligodendrocitos (3-5%). Además, las hMSC tratadas con extractos de TBI responden activando las secreciones de factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF) , factor de crecimiento nervioso (NGF) , factor de crecimiento de fibroblastos básicos (bFGF) , factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) de una manera que depende del tiempo. Estos datos demuestran que los extractos de TBI inducen a las hMSC a expresar morfología neural y proteínas fenotípicas del tejido cerebral. Además, los datos de ELISA muestran que las hMSC transplantadas proporcionan beneficio terapéutico vía una secreción sensible una de gama de factores de crecimiento que pueden nutrir la neuroprotección y angiogénesis . Las células estromáticas de médula ósea (MSC, por sus siglas en inglés) , cuando se transplantan intravenosamente en ratas sometidas a daño cerebral traumático (TBI, por sus siglas en inglés) , promueven la recuperación funcional neurológica (Lu et al., 2001a) . Ante el transplante, las MSC migran de manera preferencial al lugar del tejido dañado, y algunas células expresan proteínas fenotípicas de células similares endógenas del cerebro (Lu et al., 2001b; Lu et al., 2001a; Mahmood et al., 2001) . Aunque la estrategia a largo plazo de sustitución del tejido dañado por una población de células precursoras es un enfoque directo para el tratamiento del daño neural, el bajo nivel de diferenciación de MSC en el transplante terapéutico agudo y a corto plazo del modelo de TBI, es poco probable que proporcione el beneficio funcional (Lu et al., 2001b; Lu et al., 2001; Mahmood et al., 2001) y permanecen sin conocerse los mecanismos que proporcionan dicho beneficio. Las MSC producen de manera natural una variedad de citocinas y factores de crecimiento (Takai et al., 1997; Labouyrie et al., 1999; Bjorklund and Lindvall, 2000; Dormady et al., 2001), cuyas propiedades secretoras son alteradas por su microambiente (Dormady et al., 2001). Las neurotrofinas tales como el factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF, por sus siglas en inglés) y el factor de crecimiento de nervios (NGF, por sus siglas en inglés) incrementa la supervivencia de tejido del SNC dañado tanto in vivo como in vitro (Hefti, 1986; Kromer, 1987; Koliatsos et al., 1993; Bullock et al., 1999; Gage 2000). Un factor de crecimiento estudiado ampliamente en estudios preclínicos es el factor de crecimiento de fibroblastos básicos (bFGF, por sus siglas en inglés) (Ay et al., 1999) . El bFGF administrado por vía intravenosa en las siguientes horas después del inicio de isquemia reduce el tamaño del infarto, debido probablemente a la protección directa de las células en los límites (penumbra) del infarto cerebral (Ay et al., 1999). La expresión del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, por sus siglas en inglés) también promueve la angiogénesis y la reparación neural (Papavassiliou et al., 1997). El tratamiento de apoplejía con VEGF mejora el resultado funcional (Zhang et al., 2000b). La expresión del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF, por sus siglas en inglés) es activada de manera natural dentro del cerebro después del daño y muestra efectos antiapoptóticos sobre neuronas cerebrales in vitro (Zhang et al., 2000a). MATERIALES Y MÉTODOS Reactivos La solución salina balanceada de Hank (HBSS, por sus siglas en inglés) , el medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) , el medio DMEM Bloqueado, el reemplazo de suero Bloqueado, en suero bovino fetal (FBS, por sus siglas en inglés) , la tripsina y el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA, por sus siglas en inglés) se adquieren de GIBCO (Grand Island, NY . ) . Se adquiere Ficoll a partir de Pharmacia (Piscataway, NJ) . Los anticuerpos contra antígeno nuclear neuronal monoclonal (NeuN) , policlonal de ß-tubulina isotipol (Tuj-1), proteína de ácido fibrilar de la neuroglia . (GFAP) y la proteína básica de mielina (MBP, por sus siglas en inglés) se adquieren de CHEMICON (Temecula, CA) . Los equipos de ensayos inmunoabsorbentes unidos a enzima indirectos (ELISA) para BDNF, bFGF, VEGF y HGF se obtienen de R & D systems (Minneapolis , MN) . El equipo de ELISA para NGF se elabora en el laboratorio. El anticuerpo monoclonal contra NGF ß (2.5S, 7S) , y los anticuerpos contra ß (2.5S, 7S) NGF-(3-gal, NGF- ß estándar se adquieren de Roche Molecular Biochemicals (Indianapolis , IN) . A menos que se indique de otra manera, los reactivos se obtienen de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) . Cultivo primario de las hMSC La médula ósea primaria se obtiene de 15-16 mi de aspirados de la cresta ilíaca de tres donadores humanos normales. Cada aspirado se diluye 1:1 con HBSS y se estratifica sobre aproximadamente 10 mi de Ficoll. Después de centrifugación a 2,500 x g durante 30 minutos, la capa de células mononucleares se remueve de la interfase y se suspende en HBSS. Las células se centrifugan a 1,000 x g durante 10 minutos y se resuspenden 5 x 106 células en cada caja de cultivo de tejido de 100 mm (Falcon, Becton-Dickinson, NJ) en DMEM completo suplementado con FBS 10%. Las células se incuban a 37 °C en C02 5% en matraces durante 3 días y se separan las células no adherentes por sustitución del medio. Después de que los cultivos alcanzan confluencia, habitualmente a las 2-3 semanas, las células se cosechan con 0.05% p/v y 0.02%% p/v de EDTA en solución salina amortiguada con fosfato (PBS, por sus siglas en inglés, pH 7.4) durante 5 minutos a 37 °C, se vuelven a sembrar en placas y una vez más se cultivan durante 2 semanas y se cosechan. Las células después se congelan para uso posterior. Las células utilizadas en estos experimentos se cosechan de 3 a 5 pasajes . Extractos de cerejbro dañado traumático Se realizan experimentos en ratas Wistar macho que pesan 250 a 350 g (n = 21) . Se induce anestesia en las ratas por administración intraperitoneal de hidrato de cloral (35 mg/100 g de peso corporal) . La temperatura rectal se mantiene a 37°C mediante el procedimiento quirúrgico utilizando un sistema de calentamiento con agua regulado por retroalimentación . Las ratas se colocan en un bastidor estereotáxico . Se induce daño al impactar la corteza izquierda (corteza del mismo lado) con un pistón neumático que tiene una punta de 6 mm de diámetro, a una velocidad de 4 m/segundo y una compresión de 2.5 mm (Dixon et al., 1991) . Los animales control experimentan craneotomía, pero no reciben daño. Se sacrifica las ratas a los 1, 4 y 7 días (n = 6 por punto de tiempo) después de la operación. Los extractos de tejido de cerebro se obtienen de inmediato de las ratas experimentales y los controles normales (n = 3) . Los segmentos del hemisferio izquierdo de las ratas tanto experimentales como de las ratas control se colocan en hielo y se mide rápidamente el peso húmedo en gramos . Posteriormente, las piezas de tejido se homogeneizan al agregar DME (150 mg de te ido/ml de DMEM) y se incuban en hielo durante 10 minutos. El homogeneizado se centrifuga durante 10 minutos a 10,000 x g a 4°C. El sobrenadante se recolecta y se almacena a -80°C para tratamiento de las hMSC. Diferenciación celular Los estudios fenotípicos de proteínas se realizan al sembrar 1.0 x 106 células en cajas de 35 mm y al tratarlas con DMEM bloqueado fresco con suero bloqueado 20% de reemplazo que contiene 10%, 20% o 40% de sobrenadante de extracto de tejido TBI . Todas las células se incuban durante 7 días. Los cálculos de células similares a las neuronales inmunorreactivas se basan en las cuentas de células en 10 campos visuales aleatorios (lOx objetivo) en tres cajas de cultivo en un mínimo de tres experimentos diferentes. Los porcentajes de células neurales fenotípicas se calculan a partir del número total de células. Inmunocitoguímica por teñido doble y triple Las hMSC se cultivan en placa a una densidad de 1.0 x 106 en cubreobjetos de vidrio (18 x 18 mm2) en recipientes de 35 mm utilizando tratamientos diferentes indicados antes. Las células sobre los cubreobjetos de vidrio se utilizan para inmunocitoquímic . Se utiliza el sobrenadante del medio de cultivo para la medición de ELISA cuantitativa como se describe en lo siguiente. Las células se lavan con PBS (pH 7.4) y se fijan con paraformaldehído 4% durante 10 minutos. Se bloquean los sitios de unión no específicos con suero equino normal 4%, albúmina de suero bovino 2% y Tritón X-100 0.1% durante 1 hora. Los cubreobjetos se lavan con PBS y se incuban con anticuerpos primarios contra Tuj-1, GFAP o BP durante 1 hora. Se lavan nuevamente con PBS y se incuban con anticuerpo de chivo contra ratón conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC, por sus siglas en inglés) o anticuerpo secundario contra IgG de conejo durante 1 hora. Los cubreobjetos de hMSC teñidos con Tuj-1 una vez más se lavan y se incuban con el segundo anticuerpo primario NeuN durante la noche, después se lavan con PBS y se incuban con anticuerpo secundario contra IgG de ratón, conjugado con cianina-5.18 (Cy5) durante 1 hora. Se utiliza el colorante de diclorhidrato de 4 'b-diamidino-2-fenilindol (DAPI, por sus siglas en inglés) para determinar el número de células mediante el conteo de los núcleos en cada campo. Los cubreobjetos se montan con medio de montaje glycergel. ELISA Se utiliza la prueba de ELISA para medir la secreción de BDNF, NGF, bFGF, VEGF y HGF por las hMSC a los 1, 4 y 7 días en cultivo acondicionado por TBI y sobrenadante de extracto de cerebro normal. Brevemente, todos los reactivos y estándares de trabajo se preparan como lo indican los fabricantes y se agregan por pozo, en las placas de 96 pozos, 50-150 µ? de solución estándar o diluyente de ensayo. Los pozos se mezclan suavemente y se incuban durante 2-4 horas a temperatura ambiente. Cada pozo se aspira y se lava, repitiendo el procedimiento tres veces. Después del último lavado, cualquier amortiguador remanente se separa por aspiración o decantación del pozo y se agregan a cada pozo 200 µ? de diversos conjugados de factor de crecimiento. La placa después se incuba durante 2-4 horas a temperatura ambiente. Se repite la aspiración y el lavado. Se agregan a cada pozo 200 µ? de solución de sustrato y se incuba durante 15-30 minutos a temperatura ambiente. Se agregan 50 µ? de la solución de detención y se mezcla suavemente. Se determina la densidad óptica de cada pozo en los siguientes 30 minutos utilizando un lector de microplaca ajustado a 450-620 nm. Análisis estadístico Se utiliza la prueba t de Student para evaluar las diferencias morfológicas entre las muestras estimuladas y su control respectivo. La importancia de las respuestas en tiempo se determina por análisis de varianza de las medidas repetidas (ANOVA) . Los datos de ELISA se linealizan al graficar el logaritmo de las diversas concentraciones de factor de crecimiento versus el logaritmo de la densidad óptica, y se determina la línea de mejor ajuste por análisis de regresión. Las lecturas por duplicado del promedio se realizan para cada estándar, control y muestra y se resta la densidad óptica estándar cero promedio. Todos los valores se expresan como una media + desviación estándar. Se considera que p<0.05 es estadísticamente significativo. RESULTADOS Diferenciación morfológica de las hMSC en células similares a las neurales La miscroscopía de contraste de fases muestra la morfología normal de las hMSC similares a fibroblastos cultivadas en DMEM completo suplementado con FBS 10%. Después de 7 días de exposición en DMEM bloqueado con 20% de reemplazo de suero bloqueado, algunas células refractarias muestran un proceso corto. Algunas células (-2.3% de las células totales, Tabla 1) muestran morfología similar a la neuronal en las hMSC cultivadas en sobrenadante de extracto de tejido de cerebro normal. No obstante, los extractos de cerebro normales inducen la proliferación de hMSC (1.56 x 104 + 0.2 x 104/ml) en comparación con las hMSC cultivadas en el DMEM bloqueado con 20% de reemplazo de suero bloqueado (1.24 x 104 + 0.5 x 104/ml) (p<0.05). La morfología diversa, pero típicamente las células refractarias con prolongaciones de ramificación largas (longitud de prolongación > 10 m) y un cono de crecimiento - similar a estruturas terminales (-13-30% de células similares a neuronas de las células totales, Tabla) y células en estrella con prolongaciones pequeñas y multipolares detectadas en las hMSC cultivadas en 20% ~ 40% de sobrenadante de extracto de TBI . Existe una tendencia para que el número total de células en los cultivos de extracto de TBI (1.08 X 104 + 0.3 x 104/ml) disminuya, pero esto no alcanza significancia estadística. La totalidad de las diversas concentraciones de los extractos de tejido de TBI indujeron a las hMSC a células similares a neurales parecidas morfológicamente. Expresión de marcadores normales por las hMSC Después de 7 días en DMEM bloqueado con sustitución de suero bloqueado 20% y que contiene 10%, 20% o 40% de cultivo de extracto de tejido de TBI, las hMSC se procesan por inmunocitofluorescencia . El marcado doble permitido con DAPI (azul púrpura para identificación de núcleo) , FITC (verde) o el etiquetado triple CY5 (rojo) de las hMSC para determinar si las células son de origen de médula ósea que expresan marcadores específicos neurales para neuronas (NeuN, Tuj-1), astrocitos (GFAP) y oligodendrocitos (MBP) . Los núcleos celulares se tiñieron por DAPI. En cultivos teñidos para inmunorreactividad, 0.2 a 0.5% de las hMSC expresaron proteína NeuN y 6 a 10% de las hMSC se marcaron por el fenotipo Tuj-1. La inmunorreactividad NeuN y Tuj-1 se colocaliza en las mismas células (rosa) . Una cantidad de 4 a 7% de las células derivadas de las hMSC expresaron inmunorreactividad a GFAP . Una cantidad de 3 a 5% de células derivadas de las hMSC expresaron inmunorreactividad a MBP. La totalidad de las concentraciones diversas de los extractos de TBI examinados indujeron a las hMSC a expresar inmunorreactividad al fenotipo neural. Secretor de factor de crecimiento por las hMSC tratadas con sobrenadante de extracto de tejido de TBI Las secreciones de factor de crecimiento por las hMSC después de 1, 4 y 7 días en el DMEM bloqueado con medio de sustitución de suero bloqueado 20% y que contiene sobrenadante de extracto de TBI 20% se muestran en la figura 1. Los extractos de cerebro normal y de tejido de TBI influyeron en las secreciones de HMSC de BDNF (figura la) , NGF (figura Ib) , fFGF (figura le) , VEGF (figura Id) y HGF (figura le) in vitro. El extracto de tejido de cerebro normal incrementó las secreciones para la totalidad de los factores de crecimento detectados in vitro, en comparación con el control de medio únicamente. En cada uno de los grupos experimentales, la secreción de BDNF, NGF y HGF se incrementó del día 1 al día 7 en extractos de TBI acondicionados. La secreción de VEGF es similar a la del cerebro normal y a la de los grupos del cerebro posterior al tratamiento con TBI . La secreción de VEGF es consistentemente más grande para las duraciones del día 4 y del día 7 en cultivo en comparación con otro día 1 en cultivo. Los perfiles de secreción de VEGF difieren de otros factores tróficos. La duración del día 1 en los valores de secreción de bFGF de cultivo, en contraste con otros factores de crecimiento, excede o es igual a las secreciones para los valores del día 4 y del día 7. Estos datos indican que TBI promueven la secreción de NGF y BDNF por las hMSC in vitro y que la totalidad de la neurotrofina y los factores de crecimiento probados muestran un incremento significativo de secreción de hMSC en cerebro normal en comparación con hMSC en medio de sustitución de suero. DISCUSIÓN Las células estromáticas de médula ósea humanas tratadas con extractos de TBI morfológicamente pueden diferenciarse en células similares a las neurales y expresar proteínas fenotípicas de células del parénquima cerebral . Las hMSC secretan BDNF, NGF, bFGF, VEGF, HGF y los niveles de secreción dependen del tiempo de exposición a los extractos de TBI en cultivo y del tiempo en el cual se extrajo el tejido TBI. Los datos demuestran que las hMSC pueden ser activadas para recordar a subpoblaciones de células similares a las neurales morfológicamente por exposición a extractos de tejido de TBI in vitro. Las hMSC tratadas también expresan marcadores de proteína cerebral específicos tales como NeuN (para neuronas), Tuj-1 (para diferenciación temprana y crecimiento de neuritas) , GFAP (para astrocitos) y MBP (para oligodendrocitos) . Por lo tanto, las hMSC son capaces de diferenciarse en los linajes de células múltiples. Los estudios han reportado que las MSC se pueden activar para que se diferencien en células similares a neuronas en cultivos mediante reactivos (Sánchez-Ramos et al., 2000; Woodbury et al., 2000; Deng et al., 2001) y en el SNC dañado (Azizi et al., 1998; Kopen et al., 1999; Chopp et al., 2000; Li et al., 2000; Chen et al., 2001; Lu et al., 2001b; Lu et al., 2001a; Mahmood et al., 2001). Los datos muestran por primera vez que algunas hMSC, cuando se colocan in vitro dentro de un microambiente específico que contiene extracto de tejido TBI , responden asumiendo características morfológicas así como fenotípicas de células del parénquima del cerebro. Ante el transplante terapéutico, estas células pueden proporcionar una fuente de sustitución celular en un cerebro dañado TBI . Se requieren células estromáticas de médula ósea para hematopoyesis normal. Se han caracterizado muchos factores solubles secretados por las MSC que median la hematopoyesis (Berezovskaya et al., 1995; Majumdar et al., 1998; Majumdar et al., 2000). Las MSC producen IL-6, -7, -8, -11, -12, -14, -15 y ligando Flt-3 e inducen niveles en estado estable de M-CSF, G-CSF, GM-CSF y SCF . No obstante, estos factores, solos, es poco probable que proporcionen el mecanismo subyacente al beneficio terapéutico del tratamiento con MSC de TBI. Se ha postulado la existencia de otros factores estromáticos aún desconocidos. En los experimentos que se presentan aquí, los datos de ELISA cuantitativos demuestran que las hMSC tratadas con extractos de tejido TBI secretan de manera concomitante BDNF, NGF, bFGF, VEGF y HGF de una manera dependiente tanto del tiempo de cultivo como del tiempo en el cual se obtiene el extracto de tejido TBI. La administración intravenosa de BDNF reduce el volumen de daño después de TBI en ratas y soporta el papel neuroprotector de BNDF en daño en cerebro (Koliatsos et al., 1993; Bullock et al., 1999). El potencial neuroprotector después de inyección con NGF, o vía implantación de fibroblastos productores de NGF y ratones transgénicos NGF se ha demostrado en diferentes paradigmas de daño cerebral experimental (Hefti, 1986; Kromer, 1987; Canevá et al., 1995; Gage, 2000) . La administración intravenosa de VGF reduce el volumen de infarto en modelos de isquemia cerebral focal en ratas, ratones y gatos (Sugimori et al., 2001) . El factor VEGF, el promotor fuerte de angiogénesis, también estimula el crecimiento axonal, la supervivencia de células nerviosas y la proliferación de células de Schwann (Sondell et al., 1999) . El incremento en VEGF posterior a la lesión por trituración del nervio ciático sugiere que el VEGF juega un papel en la regeneración de nervios (Sondell y Kanje, 2001) . El tratamiento de apoplejía experimental en la rata con VEGF reduce de manera significativa las deficiencias funcionales (Zhang et al., 2000b) . Las hMSC producen de manera constitutiva HGF (Takai et al., 1997), y HGF es una molécula importante para la reparación de tejido ( izuno et al., 2000). Por lo tanto, los hallazgos muestran fuertemente que las hMSC son sensibles al cerebro normal y los ambientes de TBI y responden al incrementar significativamente la producción de muchos factores. Dada la supervivencia que las MSC transplantadas en tejido neural dañado traumáticamente (Lu et al., 2001b; Lu et al., 2001a; Mahmood et al., 2001), una secreción de respuesta microambientalmente de factores neuroprotectores y angiogénicos por las MSC a nivel local del te ido deteriorado es la clave en el beneficio funcional proporcionado por el transplante con MSC. Los datos muestran que las MSC adultas pueden ser inducidas para que corrijan sus limitaciones del mesénquima y constituyan un depósito abundante y accesible celular y molecular del cerebro para el tratamiento de diversas enfermedades neurológicas . Los resultados aquí muestran que las MSC transplantadas proporcionan un beneficio funcional después de TBI (Lu et al., 2001b; Lu et al., 2001a; Mahmood et al., 2001) . En particular, las MSC pueden obtenerse fácilmente a partir de un volumen pequeño de médula ósea a partir de la cresta ilíaca propia del paciente y se pueden expandir en cultivo. Por lo tanto, las MSC proporcionan una fuente accesible y reabastecible de células autólogas para transplante. Estas células en tejido dañado proporcionan una fuente continua de factores de crecimiento vitales para reparación y plasticidad del cerebro dañado. La figura 1 muestra las secreciones de factores de crecimiento de BNDF (figura 1A) , NGF (figura IB) , bFGF (figura 1C) , VEGF (figura ID) y HGF (figura 1E) a partir de las H SC tratadas con sobrenadante de extracto de tejido TBI . Las secreciones son cuantificadas con ELISA. El extracto de tejido de cerebro normal incrementa las secreciones de la totalidad de los factores de crecimiento detectados in vi tro en comparación con un control único medio. En cada grupo experimental, la secreción de BDNF, NGF y HGF se incrementa del día 1 al día 7 en extractos de TBI condicionado. La secreción de VEGF es similar a la del cerebro normal y a los grupos del cerebro posterior a TBI. La secreción de VEGF es consistentemente más grande para las duraciones del día 4 y del día 7 en cultivo en comparación para el día 1 en cultivo. Los perfiles de secreción de VEGF difieren de otros factores tróficos. La duración del día 1 en los valores de secreción de cultivo bFGF, en contraste con otros factores de crecimiento, excede o es igual a las secreciones para los valores del día 4 y del día 7. Ejemplo 2: Métodos : Se somete a ratas a oclusión de la arteria cerebral media transitoria y se inyecta IV con 3 x 106 hMSC 1 día después del ataque apoplejico. El resultado funcional se mide antes y a los 1, 7 y 14 días después de la apoplejía. La reacción mixta de linfocitos y el desarrollo de los linfocitos T citotóxicos mide el rechazo inmunológico de hMSC. Se utiliza un anticuerpo monoclonal específico para núcleos celulares humanos (mAt>1281) para identificar las hMSC y medir el fenotipo neural . Los niveles de neurotrofina analizados por ELISA en tejido cerebral de ratas tratadas con hMSC o ratas no tratadas. Se utilizan inyecciones de bromodesoxiuridina para identificar células recién formadas. Resultados: Se encuentra recuperación significativa de la función en ratas tratadas con hMSC a los 14 días, en comparación con las ratas control con isquemia. Algunas hMSC (1 a 5%) expresan proteínas fenotípicas de células parenquimales del cerebro. El factor neurotrófico derivado de cerebro y el factor de crecimiento de nervios se incrementa de manera significativa y las células apoptóticas disminuyen de manera significativa en la zona límite isquémica; de manera significativa, se detectan más células reactivas a bromodesoxiuridina en la zona subventricular del hemisferio isquémico de ratas tratadas con las hMSC. Las hMSC indujeron proliferación de linfocitos sin la inducción de linfocitos T citotóxicos . Conclusión : El beneficio neurologico resultante del tratamiento con hMSC de apoplejía en ratas puede derivarse del incremento de factores de crecimiento en el tejido isquémico, la reducción de apoptósis en la zona penumbral de la lesión y la proliferación de células endógenas en la zona subventricular . Las células estromáticas de médula ósea (MSC; también denominadas como células precursoras del mesénquima y células progenitoras) son multipotentes y capaces de ayudar en la reparación de tejidos in vitro e in vivo. Las MSC normalmente dan lugar a hueso, cartílago y células del mesénquima y las MSC se pueden diferenciar en miocitos, hepatocitos , células de la neuroglía y neuronas. Las MSC pueden pasar a través de la barrera hematoencefálica y migrar hacia el cerebro anterior y el cerebelo. Las células de médula ósea derivadas de individuos del género masculino suministradas por infusión sistémica en ratas isquémicas femeninas migran de manera preferencial a la corteza isquémica. Células de médula ósea de ratón del género masculino administradas a ratones hembra irradiados entran al cerebro en cuestión de días a semanas y se diferencian en microglia y astroglia. No hay un reactivo neuroprotector que haya mejorado el resultado posterior a apoplejía. El beneficio terapéutico de las MSC humanas (hMSC) para isquemia al miocardio y la enfermedad cardíaca en ratas parece derivarse de la sustitución del tejido y la inducción de angiogénesis y vasculogénesis . Las MSC secretan muchos factores de crecimiento y citocinas, los cuales normalmente soportan a los progenitores hematopoyéticos para que proliferen y se diferencien. La médula ósea contiene varias células primitivas que secretan varios factores de crecimiento angiogénicos que incluyen VFGF y bFGF. Por lo tanto, las MSC se pueden desarrollar en tratamiento viable para enfermedades neurológicas de tratamiento. Se ha demostrado recuperación funcional significativa en el modelo en rata de la oclusión de la arteria cerebral media (MCAO, por sus siglas en inglés) cuando se trata con las MSC de roedor. Materiales y métodos. Preparación de las hMSC y cinética de crecimiento in vitro Para examinar la cinética de crecimiento celular y la expansión de las hMSC in vitro se obtuvieron aspirados de médula ósea por punción de la cresta ilíaca posterior en tres donadores humanos sanos, bajo anestesia local. Las células mononucleares de especímenes de médula ósea (15 a 16 mi por persona) se separaron en un gradiente de densidad Ficoll (Ficoll-Paque [densidad, 1.073], Pharmacia, CA) . El aislamiento y establecimiento de cultivos de hMSC se lleva a cabo como se describe en Digirolamo et al. Brevemente, se siembran en placas células mononucleares a una concentración de 1 x 106 células/75 cm2 en matraces de cultivo de tejido en 20 mi de medio de Eagle modificado por Dulbecco, con baja concentración de glucosa (Gibco-BRL, Grand Island, NY) y se suplementa con suero bovino fetal 20% (Gibco-BRL) , 100 unidades/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina y 2 mmol/1 de L-glutamina . Después de 72 horas de incubación, se eliminan las células no adherentes de los cultivos y se agrega a los matraces medio de cultivo fresco. Las hMSC que se adhieren al plástico se dividen en el día 14 (90% de confluencia) y cada 7 días después para determinar el crecimiento celular y el rendimiento celular. Se cuentan las células de médula nuclear utilizando un citométrico para asegurar un número de células adecuado para el transplante. Se inyecta a cada rata una dosis de 3 x 106 hMSC. Las hMSC cosechadas de cinco pasajes y cultivadas adicionalmente en el medio de Eagle modificado por Dulbecco bloqueado (sin suero; Gibco-BRL) con 20% de medio de sustitución de suero bloqueado (Gibco-BRL) se utilizan para la medición de ELISA (n = 6) . Se mide la secreción de factor neurotrófico derivado de cerebro (BNDF) y el factor de crecimiento de nervios (NGF) por las hMSC a l, 4 y 7 días en el medio de Eagle modificado por Dulbecco sin suero. Reacción mixta de linfocitos entre células de bazo de rata y hMSC in vi tro. Para estudiar la proliferación de linfocitos inducida por antígeno, se cultivan por triplicado 2 x 105 células de bazo de ratas sanas o ratas inyectadas con 3 x 106 hMSC 2 semanas antes, con o sin hMSC irradiadas (20 Gy) durante 96 horas en una proporción de 10:1 de célula sensible respondedor (esplenocitos) a estimulador (hMSC) . Las células mezcladas se pulsan con 3H-timidina (0.25 µ??/????) durante 16 horas. La inducción de proliferación de linfocitos esplénicos por hMSC se mide por la incorporación de 3H-timidina en células esplénicas replicantes. Los cultivos se cosechan con un cosechador de células automático y se mide la incorporación de 3H-timidina por centelleo líquido. Insertar ecuación Respuesta de linfocitos T citotóxicos de rata a hMSC in vi tro . Los linfocitos T están implicados como un iniciador de enfermedad iatrogénica mortal de rechazo inverso (injerto versus huésped) . Por lo tanto, se midió la respuesta de injerto humano versus linfocitos T de hospedador de rata utilizando un ensayo de 51Cr para determinar el efecto lítico. Se cultivan células de bazo de ratas sanas o células de bazo de ratas inyectadas con 3 x 10s hMSC dos semanas antes, con hMSC irradiadas durante 5 días en una relación de 10:1 de células sensibles (células del bazo) respecto a estimulador (hMSC) . Al final del período de incubación las células viables se recuperan de los cultivos y se prueban para determinar citotoxicidad para hMSC marcadas con 51Cr, en un ensayo de liberación de 51Cr de 8 horas.

Modelo animal MCAO. Se adquieren ratas Wistar macho adultas (con un peso de 270 a 300 g) de Charles River Breeding Company (Wilmington, MA) . Las ratas inicialmente se anestesian con halotano 3.5% y se mantienen con halotano 1.0% a 2.0% en N20 70% y 02 30% utilizando una mascarilla facial. Se mantiene la temperatura rectal a 37°C durante el procedimiento quirúrgico utilizando un sistema de calentamiento de agua regulado por retroalimentación. Se induce MCAO transitoria utilizando un método de oclusión vascular intraluminal modificado en el laboratorio. Se expone la arteria carótida común derecha. La arteria carótida externa y la arteria carótida interna. Se introduce y se hace avanzar una longitud de sutura de nylon de monofilamento 4-0 (18.5 a 19.5 mm) , determinado por el peso del animal, con su punta redondeada al calentar cerca de una flama, desde la arteria carótida externa dentro del lumen de la arteria carótida interna hasta que se bloquea el origen del MCA. Dos horas después de realizar MCAO, los animales se reanestesian con halotano y se realiza reperfusión por extracción de la sutura hasta que la punta aclara la luz de la arteria carótida externa. Grupos experimentales . Grupo 1. Para medir neutrófilos, se somete a las ratas a MCAO sin tratamiento (n = 3) o se les inyecta con 3 x 106 de MSC (n = 3) o 3 x 106 de fibroblastos hepáticos (n = 3) en un volumen de fluido total de 1 mi, en la vena de la cola, 1 dia después del ataque de apoplejía. El estudio de fibroblastos hepáticos es un "control" limitado en el cual los fibroblastos se recolectan de la misma cepa de ratas Wistar para evitar una respuesta inmunológica inesperada de las células control a las ratas hospedadoras . Se sacrifica a las ratas 7 días después de MCAO para medición de neutrófilos. También se utilizan como sujetos control tres ratas sanas. Grupo 2. Se somete ratas a MCAO con 3 x 106 hMSC (n = 9) o 3 x 106 fibroblastos hepáticos de rata (n = 9; control) inyectado a 1 día o con MCAO únicamente, sin donadores de células (n = 10; control) . Se sacrifica las ratas 14 días después de MCAO para medición de la morfología celular. Debido a que MCAO induce proliferación de células precursoras neurales endógenas y células progenitoras en la zona ependímica y subependímica (también denominada como zona ventricular/zona subventricular [VZ/SVZ, por sus siglas en inglés] ) , 17 ratas en el grupo 2 recibieron diariamente inyecciones intraperitoneales de bromodesoxiuridina (BrdU, un análogo de timidina que etiqueta ADN recién sintetizado [50 mg/kg] ; Sigma, St . Louis, MO) de manera consecutiva durante 14 días después de MCAO con o sin inyección IV de células donadoras para identificación de proliferación celular. Como un control, a dos animales sanos adicionales se les administra 14 inyecciones, una diariamente, de 50 mg/kg de BrdU intraperitonealmente, antes de morir. Prueba de comportamiento. Todos los animales experimentaron pruebas de comportamiento antes de MCAO y a los 1, 7 y 14 días después de MCAO por un investigador quien desconocía los grupos experimentales. Para medir las asimetrías somatosensitivas de las extremidades anteriores, se utilizan puntos de papel con adhesivo, pequeños (113.1 mm2) como un estímulo táctil bilateral y se aplican a la cara radial de la muñeca de cada extremidad anterior en cinco ensayos al día en una jaula donde habitualmente viven las ratas . Los tiempos en los cuales las ratas tienen contacto con el estímulo y se les retira el estímulo se registra. Los ensayos individuales están separados por al menos 5 minutos. Los animales fueron entrenados en la prueba del círculo de adhesivo-remoción durante 3 días antes de la cirugía. Una vez que las ratas eran capaces de removerse los círculos en los siguientes 10 segundos, se les sometía a MCAO. Se utiliza una calificación de gravedad neurológica modificada (mNSS, por sus siglas en inglés) para establecer una clasificación de los diversos aspectos de la función neurológica. La mNSS es una composición de las pruebas motoras (estado muscular y movimiento anormal), sensitiva (visual, táctil y propioceptiva) y de reflejos.

Tabla 1 Pruebas de calificación de gravedad neurológi modificada Pruebas Motoras Puntos Elevación de la rata por la cola 3 1 = Flexión de las extremidades anteriores 1 = Flexión de las extremidades posteriores 1 = Cabeza que se mueve > 10° respecto al eje vertical en los siguientes 30 s Caminar en el piso (normal = 0; máximo = 3) 3 0 = Caminado normal 1 = Incapacidad para caminar en línea recta 2 = Realizar círculos hacia el lado parético 3 = Caída hacia el lado parético Pruebas sensitivas 2 1 = Prueba de colocación (prueba visual y táctil) 1 = Prueba propioceptiva (sensación de profundidad, empujar la planta de la pata contra el borde de la mesa para estimular a los músculos de las extremidades) Pruebas de balance en viga (normal = 0; máximo = 6 0 = equilibrios con postura estable 1 = Sujetarse al lado de la viga 2 = Abrazar la viga y una extremidad cae de la viga 3 = Dos extremidades caen de la viga o girar sobre la viga (>60 s) 4 = Intentos por equilibrarse en la viga pero presenta caída (>40 s) 5 = Intentos por equilibrarse en la viga pero cae (>20 s) 6 = Caídas: no hay intento por equilibrarse o colgarse en la viga (<20 s) Ausencia de reflejos y movimientos anormales 4 1 = Reflejo pinna (agitación de la cabeza cuando se toca el ....

Prueba de calificación de gravedad neurologica modificada Preparación de extracto del cerebro isquémico: Siete días antes de MCAO, las ratas en el grupo 1 fueron anestesiadas con halotano; se extrajeron los cerebros y se realizaron disecciones sobre hielo de los hemisferios isquémicos. Las muestras después se almacenan a -80 °C. Posteriormente, cada muestra de tejido se homogeneiza en 1 g/ml de amortiguador de homogeneizado . El homogeneizado se centrifuga (10,000 g) durante 10 minutos a 4°C y el sobrenadante se recolecta para medición de secreción. Medición de secreción de factores de crecimiento utilizando ELISA indirecta (tipo emparedado) . El equipo de ELISA para BNDF se obtiene de R & D Systems (Minneapolis , MN) y la prueba de ELISA se prepara como lo instruye el fabricante. Se elabora una solución de ELISA para NGF. Se adquiere anticuerpo monoclonal contra ß (2.5S, 7S) N6F, anticuerpo monoclonal contra-ß (2.5S, 7S) NGF- -gal y NGF-ß estándar de Roche Molecular Biochemicals (Indianapolis, IN) . Brevemente, el sobrenadante recolectado del tejido isquémico del medio de cultivo sin suero a partir de las hMSC se divide en muestras por triplicado de 100 a 200 µ? . Se utilizan anticuerpos monoclonales para BDNF y NGF de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Posteriormente, se agrega el segundo anticuerpo policlonal específico para cada anticuerpo primario. Después de un período de incubación con un sustrato cromogénico, se presentan desarrollos de color en proporción a la cantidad de factores de crecimiento y se miden utilizando un lector de microplaca (450 a 620 nm) . Determinación histológica, inmunohistoguímica y apoptótica. Preparación de cubreobjeto. Las ratas del grupo 2 se les permite sobrevivir durante 14 días después de MCAO y se les utiliza para análisis morfológico. En este momento, se anestesia a las ratas con quetamina (44 a 80 mg/kg intraperitonealmente) y xilazina (13 mg/kg, intraperitonealmente) , y el sistema vascular se somete a perfusión transcardíaca con solución salina amortiguada con fosfato heparinizada (PBS) seguido por paraformaldehído 4% en PBS . Los cerebros se sumergen en paraformaldehído 4% en PBS durante 2 días y después los tejidos de cerebro se cortan en siete bloques de corona separados por igual (2 mm) . Los tejidos se procesan y se cortan rebanadas o cortes de la parte de la corona con vibratomo de flotación libre con espesor de 100 µt? (cinco cortes de vibratomo por bloque) . Todos los bloques de cerebro permanentes se incrustan en parafina y se cortan una serie de 6 cortes de 6 \im de espesor adyacentes . Medición del volumen de infarto. Se tiñe con hematoxilina-eosina (H-E) un corte de cada uno de los cortes de parafina coronales (6 ym de espesor) de siete bloques. Los siete cortes de cerebro se trazan utilizando el sistema de análisis Global Lab Image (Data Translation, alboro, A) . Se calcula el área de lesión indirecta, la cual el área intacta del hemisferio del mismo lado se resta del área del hemisferio del lado contrario. Se presenta el volumen de lesión como un porcentaje en volumen de la lesión en comparación con el hemisferio del lado contrario . Tinción inmunohistoquímica . Después del bloqueo en suero normal, todos los cortes de vibratomo se tratan con el anticuerpo monoclonal específico para núcleos humanos (mAB1281; Chemicon, Temecula, CA) diluido 1:100 en PBS durante 3 días a 4°C. Después de la incubación secuencial con anticuerpo de conejo para IgG de ratón, conjugado con isotiocianato de fluoresceína (dilución, 1:100; Dakopatts, CA) , el anticuerpo secundario se une al primer anticuerpo con mAb 1281. Las células derivadas de hMSC se identifican utilizando criterios morfológicos y tinción inmunohistoquímica con mAbl281 presente en las células donadoras pero no presente en las células de parénquima. Para visualizar la localización celular de mAbl281 y los marcadores específicos de tipo de célula en las mismas células, se utiliza tinción doble en los cortes de vibratomo de referencia en serie (100 µt?) centrados en el núcleo isquémico (coordenada al bregma -1.0 1.0 mm) . Cada corte coronal se trata primero con el anticuerpo primario, mAbl281 como se describe en lo anterior y después se trata con anticuerpos primarios secundarios específicos de tipo de célula conjugados a cianina 5.18 (Calbiochem, CA) durante 3 días a 4°C: un antígeno nuclear neuronal (NeuN para núcleos neuronales [dilución, 1:200]; Chemicon) , proteína 2 asociada con microtúbulos (MAP-2 para dendritas neuronales [dilución , 1:200]; Sigma) , proteína ácida fibrilar de la neuroglia (GFAP para astrocitos [dilución 1:1,000]; DAKO, Carpintería, CA) y vWF (para células endoteliales [dilución, 1:400]; DAKO). Los cortes de control negativo para cada animal recibieron preparaciones idénticas para tinción inmunohistoquimica, excepto que se omitieron los anticuerpos primarios. Microscopía confocal de exploración láser. Los cortes de vibratomo coronales se analizan con un sistema de formación de imágenes confocal de exploración láser Bio-Rad RC 1024 (argón y krypton) montado en un microscopio Zeiss (Bio-Rad, Cambridge, MA) . Para los cortes marcados por inmunofluorescencia se excitan los fluorocromos en los cortes tanto de color verde (isotiocianato de fluoresceina) como rojo (cianina-5.18) mediante el haz láser a 488 nm y 647 nm, y las emisiones se adquieren secuencialmente con un tubo fotomultiplicador a través de flitros de emisión de 522 nm y 670 nm. El número total de células positivas para mAbl281 se mide en cinco cortes secuenciales (100 µp? de espesor) para cada bloque a partir de la totalidad de los siete bloques mediante la utilización de los codificadores de etapa XYZ para conteo de células.26. Posteriormente se calcula el número total de células positivas para mAbl281 del cerebro anterior completo al sumar los números de células positivas para mAbl281 a partir de la totalidad de los siete bloques. Se cuentan un total de 500 células positivas para mAbl281 por animal, para obtener el porcentaje de células positivas para mAbl281 colocalizadas con los marcadores específicos de tipo de célula (NeuN, MAP-2, vWF, y GFAP) mediante tinción doble. Tinción de células apoptóticas. Se utilizaron para el análisis de células apoptóticas cinco cortes de parafina coronales (6 µ?t? de espesor; intervalo de 25 ym) de la coordenada de bloque a la que se hace referencia en lo anterior en la bregma -1.0 1.0 mm. Estos cortes se tiñen mediante el método de etiquetado del extremo de estrechamiento con dUTP-biotina mediado por desoxinucleotidiltransferasa terminal (TUNEL, por sus siglas en inglés) para detección de apoptósis in situ (equipo ApopTag; Oncor, Gaithersburg, MD) . Después de suspender la actividad de peroxidasa endógena con H202 en PBS , los cortes se colocan en desoxinucleotidiltransferasa terminal. Se aplica anti-digoxigenina-peroxidasa a los cortes y la peroxidasa se detecta con 3 , 31 -diaminobencidina . Después de tinción con TUNEL, los cortes se someten a tinción contrastante con hematoxilina Mayer. Los cortes de control negativo se corren para cada bloque. En las preparaciones TUENL, únicamente las células que contienen cuerpos apoptóticos de color café oscuro (>2) se denominan como células apoptóticas. La figura 2 muestra una sección coronal estándar identificada al nivel de la comisura anterior del cerebro de rata, la cual divide el hemisferio derecho en tres regiones secundarias (núcleo isquémico, zona límite isquémica y VZ/SVZ) . Se miden las hMSC exógenas (mAbl281) , las células positivas al tipo de célula (NeuN, MAP-2, GFAP y vWF) y las células apoptóticas (células positivas a TUNEL) en estas regiones de los hemisferios del mismo lado y del lado contrario. Se utilizan características histológicas con tinción habitual H-E para identificar tres regiones: el núcleo isquémico (palidez difusa del fondo eosinofílico) y el interior (vacuolación o formación esponjosa de los neutrófilos) y otras zonas límite (a partir de la condición esponjosa hasta tejido completamente intacto [la mayor parte de las células están intactas; no obstante, se pueden observar de manera dispersa células dañadas y muertas] ) de la lesión isquémica y alteraciones en la forma y capacidad de tinción de las células. La figura 2 muestra una sección coronal estándar identificada a nivel de la comisura anterior del cerebro de rata que divide el hesmiferio derecho en tres regiones secundarias (núcleo isquémico [IC, por sus siglas en inglés] ; zona de límite isquémico [IBZ, por sus siglas en inglés] ,- y zona ventricular/zona subventricular [VZ/SVZ, por sus siglas en inglés]) y ocho campos (1, la corteza en IC; 2, la parte estriada en IC; 3-4, la corteza en IBZ , 5-6, la parte estriada en IBZ; y 7-8, la parte estriada en VZ/SVZ) para análisis de respuesta al tratamiento. Análisis estadístico. Todas las mediciones se realizaron sin que el analista conociera el grupo que estaba analizando. Las calificaciones de comportamiento (a partir de la prueba de los círculos de remoción de adhesivo y la NSS) se evalúan para determinar normalidad. Se llevó a cabo un análisis de medición repetida para determinar el efecto del tratamiento en la calificación del comportamiento. El análisis comenzó con la prueba para la interacción de tratamiento-tiempo a un nivel de significancia de 0.1; la prueba para el efecto de tratamiento completo se realizó si no se detectaba interacción a un nivel de significancia de 0.05. Se llevó a cabo un análisis de grupo secundario del efecto de tratamiento en cada calificación de comportamiento cada vez, con un nivel de significancia de 0.05 si estaba presente una interacción de tratamiento- tiempo con un nivel de significancia de 0.1 o un efecto de tratamiento total con un nivel de significancia de 0.05. De otra manera, los análisis de grupos secundarios se consideraban como exploratorios. Se utilizaban las pruebas t de Student para evaluar las diferencias entre el grupo conrol y el grupo tratado en términos de volumen de lesión y números de células. Los datos de ELISA se linealizan al graficar el logaritmo de las concentraciones de BNDF y NGF versus el logaritmo de la densidad óptica y se determina la línea de mejor ajuste mediante análisis de regresión. Se realizan lecturas por duplicado del promedio para cada estándar, control y muestra y se resta la densidad óptica estándar cero promedio. Se presentan las medias (SD, desviación estándar, por sus siglas en inglés) y el valor p para la prueba de diferencia entre los grupos tratado y control. Resultados . Cinética de crecimiento de hMSC in vi tro. Se realizan pruebas por expansión de cultivo de las hMSC derivadas de médula ósea de tres donadores humanos sanos. En los cultivos primarios, las hMSC crecen como una población morfológicamente homogénea de células similares a fibroblastos. Durante los pasajes subsecuentes, habitualmente a intervalos de 7 días, las hMSC crecen como espiral de células en forma de husos empacados densamente. Al final de las 5 semanas (cuatro pasajes) , las hMSC proporcionan un intervalo entre 5.4 y 6.6 x 107 células (tabla 2) .

Tabla 2. Cinética de crecimiento de las hMSC No. de Médula Células hMSC Donador ósea, mi mononucleares, (106) (7 106 días por cada pasaje) Pasaje 1 Pasaje 2 Pasaje 3 Pasaje 4 1 16 100 1.65 9.0 18.9 53.6 2 16 130 3.21 14.3 35.8 64.3 3 15 160 10.8 18.9 28.8 66.0 hMSC = células estromáticas de médula ósea humanas.

Reacción mixta de linfocitos y respuesta de linfocitos T citotóxicos entre células de bazo de rata y las hMSC in vitro. Las hMSC incrementan de manera significativa la proliferación de células de bazo de rata sanas (índice de estimulación = 18.8) en comparación con células de bazo no estimuladas (figura 2A) . La proliferación de células de bazo de ratas inyectada con hMSC también se incrementa después de la reestimulación con hMSC in vitro (índice de estimulación = 15.6); no obstante, la respuesta proliferativa en estas células no es significativamente diferente de la que se observa en células de bazo de una rata sana. Estos datos indican que aunque las hMSC son capaces de inducir una respuesta proliferativa primaria en linfocitos de bazo de rata, la administración de las mHSC a ratas no sensibiliza a los linfocitos in vivo para una respuesta proliferativa in vitro secundaria.

La figura 8A muestra la reacción de linfocitos mixta entre las células de bazo de rata y células estromales de médula ósea humanas (hMSC) : 2 x 105 células de bazo de rata sana (N-Spl) o células de bazo de rata tratadas IV con hMSC (T-Spl) 2 semanas antes, por triplicado, con o sin hMSC irradiada (20 Gy) durante 96 horas en una proporción de células que responden al estímulo : estimulador de 10:1. Los cultivos se someten a pulsos con 3H-timidina (0.25 Ci/pozo) durante 16 horas y después se cosechan con un cosechador de células automático. Se mide la incorporación de 3H-timidina por centelleo líquido. No se detectan diferencias entre células de bazo obtenidas de ratas tratadas o no tratadas con hMSC. SI = índice de estimulación (por sus siglas en inglés) . (B) Se cultivan células de bazo de rata (1 x 107) con 1 x 10s hMSC irradiadas (20 Gy) durante 5 días. Al final del período de incubación, las células viables se recuperan de los cultivos y se prueban para determinar toxicidad a hMSC marcado con 51Cr en un ensayo de liberación de 51Cr que dura 8 horas con proporciones de efectora : obetivo (E:T, por sus siglas en inglés) . Las células del bazo de rata se expresan como medias + SD. La figura 8B demuestra <4% de lisis de las células objetivo (hMSC) por células de bazo de rata sanas incubadas con o sin los estimuladores (hMSC) . De manera similar, el cebador de células de bazo in vivo por administración de hMSC seguido por reestimulación con hMSC en cultivo durante 5 días no genera citotoxicidad en las células, lo que indica que hMSC no inducen una respuesta de linfocitos T citotóxicos en células de bazo de rata. Prueba funcional neurológica. A los 14 días después del ataque apopléjico, la recuperación funcional mostrada por la prueba de remoción del círculo adhesivo (p < 0.05; figura 3A) y la prueba mNSS (p < 0.05; véase figura 3B) se encuentra en ratas inyectadas con 3 x 106 hMSC 1 día después de MCAO en comparación con ratas control se someten a MCAO únicamente y ratas inyectadas con 3 x 106 fibroblastos hepáticos de rata. La figura 3 muestra los resultados de las pruebas funcionales de comportamiento (A: prueba de separación del círculo adhesivo; B: prueba de calificación de gravedad neurológica modificada [mNSS] ) antes y después de oclusión de la arteria cerebral media (MCAO, por sus siglas en inglés) . Las ratas se someten a 2 horas de MCAO únicamente (n = 10) o bien se inyecta con células estromáticas de médula ósea humana cultivadas (hMSC) (n = 9) o células de fibroblasto hepático de rata (LC; n = 9) 1 día después de MCAO. Se detecta recuperación funcional significativa en ratas tratadas con hMSC en comparación con los sujetos control. Círculo blanco = MCAO; círculo negro = +LC; triángulo +hMSC.

Cuantificación de la prueba ELISA indirecta. Utilizando los métodos de ELISA indirecta, se incrementaron (p < 0.05) los niveles de secreción de BDNF (969 + 198 pg/mL versus + 59 pg/mL y 498 + 76 pg/mL) y NGF (1,227 + 111 pg/mL versus 834 + 123 pg/mL y 980 + 55 pg/mL) en el hemisferio isquémico de ratas tratadas con hMSC en comparación con animales, 7 días después de MCAO únicamente, sin el tratamiento celular y ratas tratadas con fibroblastos hepáticos de rata. Los datos in vitro indican que las hMSC secretan BNDF y NGF de una manera que depende del tiempo. Se detecta un incremento significtivo en BDNF y NGF en medio sin suero a los 4 y 7 días en cultivo, en comparación con el dia 1 (tabla 3) . Tabla 3 Secreción de neurotrofina por hMSC en cultivo Análisis morfológico. Ratas sometidas a 2 horas de CAO se someten a infusión con 3 x 106 hMSC 1 día después de isquemia y se les sacrifica 14 días después de MCAO para realización de análisis morfológico. Dentro de los cortes coronales teñidos con H-E, se observan neuronas oscuras y rojas en el núcleo isquémico de todas las ratas sometidas a MCAO con y sin inyección de hMSC. No se detecta una reducción significativa en el volumen de daño isquémico en ratas tratadas con hMSC (volumen de lesión, 33.3% + 7.6%) en comparación con ratas control tratadas únicamente con MCAO (36.3% + 10.5%) o ratas inyectadas con fibroblastos hepáticos de rata 14 días después de MCAO (34.6% + 9.1%) . Dentro del tejido de cerebro, las células derivadas de hMSC se caracterizan por núcleos redondos a ovalados identificados por el anticuerpo específico humano mAbl281. Las hMSC (124 x 103 + 46 x 103; 4% de 3 x 106 hMSC) sobrevivieron y se distribuyeron a través del cerebro dañado isquémico de ratas receptoras. Aunque las células reactivas a mAbl281 se observaron en áreas múltiples del hemisferio del mismo lado, que incluye la corteza y el cuerpo estriado, la mayor parte de las hMSC marcadas con mAbl281 (60% del total de 124 x 103 + 46 103) se localizan en la zona del límite isquémico. Algunas células también se observan en el hemisferio del lado contrario (9 x 103 + 2 x 103; 0.3% de 3 x 105 hMSC) . La inmunohistoquímica de tinción doble revela que algunas células positivas a mAbl281 son reactivas para los marcadores neurales utilizados. Los porcentajes de las hMSC marcadas con mAbl281 que expresan NeuN, MAP-2, GFAP y v F son 1%, 1%, 5% y 2%. Las imágenes de microscopía confocal de exploración láser muestran localización conjunta del anticuerpo monoclonal específico para los núcleos humanos mAbl281 (verde para identificación de hMSC) con NeuN, MAP-2, GFAP o vWF (rojo para los marcadores específicos de tipo de célula) en el cerebro de rata receptor (figura 4, a hasta h) . La mayor parte de las células positivas a mAbl281 circundan a los vasos, con algunas células localizadas en el parénquima. La figura 9 muestra fotomicrografías que muestran las características morfológicas de las células estromáticas de médula ósea humanas (hMSC) exógenas y células de cerebro endógenas en cerebro de rata. Utilizando tinción inmunofluorescente doble, las células reactivas a mAbl281 (las específicas de anticuerpo monoclonal para núcleos humanos) están presentes en la región dañada del cerebro. Las imágenes de microscopía confocal de exploración láser muestran mAbl281 (verde para hMSC [a, c , d, f-h] ) , antígeno nuclear neuronal (NeuN) (b,c), proteína 2 asociada a microtúbulos (MAP-2) (e,f), proteína ácida fibrilar de neuroglia (GFAP) (g) y vWF (h) (rojo para marcadores específicos de tipo de célula) en el cerebro de rata receptora. Barra de escala = 50 µ?t?. Utilizando TUNEL (figura 7, a, c y d) y tinción con H-E (véase la figura 7b) , las células apoptóticas con cuerpos de color café oscuro típico redondeado y cuerpos apoptóticos ovalados se cuentan en la zona del límite isquémico. Dentro de la sección coronal de referencia de 6 µt? de espesor, se reduce el número de células apoptóticas medidas (38.5 + 3.4 versus 82.6 + 3.8 ó 76.4 + 6.8; p < 0.05) en la zona de límite isquémico en ratas tratadas con hMSC en comparación con animales 14 días después de únicamente MCAO o ratas isquémicas tratadas con fibroblastos hepáticos. Las figuras 7A - 7H muestran células apoptóticas (Fig. 7A células positivas a etiquetado de extremo de estrechamiento con dUTP-biotina mediada por desoxinucleotidil transferasa terminal [TUNEL] [flechas] ; Fig. 7B: tinción con hematoxilina-eosina [H&E] ) están presentes en la zona límite isquémica después de oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) únicamente. Las células apoptóticas disminuidas (Fig. 7D: mayor supervivencia de células sometidas a tinción contrastante con azul-hematoxilina; cabezas de flecha) se detectan en ratas inyectadas con células estromáticas de médula ósea humana (hMSC) en comparación con ratas inyectadas con fibroblastos hepáticos (Fig. 7C) . Algunas células positivas a bromodesoxiuridina (BrdU; un marcador de ADN recién sintetizado) (flechas) están presentes en la zona ventricular/zona subventricular (VZ/SVZ) del cerebro sano (Fig. 7E) . Se detectan células positivas para BrdU aumentadas en VZ/SVZ del hemisferio del mismo lado de ratas sometidas únicamente a CAO (Fig. 7F) y ratas inyectadas con fibroblastos hepáticos (Fig. 7G) . Se detectan células positivas a BrdU aumentadas de manera significativa en VZ/SVZ en ratas tratadas con hMSC (Fig. 7H) en comparación con ratas sometidas a MCAO con o sin tratamiento con células hepáticas. Barra de escala = 15 µt?. Algunas células positivas para BrdU están presentes en VZ/SVZ (véase figura 7E a 7H) . Se detecta una cantidad significtivamente mayor de células reactivas a BrdU en VZ/SVZ del hemisferio del mismo lado de ratas que se someten a MCAO con tratamiento por hMSC (véase la figura 7H) en comparación con las ratas que se someten únicamente a MCAO (véase la figura 7F) o ratas tratadas con fibroblastos hepáticos (véase la figura 7G) . Se utilizaron para el análisis de células reactivas a BrdU cinco cortes de parafina coronales (6 µt? de espesor; intervalos de 25 µt?) a partir de la sección de referencia estándar con coordenadas en bregma -1.0 1.0 mm. El número de células positivas a BrdU por corte en la parte VZ/SVZ de ratas sometidas a MCAO con tratamiento con hMSC (95.3 + 24.1) es significativamente mayor que en la región VZ/SVZ de ratas sometidas únicamente a MCAO (27.5 + 18.5) o ratas isquémicas tratadas con fibroblastos hepáticos (37.8 + 11.2). Un número más elevado de células positivas a BrdU por placa expresan NeuN (2.5 + 0.4 versus 0.5 + 0.6 ó 0.6 + 0.4; p < 0.05) y GFAP (4.4 + 2.3 versus 1.4 + 1.1 ó 1.7 + 0.5; p < 0.05) para ratas sometidas a CAO con tratamiento con h SC en comparación a las ratas sometidas únicamente a MCAO o ratas tratadas con fibroblastos hepáticos 14 días después de apoplej £a . Discusión. La inyección IV de hMSC 1 día después del ataque apoplé ico mejora de manera significativa el resultado funcional de acuerdo con la calificación somatosensorial y la m SS, en comparación con ratas sometidas únicamente a MCAO o inyectadas con fibroblastos hepáticos de rata. Este beneficio puede reflejar la producción de factores de crecimiento, que incluyen neurotrofinas que pueden promover la reparación de células de parénquima dañadas, reducidas la apoptósis en la zona límite isquémica y mejorar la proliferación y diferenciación de células precursoras y progenitoras neurales endógenas en VZ/SVZ después de ataque apopléjico en ratas. Los injertos neurales tienen deficiencias funcionales revertidas asociadas con el daño a cerebro. Los datos actuales de injerto humano versus hospedador de rata concuerdan con los hallazgos de otros estudios que muestran direccionamiento final (ecotaxia) preferencial de células de médula ósea halogeneicas transplantadas y administradas IV hacia el sitio de daño después del inicio de MCAO permanente en animales irradiados 7 y transitorio 2 horas de MCAO en animales no irradiados. El análisis morfológico indica que hMSC tiene la capacidad de migrar selectivamente al cerebro de rata dañado isquémico. Las hMSC sobreviven y las pocas dispersadas expresan marcadores de proteína para células de cerebro de parénquima . Aunque las hMSC pueden tener el potencial de sustituir neuronas perdidas, es probable que los mecanismos que proporcionan beneficio terapéutico tengan ramificaciones múltiples. Los datos muestran que la inyección de 3 x 106 hMSC 1 día después del ataque apopléjico mejora el resultado funcional, de acuerdo con la calificación somatosensorial y la mNSS en comparación con ratas no tratadas, a los 7 y 14 días (p < 0.01) después de la administración. No obstante, únicamente 1%, 5% y 2% de hMSC expresan proteínas neuronales, astrocíticas y de células endoteliales , lo que indica que es muy pronto para una diferenciación e integración celular completa dentro del tejido. Por lo tanto, un mediador más probable del beneficio a corto plazo es que las hMSC suplementen los tejidos dañados con un arreglo de factores de crecimiento que promueven la recuperación funcional de las neuronas restantes y reduzcan la apoptósis en la zona del límite isquémico. Las MSC pueden estar involucradas directamente en promover la plasticidad de las neuronas dañadas isquémicas o en estimular células de neuroglia para secretar neurotrofinas (por ejemplo BDNF y NGF) . La interacción de hMSC con el cerebro hospedador puede inducir a las hMSC y células de parénquima a producir factores tróficos abundantes, los cuales pueden contribuir a la recuperación de función perdida como resultado de la lesión. 30,31 utilizando métodos de ELISA indirectos (tipo emparedado) en este estudio, se demuestra que los niveles de secreción de BDNF y NGF se incrementan de manera significativa en el hemisferio isquémico de ratas tratadas con hMSC en comparación con animales, 7 días después de únicamente MCAO sin tratamiento celular y con tratamiento con células hepáticas de rata. Aunque se midió la presencia de BDNF y NGF en el cerebro isquémico, no se excluye la posibilidad de que otros factores de crecimiento (tales como los factores angiogénicos VEGF32 y HGF33) puedan mejorar la recuperación funcional por lo menos en parte, al incrementar la angiogénesis . La angiogénesis se relaciona con una recuperación neurológica mejorada, después de apoplejía. Las MSC se comportan como "fábricas" moleculares pequeñas. Estas células producen una gama de citocinas y factores tróficos. También secretan estos factores sobre un período prolongado y no en una sola dosis rápida. Las MSC expresan muchas citocinas que se sabe juegan un papel en la hematopoyesis y también suministran factores autocrinos, paracrinos y yuxtacrinos que influyen en las células mismas del microambiente de la médula. Es probable que las MSC dentro del tejido cerebral expresen estos factores y el efecto de estas citocinas y factores tróficos sobre tejido de cerebro el cual promueve rápida y eficazmente la restaruacion de función. Estas células, cuando se cultivan bajo microambientes iónicos diferentes (por ejemplo calcio) responden a las claves del microambiente iónico ajustando la expresión del factor de crecimiento. Esto sugiere que las células dentro de tejido dañado expresan factores tróficos y de crecimiento titulados para las necesidades del tejido. En el cerebro, el tratamiento de apoplejía con MSC produce una variedad de factores tróficos y citocinas de una manera distribuida anatómicamente, sensible al tejido y temporalmente en desarrollo, en contraste notable con la inyección localizada única de un factor específico. Las células precursoras neurales residen dentro del VZ/SVZ y estas células migran a su destino, en el cerebro en desarrollo. En el cerebro adulto sano, la ausencia de producción neuronal del cerebro anterior puede reflejar no una carencia de células precursoras neuronales apropiadas sino más bien una inhibición tónica o una carencia de un soporte posmitótico trófico y migratorio. En este estudio, las células reactivas BrdU incrementaron la zona VZ/SVZ después de MCAO con tratamiento con hMSC en comparación con MCAO únicamente, lo que sugiere que las hMSC inyectadas IV pueden estimular las células endógenas del cerebro para que proliferen y participen en la reparación de cerebros dañados isquémicos. Estos hallazgos concuerdan con los datos obtenidos utilizando la administración de MSC IV derivadas de rata . El transplante IV de las hMSC en ratas no sensibiliza a las ratas contra hMSC, como se determina por la reacción mixta de linfocitos in vitro. De manera similar, las células de bazo de ratas sanas o de ratas inyectadas con HMSC no generan una respuesta de los linfocitos T citotóxicos hacia hMSC, una respuesta inmunologica funcional que está implicada en el rechazo de transplantes de órganos/células extrañas. Estos datos sugieren que el rechazo inmunológico de hMSC por ratas no es una preocupación a la hora de realizar pruebas de hMSC como un tratamiento para la apople ía. De manera potencial y lo que es más importante, el bazo de rata mostró poca o nula sensibilidad a las hMSC inyectadas. La incapacidad de las hMSC a inducir una respuesta inmunologica fuerte se puede relacionar con una inmunogenicidad débil de estas células debido a la ausencia o la poca expresión del complejo principal de histocompatibilidad (clase I y clase II) y moléculas coestimuladoras (CD40, CD80 y CD86) . Además, las hMSC también pueden secretar mediadores solubles que inhiben el desarrollo de respuestas inmunológicas involucradas en el rechazo de un xenoinjerto. Estos datos requieren de estudios adicionales para investigar la inmunogenicidad de poblaciones de células adherentes alogeneicas de las MSC. Los datos indican que las hMSC administradas IV promueven la recuperación funcional neurológica 2 semanas después de apoplejía. Las hMSC entran selectivamente en la región isquémica cerebral . La interacción entre las hMSC y el cerebro isquémico mejora la secreción de neurotrofinas , lo cual puede reducir la apoptósis neuronal en la zona límite isquémica y promover la proliferación celular desde la SVZ relativamente intacta en el cerebro isquémico. No obstante, aún no se ha determinado si las células que se originan en la SVZ migran y se integran al cerebro isquémico. En el SNC, el tratamiento eficaz del daño neural puede requerir la activación de mecanismos compensatorios endógenos que incluyan remodelado de los circuitos cerebrales, en donde aún no están definidos los mecanismos exactos. Mediante la dilucidación de los mecanismos subyacentes a la reducción de las deficiencias neurológicas inducidas por MSC así como la demostración de un beneficio terapéutico a largo plazo, las hMSC pueden proporcionar un tratamiento molecular y celular poderoso para la apoplejía y posiblemente una amplia gama de desórdenes neurologicos en los humanos.

Ejemplo 3 Tratamiento del daño neuronal: protocolos precllnicos. Al investigar la hipótesis de que las MSC promueven la recuperación funcional después de apoplejía, los solicitantes se enfrentan a diversas opciones para implementar protocolos terapéuticos celulares preclínicos. Entre las dudas que se tienen que resolver están determinar el momento y el lugar en los cuales implantar las células Dado el interés en el tratamiento restaurador, con la hipótesis de que el tamaño de la lesión isquémica no se altera por el tratamiento restaurador eficaz, los solicitantes inicialmente eligieron tratar animales un día o más después de la apolejía. 31,32Esta calendarización es clínicamente razonable. Si las deficiencias persisten durante 1 día después de la apoplejía, el suceso se clasifica como una apoplejía y no como un ataque isquémico transitorio. En el día 1, los pacientes tienden a estar estabilizados, y se puede determinar con facilidad la gravedad de las deficiencias neurológicas . La ruta más directa de colocación de las células en el cerebro es por medio de transplante quirúrgico. ¿Las células deben ser colocadas dentro de la lesión, en el tejido no isquémico sano o dentro de la zona límite? En base en las observaciones del cerebro, particularmente con la zona límite de una lesión que se encuentra en un estado en desarrollo, en los estudios iniciales los solicitantes decidieron colocar células de médula ósea completas, previamente no expuestas, dentro del te ido límite. — Por lo tanto, las células se extrajeron de ratas donadoras y se implantaron quirúrgica y estereotácticamente dentro de la zona límite de la lesión isquémica dentro del tejido subcortical y cortical. 31-33 La hipótesis principal que se va a probar es si estas células promueven recuperación funcional, de manera que se llevaron a cabo pruebas neurológicas y funcionales en los animales. Se realizó un examen neurológico completo (tabla 1) . Este examen, la calificación de gravedad neurológica modificada (mNSS) , proporciona un índice del estado motor, de reflejos sensoriales y muscular. 34-38 Además, los solicitantes utilizaron una prueba somatosensitiva la cual involucra el retiro de una etiqueta pegajosa de la planta de la pata — y la prueba de la varilla giratoria, — la cual mide el tiempo en que la rata persiste en acelerar un molino de rosca. Las mediciones se realizaron antes del ataque apopléjico y a los 7 y 14 días posteriores. — Se sacrificó a los animales en el día 14 y las células transplantadas se observaron en tejidos cerebrales mediante histología. Una pregunta resuelta con este análisis histológico es si las MSC se diferencian en células parenquimales de cerebro. Se realizaron experimentos similares en ratones sometidos a oclusión embólica de la arteria cerebral media y se trataron con el transplante intracerebral de células de médula ósea completas previamente no expuestas, de ratones donadores. Se realizaron mediciones funcionales 28 días después del transplante. Hubo una recuperación funcional notable y rápida después de colocación de estas células dentro del límite de la lesión isquémica. Un estudio similar del transplante dentro del parénquima de las SC dentro del cuerpo estriado de ratones en los cuales se indujo una lesión similar a la enfermedad de Parkinson mediante l-metil-4-fenil-1, 2 , 3, 6-tetrahidropiridina muestra una recuperación significativa de la función motora. — De igual manera, se implantaron las MSC adyacentes a una lesión de contusión de la médula espinal y es evidente el beneficio funcional significativo. Las variaciones de estos experimentos demostraron que la administración conjunta de MSC con factores tróficos, tales como el factor de crecimiento de nervios derivado de cerebro, promueve la recuperación funcional y el precultivo de estas células en factores de crecimiento facilitan el beneficio funcional así como el incremento en los números de células que expresan proteínas fenotípicas de células de cerebro. El aclimatado de las células en cultivo al ambiente del cerebro parece facilitar la transición in vi tro a in vivo. Muchas de las células de médula ósea tratadas experimentan apoptósis en el cerebro isquémico. Por lo tanto, los solicitantes administraron de manera conjunta con células de médula ósea Z-Val -Ala-DL-Asp-fluorometilcetona (Z-VAD) , un inhibidor de caspasa . Se confirmó la hipótesis: el número de células apoptóticas disminuye de manera significativa y se mide la función en la prueba de varilla giratoria lo que muestra un beneficio aumentado. Por lo tanto, incluso con tratamiento celular, el tratamiento adyuvante puede mejorar el resultado deseado. También fueron eficaces intervenciones terapéuticas similares en modelos animales de daño traumático al cerebro, daño a la médula espinal y enfermedad de Parkinson; en estos tres modelos hubo una reducción significativa en las deficiencias neurológicas con la implantación quirúrgica de las MSC. El beneficio terapéutico se volvió evidente en los siguientes días de transplante. No obstante, únicamente 1-3% de las células expresaron proteínas fenotípicas de células del parénquima. Aunque las proporciones de células que expresan tales proteínas se pueden incrementar con un cultivo previo, los números de células transplantadas son pequeños en comparación con la cantidad de tejido de cerebro hemisférico infartado después de la oclusión de la arteria cerebral media (aproximadamente 40%) . A los 14 días después de la oclusión, sobreviven aproximadamente 50,000 células (SE 18,000) ó 12-5% de las 400,000 transplantadas; un porcentaje pequeño expresan proteínas neurales - demasiado pequeño para sustituir el tejido infartado. El éxito de la implantación directa de estas células en el cerebro alienta experimentos para probar una vía de administración vascular, menos invasiva. Se sometió a ratas a oclusión de la arteria cerebral media y la arteria carótida del mismo lado al hemisferio con la lesión isquémica se cánula para inyección de las células. Se inyectaron aproximadamente 2 millones MSC 1 día después del ataque apopléjico. Se realizó una batería de pruebas neurológicas antes y después del tratamiento. El análisis histológico muestra lo plausible de que las células expresen proteínas fenotípicas de células de parénquima . No obstante, es evidente un beneficio funcional significativo. Los solicitantes también probaron el potencial de una ruta arterial de administración de MSC para el tratamiento de daño al cerebro traumático. Aunque las células entraron al cerebro cuando se administraron por medio de la ruta carótida, no hubo beneficio funcional, probablemente debido a que la ruta de administración requiere la ligación de la arteria carótida interna, lo que provoca una hipoperfusión impuesta que exacerba el daño cerebral traumático. Posteriormente los solicitantes investigaron lo factible de una vía de administración intravenosa clínicamente más relevante. Esta solución es claramente menos invasiva y tiene menos efectos adversos en comparación con la inyección carótidea o directa a tejido. Una ruta venosa también permite tratamientos celulares múltiples a largo plazo . Otros investigadores han demostrado que las células inyectadas por vía intravenosa encuentran su camino dentro del cerebro. No obstante, no ha habido estudios que muestren que, cuando se presenta un daño, tal como apoplejía o traumatismo, las células inyectadas intravenosamente migren selectivamente al sitio del daño isquémico y promuevan beneficio funcional. Por lo tanto, los solicitantes probaron esta hipótesis en ratas sometidas a oclusión de la arteria cerebral media. Un día o más después del ataque apopléjico, se inyectaron 1-3 millones de MSC en la vena de la cola. Los solicitantes llevaron a cabo una batería de medidas de resultado neurológico (tabla 1) . Los animales en los cuales se administraron 1 día después del ataque apopléjico se sacrificaron 14 días después de dicho ataque (figura 1) y aquellos tratados 7 días después del ataque apopléjico fueron sacrificados a los 35 días. Como en los experimentos previos, las células se marcaron con bromodesoxiuridina, un marcador de ADN recién sintetizado, para indicar la generación de células nuevas. Además, las MSC de ratas machos se inyectaron en animales hembra, y las células se identificaron mediante hibridación in si tu para el cromosoma Y. Los animales tratados mostraron una mejoría funcional significativa con el tratamiento (figura 2). También se utilizaron poblaciones de control de células para probar la especificidad del tipo de célula en promover la fusión mejorada. Las MSC muertas y los fibroblastos hepáticos y pulmonares (como células control que no son del mesénquima) no muestran beneficio terapéutico y no son mejores que un control de solución salina amortiguado con fosfato. Por lo tanto, la vía intravenosa proporciona una mejora funcional significativa después de apoplejía y traumatismo. Esto también es válido para un tratamiento iniciado 7 días después del ataque apopléjico, y el beneficio funcional es similar en ratas macho y hembra. En un esfuerzo por simular las condiciones de prueba en humanos de manera más cercana, se utilizaron células estromáticas de médula humana como la población de células donadoras, en vez de las MSC de rata, se extrajeron células humanas por punción de la cresta ilíaca posterior de donadores sanos, bajo anestesia local. Se separaron las células mononucleares de los extractos de hueso-médula (15-16 mi) . Se inyectaron por vía intravenosa en cada rata una dosis de 3 millones de MSC humanas, 1 día después de oclusión o después de daño traumático al cerebro. Se encontró una mejoría funcional fuerte después tanto del ataque apopléjico como del traumatismo. Las células humanas se obtienen fácilmente de donadores. Se pueden expandir fácilmente a cantidades muy grandes y están disponibles anticuerpos para separación por medio de citometría de flujo o por clasificación magnética de células. Las MSC humanas han sido utilizadas para tratar a pacientes con cáncer y con esclerosis múltiple. Por lo tanto, están disponibles datos de inocuidad en seres humanos . Los solicitantes no observaron ninguna indicación de inmunorrechazo (observación no publicada) . Los bazos de ratas no tratadas y los animales tratados con las MSC humanas se removieron y cultivaron con MSC humanas. La proliferación de las células de bazo a partir de ratas inyectadas con MSC humano incrementó después de reestimulación con estas células in vitro; no obstante, la respuesta proliferativa no difiere significativamente del que se obtiene en células de bazo para ratas no tratadas. Por lo tanto, aunque las MSC humanas pueden inducir una respuesta proliferativa primaria en linfocitos esplénicos de rata, la administración de estas células a ratas no sensibiliza a los linfocitos in vivo para una respuesta proliferativa secundaria in vi tro. Los linfocitos T están implicados como un inhibidor de las enfermedades de rechazo inverso (injerto versus huésped). Por lo tanto, la respuesta de los linfocitos T del hospedador de rata al injerto humano se mide con un ensayo de cromo 51 estándar para determinar el efecto lítico. Las MSC humanas no inducen una respuesta de los linfocitos T citotóxicos en las células de bazo de rata. Los solicitantes no pueden excluir la posibilidad de que los roedores y los seres humanos puedan responder de manera diferente al tratamiento con MSC. No obstante, otra posibilidad es que se pueda utilizar una célula universal, células halogeneicas y no células autólogas para tratar pacientes. Claramente, se requieren más datos en seres humanos para demostrar esta hipótesis. La aplicación clínica inicial considerará el transplante autólogo. Existen aún muchas dudas por resolver, que incluyen: ¿Cómo se dirigen estas células al sitio del daño y cómo proporcionan beneficios? ¿Cómo saben estas células a dónde dirigirse? ¿Qué mecanismos dirigen a estas células específicamente a los sitios del daño? No obstante, la duda más interesante son los efectos de las células en el cerebro y la manera en que estos efectos se traducen en un beneficio terapéutico . Direccionamiento de MSC a sitios de daño cerebral. ¿Hacia dónde se dirigen las células inyectadas intravenosamente? En primer lugar, las células inyectadas deben ser marcadas de manera que puedan ser identificadas en el tejido. Las MSC se pueden identificar por medio de reactividad de anticuerpo a diversas etiquetas. Las MSC se pueden etiquetar con bromodesoxiuridina ; se pueden inyectar células derivadas del género masculino en animales femeninos y el cromosoma Y identificado por hibridación in si tu; o las células humanas se pueden inyectar en ratas y se puede utilizar un anticuerpo para antígenos humanos. Las células inyectadas por vía intravenosa se han encontrado dentro de hígado, riñon, bazo y médula ósea. No obstante, las MSC más identificadas circundan a los microvasos en estos órganos, con algunas células localizadas en el parénquima . Se detectaron muy pocas células (1.5-3.0% de 3 millones inyectadas de MSC a los 14-35 días después del tratamiento) dentro del parénquima del tejido de cerebro. En el cerebro dañado, después tanto de apoplejía como de daño traumático, la gran mayoría de las células se dirigen a la región del daño. Por ejemplo, después de apoplejía, más de 80% de las células están dentro del hemisferio afectado, y la mayor parte de esta células se congregan en las áreas alrededor de la lesión. Muchas células también están presentes adyacentes o dentro de los vasos. ¿Cómo se dirigen las células al tejido dañado? y ¿Es importante la localización de estas células en la microvasculatura? . El direccionamiento de las MSC a los sitios de daño recuerda a la respuesta de las células inflamatorias a tejido dañado. Los neutrofilos y monocitos dirigidos a tejido dañado e inflamado por una secuencia orquestada de señalización vascular y molecular celular. Las moléculas de adhesión y sus receptores, expresados sobre las células inflamatorias y la vasculatura, guían a las células al tejido dañado y transportan estas células a través del límite vascular, pasando comúnmente a través de la barrera hematoencefálica . Este direccionamiento y las moléculas de adhesión funcionan de manera concertada con las quimiocinas. Por lo tanto, los solicitantes probaron si las moléculas de adhesión y los agentes quimioatrayentes operan y dirigen a las MSC al cerebro. Los solicitantes utilizaron una cámara Boyden, un ensayo para migración de células entre dos cámaras separadas por una membrana permeable. Se ajustaron las MSC a 5 x 105 células/ml en medio de migración (medio de Dulbecco modificado por Iscove con albúmina sérica bovina 5%) . Se agrega a cada pozo superior 50 µ? de suspensión de células. El número de MSC que migran a la superficie inferior se cuenta en cinco campos ópticos (área de 0.12 mm2) . Dado que el tejido del cerebro isquémico expresa proteínas quimiotácticas , tales como la proteína 1 quimioatrayente de monocitos y la proteína 1 inflamatoria de macrófagos, los solicitantes colocaron estas sustancias en la cámara inferior, para proporcionar un incremento dependiente de la dosis en la migración. Se encontraron respuestas similares cuando se colocaban en la cámara inferior moléculas de adhesión tal y como la molécula adhesión intercelular 1. La migración aumentada se bloquea eficazmente por adición de anticuerpos a las moléculas de adhesión o las quimiocinas a la cámara inferior. Cuando se coloca en las cámaras inferiores tejido de cerebro sometido a daño traumático o apoplejía, también se incrementa de manera significativa la migración de las células. Estos hallazgos proporcionan claridad respecto a la manera en que las células asumen una identidad a células inflamatorias y la manera en que "saben" que deben dirigirse de manera específica al tejido dañado. De esta manera, cualquier daño que tenga una respuesta inflamatoria, incluyendo procesos neurodegenerativos tales como enfermedad de Parkinson y esclerosis múltiple, puede guiar a las MSC a los sitios afectados. La dependencia de la guia en los grados de daño también proporciona una forma de titulación de la dosis "efectiva" de las células. Cuanto más grave sea el daño y la respuesta inflamatoria concomitante mayor será la cantidad de células dirigidas al sitio. Mecanismos de acción ¿Cómo afectan las células al cerebro y de qué manera promueven la recuperación funcional del daño y de los procesos patológicos?. La posibilidad de que las MSC beneficien al tejido cerebral al volverse células del cerebro es muy poco probable. Con inyección intravenosa y los números de células dentro del parénquima que constituyen algunos cientos de miles como máximo, existen muy pocas células presentes, incluso si se vuelven células de cerebro, como para sustituir un volumen de tejido de más de algunos milímetros cúbicos. El beneficio se detecta en muchos casos algunos días después del tratamiento. Como máximo, solo una porción pequeña de células expresan proteínas fenotípicas de células del parénquima. La expresión de estas proteínas no indica una diferenciación verdadera y una función neuronal o de células de la neuroglia. Después de tal período breve, incluso las células diferenciadas es muy poco probable que se integren verdaderamente en el te ido y formen conexiones complejas, que puedan mejorar la función. Por lo tanto, es muy poco probable que el reemplazo de tejido sea el mecanismo por el cual las MSC promueven sus efectos benéficos. Una explicación mucho más razonable para el beneficio es que las MSC inducen al tejido cerebral a activar efectos restauradores endógenos del cerebro. Las MSC a su vez pueden llevar a cabo reacciones que interactúen con el cerebro para activar los mecanismos de restauración y posiblemente de regeneración. Las MSC se comportan como fábricas moleculares pequeñas, que producen muchas citocinas y factores tróficos diferentes. Las MSC dentro del tejido cerebral o dentro de la microvasculatura del cerebro dañado es probable que expresen estos factores y el efecto de los factores tróficos en el tejido cerebral es el mecanismo que promueve rápida y eficazmente la restauración de la función. Los solicitantes han demostrado que las MSC producen factor de crecimiento de los hepatocitos, VEGF, factor de crecimiento de nervios (NGF) y factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF) , entre muchos otros factores tróficos y de crecimiento. Esta variedad de factores, y no el objetivo único de un factor de crecimiento particular, es lo que facilita el efecto benéfico. Una observación muy importante es que las SC cuando se cultivan bajo microambientes iónicos diferentes, responden a las claves ajustando la expresión de los factores de crecimiento. Este hallazgo sugiere que las células dentro de tejido dañado expresa factores tróficos y de crecimiento ajustados a las necesidades del tejido. Diferentes ambientes afectan la secreción de estos factores. Por lo tanto, el grado de daño a tej ido y la ruptura correspondiente del ambiente iónico dictarán la secreción de factores tróficos. Los solicitantes han probado esta hipótesis bajo varias condiciones experimentales. El cultivo de las MSC en tejidos extraídos de cerebros afectados por apoplejía o daño incrementan de manera significativa la secreción de factores tróficos. La respuesta de secreciones de las MSC al cerebro dañado difieren de acuerdo con el tiempo en que el tejido ha sido extraído del cerebro afectado. Estos experimentos tomaron una etapa adicional en las mediciones de expresión de factores de crecimiento en el cerebro tratado con MSC. Los solicitantes utilizaron una prueba de ELISA indirecta cuantitativa, la cual mide por métodos de inmunoetiquetado la expresión de factores de crecimiento en el cerebro. La expresión de factores tróficos es significativamente mayor en animales tratados con MSC en comparación con animales no tratados sometidos a apoplejía o traumatismo.

Dada la suposición de que MSC entra selectivamente en el cerebro dañado y secreta factores de crecimiento y tróficos en un circuito de retroalimentación de tejido ¿de qué manera estos factores alteran al cerebro para promover el beneficio terapéutico? La hipótesis operacional es que el beneficio terapéutico se induce por un conjunto de eventos relacionados con la plasticidad del cerebro; este proceso incluye, pero no se limita a angiogénesis , neurogénesis , sinaptogénes s , arborización dendrítica y reducción de apoptósis dentro de tejido estratégicamente importante en la zona límite del tejido. VEGF y el factor de crecimiento de fibroblastos básico son potentes agentes angiogénicos . Los solicitantes probaron el efecto de MSC o del sobrenadante de MSC en la inducción de angiogénesis. Se realizaron mediciones con un ensayo sobre células endoteliales de cerebro humano en las cuales los sobrenadantes de MSC se demostró que inducen la formación rápida de túbulos, que reflejan procesos estructurales y angiogénicos. El ensayo utilizado in vivo fue el ensayo de córnea avascular clásico. Una incisión quirúrgica forma un saco en la córnea y una oblea de colágeno recubierta con sobrenadante de MSC o las MSC mismas se insertan en el receptáculo. Las condiciones control consisten de la incisión quirúrgica y colocación de la oblea de colágeno sola o colocación de VEGF directamente dentro del receptáculo. Los solicitantes observaron una angiogénesis de rapidez robusta en las córneas tratadas con obleas cargadas con sobrenadante de MSC . Aunque la mayor parte de las células se colocaron directamente en la incisión corneal y conforme se alejaban del sitio se volvían más difusas, era evidente la angiogénesis. No existe angiogénesis en los animales control (figura 2) . La inducción de angiogénesis es más robusta con el sobrenadante de MSC que con el uso directo de VEGF, lo que sugiere que el sobrenadante es una fuente altamente eficaz de factores angiogénicos . Los estudios preliminares de inducción de angiogénesis por tratamiento con MSC de tejido de cerebro también sugiere formación aumentada de vasos sanguíneos nuevos (observación no publicada) . Aunque la inducción de angiogénesis no se traduce directamente en promoción de función. Los solicitantes han demostrado previamente que el tratamiento de apoplejía con VEGF, un día o más después del ataque apoplé ico mejora de manera significativa la recuperación funcional e incrementa la angiogénesis. La inducción de neurogénesis por medio de MSC también puede contribuir a la mejora funcional después del ataque apopléj ico . Un sitio importante de neurogénesis es el área adyacente a los ventrículos laterales - la zona subventricular . La neurogénesis también se encuentra en el bulbo olfativo y en el giro dentado del cerebro de roedor. El daño cerebral tal como apoplejía amplifica la producción de neuronas dentro de ciertas regiones del cerebro. La reparación funcional, particularmente a largo plazo después del ataque apopléjico se puede relacionar con la producción de células cerebrales nuevas. Los mecanismos que promueven la producción de estas células pueden mejorar la recuperación. Los solicitantes probaron los efectos del tratamiento de apoplejía con MSC para la inducción de neurogénesis. Se midió un incremento significativo en los números de células en la zona subventricular después de apoplejía. Muchas de estas células presentaban marcadores de células similares a las progenitoras recién formadas, como se muestra por la expresión de marcadores moleculares específicos tales como TUJ-1. El tejido cerebral dentro del hemisferio del mismo lado también muestra un incremento masivo de expresión del marcador de células precursoras, nestina, lo que indica la activación del tejido cerebral en un estado progenitor o de desarrollo. El análisis histológico del tejido cerebral transplantado con MSC también muestra la presencia de rosetas de neuroesfera dentro del tejido isquémico. Estas rosetas de células neuronales son similares a las que se encuentran en el cerebro en desarrollo. La migración de estos sistemas celulares al tejido cerebral puede ser guiado por proyecciones similares a astrocitos que surgen de la zona ventricular, lo que recuerda nuevamente los sucesos dentro del cerebro en desarrollo. De esta manera, la presencia de células de médula ósea parece promover la inducción y migración rápida de células nuevas desde una fuente primaria dentro de la zona ventricular y el plexo coroideo dentro del cerebro dañado. Estas células pueden contribuir a la reparación funcional, aunque no se ha probado directamente la relación de la inducción de neurogénesis y la migración de estas células para la restauración de la función. El crecimiento y los factores tróficos producidos por las MSC pueden afectar la sinaptogénesis e incrementar la arborización dendrítica en cerebro dañado e isquémico. El efecto directo del tratamiento de apoplejía con MSC sobre la arborización dendrítica requiere de experimentos adicionales. En experimentos preliminares, los solicitantes han demostrado una expresión aumentada de sinaptofisina, una proteína sináptica, dentro de la zona límite de la lesión isquémica, después de apoplejía. La gliosis puede ser un impedimento para el crecimiento excesivo de neuritas y arborización después de daño neural . Las proteínas del factor de crecimiento transformantes son de importancia principal en el sanado de heridas y se han implicado en la inhibición de cicatrizado en la piel y miocardio y la reparación de heridas sin cicatrices observada en el feto. Dado que MSC produce este factor de crecimiento, el beneficio terapéutico también puede derivarse de la reducción de cicatrización y la mejora subsecuente de sinaptogénesis y arborización dendrítica. Además de las citocinas y los factores de crecimiento y trófico, MSC expresa factores asociados con la formación de hueso, tales como el factor 2 específico de osteoblastos y la proteína 1 morfogenética de hueso. También expresa la molécula de adhesión celular neural neuropilina y los factores neurotróficos que incluyen NGF y BDNF . Estudios recientes han demostrado que las proteínas morfogenéticas óseas, dragado sónico, hormona paratiroidea y factor de crecimiento de fibroblastos ocho tiene papeles reguladores durante la diferenciación de células embriónicas, al modificar las vías mesodérmica y neuroectodérmica . La secreción por las MSC de esta cascada de citocina en cerebro dañado contribuye al beneficio funcional y garantiza una consideración cuidadosa y experimentos adicionales. El área alrededor de la lesión es altamente susceptible a muerte celular apoptótica. La apoptósis persiste durante meses después de apoplejía o traumatismo cerebral. Se desconocen los efectos de la recuperación. Los solicitantes han demostrado que el tratamiento de apoplejía y traumatismo cerebral con MSC reduce de manera significativa la apoptósis dentro de esta área. El efecto puede ser mediado por la producción de factores de crecimiento tales como NGF, dentro del cerebro dañado. Los solicitantes establecen la hipótesis de que la reducción selectiva de apoptosis dentro de esta región puede sostener el recableado cerebral . El mecanismo mediante el cual el remodelado del cerebro, la neurogénesis y los mecanismos neuroprotectores inducen una mejora funcional después del daño es incierto y un tópico importante de investigación. Cualquiera de estos eventos, los cuales son amplificados por tratamiento con MSC en realidad contribuyen a un resultado mejorado después de apoplejía y traumatismo y aún están bajo investigación. En este momento, los sucesos específicos que inducen restauramiento de la función neurológica no pueden ser aislados. No obstante, los solicitantes establecen la hipótesis de que el procedimiento que promueve la restauración de la función no es una sola modificación de tejido (por ejemplo neurogénesis) sino que muy probablemente sea un conjunto entretejido de sucesos, angiogénesis , neurogénesis, sinaptogénesis y reducciones de límite de cicatrizado y apoptosis los cuales contribuyen de una manera acoplada, si no sinergística para mejorar la función. Aunque la prueba de esta hipótesis y la identificación de los factores específicos que contribuyen a la función neurológica mejorada aún está en desarrollo, los solicitantes tienen capacidad limitada para incrementar selectivamente la apoptosis dentro de la zona límite, para reducir la angiogénesis sin afectar la neurogénesis . El tejido cerebral dañado en muchas maneras recapitula a ontogenia. Después de apoplejía o daño, el tejido cerebral se revierte a una etapa anterior del desarrollo y por lo tanto se vuelve altamente sensible a la estimulación por citocinas y factores tróficos y de crecimiento que invadan a las MSC. Las MSC probablemente estimulan dentro del tejido cerebral cuasi en desarrollo cambios estructurales y regenerativos que incluyen angiogénesis, vasculogénesis , neurogénesis y arborización dendrítica. El estado primitivo del tejido, el cual es altamente sensible a varios estimulantes y factores de crecimiento, en vez del estado primitivo de las MSC, alberga principalmente una respuesta terapéutica. Las MSC simplemente pueden proporcionar los recursos requeridos por el tejido cerebral ontogénico para estimular el remodelado cerebral . Los solicitantes no excluyen la posibilidad de que otras células o una secuencia orquestada de infusiones tituladas de citocinas y factores de crecimiento puedan estimular a las células del cerebro dañadas para que respondan y restauren su función. De manera similar, los solicitantes no pueden excluir la posibilidad de que una subpoblación de las MSC sean similares a las células precursoras o similares a las progenitoras y puedan reaccionar de manera sinergística con te ido dañado. No obstante, los solicitantes consideran altamente probable que las MSC dentro del cerebro no reemplazan tejido, y no se difierencian en neuronas funcionales y astrocitos de soporte, por lo menos en una escala de tiempo en la cual los solicitantes observaron beneficio funcional . El beneficio primario se obtiene por activación del tejido dañado para remodelado y para compensar el daño. La figura 3 ilustra la presente compresión del procedimiento mediante el cual las MSC pueden ser cosechadas y utilizadas para tratar tejido cerebral dañado. Transplante a pacientes Claramente, deben resolverse los problemas de seguridad antes de que se pueda utilizar esta forma de terapia con células en pacientes con apoplejía. Aunque el transplante de médula ósea es un procedimiento común en el tratamiento de cáncer y sea utilizado como un tratamiento adyuvante en esclerosis múltiple, se garantizan los estudios fase I en cuanto a seguridad en apoplejía. Hasta la fecha, en estudios en casi 2,000 animales con apoplejía, los solicitantes no han detectado ningún efecto adverso de la terapia o indicación de formación de tumores. ¿Los pacientes deben ser tratados con sus propias células, con células con HLA coincidente o con una población de donadores universales? Los datos preclínicos sugieren hasta ahora que es posible el tratamiento con células donadoras. No obstante, deben realizarse estudios preclínicos y clínicos fase I para resolver esta cuestión.

Los estudios preclínicos y básicos descritos en esta revisión indican que el tratamiento de apoplejía con MSC puede proporcionar un tratamiento restaurador viable y altamente eficaz. Por lo tanto se garantizan estudios clínicos. A través de esta solicitud, diversas publicaciones, que incluyen patentes de los Estados Unidos, han sido mencionadas por autor y año así como por número de patente. Las citas completas de las publicaciones se incluyen en lo siguiente. Las descripciones de estas publicaciones y patentes en su totalidad por lo tanto se incorporan en la presente como referencia en esta solicitud con el fin de describir de manera más completa el estado de la técnica a la que pertenece la invención. La invención se ha descrito de una manera ilustrativa y debe entenderse que la terminología que se ha utilizado se considera que es naturaleza de palabras de descripción en vez de una limitación. Evidentemente, muchas modificaciones y variaciones de la presente invención son posibles en base en las enseñanzas anteriores. Por lo tanto, debe entenderse que dentro del alcance de la invención descrita, la invención se puede llevar a la práctica de una manera diferente a la descrita específicamente .

Tabla . Diferenciación de las hMSC inducidas por extractos de tejido TBI Las hMSC tratadas con extractos de tejido TBI se comparan con DMEM bloqueado control con sustitución de suero bloqueado y con extractos de cerebro normales. *P<0.01. REFERENCIAS Burke and Olson, "Preparation of Clone Librarles in Yeast Artificial-Chromosome Vectors" in Methods in Enzymology, Vol. 194, "Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology", eds . C. Guthrie and G. Fink, Academic Press, Inc., Capitulo 17, páginas 251-270 (1991). Capecchi, "Altering the genome by homologous recombination" Science 244:1288-1292 (1989). Davies et al., "Targeted alterations in yeast artificial chromosomes for inter-species gene transfer", Nucleic Acids Research, Vol. 20, No. 11, páginas 2693-2698 (1992) . Dickinson et al., "High frequency gene targeting using insertional vectors" , Human Molecular Genetics Vol . 2, No. 8, páginas 1299-1302 (1993) . Duff and Lincoln, "Insertion of a pathogenic mutation into a yeast artificial chromosome containing the human APP gene and expression in ES cells", Research Advanced in Alzheimer's Disease and Related Disorders, 1995. Huxley et al., "The human HPRT gene on a yeast artificial chromosome is functional when transferred to mouse cells by cell fusión", Genomics, 9:742-750 (1991) . Jakobovits et al., "Germ-line transmission and expression of a human-derived yeast artificial chromosome", Nature , Vol . 362, páginas 255-261 (1993) . Lamb et al, " Introduction and expression of the 400 kilobase precursor amyloid protein gene in transgenic mice", Nature Genetics, Vol. 5, páginas 22-29 (1993) . Pearson and Choi, Expression of the human b-amyloid precursor protein gene from a yeast artificial chromosome in transgenic mice. Proc . Nati. Acad. Sci . USA, 1993. 90:10578-82. Rothstein, "Targeting, disruption, replacement, and alíele rescue: integrative DNA transíormation in yeast" in Methods in Enzymology, Vol. 194, "Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology" , eds . C. Guthrie and G. Fink, Academic Press, Inc., Capítulo 19, páginas 281-301 (1991) . Schedl et al, "A yeast artificial chromosome covering the tyrosinase gene confers copy number-dependent expression in transgenic mice" , Nature, Vol . 362, páginas 258-261 (1993) . Strauss et al , "Germ line transmission of a yeast artificial chromosome spanning the murine a, (1) collagen locus", Science, Vol. 259, páginas 1904-1907 (1993). Gilboa, E , Eglitis, MA, Kantoff, PW, Anderson, WF : Transfer and expression of cloned genes using retroviral vectors. BioTechniques 4 (6) : 504-512 , 1986. Cregg JM, Vedvick TS, Raschke WC : Recent Advances in the Expression of Foreign Genes in Pichia pastoris, Bio/Technology 11:905-910, 1993 Culver, 1998. Site-Directed recombina ion for repair of mutations in the human ADA gene. (Abstract) Antisense DNA & RNA based therapeutics , Febrero, 1998, Coronado, CA. Huston et al, 1991 "Protein engineering of single-chain Fv analogs and fusión proteins" in Methods in Enzymology (JJ Langone, ed. ; Academic Press, New York, NY) 203:46-88. Johnson and Bird, 1991 "Construction of single-chain Fvb derivatives of monoclonal antibodies and their production in Escherichia coli in Methods in Enzymology (JJ Langone, ed. ; Academic Press, New York, NY) 203:88-99. Mernaugh and Mernaugh, 1995 "An overview of phage-displayed recombinant antibodies" in Molecular Methods In Plant Pathology (RP Singh and US Singh, eds . ; CRC Press Inc., Boca Ratón, FL) páginas 359-365. AY H, AY 1, KOROSHETZ WJ, et .al. (1999) Potential usefulness of basic fibroblast growth factor as a treatment for stroke. Cerebrovasc Dis 9: 131-135. AZIZI SA, STORES 0, AUGELLI BJ, et al.. (1998) Engraftment and migration of human bone marrow stromal cells implanted in the brains of albino rats-similarities to astrocyte grafts. Proc Nati Acad Sci USA 95:3908-3913. BEREZOVSKAYA 0, MAYSINGER D, and FEDOROFF S (1995) The hematopoietic cytokine, colony-stimulating factor 1, is also a growth factor in the CNS : congenital absence of CSF-1 inmice results in abnormal microglial response and increased neuron vulnerability to injury. Int J Dev Neurosci 13:285-299. BJORKLUND A, and LINDVALL 0 (2000) Cell replacement therapies for central nervous system disorders. Nat Neurosci 3 : 537-54 . BULLOCK MR, LYETH BG, and MUIZELAAR JP (1999) Current status of neuroprotection triáis for traumatic brain injury: lessons from animal models and clinical studies. Neurosurgery 45:207-217; discussion 217-220. CANEVA L, SOLIGO D, CATTORETTI G, et al. (1995) Immuno-electron microscopy characterization of human bone marrow stromal cells with anti-NGFR antibodies. Blood Cells Mol Dis 21 :73-85.

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Claims

REIVINDICACIONES
Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Una sustancia terapéutica para uso en inducción de angiogenesis y vasculogénesis , la sustancia terapéutica, caracterizada porque comprende factores inductores de angiogénesis y vasculogenesis aislados de células precursoras junto con sustancias terapéuticas celulares farmacéuticamente aceptables, las sustancias terapéuticas para inducir angiogenesis y vasculogénesis. 2. La sustancia terapéutica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque los factores inductores de angiogénesis y vasculogénesis se seleccionan del grupo que consiste esencialmente de factores angiogénicos, tróficos y de crecimiento.
3. La sustancia terapéutica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la sustancia terapéutica celular es una célula precursora que se selecciona del grupo que consiste esencialmente de células precursoras del mesénquima, células estromáticas y precursores de las mismas, fibroblastos, reticulocitos , adipocitos y células endoteliales .
4. Un método para amplificar la producción de factores inductores de angiogenesis y vasculogénesis secretados por células estromáticas , caracterizado porque se expone y cocultivan células estromáticas con un compuesto inductor de diferenciación para incrementar la producción de la angiogénesis y factores inductores de vasculogénesis.
5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el método incluye exponer y cocultivar células estromáticas con un compuesto inductor de diferenciación para incrementar la producciónn de factores inductores de angiogénesis y vasculogénesis, el compuesto inductor de diferenciación se selecciona del grupo que consiste esencialmente de extracto de cerebro y calcio.
6. Los factores inductores de angiogénesis y vasculogénesis aislados y purificados de células precursoras, caracterizados porque son para usarse como un tratamiento.
7. Los factores inductores de angiogénesis y vasculogénesis, de conformidad con la reivindicación 6, caracterizados porque los factores inductores de angiogénesis y vasculogénesis inducen angiogénesis y vasculogénesis cuando se administran a un paciente en necesidad de tal tratamiento.
8. Los factores inductores de angiogénesis y vasculogénesis, de conformidad con la reivindicación 6, caracterizados porque los factores inductores de angiogénesis y vasculogénesis son factores secretados por células precursoras cuando se exponen y se cocultivan con un inductor de diferenciación para incrementar la producción de los factores deseados .
9. Los factores inductores de angiogénesis y vasculogénesis de conformidad con la reivindicación 8, caracterizados porque el compuesto inductor de diferenciación se selecciona del grupo que consiste esencialmente de extracto de cerebro y calcio.
10. Los factores inductores de angiogénesis y vasculogénesis de conformidad con la reivindicación 9, caracterizados porque el extracto de cerebro se selecciona del grupo que consiste esencialmente de células de cerebro, células que se obtienen del cerebro y sobrenadante de células estromales cultivadas con un medio.
11. El procedimiento para obtener los factores inductores de angiogénesis y vasculogénesis como se establece en la reivindicación 6, caracterizado porque comprende las etapas de: aislar y purificar células precursoras del mesénquima humano, a partir de tejido antes de diferenciación; y expandir en cultivo las células precursoras del mesénquima para producir una herramienta para tratamiento neurológico y musculoesquelético .
12. Células precursoras del mesénquima aisladas y expandidas en cultivo, bajo la influencia de un compuesto nductor de diferenciación, las células precursoras, estas son caracterizadas porque son capaces de diferenciarse y producir un fenotipo de células deseado necesario para reparación de tejido.
13. Las células precursoras de conformidad con la reivindicación 12, caracterizadas porque el compuesto inductor de diferenciación se selecciona del grupo que consiste esencialmente de extracto de cerebro y calcio.
14. Las células precursoras de conformidad con la reivindicación 13, caracterizadas porque el extracto de cerebro se selecciona del grupo que consiste esencialmente de células de cerebro, células que se obtienen del cerebro y sobrenadante de células estromales cultivadas con un medio.
15. Las células precursoras de conformidad con la reivindicación 12, caracterizadas porque se utilizan en la redirección de la capacidad de reparación de las células.
16. Un tratamiento para inducir angiogénesis y vasculogénesis en un paciente en necesidad del tratamiento, caracterizado porque se administra una sustancia terapéutica que comprende factores inductores de angiogénesis y vasculogénesis aislados de las células precursoras junto con una sustancia terapéutica celular farmacéuticamente aceptable, la sustancia terapéutica induce angiogénesis y vasculogénesis en el paciente.
17. El tratamiento de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la etapa de administración incluye administrar la sustancia terapéutic de una manera que se selecciona del grupo que consiste esencialmente de las vías subcutánea, parenteral, intravenosa, intraarterial , intramuscular, intraperitoneal , intranasal, intratecal y por infusión.
18. Un método para inducir reparación de tejido, caracterizado porque administra una sustancia terapéutica que comprende factores inductores de angiogénesis y vasculogénesis aislados de células precursoras junto con una sustancia terapéutica celular farmacéuticamente aceptable, la sustancia terapéutica induce reparación de tejido.
19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la etapa de administración incluye administrar la sustancia terapéutica de una manera que se selecciona del grupo que consiste esencialmente de las técnicas subcutánea, parenteral, intravenosa, intraarterial, intramuscular, intraperitoneal, intranasal, intratecal y por infusión.
20. Una sustancia terapéutica para uso en aumento de la función celular, la sustancia terapéutica, caracterizada porque comprende factores que aumentan la función celular aislados de células precursoras, junto con una sustancia terapéutica celular farmacéuticamente aceptable, la sustancia terapéutica aumenta la función celular.