JP6339737B2 - 神経幹細胞とIL12p40を使用して神経再生を促進するための組成物 - Google Patents
神経幹細胞とIL12p40を使用して神経再生を促進するための組成物 Download PDFInfo
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Description
本出願は、2014年8月15日に出願された米国仮特許出願第62/037,612号の優先権を主張するものであり、その開示は参照によりその全内容が本明細書に援用される。
1.発明の分野
本出願は、神経幹細胞およびIL12p40を用いて神経再生を促進するための組成物および方法に関する。
重篤な末梢神経損傷は、運動および感覚ニューロンの活動の低下、ならびに神経線維および周囲組織の変性を引き起こす。損傷を受けた末梢神経の再生は複合的なプロセスであり、ワーラー変性(Wallerian degeneration)(WD)が最も基本的な反応であり、シュワン細胞が重要な役割を果たす(Ren Z.et al.,Reviews in the Neurosciences 2012,23:135−143)。
WDは、生き残っているニューロンの再生のための微小環境を作り出し、機能回復に利益をもたらす(Navarro X.et al.,Progress in Neurobiology 2007,82:163−201)。WDの制御には、シュワン細胞の存在、神経栄養因子の分泌、および神経細胞の足場として働く特殊な細胞外マトリックスが関わる(Gaudet A.D.et al.,Journal of Neuroinflammation 2011,8:110;Kehoe S.et al.,Injury 2012,43:553−572)。
本出願は、神経幹細胞と、少なくとも1つのサブユニットとしてのIL12p40により構築される神経栄養因子とを含む、神経再生のための組成物を提供する。
本出願では、神経再生のための組成物は、NSCと、少なくとも1つのサブユニットとしてのIL12p40により構築される神経栄養因子とを含む。いくつかの実施形態では、IL12p40は、NCBI受託番号:NM_008352(マウス)または1F42_A(ヒト)として示されるタンパク質配列を有する。
IL12p40の配列
IL12p40のタンパク質配列はNCBI受託番号:NM_008352(マウス)または1F42_A(ヒト)として示され、これらは米国国立生物工学情報センターのウェブサイト(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)から入手可能である。
マウスNSCの単離および細胞培養は2つの従前の刊行物(Hsu Y.C.et al.,Developmental Dynamics 2009,238:302−314;Lee D.C.et al.,Molecular and Cellular Neurosciences 2009,41:348−363;これら2つの刊行物は参照によりその全内容が本明細書に援用される)に記載されている通りに行った。
本出願では、全ての動物試験手順は倫理指針に従い、所内動物管理使用委員会(Institutional Animal Care and Use Committee)(IACUC)によって承認された(プロトコールNo.NHRI−IACUC−101067A)。FVBマウス(8〜10週齢)を動物試験に使用し、米国国立衛生研究所(National Health Research Institutes)(NHRI)動物センターで維持した。
術前に、マウスを5%イソフルラン(ハロ炭素)空気吸入により麻酔し、手術中、2%イソフルラン空気吸入により麻酔を維持した。坐骨神経損傷術では、3mmのマウス坐骨神経セグメントをマイクロシザーズで切り出した。神経コンジットの外科的移植では、従前に記載されているように(Hsu S.H. et al., Artif Organs 2009, 33:26−35;参照によりその全内容が本明細書に援用される)、ポリ(L−乳酸)(PLA)コンジットを使用した。
歩行軌跡分析は、術後毎週、Treadmill/TreadScanシステム(CleverSys)を用いて行い、坐骨神経機能指数(SFI)として表した。SFIの式は次の通りである。
タンパク質サンプルを移植されたコンジットから、1×プロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche)を含有する1×RIPAバッファー[50mM HEPES、pH7.3、150mM NaCl、2mM EDTA、20mM β−グリセロホスフェート、0.1mM Na3VO4、1mM NaF、0.5mM DTT、および0.5%NP−40]を用いて抽出した。100μgのタンパク質サンプルを、製造者のプロトコールに従ったマウス血管新生タンパク質抗体アレイ(RayBiotech)分析で使用した。タンパク質レベルは化学発光法を用いて検出した。
1×HyQTase(Hyclone)を用い、ニューロスフェアから単細胞を解離させた。2×103細胞を、誘導因子を添加したまたは添加しない神経分化培地(2%FBSを含有するDMEM/F12)とともにポリ−D−リシン(BD Bioscience)コーティングチャンバースライドに播種した。CNTF+T3群では、神経分化培地に50ng/ml CNTFおよび10ng/ml T3を添加した。hIL12およびmIL12群では、神経分化培地にそれぞれ100ng/mlヒトIL12p80およびマウスIL12p80を添加した。
CNTF+T3+hIL12群では、神経分化培地に50ng/ml CNTF、10ng/ml T3および100ng/mlヒトIL12p80を添加した。CNTF+T3+mIL12群では、神経分化培地に50ng/ml CNTF、10ng/ml T3および100ng/mlマウスIL12p80を添加した。CNTF、T3、およびヒトIL12p80はPeproTechから購入した。培養培地を3日毎に交換した。
細胞をチャンバースライド(Nunc、ネーパーヴィル、IL、USA)上、37℃、5%CO2で増殖させた。免疫蛍光染色では、細胞をPBSで洗浄し、PBS中、4%(v/v)パラホルムアルデヒド(PFA;Electron Microscopy Sciences)で室温にて15分間固定した。次に、細胞をPBS中0.1%(v/v)トリトンX−100で室温にて15分間、透過処理を行った。次いで、細胞をブロッキング溶液(1×PBS中1%BSA)で室温にて1時間ブロッキングした後、特異的一次抗体で室温にて1時間インキュベーションを行った。
本出願では、分化能は、ガラクトセレブロシドに対するマウスモノクローナル抗体(Galc、1:1000、Millipore)、乏突起グリア細胞特異的タンパク質に対するウサギポリクローナル抗体(OSP、1:1000、Abcam)、およびミエリンタンパク質ゼロに対するニワトリポリクローナル抗体(PZO、1:1000、GeneTex)による免疫蛍光染色を使用することによって確認した。次に、これらの細胞をローダミン結合二次抗体(Millipore、ビルリカ、MA、USA)とともに室温で1時間インキュベートした。全ての切片を、2−(4−アミジノフェニル)−6−インドールカルバミジン二塩酸塩(DAPI)(Molecular Probes)で核染色し、蛍光顕微鏡(Olympus、東京、日本)下で観察した。Galc/DAPI、OSP/DAPIおよびPZO/DAPI二重陽性細胞を計数し、対照群に対して正規化した。
ニューロスフェアから単離し誘導因子を含むまたは含まない神経分化培地(表1)で7日間培養した分化細胞において、免疫ブロット法により対応するタンパク質レベルを検出するために、グリア線維性酸性タンパク質に対するウサギポリクローナル抗体(GFAP、1:1000;Abcam)、乏突起グリア細胞特異的タンパク質に対するウサギポリクローナル抗体(OSP、1:4000;Abcam)、ミエリンタンパク質ゼロに対するニワトリポリクローナル抗体(PZO、1:4000;GeneTex)、およびα−チューブリンに対するウサギポリクローナル抗体(α−チューブリン、1:8000希釈;GeneTex)を使用した。分化細胞からのタンパク質サンプルは、1×プロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche)を添加した1×RIPA溶解バッファー(Millipore、ビルリカ、MA、USA)により採取した。
複合筋活動電位は、BIOPAC MP36およびBIOPAC BSL 4.0ソフトウエア(BIOPAC system Inc.)で記録および分析した。ステンレス鋼電極は直径0.22mmであった。刺激電極は坐骨切痕に配置し、記録電極は脾腹筋(坐骨切痕からおよそ2cm)に配置した。刺激電圧は6ボルトであり、刺激期間は0.1ミリ秒であり、取得長は200ミリ秒であった。距離はノギスで測定し、皮膚温度は25℃の一定温度に維持した室内で36℃に維持した。
移植したコンジットを術後第8週に回収した。簡単に述べれば、移植したコンジットを4℃にて一晩、4%PFAで固定した。固定したサンプルを1×PBS中30%スクロースを用い、4℃で一晩脱水した。サンプルをTissue−Tek O.C.T.(Sakura、オランダ)中に包埋した後、液体窒素中で凍結させ、−80℃で保存した。
PBS洗浄の後、サンプルを各二次抗体とともに室温で1時間インキュベートした。全てのサンプルをDAPI(1:5000)で室温にて3分間核染色し、FluorSave試薬(Merck)を用いてマウントした。蛍光顕微鏡(Olympus)および共焦点顕微鏡(Leica)を用いて再生した組織の全画像データを観察および収集した。
データは平均±平均の標準誤差(SEM)として表した。2群を比較するためにスチューデントのt検定を用い、複数の群を比較するためには一元配置ANOVAを用いた。p<0.05の場合に統計的有意と見なした。
NSCと神経コンジットを移植すると、マウスにおける坐骨神経損傷の機能回復がコンジット単独の場合よりも改善する。
左坐骨神経(3mm)の切断後、全てのマウスが左後肢の運動機能を失い、足先が萎縮した引きずり歩行の表現型を示した。この試験で、本発明者らは、損傷を受けた坐骨神経を修復するためにNSCとコンジットを移植した。機能回復は、再生期間中、非侵襲的方法である歩行軌跡分析およびロータロッドテストを用いて評価した。坐骨神経機能指数(SFI)は、足取り分析と歩行中のある足跡と別の足跡の時間的および空間的関係とを組み合わせた歩行軌跡分析からのデータのスコアを計算したものである。SFIは0〜−100の尺度で、0は正常な歩行機能に相当し、−100は完全な機能喪失を意味する。
軌跡分析では、偽手術対照マウスは、坐骨神経の実際の損傷が無いこと以外は同じ手術手順を受けたマウスとして定義した。これらのマウスは、術前のSFIスコアと比べて、術後第1週から第8週までSFIスコアに明らかな差を示さなかった(図1A、偽手術対照)。NSCとコンジット(図1A、コンジット+NSC群)またはコンジット単独(図1A、コンジット単独群)の移植では、SFIスコアは、術後第1週に、これらの2群間に有意差はないことを示した(−73.2±2.5と−77.0±3.9)。術後第2週から始まり、コンジット+NSC群は、コンジット単独群よりも高いSFIスコアを示した(p<0.01)。コンジット単独群よりもコンジット+NSC群におけるこの機能的向上は第8週まで続いた(図1A)。
NSCは、シュワン細胞を含む3種類の神経外胚葉系譜の全てに分化する能力を保持し、また、神経再生のための栄養因子も分泌または動員し得る(Ren Z.et al.,Reviews in the Neurosciences 2012,23:135−143)。従って、NSCを介した神経再生に関与した因子を特定するために、マウス抗体アレイを用いて、コンジット単独群とコンジット+NSC群の間のタンパク質発現レベルを検討した。NSCとともにまたは伴わずに移植した神経コンジットから抽出したタンパク質溶解液を術後第4週にタンパク質抗体アレイ向けに採取した。抗体アレイの定量データによると、コンジット+NSC群から採取した細胞抽出液中のIL12p40の発現はコンジット単独群の1.89倍であり、さらに、コンジット+NSC群のIL12p35発現はコンジット単独群と同等(1.04倍)であった(図2、IL12p40およびIL12p35)。IL12p40はIL12p70のサブユニットの1つであり、全IL12p40サブユニットの20%〜40%がホモ二量体型(IL12p80)として分泌される可能性があり、このホモ二量体型は生物学的機能の誘導においてIL12p40単量体の25〜50倍の活性であった(Heinzel F.P.et al.,Journal of Immunology 1997,158:4381−4388;Gillessen S.et al.,European Journal of Immunology 1995,25:200−206;Jacobson N.G.et al.,Journal of Experimental Medicine 1995,181:1755−1762)。これらの抗体アレイデータでは、コンジット+NSC群はIL12p40の発現レベルを増大させたがIL12p35はそうではなく、このことは、IL12p40の生理活性型であるIL12p80は神経再生に関与する因子であり得ることを示した。
IL12p40はIL12受容体β1と結合し、Stat3のリン酸化とStat3下流シグナル伝達の活性化をもたらす(Heinzel F.P.et al.,Journal of Immunology 1997,158:4381−4388;Gillessen S.et al.,European Journal of Immunology 1995,25:200−206;Jacobson N.G.et al.,Journal of Experimental Medicine 1995,181:1755−1762)。従前の研究は、Stat3の活性化は神経前駆細胞の星状グリア細胞系譜への分化を誘導することを示している(Wang B.et al.,PLoS One 2008,3:e1856)。これらの結果は、Stat3下流シグナル伝達の活性化および神経再生への関与におけるIL12p80の役割を暗示している。
神経再生におけるIL12p80の機能を調べるために、以下の条件で処置した坐骨神経損傷マウスを比較した:コンジット単独群、コンジットとNSC(コンジット+NSC群)、およびコンジットとNSCとマウスIL12p80(コンジット+NSC+mIL12群)。移植後第8週に、歩行軌跡分析およびロータロッドテストにより機能評価を行った。コンジット+NSC群およびコンジット+NSC+mIL12群のマウスは、コンジット単独群よりも有意に高いSFIスコアを示した(図3A)。ロータロッドテストでは、コンジット+NSC群およびコンジット+NSC+mIL12群のマウスは、コンジット単独群よりも良好な歩行およびバランス能を示した(図3B)。
さらに、これらのデータは、歩行軌跡およびロータロッドの両分析の機能評価において、コンジット+NSC+mIL12群がIL12p80無しの群(p<0.05)よりも有意な結果(p<0.01)を示したことを実証した(図3Aおよび3B)。しかしながら、このIL12p80の付加的投与の効果(コンジット+NSC+mIL12群)はわずかなものであったので、IL12p80無しの場合(コンジット+NSC群)から神経修復能の補助を識別することはできなかった。従って、神経修復におけるIL12p80の効果を、組織学的切片評価(図4)および神経伝導試験(図5)によって実証する。
図4A、4Bおよび4Cでは、「P」および「D」は残存神経の断端を示す(「P」は移植したコンジットの近位端から1.0mmであり、「D」は「P」から3.0mm遠位である)。H&E染色では、コンジット+NSC群(図4B)およびコンジット+NSC+mIL12群(図4C)は、コンジット単独群(図4A)に比べて、再生した軸策の完成度に有意な促進を示した。神経再生の状態を、抗神経フィラメント200抗体(神経線維のマーカーであるNF200)および抗タンパク質ゼロ抗体(有髄シュワン細胞のマーカーであるPZO)を用いた免疫組織化学染色を使用することによってさらに確認する。免疫組織化学染色結果は、コンジット内での有髄シュワン細胞(PZO陽性細胞)と再生した神経の神経線維(NF200陽性細胞)の連関(それぞれ図4A、4B、および4Cの点線領域)がコンジット+NSC群(図4E)およびコンジット+NSC+mIL12群(図4F)では見られたが、コンジット単独群(図4D)では見られなかったことを示した。さらに、再生神経の直径を、移植した神経コンジットの近位部位、中央部位、および遠位部位においてH&Eにより染色された一連のサンプル切片を再構成することにより測定する:近位部位(コンジットの近位端から1.0mm)、遠位部位(近位部位から3.0mm)、および中央部位(近位部位と遠位部位の間の中央)。近位部位と遠位部位において、再生神経の直径は、3群の間で有意差が無いことを示した(それぞれ、近位部位では262±44μm、284±42μm、および302±97μm、遠位部位では279±56μm、298±75μm、および322±123μm)。これに対して、コンジット+NSC群(189±18μm)およびコンジット+NSC+mIL12群(295±47μm)の中央部位の直径は、コンジット単独群(65±21μm)のそれぞれ2.9倍および4.5倍の厚さであった。注目すべきは、再生坐骨神経の中央部位では、IL12p80の添加がIL12p80を含まない群の1.6倍神経直径を増大させたことである(図4G)。
3群の再生の概略図を図4Hに示す。神経伝導は、坐骨神経を電気的に刺激し、個々の筋肉線維の活動電位からの電圧応答の総和である複合筋活動電位(CMAP)を記録することにより測定される(Mallik A.et al.,J Neurol Neurosurg Psychiatry 2005,76 Suppl 2:ii23−31)。本出願では、損傷肢および反対側の正常肢のCMAPを測定した。回復パーセンテージは、損傷肢のCMAPを反対側の正常肢のCMAPで正規化したものとして計算した(図5)。コンジット+NSC+mIL12群は、コンジット+NSCまたはコンジット単独のいずれよりも良好な回復状態を示した(それぞれ17.7±4.3%、8.5±2.1%、および6.6±0.2%)。さらに、コンジット+NSC+mIL12群は、コンジット単独群よりも低い脾腹筋萎縮を示した(損傷肢/正常肢はそれぞれ0.39±0.02および0.26±0.07であった、p<0.01)。これらのデータは、NSCとコンジットの移植が機能回復および神経再生を促進したことを実証した。重要なこととして、IL12p80の付加的投与は、SFIおよびロータロッドの両分析の機能評価、神経伝導の改善、ならびに新たに再生した神経の直径の増大に統計的に有意な結果を示した。
次に、本出願は、マウスNSCにおいて乏突起グリア細胞およびシュワン細胞分化の誘導におけるIL12p80の能力を検討した。ニューロスフェアから解離させた細胞を、分化対照培地としての2%FBSを添加したDMEM/F12(対照群)、および乏突起グリア細胞分化培地(CNTF+T3群)でそれぞれ培養した(Hsu Y.C.et al.,Developmental Dynamics 2009,238:302−314;Lee D.C.et al,Molecular and Cellular Neurosciences 2009,41:348−363)。
乏突起グリア細胞およびシュワン細胞分化の誘発におけるIL12p80の能力を調べるために、100ng/mlヒトIL12p80(hIL12p80)またはマウスIL12p80(mIL12p80)を対照群またはCNTF+T3群に添加し、hIL12群、mIL12群、CNTF+T3+hIL12群、およびCNTF+T3+mIL12群と呼称した。分化細胞は、特異的細胞マーカー:ガラクトセレブロシド(Galc;乏突起グリア細胞)、乏突起グリア細胞特異的タンパク質(OSP;乏突起グリア細胞)、およびミエリンタンパク質ゼロ(PZO;有髄シュワン細胞)を認識する一次抗体ならびに蛍光色素結合二次抗体による免疫蛍光染色を用いて確認した(図6A)。マーカー陽性細胞のパーセンテージを定量化し、図6Bにまとめる。
細胞形態および免疫蛍光染色の結果は、IL12p80がマウスNSCにおいて乏突起グリア細胞または有髄シュワン細胞分化を誘導するためにCNTF+T3に取って代わり得ることを示した。細胞分化および成熟状態は、それぞれグリア線維性酸性タンパク質(GFAP、星状グリアマーカー)、OSP、およびPZOに対する系譜特異的抗体を用いたウエスタンブロット法により確認される(図7A)。定量化結果は、GFAP、OSPおよびPZOのタンパク質レベルが、IL12p80を含有する分化条件でアップレギュレートされていたことを示した(図7B)。これらの結果は、NSCを乏突起グリア細胞および有髄シュワン細胞へ分化誘導可能であることを実証した。
NSCにおいて、Stat3のリン酸化は、乏突起グリア細胞分化過程に関与することが示されている(Wang B.et al.,PLoS One 2008,3:e1856)。T細胞では、IL12p40サブユニットはIL12受容体β1に結合し、その後、Stat3のリン酸化および下流シグナル伝達経路を誘導することができる(Jacobson N.G.et al.,Journal of Experimental Medicine 1995,181:1755−1762)。従って、IL12p80は、NSCにおいて、Stat3活性化を介して乏突起グリア細胞の分化を誘発することができる。
hIL12p80またはmIL12p80処理NSCにおけるStat3のリン酸化状態は、ウエスタンブロット法により分析される。この研究では、Y705とS727(Stat3リン酸化部位)の両方のリン酸化状態がニューロスフェアにおいてわずかに発現された(図8、スフェアのレーン)。ヒトおよびマウスIL12p80は両方ともY705におけるStat3のリン酸化を誘導し、その強度は15分でピークに達し、30分で低下し始めた。同様に、S727におけるStat3のリン酸化もIL12p80によって増大し、8時間持続した(図8、hIL12群およびmIL12群)。これらの結果から、Stat3のリン酸化はNSCにおけるIL12p80により誘導される乏突起グリア細胞分化に重要であったことが明らかとなった。
本研究では、神経コンジットにてNSCとともにIL12p80を移植すると、運動機能の回復が改善され、神経再生が促進され、神経伝導が改善され、新たに再生した神経の直径が増大することが実証される。コンジット+NSC+IL12からの再生神経は、損傷を受けた神経の中央部においてコンジット単独群の最大4.5倍厚い。IL12p80はin vitroでNSCを乏突起グリア細胞または有髄シュワン細胞へと分化誘導し得る。さらに、この分化誘導はStat3のリン酸化を介するものであり得ることも示される。IL12p80単独の投与でも、ある程度の神経修復を達成することができた。
IL12p80はIL12p40のホモ二量体であり、IL12p70はIL12p40とIL12p35のヘテロ二量体である。IL12p40はIL12受容体β1に結合し、IL12p35はIL12受容体β2に結合する。また、IL23はIL12p40とIL23p19のヘテロ二量体であり、IL23p19はIL23受容体に結合することも報告されている。神経コンジット内のIL12p80とNSCは神経損傷修復を改善することが示された。IL12p80単独の投与でも、ある程度の神経修復を達成することができた。
Claims (10)
- 神経幹細胞と、
少なくとも1つのサブユニットとしてのIL12p40により構築される神経栄養因子を含み、
前記神経栄養因子はIL12p40の単量体またはIL12p80であることを特徴とする、
神経再生のための組成物。 - IL12p40はNCBI受託番号:NM_008352(マウス)または1F42_A(ヒト)として示されるタンパク質配列を有することを特徴とする、請求項1に記載の組成物。
- 前記神経幹細胞はCD133およびGFAP陽性の脳細胞として特徴付けられることを特徴とする、請求項1に記載の組成物。
- 前記神経幹細胞はF1BGFP+細胞として特徴付けられることを特徴とする、請求項1に記載の組成物。
- 神経再生促進要素をさらに含むことを特徴とする、請求項1に記載の組成物。
- 前記神経再生促進要素は細胞、増殖因子、およびそれらの組合せを含むことを特徴とする、請求項5に記載の組成物。
- 前記神経再生促進要素はシュワン細胞、間葉幹細胞(MSC)、脂肪由来幹細胞(ADSC)、羊水幹細胞(AFSC)、誘導ニューロン(iN)、誘導神経幹細胞(iNSC)、または誘導多能性幹細胞(iPSC)に由来する細胞を含むことを特徴とする、請求項5に記載の組成物。
- 前記神経再生促進要素は線維芽細胞増殖因子1(FGF1)、線維芽細胞増殖因子2(FGF2)、血小板由来増殖因子(PDGF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、グリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)、神経増殖因子(NGF)、およびそれらの任意の組合せを含むことを特徴とする、請求項5に記載の組成物。
- 神経幹細胞と神経栄養因子のうち少なくとも1つを担持するための神経コンジットをさらに含む、請求項1に記載の組成物。
- 経幹細胞、神経栄養因子、および神経再生促進要素のうち少なくとも1つを担持するための神経コンジットをさらに含む、請求項5に記載の組成物。
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