LV13457B - Vaccine composition admixed with an alkylphosphatidylcholine - Google Patents

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LV13457B LVP-06-70A LV060070A LV13457B LV 13457 B LV13457 B LV 13457B LV 060070 A LV060070 A LV 060070A LV 13457 B LV13457 B LV 13457B
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Description

La presente invention est relative au domaine des vaccins et plus particulierement ā des vaccins adjuves. En particulier, l’invention conceme des compositions pharmaceutiques comprenant au moins un antigene vaccinal et au moins un derive ester phosphorique de phosphatidylcholine.
Selon l’art anterieur, il est connu de vouloir augmenter ou orienter la reponse hnmunitaire induite par Ies antigenes presents dans un vaccin, au moyen d’adjuvants. Ceci peut etre souhaitable car l’antigene, administrē seul, n’est pas suffisamment immunogene, ā cause notamment de son tres haut degre de purete, ou parce qu’on souhaite reduire la quantiie d’antigenes presents dans le vaccin ou le nombre de rappels ā effectuer, ou encore parce qu’on souhaite allonger la duree de protection conferee par le vaccin. Parfois, il s’agit de modifier qualitativement plutot que quantitativement la reponse induite.
Bien que l’art anterieur abonde en propositions de produits pouvant etre utilises connne adjuvants, on remarque que la plupart des vaccins adjuves faisant l’objet d’une autorisation de.
mise sur le marche en medecine humaine, sont adjuves au moyen d’un sel d’aluminium, ou d’une emulsion.
Or, il existe une demande reelle de disposer de nouveaux adjuvants dont Ies qualites permettront de modifier la reponse immune tout en conservant Ies qualites d’une administration en toute securite.
Par ailleurs, dans un autre domaine qui est celui de la transfection, il a ete propose dans l’etat de la technique, d’utiliser des lipides cationiques. Ainsi, par exemple, dans la publication intitulee « Modulation of Cellular Immune Response Against Hepatitis C Virus Nonstructural Protein 3 by Cationic Liposome Encapsulated DNA Immunization», plusieurs lipides cationiques constituant des liposomes sont testes pour leur capacite ā vehiculer l’ADN plasmidique d’interēt vērs Ies cellules. Cette publication est d’un interet dans le domaine des vaccins car l’ADN transfecte code pour des antigenes contre lesquels on souhaite une reponse du systeme immunitaire. Pour que la reaction du systeme immunitaire soit bonne, il faut tout d’abord que l’antigene soit exprime, et done que l’ADN soit « delivre » dans Ies meilleures conditions aux cellules capables de l’exprimer, Le role joue par Ies aģents de transfection qui servent de « vehicule » ā l’ADN est different du role joue par un adjuvant qui accompagne un antigene vaccinal present dans une composition pharmaceutique. Les resultats obtenus par Ies auteurs de cette publication montrent que la reponse obtenue est plus importante lorsque l’ADN est transportē au moyen de liposomes plutot que lorsque l’ADN est injecte « nu » ;
cependant, suivant la nature des lipides utilises pour former Ies liposomes, Ies reponses obtenues varient en nature et en intensite.
Malgre la litterature abondante sur Ies divers produits pouvant etre utilises comme adjuvants, il existe toujours un besoin de disposer d’un produit pouvant ētre utilise sāns risque pour l’organisme auquel il est administrē, et qui permette d’accroītre et/ou de modifier la reponse du systeme immunitaire vis-ā-vis de l’antigēne vaccinal avec lequel il est administrē.
C’est un des būts de l’invention que de proposer un tel produit.
Un autre but de l’invention est de proposer un adjuvant vaccinal facilement disponible, dont le cout est tel qu’il puisse etre ajoute aux compositions vaccinales sāns en augmenter le prix de revient de faņon prohibitive.
Pour atteindre ces būts, la presente invention a pour objet une composition pharmaceutique comprenant au moins un antigēne vaccinaļ caracterisee en ce qu’elle comprend en outre au moins un derive ester phosphorique de phosphatidylcholine ayant la structure:
H2C-0-C-R3
II o
HC-0-C-R2
H2C-O-P-O ©/
CH2-CH2-N-CH3
ORļ ch3 (I) dans laquelle:
- R] est un alkyle inferieur,
- R2 et R3 sont identiques ou differents, et peuvent chacun representer des chaines lineaires hydrocarbonees ayant de 13 ā 21 atomes de Carbone.
Selon un mode de realisation particulier, Ri represente le radical ethyl; ainsi, la degradation de ce derive dans l’organisme auquel il aura ete administrē produira des produits biocompatibles : Ies phosphatidylcholines et 1’ethanol.
Selon un mode particulier de l’invention, R2 et R3 sont choisis parmi Ies radicaux provenant des acides gras suivants : acide myristique, acide palmitique, acide stearique, acide oleique. Selon un mode particulierement avantageux, R2 et R3 sont tous 2 identiques et representent le radical de l’acide oleique. Un tel produit pouvant etre totalement prepare par synthese chimique presente toutes Ies garanties de securite et de reproductibilite souhaitees pour un usage pharmaceutique.
L’invention a ēgalement pour objet l’utilisation d’un derive ester phosphorique de phosphatidylcholine ayant la structure :
H,C-O-C-R,
O
HC-O-C-R2
II °
HoC-OOR,
CH3 ©/
O-CH2-CH2-N-CH3 \h3 (I) dans laquelle:
- Ri est un alkyle inferieur,
- R2 et R3 sont identiques ou differents, et peuvent chacun representer des chames lineaires hydrocarbonees ayant de 13 ā 21 atomes de Carbone, pour la preparation d’un adjuvant vaccinal.
L’invention. a egalement pour objet une methode d’immunisation d’un maimnifere selon 15 laquelle on lui administrē au moins un antigdne vaccinal et on lui administrē egalement un . derive ester phosphorique de phosphatidylcholine ayant la structure:
H,C-O-C-R3
O
HC-O-C-R2 11 H 0 II
H9C-0-P-O OR,
CH3 e/
-CH2-CH2-N-CH3
CH3 (I) dans laquelle:
Ri est un alkyle inferieur,
- R2 et R3 sont identiques ou differents, et peuvent chacun representer des chaines lineaires hydrocarbonees ayant de 13 ā 21 atomes de Carbone.
Ainsi, la reponse du systeme immunitaire est modifiee par rapport a la reponse qui serait obtenue si l’antigene vaccinal etait administrē sāns derive de phosphatidylcholine.
De nombreux autres avantages de la presente invention apparaitront ā la lecture de la description detaillee qui va suivre.
La presente invention est relative ā une composition pharmaceutique comprenant au moins un antigene vaccinal. Par antigene vaccinal, on entend un antigene susceptible d’induire une reponse du systeme immunitaire lorsqu’il est administrē ā l’homme ou ā un animal. Cette reponse du systeme immunitaire peut se traduire par une produetion d’anticorps ou par une activation de certaines cellules, notamment Ies cellules presentatrices d’antigenes ( ex: Ies cellules dendritiques), Ies lymphocytes T, Ies lymphocytes B.
La composition pharmaceutique peut etre une composition ā visee prophylactique ou ā visee therapeutique, ou encore Ies deux.
Elle peut etre administree par toutes Ies voies habituellement utilisees ou preconisees pour Ies vaccins: voie parenterale, voie muqueuse, et se presenter sous diverses formēs: Iiquide injectable ou pulverisable, formulation lyophilisee ou sech.ee par atomisation ou ā l’air,...etc. Elle peut etre administree au moyen d’une seringue ou au moyen d’un injecteur sāns aiguille pour injection intramusculaire, sous-cutanee ou intradermique. Elle peut aussi etre administree grāce ā un nebuliseur capable de delivrer une poudre seche ou un spray liquide au niveau des muqueuses, qu’elles soient nasales, pulmonaires, vaginales ou rectales.
Les antigenes vaccinaux utilises dans Ies compositions pharmaceutiques selon la presente invention sont des antigenes « directs», c’est-ā-dire qu’il ne s’agit pas d’ADN codant pour ces antigenes, mais les antigenes eux-memes ; il peut s’agir d’un germe entier ou seulement d’une partie de ce germe; ainsi parmi les antigenes utilises habituellement dans les vaccins, on peut notamment citer :
- les polysaccharides, qu’ils soient seuls ou conjugues a des elements porteurs, tēls que les proteines porteuses, les germes entiers vivants attenues,
Ies gennes inactives,
- Ies peptides et proteines recombinants,
- Ies glycoproteines, Ies glycolipides, Ies lipopeptides,
- Ies peptides synthetiques,
- Ies gennes eclates dans le cas de vaccins appeles vaccins « splittes ».
Ces antigenes sont des antigenes utilises ou susceptibles d’etre utilises pour le traitement ou la prevention de diverses maladies telles que par exemple : diphterie, tetanos, polio, rage, coqueluche, hepatites Α, B, C, fievre jaune, fiēvre typhoīde, varicelle, rougeole, oreillons, rubeole, encephalite japonaise, meningites, infections ā pneumocoques, infections ā rotavirus,
SULA, cancers, tuberculose, maladie de Lyme, infections a RSV, herpes, affections bacteriennes provoquees par Chlamydia, Neisseria gonorrheae, Streptococcus pneumoniae, Moraxella catarrhalis, Staphylococcus aureus ou Haemophilus influenza type B, la malaria, Ies leshmanioses, Ies listerioses, .. .etc.
La composition pharmaceutique selon l’invention peut ētre une composition destinee ā l’immunisation contre un seul pathogene ou cancer, c’est-a-dire qu’elle comprend un ou plusieurs antigenes d’un seul pathogene ou cancer, ou bien etie une composition destinēe a l’immunisation contre plusieurs pathogēnes ou cancers (on parle alors de combinaison vaccinale).
L’action du derive ester phosphorique de la phosphatidylcholine utilise est d’adjuver la composition vaccinale, c’est-a-dire d’accroitre ou de modifier la rēponse du systeme immunitaire de l’organisme auquel la composition vaccinale est administree, par rapport a la reponse qui serait obtenue en absence d’un tel compose. En particulier, il peut s’agir d’une augmentation de la reponse humorale, ou de la reponse cellulaire, ou des deux. L’action peut egalement ētre, non pas une augmentation de la reponse, mais une orientation differente de la reponse induite : par exemple, orientation vērs une reponse cellulaire plutot qu’une reponse humorale, production de certaines cytokines plutot que d’auties, production de certains types ou sous-types d’anticorps plutot que d’auties, stimulation de certaines cellules plutot que d’autres, etc... L’action de l’adjuvant peut egalement consister ā augmenter la duree de la reponse immune dans le temps. II peut aussi s’agir de permettie de diminuer le nombre d'ādministratinns necessaires pour obtenir une protection de l’individu immunise, ou encore diminuer la quantite d’antigene contenue dans la dose administiēe.
L’action adjuvante du derive selon l’invention peut ētre obtenue, soit lorsqu’il est associe ā I’antigene ou aux antigenes de la composition pharmaceutique lors de leur administration, i.e. lorsqu’il est present directement dans la composition pharmaceutique, ou encore lorsqu’il est administrē separement de l’antigene ou des antigenes dont on veut modifier le pouvoir immunogene. On prefere cependant l’utiliser dans la mēme composition pharmaceutique que l’antigene ou Ies antigenes ā administrer.
Aux fins de la presente invention, on entend par phosphatidylcholine des phospholipides constitues d’une molecule de glycerol, de 2 acides gras, d’un groupe phosphate et de la choline. Ces composes encore appeles lecithines, varient en fonction de leurs acides gras.
Pour Ies besoins de l’invention, Ies 2 acides gras R2 et R3 peuvent ētre identiques ou differents, saturēs ou insatures; on utilise de preference des phosphatidylcholines provenant de l’esterification d’acides gras ayant au moins 13 atomes de Carbone, et notamment des acides suivants : myristique, palmitique, stearique, ou oleique.
Par radical alkyle inferieur Ri, on entend un radical alkyle ayant au plus 5 atomes de Carbone. En effet, selon l’invention, le derive de phosphatidylcholine est un ester phosphorique d’une phosphatidylcholine; il peut s’agir d’un ester provenant de la reaction de la phosphatidylcholine et de methanol, d’ethanol, d’un propanol, d’un butanol ou d’un pentanol; on a obtenu de particulierement bons resultats avec un ester provenant de l’ethanol.
Les composes convenant aux fins de l’invention peuvent ētre obtenus par synthese chimique complete, ou encore par esterification de phosphatidylcholines naturelles, telles que la phosphatidylcholine extraite du soja ou des ceufs. Ce sont des composes que l’on peut utiliser sous formē de sel pharmaceutiquement acceptable, et notamment de chlorure. Parmi les composes convenant particulierement bien , on peut citer la l,2-dimyristoyl-jrz-glycero-3ethylphosphocholine, la l,2-dipalmitoyl-CT-glycero-3-ēthylphosphocholine, la l,2-distearoyls/?-glycero-3-ethylphosphocholine, la l,2-dioleoyl-src-glycero-3-ethylphosphocholine ou encore la l,2-palmitoyl-oleoyl-s«-glycero-3-ethylphosphocholine, disponibles notamment aupres de la Societe Avanti® Polar Lipids Inc. Ces composes sont disponibles sous formē de poudre ou en solution dans du chloroforme.
Selon l’invention, les composes sont disperses dans l’eau ou dans un tampon aqueux pour former une suspension qui est alors melangee avec une solution comprenant les antigenes vaccinaux, ou bien la suspension contenant le derive ester phosphorique de phosphatidylcholine est utilisēe pour reprendre un lyophilisat comprenant les antigenes vaccinaux. De faņon altemative, il est possible de disperser ou d’hydrater le derive ester de phosphatidylcholine avec de l’eau ou un tampon comprenant dejā au moins un antigene vaccinal.
Les derives esters phosphoriques de phosphatidylcholine utilises peuvent alors former des vesicules lipidiques, ou liposomes, dont la taille est avantageusement comprise entre 50 et 220nm.
est egalement possible d’utiliser les adjuvants selon l’invention dans une composition comprenant une emulsion.
Les exemples qui suivent illustrent, de faņon non limitative, des exemples de realisation de la . presente invention.
Exemple 1 : Compositions vaccinales ayant comme antigene de la proteine TAT.
1.1, Preparation des compositions
On prepare des compositions vaccinales comprenant i titre d’antigene vaccinal, une proteine recombinante susceptible d’ētre utilisee dans un vaccin contre le SĪDA; il s’agit de la proteine TAT ΠΙB detoxifiee qui est obtenue par expression chez E. coli et purification par differentes etapes de chromatographie, puis inactivation chimique, ainsi que ceļa est decrit dans la demande WO99/33346, ou elle est identifiee sous le terme de Tat carboxymethylee.
Les compositions sont preparees de la maniere dčcrite ci-apres.
0n dispose de poudre de chlorure de 1,2 dioleoyl-sn-glycero-3 ethylphosphocholine (etbyl PC) foumie par la Societe AVANTI® POLAR LIPIDS Inc. que l’on solubilise dans un melange de chlorofonne/methanol 4/1 afin d’obtenir une concentration de 2 mg/mL.
3,18 mL de la solution obtenue, soit 6,36 mg d’ethyl PC sont introduits dans un ballon en verre ; le solvant est elimine a l'aide d'un evaporateur rotatif jusqu'a obtention d'un film lipidique regulier sur les parois du ballon. Ce film est sčche ensuite sous vide pousse pour eliminer toute trace de solvant residuel.
Le film est ensuite rehydrate par 4 ml d'eau distillee a 40°C en utilisant un bain ā sonication. La dispersion des vesicules ainsi obtenue est ensuite extrudee ā travers plusieurs membranes de polycarbonate (0,8 pm ; 0,4 pm et 0,2 pm) montees sur un Extruder (Lipex Biomembranes, Inc.) thermostate ā 50°C sous pression d'azote.
La suspension liposomale alors obtenue, ayant une concentration de 1,59 mg/mL est melangee volume a volume ā la solution de Tat concentree ā 200 gg/mL en tampon TRĪS 100 mmol/L, NaCI 200 mmol/L ā pH 7,4.
Une composition comprenant uniquement l’antigene TAT, sāns adjuvant est egalement 5 preparee.
On obtient ainsi des doses de 200μ1 dont les compositions sont les suivantes :
1) 20pgdeTAT
2) 20pg de TAT et 159pg d’ethyl PC.
1.2. Immunisation.
On dispose de 2 groupes de 6 souris BALB/c femelles agees de 8 semaines, ā qui l’on injecte une des compositions preparees au paragraphe 1.1, par voie sous-cutanee, a raison d’une dose de 200μ1 par souris; les injections sont realisees ā JO et ā J21.
On preleve des echantillons sanguins au sinus retro-orbital ā J14 pour l’appreciation de la reponse primaire et ā J35 pour la reponse secondaire. La determination du taux d’IgGl et d’īgG2a specifiques est effectuee grāce ā des tests ELISA standardises.
Les souris sont sacrifiees ā J37; on preleve leur rāte et on isole les splenocytes.
Les resultats obtenus en ce qui conceme les reponses humorales sont recapitules dans le tableau ci-dessous, ou les taux d’IgG sont exprimes en unites arbitraires ELISA (loglO).
Pour chaque groupe de souris, la valeur indiquee est le titre geometrique moyen des valeurs obtenues pour chacune des souris.
Groupes de souris Taux IgGl aJ14 Taux IgG2a aJ14 Taux IgGl aJ35 Taux IgG2a a J35
Tat seule 1,943 1,045 3,950 2,437
Tat + EthylPC 2,931 2,429 4,889 4,368
Les resultats obtenus montrent que les compositions selon l’invention permettent d’obtenir une reponse humorale nettement superieure ā celle obtenue dans le cas ou l’antigene est administrē seul.
On observe que l’effet adjuvant est nettement marque vis-ā-vis de la reponse en IgG2a, ce qui est une indication d’une reponse immune plutot orientee vērs une reponse de type ΊΉ1.
Pour apprecier l’effet des compositions phannaceutiques selon l’invention sur la reponse cellulaire, on effectue des comptages des cellules spleniques capables de produire de l’interferon γ par un tēst ELISPOT. Ce tēst est realise ā la fois sur des cellules fraīches et sur des cellules restimulees.
Pour la realisation du tēst, on cultive Ies cellules spleniques dans des plaques de culture cellulaire, ā raison de 200 000 cellules par puits, en presence soit du milieu seul, soit de l’antigene TAT recombinante. Apres 16 heures de culture, on revele l’ELISPOT, i.e. que l’on compte le nombre de spots correspondant aux cellules secretant de l’interferon γ. Les resultats obtenus sont resumes dans les tableaux ci-apres; les valeurs indiquees sont les valeurs moyennes (par groupe de souris), des differences calculees pour chaque souris entre le nombre de spots comptes par million de cellules dans les puits ayant de la TAT recombinante et le nombre de spots comptes par million de cellules dans les puits n’ayant que du milieu.
Le tableau ci-apres resume les resultats obtenus sur cellules fraiches.
Composition pharmaceutiqne testee Nombre de spots par millions de cellules
TAT a 20 pg 31,67
TAT έ. 20 pg + EthylPC 129,17
Le tableau ci-apres resume les resultats obtenus sur cellules restimulees par de la TAT recombinante en presence d’IL2.
Composition pharmaceutique testee Nombre de spots par millions de cellules
TAT ā 20 pg 44,16
TAT ā 20 pg + EthylPC 411,66
Ces resultats montrent l’effet positif obtenu en utilisant une composition pharmaceutique selon la presente invention, sur la stimulation des cellules CD4+.
2. Compositions vaccinales avant comme antigene de la glvcooroteme gB du
Cvtomegalovirus.
2.1. Preparation des compositions.
On prepare des compositions vaccinales comprenant ā titre d’antigene vaccinal une proteine recombinante derivee d’une glycoproteine d’enveloppe de la souche Towne du Cytomegalovirus (CMV) denommee gB dont Ies sequences nucleotidique et proteique sont decrites dans le brevet USP 5,834,307. Cette proteine recombinante est produite par une lignee CHO recombinante transfectee par un plasmide denomme pPRgB27clv4 qui contient un gene modifie de la gB. En effet, pour faciliter la production de cette proteine recombinante par la lignee CHO le gene de la gB a ete modifie au prealable en supprimant la partie du gene qui code pour la region transmembranaire de la proteine gB correspondant ā la sequence d’acides amines comprise entre la Valine 677 et l’Arginine 752 et en introduisant 3 mutations ponctuelles de sorte que le site de clivage existant dans la gB native a ete supprimee. En definitive la proteine recombinante produite par la lignee CHO recombinante correspond a une proteine gB tronquee depourvue de site de clivage et de region transmembranaire denommee gBdTM.
La construction du plasmide pPRgB27clv4 et la production de la proteine gB tronquee (gBdTM) par la lignēe CHO recombinante sont decrites dans US 6,100,064. La purification de la proteine gB tronquee est realisee sur colonne chromatographique d’immunoaffinite en utilisant l’anticorps monoclonal 15D8 decrit par Rasmussen L et al. ( J. Virol. (1985) 55 : 274-280).
On dispose de poudre de chlorure de l,2-distearoyl-yn-glycero-3-ethylphosphocholine (Ethyl DSPC) et de chlorure de l,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (Ethyl DOPC) foumis par la Societe AVANTI® POLAR LIPIDS Inc. Pour chacun des produits, on effectne Ies operations suivantes:
On solubilise 5mg de poudre dans 5ml de chloroforme/methanol 4 :1 (vol/vol). La solution est sechee dans un ballon en verre a l’aide d’un evaporateur rotatif de maniere a laisser un film lipidique sur Ies parois du ballon. Ce film est encore sech.6 sous vide pousse pour eliminer toute trace de solvant residuel puis repris dans 2,5ml d’eau ā 60°C pour une concentration finale de 2mg/ml. La suspension liposomale resultante est homogeneisee par agitation au vortex 10 minūtes, sonication dans un bain ā ultrasons 5 minūtes puis extrudee , a l’aide d’un extrudeur Lipex (Northern Lipids Inc.,Vancouver, CA) thermostate a 50°C, en cinq passages ā travers une membrane de polycarbonate de porosite 0,2 pm.
On prepare egalement une formulation comprenant de l’ethyl PC en emulsion.
Pour ceļa, on solubilise dans un ballon en verre 25 mg de chlorure de l,2-dioleoyl-5,uglycero-3-ethylphosphocholine (Ethyl DOPC - Avanti Polar Lipids) ā l’aide de 10 ml de chloroforme/methanol 4 :1 (vol/vol). La solution obtenue est sechee ā l’aide d’un evaporateur rotatif de maniere a laisser un film lipidique sur Ies parois du ballon. Ce film est encore seche sous vide pousse pour eliminer toute trace de solvant residuel.
Dans un becher, on pese 375 mg de Tween® 80 vegetal foumi par la Societe Merck et on y ajoute 29,29 g d’eau, on agite jusqu’ā complete dissolution du tensio-actif.
Puis, on reprend le film lipidique obtenu ā l’etape precedente par cette solution de Tween® 80. A cette suspension, on ajoutel475 mg de squalene (Fluka), et on homogeneise l’emulsion obtenue ā l’Ultraturrax (8000-9500 ipm) puis au Microfluidiseur Ml 10 (Microfluidics, Newton MA.), 20 passages a 60 psi.
La concentration finale en squalene de cette emulsion est de 5%.
On prepare Ies doses d’immunisation en melangeant Ies formulations adjuvantes decrites eidessus ou de l’eau, ā une solution stock aqueuse d’antigene ā 160pg/ml de proteine gB, et ā du tampon PBS, afin d’obtenir des doses de 50μ1 ayant Ies compositions suivantes:
1) 2pgdegB
2) 2pgde gB et 50pgd’ethylDOPC,
3) 2pg de gB et 50ug d’ethyl DSPC,
4) 2pg de gB, 50pg d’ethyl DOPC, l,25mg de squalene et 0,3mg de Tween® 80.
2.2. Immunisation·
On dispose de 4 groupes de 8 souris non-consanguines OF1 femelles āgees de 8 semaines, ā qui on injecte une des compositions preparees au paragraphe 2.1, par voie sous-cutanee, ā raison d’une dose de 50μ1 par souris; Ies injections sont realisees ā JO et ā J21.
On preleve des echantillons sanguins au sinus retro-orbital ā J20 pour l’appreciation de la rčponse primaire et ā J34 pour la reponse secondaire. La determination du taux d’IgGl et d’IgG2a specifiques est effectuee grāce a des tests ELISA standardises.
Les souris sont sacrifiees ā J37 ; on preleve leur rāte et on isole Ies splenocytes, que l’on stimulē ou non avec de la proteine gB recombinante.
On effectue alors une determination par tests ELISA de la concentration en cytokines (IL5, EFN-γ et TNF-oc) dans les sumageants de cellules spleniques stimulees pendant 5 jours avec de la proteine gB, ainsi que dans les sumageants de cellules non stimulees afin d’en deduire par comparaison la production specifique de cytokines.
Les resultats obtenus en ce qui conceme les reponses humorales sont recapitules dans le 5 tableau ci-dessous, ou les taux d’IgG sont exprimes en unites arbitraires ELISA (logi 0).
Pour chaque groupe de souris, la valeur indiquee est le titre geometrique moyen des valeurs obtenues pour chacune des souris.
Groupes de souris Taux IgGl aJ21 Taux IgG2a āJ21 Taux IgGl ā J35 Taux IgG2a āJ35
gB seule 2,703 ± 0,773 1,624 ± 0,572 4,409 ± 0,564 3,187 ± 0,595
gB + Ethyl DOPC 3,673 ± 0,521 3,763 ± 0,371 4,472 ± 0,453 4,741 ± 0,260
gB + EthylDSPC 3,708 ± 0,545 3,869± 0,303 4,388 ± 0,393 4,600 ± 0,246
gB+Ethyl DSPC + 4,205 ± 2,944 ± 5,294 ± 4,272 ±
emulsion 0,388 0,445 0,416 0,348
Les resultats pour les cytokines sont reproduits dans le tableau ci-apres; les valeurs indiquees sont pour chaque cytokine, la difference en pg/ml entre la moyenne des quantites de cytokines mesurees pour les cellules restimulees par de la proteine gB, et la moyenne des quantites de cytokines mesurees pour les cellules mises en culture dans du milieu seul (considere comme le bruit de fond du tēst); on peut donc considerer que les quantites indiquees sont les quantites produites specifiquement en reponse ā la stimulation par la proteine gB.
Groupes de souris IFN-γ IL5 TNF-a
gB seule 2193 399 61
gB + Ethyl DOPC 56338 416 310
gB+ EthylDSPC 28756 32 93
gB+Ethyl DSPC + emulsion 3432 4054 134
L’ensemble des resultats produits dans ce tēst montre le bon effet adjuvant des esters phosphoriques de phosphatidylcholine qui ont une grande capacite ā augmenter la reponse immune de type Thl (augmentation des IgG2a et de l’Interferon γ), sāns pour autant inhiber la reponse de type Th2 dej ā induite par 1’antigene.
3. Compositions vaccinales administrees par voie intradermigue.
3.1. Preparation des compositions.
On dispose de poudre de chlorure de l,2-dioleoyl-sw-glycero-3-ethylphosphocholine (Ethyl DOPC) foumis par la Societe AVAND® POLAR LIPIDS Inc dont on solubilise 5mg dans 10 ml de chlorofonne/methanol 4 ;1 (vol/vol). La solution obtenue est sechee dans un ballon en verre ā l’aide d’un evaporateur rotatif de maniere a laisser un film Iipidique sur les parois du ballon. Ce film est encore seche sous vide pousse pour eliminer toute trace de solvant residuel puis repris dans 2.5 ml d’eau ā 60°C pour une concentration finale de 2 mg/ml. La suspension liposomale resultante est homogeneisee par agitation au vortex 10 minūtes, sonication dans un bain ā ultrasons 5 minūtes puis extrudee , ā l’aide d’un extrudeur Lipex (Northern Lipids inc,Vancouver, CA) thermostate ā 50°C, en un passage sur membrane de polycarbonate de 0,8 pm puis un passage sur membrane de polycarbonate de 0,4 pm et enfin cinq passages ā travers une membrane de polycarbonate de porosite 0.2 pm.
On dispose egalement d’une solution stock d’antigene constitue par de la proteine gB obtenue de la maniere decrite ā l’exemple precedent, ā une concentration de 160pg/ml.
On melange la solution d’antigene a la suspension d’adjuvant ā 2 mg/ml dans des proportions calculees pour obtenir les vaccins experimentaux ayant par dose de 50pl, les compositions suivantes:
1) 2pgdegB,
2) 2pg de gB et 50pg d’ethyl DOPC
3) 0,2pgdegB,
4) 0,2pg de gB et 50pg d’ethyl DOPC.
3.2 Immunisation
On dispose de 4 groupes de 8 souris OF1 āgees de 8 semaines.
Chaque groupe de souris reņoit l’une des 4 formulations indiquees ci-dessus, par voie intradermique.
Les immunisations sont realisees ā JO et a J20.
On prelēve des echantillons sanguins au sinus retro-orbital ā J20 avant la 2nde immunisation pour l’appreciation de la reponse primaire et ā J35 pour la reponse secondaire La determination du taux d’IgGl et d’IgG2a specifiques est effectuee grace a des tests ELISA standardises.
Les souris sont sacrifīees ā J35 ; on preleve leur rāte et on isole les splenocytes, que l’on stimulē ou non avec de la proteine gB recombinante.
On effectue alors une determination par tests ELISA de la concentration en cytokines (IL5, IFN-γ et TNF-α) dans les sumageants de cellules spleniques stimulees pendant 5 jours avec de la proteine gB, ainsi que dans les sumageants de cellules non stimulees afin d’en deduire par comparaison la produetion specifique de cytokine.
Les resultats obtenus en ce qui conceme les reponses humorales sont rčcapitules dans le tableau ci-dessous, ou les taux d’IgG sont exprimes en unites arbitraires ELISA (logi0).
Pour chaque groupe de souris, la valeur indiquee est le titre geometrique moyen des valeurs obtenues pour chacune des souris
Groupes de souris Taux IgGl ā.J20 Taux IgG2a āJ20 Taux IgGl āJ35 Taux IgG2a āJ35
2gggB 2,095 1,097 4,478 2,829
2pg gB+ Ethyl DOPC 4,111 3,574 5,023 4,766
0,2pg gB 1,351 1,185 2,738 1,647
0,2pg gB+ Etbyl DOPC 3,621 2,607 4,698 4,087
Les resultats pour les cytokines sont reproduits dans le tableau ci-apres; les valeurs indiquees sont pour chaque cytokine, la difference en pg/ml entre la moyenne des quantites de cytokines mesurees pour les cellules restimulees par de la proteine gB, et la moyenne des quantites de cytokines mesurees pour les cellules mises en culture dans du milieu seul (considere comme le bruit de fond du tēst); on peut donc considerer que Ies quantites indiquees sont Ies quantites produites specifiquement en reponse a la stimulation par la proteine gB.
Groupes de souris ΙΡΝ-γ IL5 TNF-a
2pggB 3295 1891 65
2pg gB + Ethyl DOPC 49716 1373 638
0,2pg gB 2892 102 135
0,2pg gB + Ethyl DOPC 37877 690 533
Dans ce tēst, on voit que l’adjuvant selon l’invention est efficace par voie intradermique, et qu’il peimet ou bien d’augmenter la reponse immunitaire pour une meme quantite d’antigenes, ou de reduire la quantitē d’antigenes presentes dans la dose injectee.
Ici, l’effet adjuvant est visible ā la fois vis-ā-vis de la reponse de type Th2 (IgGl) mais aussi, et mēme de fapon tres spectaculaire, vis-ā-vis de la reponse de type Thl (IgG2a, Interferon γ).
4.Compositions vaccinales avant un antigene du SARS,
4.1. Preparation des compositions,
On prepare une suspension virale d’un coronavirus humain inactive, en l’occurrence le virus du SARS (Severe Acute Respiratory Syndrom), obtenu par culture sur lignee cellulaire puis inactivation; la suspension utilisee est ā une concentration de 7,56 log CCID50 avant inactivation; elle est diluee au 1/10 afin d’obtenir une suspension ayant une concentration de 6,56 log CCID50.
On dispose de poudre de chlorure de l,2-dioleoyl-.yn-glycero-3-ethylphosphocholine (Ethyl DOPC) foumis par la Societe AVANTI® POLAR LIPIDS Inc dont on solubilise 30 mg dans 10 ml de chloroforme/metbanol 4:1 (vol/vol). La solution obtenue est sechee dans un ballon en verre ā l’aide d’un evaporateur iotatif de maniere ā laisser un film lipidique sur Ies parois du ballon. Ce film est encore seche sous vide pousse pour eliminer toute trace de solvant residuel puis repris dans 5 ml d’eau ā 60°C pour une concentration finale de 6 mg/ml. La suspension liposomale resultante est homogeneisee par agitation au vortex 10 minūtes, sonication dans un bain a ultrasons 5 minūtes puis extrudee, a l’aide d’un. extrudeur Lipex (Northern Lipids Inc.,Vancouver, CA) thermostate ā 50°C, en cinq passages ā travers une membrane de polycarbonate de porosite 0,2 pm.
On prepare des doses d’immunisation de 200μ1, en effectuant Ies melanges indiques dans le tablean ci-apres:
Eau Suspension virale a 6,56 log TCID50 Adjuvant Tampon Phosphate Quantite virus par dose
1,418 ml llOpldil. 1/10 - 472 pl 104-6CCID5O
1,151 ml llOpldil. 1/10 267 pl Ethyl DOPC 472 pl 104'6CdD5o
1,418 ml llOpldil. 1 - 472 pl 1O5'6CCID5o
1,151 ml llOpldil. 1 267 plEthylDOPC 472 pl 105-6CCID5O
4.2. Immunisation
On dispose de 4 groupes de 8 souris BALB/c que l’on immunise ā 3 semaines d’intervalle avec l’une des formulations indiquees ci-dessus; Ies injections sont realisees en sous-cutane; Ies doses injectees sont a chaque fois de 200pl.
Des echantillons sanguins sont preleves 2 semaines apres chaque injection pour l’evaluation des reponses anticoīps anti-virus SARS entier (inactive) par dosage ELISA, soit a J14 pour la reponse primaire, et a J33 pour la rčponse secondaire.
Les cellules spleniques sont prelevees ā J33.
On evalue la reponse cellulaire specifique du SARS, grāce a un dosage ELISPOT des cellules secrčtant de l’Interferon-γ, soit ex vivo, soit apres stimulation in vitro avec du virus entier inactive pendant 7 jours. Dans chacun des cas, les cellules spleniques (ex vivo ou restimulees in vitro) sont incubees 16 heures, soit avec du virus entier inactive, soit avec des peptides 18meres pooles dont les sequences sont chevauchantes (sur 10 acides amines), et correspondent a differents antigenes du virus du SARS .
En outre, on apprecie la polarisation de la reponse cellulaire T helper induite, grāce ā un dosage ELISA des cytokines secretees par les cellules spleniques stimulees par le virus inactive entier ou par un pool de peptides.
Les resultats obtenus en ce qui conceme la reponse humorale sont regroupes dans le tableau ci-apres; ils sont exprimes en loglO d’unites arbitraires du tēst ELISA, et representent les moyennes des titres geometriques de chaque groupe de souris.
Composition immunisante Taux IgG aJ14 Taux IgG aJ33
’1O4’6CCID5O 1 1,191
ĪO4’6CdD5o+ Ethyl DOPC 1,246 2,424
lO^CCIDio 1,776 3,122
ĪO5-0CdD5o + EthylDOPC 2,621 4,387
Ces resultats montrent que l’adjuvant selon l’invention permet d’accroītre la reponse humorale contre un antigene virai.
En ce qui conceme la reponse cellulaire, les resultats obtenus lors du comptage ELISPOT 10 realise sur les cellules fraiches (ex vivo), stimulees par du virus entier sont representes dans le tableau ci-apres, qui indique la moyenne.geometrique pour chaque groupe de souris.
Composition immunisante Nombre de spots/ 106 cellules spleniques
lO4'6CdD5o 2
104’bCCID5o + EthylDOPC 18
IO^CCIDjo 17
105-6CCID5o + Ethyl DOPC 132
En ce qui conceme les resultats obtenus en reponse aux pools de peptides, les reponses varient 15 selon les pools de peptides utilises.
Les resultats en ELISPOT obtenus apres restimulation avec du virus SARS inactive ont egalement montre que la produetion d’interfēron γ etait augmentee en presence d’ethyl DOPC, en reponse a certains des peptides utilises.
Ces resultats montrent que l’adjuvant selon l’invention permet d’accroītre la reponse cellulaire T CD4+ contre un antigene virai,
En ce qui conceme les dosages des cytokines IFN-γ (cytokine Thl) et IL-5 (cytokine Th2) par ELISA, on a remarque qu’apres stimulation par du virus inactive, la production d’IFN-γ etait tres augmentee pour les souris ayant requ en plus de l’antigene de l’ethyl DOPC ; par contre, la production d’IL-5 n’etait pas nettement modifiee.
Les rēsultats obtenus sont indiques dans le tableau ci-apres ; ils sont exprimes en pg/ml, et representent les moyennes geometriques des groupes de souris.
Stimulation avec le virus entier inactive
Composition IFN-γ IL-5
immunisante (pg/ml) (pg/ml)
104’6TCID5o 4910 2793
104’6TCID50 + EthylDOPC 9262 3037
io^tcidso -- 7223 3649
105’6TdD5o + Ethyl DOPC 51453 5270
Ces resultats montrent que l’adjuvant selon l’invention permet d’accroītre la reponse cellulaire de type Thl.
Ainsi, l’ensemble de ces rčsultats montre que l’adjuvant selon l’invention permet d’accroītre significativement la reponse immune induite lors de l’administration d’un antigene constitue par un virus inactivē, ā la fois cellulaire (Thl) et humorale.

Claims (10)

  1. Virānes iela 2, Rīga LV-1073, LV
    Virsraksts: VAKCĪNAS KOMPOZĪCIJA AR PIEVIENOTU ALKILFOSFATIDILHOLĪNU © Kopsavilkums: Izgudrojums attiecas uz farmaceitisku kompozīciju, kas satur vismaz vienu vakcīnas antigēnu. Kompozīcija satur arī fosfatidilholīna fosforskābes esteri ar formulu (1):
    H c-q.............c-Ro o J
    I ii kurā Rļ ir zemākā alkilgrupa, bet R4 un R2 ir vienādi vai atšķirīgi, un satur 13 līdz 21 oglekļa atomu.
    Izgudrojuma formula
    1. Farmaceitiska kompozīcija, kas satur vismaz „tiešo” vakcīnas antigēnu, raksturīga ar to, ka tā papildus satur vismaz fosfatidilholīna fosforskābes esteri ar formulu (I):
    kurā:
    H,C-O-C-R3
    II o
    HC-O-C-R2
    II 0 0
    H,C-OOR,
    -0—ch2-ch2©/
    -N\
    CH3
    CH,
    CH,
    R-ι ir zemākā alkilgrupa,
    R2 un R3 ir vienādi vai atšķirīgi, kas katrs satur 13 līdz 21 oglekļa atomus.
  2. 2. Kompozīcija saskaņa ar iepriekšējo punktu, kas raksturīga ar to, ka Rļ ir etilgrupa.
  3. 3. Kompozīcija saskaņā ar jebkuru no iepriekšējiem punktiem, kas raksturīga ar to, ka R2 un R3 ir ņemti no alkilgrupu rindas, kas veido šādas taukskābes: miristīnskābe, palmitīnskābe, stearīnskābe, oleīnskābe.
  4. 4. Kompozīcija saskaņā ar jebkuru no iepriekšējiem punktiem, kas raksturīga ar to, ka R2 un R3 ir vienādi un ir oleīnskābes atlikuma alkilgrupa.
  5. 5. Kompozīcija saskaņā ar jebkuru no iepriekšējiem punktiem, kas raksturīga ar to, ka tā ir emulsija.
  6. 6. Fosfatidilholīna atvasinājuma ar formulu (i) h2c—ο ο
    HC—0—C-R2
    Ii <?
    o
    IRC—0 p—o—c.h2-ch2—N—ch3 OR, CH3 (I) kurā:
    R-ι ir zemākā alkilgrupa,
    R2 un R3 ir vienādi vai atšķirīgi, kas katrs satur 13 līdz 21 oglekļa atomus, izmantošana vakcīnas adjuvanta iegūšanai.
  7. 7. Izmantošana saskaņā ar 6. punktu, kas raksturīga ar to, ka R-ι ir etilgrupa.
  8. 8. Izmantošana saskaņā ar 6. vai 7. punktu, kas raksturīga ar to, ka R2 un R3 ir ņemti no šādas taukskābes veidojošo alkilgrupu rindas: miristīnskābe, palmitīnskābe, stearīnskābe, oleīnskābe.
  9. 9. Izmantošana saskaņā ar jebkuru no 6. līdz 8: punktam, kas raksturīga ar to, ka R2 un R3 abi ir vienādi un ir oleīnskābes atlikuma alkilgrupa.
  10. 10. Farmaceitiskās kompozīcijas pēc 1. punkta izmantošana ārstniecības līdzekļa ražošanai „tiešā” vakcīnas antigēna un kopā ar to fosfatidilholīna fosforskābes estera ievadīšanai.
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