CA2406949A1 - Utilisation de vecteurs particulaires dans l'immunomodulation - Google Patents
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
La présente invention a pour objet un procédé pour améliorer les propriétés immunomodulatrices d'une substance, autre qu'un antigène, capable de moduler la réponse immunologique, caractérisé en ce qu'il comprend le mélange de ladite substance avec des particules hydrophiles portant ou non des ligands ioniques et éventuellement recouvertes d'une couche de composés amphiphiles. L'invention concerne aussi les compositions pharmaceutiques ainsi obtenues e t leurs utilisations pour le traitement et/ou la prévention des cancers, des maladies virales et des maladies infectieuses.
Description
UTILISATION DE VECTEURS PARTICULAIRES DANS L'IMMUNOMODULATION
La présente invention a pour objet un procédê
pour améliorer les propriétés immunomodulatrices d'une substance, autre qu'un antigène, capable de moduler la réponse immunologique consistant à mélanger ladite substance avec des particules hydrophiles portant ou non des ligands ioniques et éventuellement recouvertes d'une couche de composés amphiphiles. L'invention concerne le traitement et/ou la prévention des maladies comprenant un caractère immunogénique comme les cancers ou les infections.
L'invention s'intéresse tout particulièrement une composition thérapeutique notamment vaccinale et à leur procédé de préparation.
L'invention vise tout spécialement l'utilisation de vecteurs particulaires incorporant de l'interleukine 2 pour la préparation de médicaments destinés au traitement des cancers.
Le cancer est une maladie caractérisée par une prolifération incontrôlée de certaines cellules, qui échappent à la surveîllance du système immunitaire. En effet, le rôle du système immunitaire est non seulement de rejeter les corps étrangers (virus, bactéries, parasites...) pathogènes qui peuvent pénétrer dans le corps humain, mais aussi d'éliminer les cellules présentant des caractéristiques anormales. Il est parfois possible que les 3 0 cellules cancéreuses échappent à la vigilance du système immunitaire, par exemple en diminuant l'expression de certains antigènes spécifiques de la tumeur, ou de molécules impliquées dans la reconnaissance par le système immunitaire (protéines du complexe majeur d'histocompatibilité). Dans d'autres cas, bien que les tumeurs soient fortement immunogéniques, le système immunitaire ne peut les combattre, les lymphocytes étant dans un état anergique à
proximité des amas cancéreux.
WO 01/80836 PCT/F'RO1/01289
La présente invention a pour objet un procédê
pour améliorer les propriétés immunomodulatrices d'une substance, autre qu'un antigène, capable de moduler la réponse immunologique consistant à mélanger ladite substance avec des particules hydrophiles portant ou non des ligands ioniques et éventuellement recouvertes d'une couche de composés amphiphiles. L'invention concerne le traitement et/ou la prévention des maladies comprenant un caractère immunogénique comme les cancers ou les infections.
L'invention s'intéresse tout particulièrement une composition thérapeutique notamment vaccinale et à leur procédé de préparation.
L'invention vise tout spécialement l'utilisation de vecteurs particulaires incorporant de l'interleukine 2 pour la préparation de médicaments destinés au traitement des cancers.
Le cancer est une maladie caractérisée par une prolifération incontrôlée de certaines cellules, qui échappent à la surveîllance du système immunitaire. En effet, le rôle du système immunitaire est non seulement de rejeter les corps étrangers (virus, bactéries, parasites...) pathogènes qui peuvent pénétrer dans le corps humain, mais aussi d'éliminer les cellules présentant des caractéristiques anormales. Il est parfois possible que les 3 0 cellules cancéreuses échappent à la vigilance du système immunitaire, par exemple en diminuant l'expression de certains antigènes spécifiques de la tumeur, ou de molécules impliquées dans la reconnaissance par le système immunitaire (protéines du complexe majeur d'histocompatibilité). Dans d'autres cas, bien que les tumeurs soient fortement immunogéniques, le système immunitaire ne peut les combattre, les lymphocytes étant dans un état anergique à
proximité des amas cancéreux.
WO 01/80836 PCT/F'RO1/01289
2 Une nouvelle stratégie développée dans les dernières années consiste à stimuler le système immunitaire par l'injection de protéines d'intérêt thérapeutique, ayant un rôle dans la régulation du système immunitaire. Parmi ces protéines, on peut citer bien sûr les cytokines, mais aussi d'autres agents comme les chémokines. En particulier, on peut mettre l'accent sur les interleukines, les interférons, les TNF (facteurs nécrosants de tumeurs), les TGF (facteurs transformants de croissance), les facteurs de croissance hématopoïétique tels que les M-CSF et GM-CSF, mais aussi des facteurs d'attraction de cellules immunitaires, tels que le MIF ou RANTES.
Une cytokine particulièrement intéressante dans la stimulation du système immunitaire est l'interleukine 2 (IL-2). Elle est synthétisée majoritairement par les lymphocytes T helper de type 1 (Thl) en réponse à une stimulation par l'antigène présenté par des cellules appropriées. Elle est impliquée dans le développement de réponses immunitaires spécifiques et non spécifiques, en ce qu'elle interagit avec de nombreuses cellules (lymphocytes B, T, cellules tueurs naturels NK) pour les activer et induire leur différentiation et/ou leur prolifération.
Ainsi, il a été montré que l'IL-2 possède des propriétés antitumorales, en ce qu'elle peut induire une régression de différentes tumeurs solides, de mélanomes, de leucémies ou de lymphomes, etc...
Toutefois, l'utilisation de l'IL-2 en chimiothérapie se heurte à de nombreux problèmes. Pour obtenir l'effet recherché, il est souvent nécessaire d'administrer des doses importantes de protéine, ce qui peut provoquer des effets secondaires gênants (fièvre, erythème, oedème). Par ailleurs, la purification de cette protéine est difficile, elle est en général produite par génie génétique, et est donc coûteuse. Par ailleurs, les cytokines sont souvent instables en solution, même à 4°C, ce qui pose un problème de conservation. De plus, les procédés de préparation des solutions comprenant de l'IL-2 contiennent une étape d'ajout de protéine stabilisatrice, souvent l'albumine, ce qui devient difficilement acceptable pour les
Une cytokine particulièrement intéressante dans la stimulation du système immunitaire est l'interleukine 2 (IL-2). Elle est synthétisée majoritairement par les lymphocytes T helper de type 1 (Thl) en réponse à une stimulation par l'antigène présenté par des cellules appropriées. Elle est impliquée dans le développement de réponses immunitaires spécifiques et non spécifiques, en ce qu'elle interagit avec de nombreuses cellules (lymphocytes B, T, cellules tueurs naturels NK) pour les activer et induire leur différentiation et/ou leur prolifération.
Ainsi, il a été montré que l'IL-2 possède des propriétés antitumorales, en ce qu'elle peut induire une régression de différentes tumeurs solides, de mélanomes, de leucémies ou de lymphomes, etc...
Toutefois, l'utilisation de l'IL-2 en chimiothérapie se heurte à de nombreux problèmes. Pour obtenir l'effet recherché, il est souvent nécessaire d'administrer des doses importantes de protéine, ce qui peut provoquer des effets secondaires gênants (fièvre, erythème, oedème). Par ailleurs, la purification de cette protéine est difficile, elle est en général produite par génie génétique, et est donc coûteuse. Par ailleurs, les cytokines sont souvent instables en solution, même à 4°C, ce qui pose un problème de conservation. De plus, les procédés de préparation des solutions comprenant de l'IL-2 contiennent une étape d'ajout de protéine stabilisatrice, souvent l'albumine, ce qui devient difficilement acceptable pour les
3 agences de régulation, en raison des risques posés par l'utilisation de l'albumine.
La présente invention se propose de résoudre ces différents problèmes, en mettant en ouvre une nouvelle façon de formuler les compositions contenant de l'IL-2, qui permet d'obtenir des solutions ayant une activité, en particulier anti-tumorale, plus importante que les formulations usuelles. Cette nouvelle formulation permet également d'augmenter la stabilité de l'IL-2. De plus, l'invention peut-être utilisée pour la fabrication d'un médicament qui peut être administré par voie intranasale ou orale, un système de délivrance de principe actif présentant une amélioration très importante par rapport aux systèmes précédemment décrits. Enfin, une formulation selon l'invention permet de s'affranchir de la présence d'albumine dans les compositions comprenant de l'IL-2, destinées à une administration sous forme injectable.
La Demanderesse a développé son expertise dans la préparation de vecteurs particulaires synthétiques, désignés aussi ci-après "BVSMT'~'" .
Un premier type de BVSM, et son procédé de préparation, ont été décrits dans le brevet européen No. 344 040. I1 s'agit de particules comprenant de l'intérieur vers l'extérieur .
- un noyau central hydrophile non liquide constitué d'une , matrice de polysaccharides ou d'oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés, pouvant être modifiés par des groupements ioniques divers;
- une couche d'acides gras greffés par des liaisons covalentes au noyau;
- une ou plusieurs couches lipidiques constituées notamment de phospholipides.
Les développements de cette première génération de BVSM ont conduit la Demanderesse à concevoir et préparer de nouveaux BVSM, aux propriétés améliorées notamment en fonction des principes actifs transportés.
Les demandes de brevet publiées sous les numéros WO 94/20078, WO 96/06638 et EP 782 851 décrivent ces BVSM,
La présente invention se propose de résoudre ces différents problèmes, en mettant en ouvre une nouvelle façon de formuler les compositions contenant de l'IL-2, qui permet d'obtenir des solutions ayant une activité, en particulier anti-tumorale, plus importante que les formulations usuelles. Cette nouvelle formulation permet également d'augmenter la stabilité de l'IL-2. De plus, l'invention peut-être utilisée pour la fabrication d'un médicament qui peut être administré par voie intranasale ou orale, un système de délivrance de principe actif présentant une amélioration très importante par rapport aux systèmes précédemment décrits. Enfin, une formulation selon l'invention permet de s'affranchir de la présence d'albumine dans les compositions comprenant de l'IL-2, destinées à une administration sous forme injectable.
La Demanderesse a développé son expertise dans la préparation de vecteurs particulaires synthétiques, désignés aussi ci-après "BVSMT'~'" .
Un premier type de BVSM, et son procédé de préparation, ont été décrits dans le brevet européen No. 344 040. I1 s'agit de particules comprenant de l'intérieur vers l'extérieur .
- un noyau central hydrophile non liquide constitué d'une , matrice de polysaccharides ou d'oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés, pouvant être modifiés par des groupements ioniques divers;
- une couche d'acides gras greffés par des liaisons covalentes au noyau;
- une ou plusieurs couches lipidiques constituées notamment de phospholipides.
Les développements de cette première génération de BVSM ont conduit la Demanderesse à concevoir et préparer de nouveaux BVSM, aux propriétés améliorées notamment en fonction des principes actifs transportés.
Les demandes de brevet publiées sous les numéros WO 94/20078, WO 96/06638 et EP 782 851 décrivent ces BVSM,
4 leur fabrication, leur association à divers principes actifs et leur utilisation pour la préparation de compositions pharmaceutiques.
Ainsi, le noyau hydrophile peut être obtenu par différentes méthodes déjà décrites précédemment (ainsi les brevets EP344040, W092/21329, W094/20078), et les procédés de réticulation sont connus de l'homme du métier, le polysaccharide peut être chargé positivement ou négativement, par la greffe de groupements ioniques, cationiques ou anioniques, aux sucres composant le polymère.
Ces groupements peuvent être choisis parmi des fonctions ammoniums quaternaires ou carboxyméthyles. Les procédés ont été décrits dans W092/21329 et les brevets cités précédemment. La charge du cour polysaccharidique des vecteurs des compositions selon l'invention est en général de préférence une charge positive. Toutefois les vecteurs dont les cours contiennent des charges négatives peuvent parfois être préférés, en particulier dans une composition pour une utilisation sous forme injectable.
Les brevets précédemment cités décrivent également les protocoles que l'homme du métier peut utiliser pour l'incorporation de la couche externe lipidique. Celle-ci est de préférence composée de " DPPC-like ", c'est à dire de DPPC (dipalmitoyl phosphatidyl choline) ou de tout autre composé possédant les mêmes propriétés que ce produit, dans lequel est ajouté du cholestérol. Toutefois, d'autres composés lipidiques..peuvent être utilisés en particulier des phospholipides ou des céramides, auxquels on peut additionner d'autres constituants, par exemple des 3 0 constituants des membranes biologiques. De façon préférée, le rapport massique DPPC/Cholestérol est de 70/30.
Le savoir-faire dont dispose aujourd'hui la Demanderesse sur la préparation des BVSM lui permet de disposer d'une gamme étendue de type de BVSM. Ces BVSM sont formés d'un polymère hydrophile réticulé, préférentiellement des polysaccharides, sous forme de gel nanoparticulaire, ces BVSM sont dits de type PSC (ou NPS en français).
Comme indiqué ci-dessus, ce polymère peut éventuellement porter des ligands ioniques positifs, BVSM
dit cationique, ou négatifs, BVSM dit anionique. Ce polymère chargé ou non est optionnellement recouvert d'une couche de
Ainsi, le noyau hydrophile peut être obtenu par différentes méthodes déjà décrites précédemment (ainsi les brevets EP344040, W092/21329, W094/20078), et les procédés de réticulation sont connus de l'homme du métier, le polysaccharide peut être chargé positivement ou négativement, par la greffe de groupements ioniques, cationiques ou anioniques, aux sucres composant le polymère.
Ces groupements peuvent être choisis parmi des fonctions ammoniums quaternaires ou carboxyméthyles. Les procédés ont été décrits dans W092/21329 et les brevets cités précédemment. La charge du cour polysaccharidique des vecteurs des compositions selon l'invention est en général de préférence une charge positive. Toutefois les vecteurs dont les cours contiennent des charges négatives peuvent parfois être préférés, en particulier dans une composition pour une utilisation sous forme injectable.
Les brevets précédemment cités décrivent également les protocoles que l'homme du métier peut utiliser pour l'incorporation de la couche externe lipidique. Celle-ci est de préférence composée de " DPPC-like ", c'est à dire de DPPC (dipalmitoyl phosphatidyl choline) ou de tout autre composé possédant les mêmes propriétés que ce produit, dans lequel est ajouté du cholestérol. Toutefois, d'autres composés lipidiques..peuvent être utilisés en particulier des phospholipides ou des céramides, auxquels on peut additionner d'autres constituants, par exemple des 3 0 constituants des membranes biologiques. De façon préférée, le rapport massique DPPC/Cholestérol est de 70/30.
Le savoir-faire dont dispose aujourd'hui la Demanderesse sur la préparation des BVSM lui permet de disposer d'une gamme étendue de type de BVSM. Ces BVSM sont formés d'un polymère hydrophile réticulé, préférentiellement des polysaccharides, sous forme de gel nanoparticulaire, ces BVSM sont dits de type PSC (ou NPS en français).
Comme indiqué ci-dessus, ce polymère peut éventuellement porter des ligands ioniques positifs, BVSM
dit cationique, ou négatifs, BVSM dit anionique. Ce polymère chargé ou non est optionnellement recouvert d'une couche de
5 composés amphiphiles, préférentiellement des phospholipides, BVSM dit de type Light décrit dans la demande de brevet PCT
W094/20078.
La taille des BVSM est comprise entre 20 et 200 nm, préférentiellement entre 50 et 100 nm et plus préférentiellement entre 60 et 80 nm.
Les BVSM sont stérilisables par filtration et leur association aux principes actifs se fait sur les BVSM
complètement fabriqués (Major et al., Biochem. & Biophys.
Acta (1997),1327,32-40). Ceci permet de travailler les molécules biologiques, particulièrement fragiles, dans des conditions optimales.
Les BVSM protègent les molécules biologiques de la dégradation (Prieur R. et al. Vaccins (1996) Vol 14, N°6 pp. 511-520 Combination of hCMV recombinant IE1 protein with 80 nm cationic biovectors . protection from proteolysis and potentiation of presentation to CD4).
Il a aussi été montré qu'ils augmentent l'activité biologique de peptides et de protéines comme des enzymes, des antigènes, etc....
Les BVSM sont connus pour être utilisés comme transporteurs de substances actives, par exemple peptides, antigènes ou oligonucléotides. Dans cette utilisation, il y a formation d'un réel complexe entre le BVSM et la substance active, comme des interactions ioniques entre le noyau cationique du BVSM et l'oligonucléotide anionique. I1 y a donc formation d'un conjugué ionique stable dans un milieu biologique. Dans ce type de préparation, le rapport oligonucléotide / BVSM est de 5 à 10 ~ et le rendement d'association mesuré est supérieur à 90 La demande de brevet PCT publiée sous le numéro WO 96/06638 rapporte l'augmentation de l'immunogénicité d'un antigène, obtenue par un simple mélange antigène/BVSM.
L'antigène est là aussi associé au vecteur particulaire par
W094/20078.
La taille des BVSM est comprise entre 20 et 200 nm, préférentiellement entre 50 et 100 nm et plus préférentiellement entre 60 et 80 nm.
Les BVSM sont stérilisables par filtration et leur association aux principes actifs se fait sur les BVSM
complètement fabriqués (Major et al., Biochem. & Biophys.
Acta (1997),1327,32-40). Ceci permet de travailler les molécules biologiques, particulièrement fragiles, dans des conditions optimales.
Les BVSM protègent les molécules biologiques de la dégradation (Prieur R. et al. Vaccins (1996) Vol 14, N°6 pp. 511-520 Combination of hCMV recombinant IE1 protein with 80 nm cationic biovectors . protection from proteolysis and potentiation of presentation to CD4).
Il a aussi été montré qu'ils augmentent l'activité biologique de peptides et de protéines comme des enzymes, des antigènes, etc....
Les BVSM sont connus pour être utilisés comme transporteurs de substances actives, par exemple peptides, antigènes ou oligonucléotides. Dans cette utilisation, il y a formation d'un réel complexe entre le BVSM et la substance active, comme des interactions ioniques entre le noyau cationique du BVSM et l'oligonucléotide anionique. I1 y a donc formation d'un conjugué ionique stable dans un milieu biologique. Dans ce type de préparation, le rapport oligonucléotide / BVSM est de 5 à 10 ~ et le rendement d'association mesuré est supérieur à 90 La demande de brevet PCT publiée sous le numéro WO 96/06638 rapporte l'augmentation de l'immunogénicité d'un antigène, obtenue par un simple mélange antigène/BVSM.
L'antigène est là aussi associé au vecteur particulaire par
6 PCT/FRO1/01289 des liaisons ioniques et/ou hydrophobes. Pour obtenir ce résultat, on incube par exemple 1 mg de protéine GST-e4 pour mg de BVSM, ce qui permet d'obtenir des taux d'association moyens de 90 ~ quel que soit le type de BVSM
S utilisé (Prieur R. et al. Vaccins (1996) Vol 14, N°6 pp 511-520) .
La Demanderesse a maintenant découvert que les BVSM permettent d'améliorer les propriétés 10 immunomodulatrices d'une substance autre qu'un antigène capable de moduler la réponse immunologique. Ces substances sont plus particulièrement .
- des adjuvants capables d'amplifier, de réguler ou de modifier la réponse immune, - des cytokines et chemokines dont la propriété intrinsèque est de modifier l'activité des cellules du système immunitaire, - des immunosuppresseurs du fait de leur utilisation dans le traitement des allergies, et/ou du rejet de greffe, - des substances capables de modifier la balance Thl/Th2.
On peut rappeler que la réponse immunitaire est relayée par les cellules lymphocytaires notamment les cellules B et les lymphocytes T. Ces derniers peuvent être classés en deux sous-types sur la base de leur expression d'antigènes de surface CD4 et CD8. Les cellules CD4+ sont généralement impliquées dans les fonctions " helper ". En particulier, ils sécrètent des cytokines qui induisent la prolifération et la maturation des autres cellules lymphocytaires. Ainsi, deux profils des lymphocytes T helper peuvent être définis .
- d'une part, un profil Thl, qui caractérise une réponse à médiation cellulaire, avec l'induction de cytokines notamment d'IL2, d'IL7 et d'interféron gamma, la stimulation des CTL et l'induction d'anticorps de type IgG2a, et - d'autre part, un profil Th2, qui caractérise une réponse à médiation humorale, avec l'induction de
S utilisé (Prieur R. et al. Vaccins (1996) Vol 14, N°6 pp 511-520) .
La Demanderesse a maintenant découvert que les BVSM permettent d'améliorer les propriétés 10 immunomodulatrices d'une substance autre qu'un antigène capable de moduler la réponse immunologique. Ces substances sont plus particulièrement .
- des adjuvants capables d'amplifier, de réguler ou de modifier la réponse immune, - des cytokines et chemokines dont la propriété intrinsèque est de modifier l'activité des cellules du système immunitaire, - des immunosuppresseurs du fait de leur utilisation dans le traitement des allergies, et/ou du rejet de greffe, - des substances capables de modifier la balance Thl/Th2.
On peut rappeler que la réponse immunitaire est relayée par les cellules lymphocytaires notamment les cellules B et les lymphocytes T. Ces derniers peuvent être classés en deux sous-types sur la base de leur expression d'antigènes de surface CD4 et CD8. Les cellules CD4+ sont généralement impliquées dans les fonctions " helper ". En particulier, ils sécrètent des cytokines qui induisent la prolifération et la maturation des autres cellules lymphocytaires. Ainsi, deux profils des lymphocytes T helper peuvent être définis .
- d'une part, un profil Thl, qui caractérise une réponse à médiation cellulaire, avec l'induction de cytokines notamment d'IL2, d'IL7 et d'interféron gamma, la stimulation des CTL et l'induction d'anticorps de type IgG2a, et - d'autre part, un profil Th2, qui caractérise une réponse à médiation humorale, avec l'induction de
7 cytokines notamment d'IL4, d'IL5 et d'IL10, et la présence d'anticorps de type IgGl et IgE.
Les antigènes protéiques, dont la présentation par les cellules présentatrices d'antigènes (APC) est majoritairement faite par le CMH de classe II, induisent une réponse orientée vers les Th2. A l'inverse, l'ADN qui permet après transfection de présenter les antigènes directement sur les CMH de classe I, oriente la réponse immunitaire vers les Thl.
Certains adjuvants sont connus pour orienter la réponse majoritairement vers Thl ou Th2. Par exemple, les sels d'aluminium qui induisent une réponse sérique de type IgGl sont considérés comme Th2. A l'inverse des adjuvants comme les dérivés du lipid A (MPL) ou les dérivés du QuilA, qui induisent une réponse IgG2a et CTL, sont considérés comme Thl. I1 serait donc utile de disposer de moyens permettant d'agir sur la balance Thl/Th2, ce que précisément se propose de réaliser la présente invention.
Les travaux de recherche réalisés par la Demanderesse dans le cadre de la présente invention montrent que le BVSM n'agit pas comme un adjuvant, car seul il n'induit pas d'activation du système immunitaire, mais comme un " carrier " permettant une meilleure pénétration et/ou une meilleure présentation de l'antigène aux cellules présentatrices. Ainsi, les résultats obtenus ont montré
l' apport de BVSM sur le pouvoir adjuvant de la CTB, des MPL
et des ODN. De façon surprenante, le pouvoir adjuvant est visualisé de manière différente .
- sur la réponse IgG sérique, pour laquelle, une forte synergie, dans le cas de la CTB, ou une addition des réponses, dans le cas des ODN CpG, a été obtenue, - sur la réponse IgA, où une synergie est clairement démontrée pour les MPL, - sur la balance Thl/Th2, où même dans le cas d'une réponse quantitativement équivalente (IL2), on observe une différence qualitative de la réponse notamment dans la balance Igl/IgG2a qui reflète un différentiel dans la réponse cellulaire.
Les antigènes protéiques, dont la présentation par les cellules présentatrices d'antigènes (APC) est majoritairement faite par le CMH de classe II, induisent une réponse orientée vers les Th2. A l'inverse, l'ADN qui permet après transfection de présenter les antigènes directement sur les CMH de classe I, oriente la réponse immunitaire vers les Thl.
Certains adjuvants sont connus pour orienter la réponse majoritairement vers Thl ou Th2. Par exemple, les sels d'aluminium qui induisent une réponse sérique de type IgGl sont considérés comme Th2. A l'inverse des adjuvants comme les dérivés du lipid A (MPL) ou les dérivés du QuilA, qui induisent une réponse IgG2a et CTL, sont considérés comme Thl. I1 serait donc utile de disposer de moyens permettant d'agir sur la balance Thl/Th2, ce que précisément se propose de réaliser la présente invention.
Les travaux de recherche réalisés par la Demanderesse dans le cadre de la présente invention montrent que le BVSM n'agit pas comme un adjuvant, car seul il n'induit pas d'activation du système immunitaire, mais comme un " carrier " permettant une meilleure pénétration et/ou une meilleure présentation de l'antigène aux cellules présentatrices. Ainsi, les résultats obtenus ont montré
l' apport de BVSM sur le pouvoir adjuvant de la CTB, des MPL
et des ODN. De façon surprenante, le pouvoir adjuvant est visualisé de manière différente .
- sur la réponse IgG sérique, pour laquelle, une forte synergie, dans le cas de la CTB, ou une addition des réponses, dans le cas des ODN CpG, a été obtenue, - sur la réponse IgA, où une synergie est clairement démontrée pour les MPL, - sur la balance Thl/Th2, où même dans le cas d'une réponse quantitativement équivalente (IL2), on observe une différence qualitative de la réponse notamment dans la balance Igl/IgG2a qui reflète un différentiel dans la réponse cellulaire.
8 L'invention a donc tout d'abord pour objet l'utilisation d'un vecteur du type comportant un noyau hydrophile non liquide pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des cancers et/ou des maladies virales, ledit vecteur étant associé dans le médicament avec au moins une substance, autre qu'un antigène, capable de moduler la réponse immunitaire.
Le vecteur est avantageusement du type comportant un noyau hydrophile non liquide et une couche externe constituée au moins en partie de composés amphiphiles, associée au noyau par des interactions hydrophobes et/ou des liaisons ioniques. La couche externe est formée de dipalmitoyl phosphatidyl choline (DDPC) et de cholestérol.
Le noyau hydrophile non liquide est constitué
d'une matrice de polysaccharides ou d'oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés, sur lequel sont greffés des ligands ioniques.
Les ligands ioniques sont de préférence à charge positive, comme des ammoniums quaternaires.
Les vecteurs particulaires possédant un noyau hydrophile non liquide et une couche externe constituée de composés amphiphiles ont déjà été décrits, en particulier dans la demande de brevet W094/20078.
Le noyau hydrophile peut être obtenu par différentes méthodes déjà décrites précédemment (ainsi les brevets EP344040, W092/21329, W094/20078), et les procédés de réticulation sont connus de l'homme du métier, le polysaccharide peut être chargé positivement ou négativement, par la greffe de groupements ioniques, cationiques ou anioniques, aux sucres composant le polymère.
Ces groupements peuvent être choisis parmi des fonctions ammoniums quaternaires ou carboxyméthyles. Les procédés ont été décrits dans W092/21329 et les brevets cités précédemment. La charge du cour polysaccharidique des vecteurs des compositions selon l'invention est en général de préférence une charge positive. Toutefois les vecteurs dont les coeurs contiennent des charges négatives peuvent
Le vecteur est avantageusement du type comportant un noyau hydrophile non liquide et une couche externe constituée au moins en partie de composés amphiphiles, associée au noyau par des interactions hydrophobes et/ou des liaisons ioniques. La couche externe est formée de dipalmitoyl phosphatidyl choline (DDPC) et de cholestérol.
Le noyau hydrophile non liquide est constitué
d'une matrice de polysaccharides ou d'oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés, sur lequel sont greffés des ligands ioniques.
Les ligands ioniques sont de préférence à charge positive, comme des ammoniums quaternaires.
Les vecteurs particulaires possédant un noyau hydrophile non liquide et une couche externe constituée de composés amphiphiles ont déjà été décrits, en particulier dans la demande de brevet W094/20078.
Le noyau hydrophile peut être obtenu par différentes méthodes déjà décrites précédemment (ainsi les brevets EP344040, W092/21329, W094/20078), et les procédés de réticulation sont connus de l'homme du métier, le polysaccharide peut être chargé positivement ou négativement, par la greffe de groupements ioniques, cationiques ou anioniques, aux sucres composant le polymère.
Ces groupements peuvent être choisis parmi des fonctions ammoniums quaternaires ou carboxyméthyles. Les procédés ont été décrits dans W092/21329 et les brevets cités précédemment. La charge du cour polysaccharidique des vecteurs des compositions selon l'invention est en général de préférence une charge positive. Toutefois les vecteurs dont les coeurs contiennent des charges négatives peuvent
9 parfois être préférés, en particulier dans une composition pour une utilisation sous forme injectable.
Les brevets précédemment cités décrivent également les protocoles que l'homme du métier peut utiliser pour l'incorporation de la couche externe lipidique. Celle ci est de préférence composée de " DPPC-like ", c'est à dire de DPPC (dipalmitoyl phosphatidyl choline) ou de tout autre composé possédant les mêmes propriétés que ce produit, dans lequel est ajouté du cholestérol. Toutefois, d'autres composés lipidiques peuvent être utilisés en particulier des phospholipides ou des céramides, auxquels on peut additionner d'autres constituants, par exemple des constituants des membranes biologiques. De façon préférée, le rapport massique DPPC/Cholestérol est de 70/30.
Dans l'utilisation de l'invention, le rapport pondéral substance / particules est compris entre environ 1~
et 20~, de préférence entre environ 5% et 10~.
Avantageusement, le rapport pondéral (substance) / (noyau +
couche externe) est de 1 contre 10.
Une première classe de substances, autres qu'un antigène, capables de moduler la réponse immunitaire comprend des protéines d'intérêt thérapeutique qui jouent un rôle dans le fonctionnement du système immunitaire. Il s'agit plus particulièrement d'une cytokine ou d'une chémokine, de préférence choisie dans le groupe comprenant les interleukines, .les interférons, les TNF, les TGF, le G-CSF, le GM-CSF, le MIF, le RANTES, ou un mélange de ceux-ci.
Une seconde classe de substances, autres qu'un antigène, capables de moduler la réponse immunitaire, recouvrant partiellement la précédente, comprend les adjuvants. On entend par adjuvant, une molécule permettant d'amplifier, de réguler ou d'orienter la réponse immune spécifique d'un antigène. Ainsi, afin d'évaluer les propriétés des BVSM sur le pouvoir immunomodulateur de substances autres que des antigènes, diverses molécules appartenant aux principales catégories d'adjuvants ont été
testées dans le cadre de la présente invention, comme des WO 01/80836 PCT/F'ROi/01289 produits bactériens (endotoxines, composants de la paroi), des cytokines, des oligonucléotides (CpG). On peut citer plus particulièrement parmi celles-ci .
- des enterotoxines bactériennes, comme CT, CTB, S LT, - des dérivés liposaccharidiques, comme MPL et dérivés de lipide A, - des dérivés de la saponine type QS21, - des sels d'ammonium et leurs dérivés, comme
Les brevets précédemment cités décrivent également les protocoles que l'homme du métier peut utiliser pour l'incorporation de la couche externe lipidique. Celle ci est de préférence composée de " DPPC-like ", c'est à dire de DPPC (dipalmitoyl phosphatidyl choline) ou de tout autre composé possédant les mêmes propriétés que ce produit, dans lequel est ajouté du cholestérol. Toutefois, d'autres composés lipidiques peuvent être utilisés en particulier des phospholipides ou des céramides, auxquels on peut additionner d'autres constituants, par exemple des constituants des membranes biologiques. De façon préférée, le rapport massique DPPC/Cholestérol est de 70/30.
Dans l'utilisation de l'invention, le rapport pondéral substance / particules est compris entre environ 1~
et 20~, de préférence entre environ 5% et 10~.
Avantageusement, le rapport pondéral (substance) / (noyau +
couche externe) est de 1 contre 10.
Une première classe de substances, autres qu'un antigène, capables de moduler la réponse immunitaire comprend des protéines d'intérêt thérapeutique qui jouent un rôle dans le fonctionnement du système immunitaire. Il s'agit plus particulièrement d'une cytokine ou d'une chémokine, de préférence choisie dans le groupe comprenant les interleukines, .les interférons, les TNF, les TGF, le G-CSF, le GM-CSF, le MIF, le RANTES, ou un mélange de ceux-ci.
Une seconde classe de substances, autres qu'un antigène, capables de moduler la réponse immunitaire, recouvrant partiellement la précédente, comprend les adjuvants. On entend par adjuvant, une molécule permettant d'amplifier, de réguler ou d'orienter la réponse immune spécifique d'un antigène. Ainsi, afin d'évaluer les propriétés des BVSM sur le pouvoir immunomodulateur de substances autres que des antigènes, diverses molécules appartenant aux principales catégories d'adjuvants ont été
testées dans le cadre de la présente invention, comme des WO 01/80836 PCT/F'ROi/01289 produits bactériens (endotoxines, composants de la paroi), des cytokines, des oligonucléotides (CpG). On peut citer plus particulièrement parmi celles-ci .
- des enterotoxines bactériennes, comme CT, CTB, S LT, - des dérivés liposaccharidiques, comme MPL et dérivés de lipide A, - des dérivés de la saponine type QS21, - des sels d'ammonium et leurs dérivés, comme
10 l' alum, - des protéines type DT, TT, ou un mélange de ceux-ci La substance, autre qu'un antigène, capable de moduler la réponse immunitaire est choisie de préférence parmi .
- les adjuvants, capables d'amplifier, de réguler ou de modifier la réponse immune, - les cytokines et chemokines dont la propriété intrinsèque est de modifier l'activité des cellules du système immunitaire, - les immunosuppresseurs du fait de leur utilisation dans le traitement des allergies et/ou du rejet de greffe, - les substances capables de modifier la balance Thl/Th2.
Parmi celles-ci, l'invention envisage plus particulièrement comme substance, dont on souhaite améliorer les propriétés immunomodulatrices, les cytokines qui stimulent l'activité des cellules immunitaires, et parmi celles-ci, l'IL2, l'IL11 et le GM-CSF. En effet, les cytokines stimulent ou inhibent l'activité des cellules immunitaires.
Une forme de mise en oeuvre toute préfére de l'invention concerne l'utilisation d'un vecteur comportant .
a) un noyau hydrophile non liquide, constitué
d'une matrice de polysaccharides ou d'olïgosaccharides
- les adjuvants, capables d'amplifier, de réguler ou de modifier la réponse immune, - les cytokines et chemokines dont la propriété intrinsèque est de modifier l'activité des cellules du système immunitaire, - les immunosuppresseurs du fait de leur utilisation dans le traitement des allergies et/ou du rejet de greffe, - les substances capables de modifier la balance Thl/Th2.
Parmi celles-ci, l'invention envisage plus particulièrement comme substance, dont on souhaite améliorer les propriétés immunomodulatrices, les cytokines qui stimulent l'activité des cellules immunitaires, et parmi celles-ci, l'IL2, l'IL11 et le GM-CSF. En effet, les cytokines stimulent ou inhibent l'activité des cellules immunitaires.
Une forme de mise en oeuvre toute préfére de l'invention concerne l'utilisation d'un vecteur comportant .
a) un noyau hydrophile non liquide, constitué
d'une matrice de polysaccharides ou d'olïgosaccharides
11 naturellement ou chimiquement réticulés, sur lequel sont greffés des ligands ioniques, b) une couche externe constituée au moins en partie de composés amphiphiles, associée au noyau par des interactions hydrophobes et/ou des liaisons ioniques et c) incorporant de l'interleukine 2 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des cancers.
Une telle composition pharmaceutique, contenant un vecteur comportant .
a) un noyau hydrophile non liquide, constitué
d'une matrice de polysaccharides ou d'oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés, sur lequel sont greffés des ligands ioniques, b) une couche externe constituée au moins en partie de composés amphiphiles, associée au noyau par des interactions hydrophobes et/ou des liaisons ioniques et c) incorporant de l'interleukine 2 fait également partie de l'invention.
Dans cette utilisation, l'invention s'intéresse au traitement des cancers du type non immunogénique ou faiblement immunogénique, et/ou au traitement des infections notamment virales comme le sida ou l'hépatite chronique où
les immunomodulateurs ont été proposés en complément de traitements thérapeutiques pour activer la réponse immunitaire. Une composition pour la mise en ouvre de cette utilisation comprend des particules hydrophiles portant ou non des ligands ioniques et éventuellement recouvertes d'une couche de composés amphiphiles dans lesquelles sont incorporées des protéines d'intérêt thérapeutique ou des adjuvants comme définis ci-dessus. Une telle composition ne comprend pas d'antigène.
Les cancers pouvant être traités par une composition selon l'invention peuvent être de toutes sortes.
En particulier, on cite les cancers de la sphère ORL, de l'oesophage, de l'estomac, du colon, du rectum, de la prostate, du foie, du pancréas, du sein, du col ou du corps utérin, de l'ovaire, du rein, de la vessie, de l'os, ou de
Une telle composition pharmaceutique, contenant un vecteur comportant .
a) un noyau hydrophile non liquide, constitué
d'une matrice de polysaccharides ou d'oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés, sur lequel sont greffés des ligands ioniques, b) une couche externe constituée au moins en partie de composés amphiphiles, associée au noyau par des interactions hydrophobes et/ou des liaisons ioniques et c) incorporant de l'interleukine 2 fait également partie de l'invention.
Dans cette utilisation, l'invention s'intéresse au traitement des cancers du type non immunogénique ou faiblement immunogénique, et/ou au traitement des infections notamment virales comme le sida ou l'hépatite chronique où
les immunomodulateurs ont été proposés en complément de traitements thérapeutiques pour activer la réponse immunitaire. Une composition pour la mise en ouvre de cette utilisation comprend des particules hydrophiles portant ou non des ligands ioniques et éventuellement recouvertes d'une couche de composés amphiphiles dans lesquelles sont incorporées des protéines d'intérêt thérapeutique ou des adjuvants comme définis ci-dessus. Une telle composition ne comprend pas d'antigène.
Les cancers pouvant être traités par une composition selon l'invention peuvent être de toutes sortes.
En particulier, on cite les cancers de la sphère ORL, de l'oesophage, de l'estomac, du colon, du rectum, de la prostate, du foie, du pancréas, du sein, du col ou du corps utérin, de l'ovaire, du rein, de la vessie, de l'os, ou de
12 la thyroïde. On ajoute aussi les cancers broncho-pulmonaires, les mélanomes malins, les tumeurs cérébrales, les lymphomes (Hodgskiniens ou non), les leucémies (myéloïdes ou lymphoïdes), les cancers de localisation primitive inconnue. Ces cancers peuvent être primaires ou métastatiques. Ils peuvent être de type sarcome, adénome, carcinome, adénocarcinome, lymphome, myélome, gliome, blastome, glioblastome. Les cancers pouvant être traités par une composition selon l'invention peuvent être immunogéniques ou non. La Demanderesse a montré que les compositions selon l'invention sont particulièrement efficaces dans le traitement et le contrôle de cancers peu ou pas immunogéniques.
Les compositions et médicaments selon l'invention peuvent être administrés de diverses façons, en particulier par voie parentérale. On peut ainsi administrer les compositions selon l'invention par voie intraveineuse, sous-cutanée, intramusculaire, ou intradermale.
L'administration peut également être effectuée (et c'est un gros avantage de l'invention) par voie orale ou intranasale.
Les compositions permettant une prise orale peuvent être des comprimés, des gélules, des poudres, des granules ou des suspensions ou solutions orales. Elles comprennent également les formes d'administration sublinguale et buccale.
On peut éventuellement rajouter certains excipients aux compositions pharmaceutiques selon l'invention. On peut ainsi utiliser toute sorte d'agents liant, tensioactif, d'enrobage, de dispersion, ou de mouillage.
3 0 La Demanderesse a montré que ces vecteurs sont capables de fixer l'IL-2 de façon très efficace, que la protéine conserve son activité biologique, et que, de façon inattendue, cette activité est augmentée par rapport à la protéine non formulée.
La Demanderesse a également montré qu'une formulation selon l'invention permet de stabiliser la protéine en solution, de la même manière qu'en présence d'albumine. Ainsi, l'utilisation d'un vecteur comportant .
WO 01/80836 PCT/F'RO1/01289
Les compositions et médicaments selon l'invention peuvent être administrés de diverses façons, en particulier par voie parentérale. On peut ainsi administrer les compositions selon l'invention par voie intraveineuse, sous-cutanée, intramusculaire, ou intradermale.
L'administration peut également être effectuée (et c'est un gros avantage de l'invention) par voie orale ou intranasale.
Les compositions permettant une prise orale peuvent être des comprimés, des gélules, des poudres, des granules ou des suspensions ou solutions orales. Elles comprennent également les formes d'administration sublinguale et buccale.
On peut éventuellement rajouter certains excipients aux compositions pharmaceutiques selon l'invention. On peut ainsi utiliser toute sorte d'agents liant, tensioactif, d'enrobage, de dispersion, ou de mouillage.
3 0 La Demanderesse a montré que ces vecteurs sont capables de fixer l'IL-2 de façon très efficace, que la protéine conserve son activité biologique, et que, de façon inattendue, cette activité est augmentée par rapport à la protéine non formulée.
La Demanderesse a également montré qu'une formulation selon l'invention permet de stabiliser la protéine en solution, de la même manière qu'en présence d'albumine. Ainsi, l'utilisation d'un vecteur comportant .
WO 01/80836 PCT/F'RO1/01289
13 (a) un noyau hydrophile non liquide constitué
d'une matrice polysaccharidique ou d'oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés, sur lequel sont greffés des ligands ioniques de charge positive ou négative, $ (b) une couche externe constituée au moins en partie de composés amphiphiles associée au noyau par des interactions hydrophobes et/ou des liaisons ioniques et (c) incorporant l'IL-2 pour la préparation d'un médicament destiné à
l'administration sous forme injectable de ladite protéine IL-2 en l'absence d'albumine fait également partie de l'invention.
De plus, la Demanderesse a montré que l'association vecteur-protéine reste stable (mesurée par un maintien de l'activité après plusieurs mois de stockage), ce qui présente une amélioration par rapport à la technique précédente, dans laquelle les préparations thérapeutiques d'IL-2 ne peuvent être conservées, ce qui en augmente d'autant plus le coût.
Enfin, la Demanderesse a montré que, de façon surprenante, l'IL-2 formulée selon l'invention, et administrée par la voie intranasale posséde une activité
similaire ou supérieure à l'IL-2 administrée par des voies plus classiques, telles la voie sous-cutanée.
L'utilisation d'un vecteur selon l'invention permet donc de s'affranchir de tous les différents problèmes précédemment posés lors de l'utilisation de l'IL-2.
Un vecteur selon l'invention est donc utilisable pour la traitement des cancers où l'on recherche une potentiation de la réponse immunitaire.
L'invention a aussi pour objet un procédé pour améliorer les propriétés immunomodulatrices d'une substance, autre qu'un antigène, capable de moduler la réponse immunitaire, caractérisé en ce qu'il comprend le mélange de ladite substance avec des vecteurs du type comportant un noyau hydrophile non liquide. Avantageusement, les vecteurs sont du type comportant un noyau hydrophile non liquide et une couche externe constituée au moins en partie de composés
d'une matrice polysaccharidique ou d'oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés, sur lequel sont greffés des ligands ioniques de charge positive ou négative, $ (b) une couche externe constituée au moins en partie de composés amphiphiles associée au noyau par des interactions hydrophobes et/ou des liaisons ioniques et (c) incorporant l'IL-2 pour la préparation d'un médicament destiné à
l'administration sous forme injectable de ladite protéine IL-2 en l'absence d'albumine fait également partie de l'invention.
De plus, la Demanderesse a montré que l'association vecteur-protéine reste stable (mesurée par un maintien de l'activité après plusieurs mois de stockage), ce qui présente une amélioration par rapport à la technique précédente, dans laquelle les préparations thérapeutiques d'IL-2 ne peuvent être conservées, ce qui en augmente d'autant plus le coût.
Enfin, la Demanderesse a montré que, de façon surprenante, l'IL-2 formulée selon l'invention, et administrée par la voie intranasale posséde une activité
similaire ou supérieure à l'IL-2 administrée par des voies plus classiques, telles la voie sous-cutanée.
L'utilisation d'un vecteur selon l'invention permet donc de s'affranchir de tous les différents problèmes précédemment posés lors de l'utilisation de l'IL-2.
Un vecteur selon l'invention est donc utilisable pour la traitement des cancers où l'on recherche une potentiation de la réponse immunitaire.
L'invention a aussi pour objet un procédé pour améliorer les propriétés immunomodulatrices d'une substance, autre qu'un antigène, capable de moduler la réponse immunitaire, caractérisé en ce qu'il comprend le mélange de ladite substance avec des vecteurs du type comportant un noyau hydrophile non liquide. Avantageusement, les vecteurs sont du type comportant un noyau hydrophile non liquide et une couche externe constituée au moins en partie de composés
14 amphiphiles, associée au noyau par des interactions hydrophobes et/ou des liaisons ioniques. Comme indiqué
précédemment, le noyau hydrophile non liquide est constitué
d'une matrice de polysaccharides ou d'oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés, sur lequel sont greffés des ligands ioniques, notamment de charge positive, comme des ammoniums quaternaires. La couche externe est par exemple formée de dipalmitoyl phosphatidyl choline (DDPC) et de cholestérol, notamment selon le rapport massique DPPC/cholestérol est de 70/30. De préférence, le rapport pondéral substance/vecteurs dans le mélange est compris entre environ l~ et 20~, de préférence entre environ 5~ et 10~.
Comme précédemment, la substance, autre qu'un antigène, capable de moduler la réponse immunitaire est choisie parmi .
- une protéine d'intérêt thérapeutique qui joue un rôle dans le fonctionnement du système immunitaire, comme une cytokine ou une chémokine, de préférence choisie dans le groupe comprenant les interleukines, les interférons, les TNF, les TGF, le G-CSF, le GM-CSF, le MIF, le RANTES, ou un mélange de ceux-ci, - un adjuvant, notamment choisi dans le groupe comprenant les enterotoxines bactériennes, les dérivés de liposaccharides, les oligonucléotides, des saponines, les sels d'ammonium et leurs dérivés, les protéines de type DT
ou TT ou un mélange., de ceux-ci.
- une substances capable de modifier la balance Thl/Th2.
- un immunosupresseur.
L'invention se rapporte aussi à une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend .
- un vecteur du type comportant un noyau hydrophile non liquide constitué d'une matrice de polysaccharides ou d'oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés, sur lequel sont greffés des ligands ioniques, et une couche externe constituée au moins en partie de composés amphiphiles, associée au noyau par des interactions hydrophobes et/ou des liaisons ioniques, et - au moins une protéine d'intérêt thérapeutique et/ou un adjuvant ou un mélange de ceux-ci.
5 Le vecteur, la protéine d'intérêt thérapeutique et l'adjuvant étant définis comme précédemment.
L'invention concerne encore tout particulièrement l'utilisation de vecteurs, comme définis 10 précédemment, pour la préparation d'une composition vaccinale thérapeutique ou prophylactique, lesdites particules étant mélangées dans la composition avec au moins un antigène et au moins une substance capable de moduler la réponse immunologique audit antigène. Dans le cas d'une
précédemment, le noyau hydrophile non liquide est constitué
d'une matrice de polysaccharides ou d'oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés, sur lequel sont greffés des ligands ioniques, notamment de charge positive, comme des ammoniums quaternaires. La couche externe est par exemple formée de dipalmitoyl phosphatidyl choline (DDPC) et de cholestérol, notamment selon le rapport massique DPPC/cholestérol est de 70/30. De préférence, le rapport pondéral substance/vecteurs dans le mélange est compris entre environ l~ et 20~, de préférence entre environ 5~ et 10~.
Comme précédemment, la substance, autre qu'un antigène, capable de moduler la réponse immunitaire est choisie parmi .
- une protéine d'intérêt thérapeutique qui joue un rôle dans le fonctionnement du système immunitaire, comme une cytokine ou une chémokine, de préférence choisie dans le groupe comprenant les interleukines, les interférons, les TNF, les TGF, le G-CSF, le GM-CSF, le MIF, le RANTES, ou un mélange de ceux-ci, - un adjuvant, notamment choisi dans le groupe comprenant les enterotoxines bactériennes, les dérivés de liposaccharides, les oligonucléotides, des saponines, les sels d'ammonium et leurs dérivés, les protéines de type DT
ou TT ou un mélange., de ceux-ci.
- une substances capable de modifier la balance Thl/Th2.
- un immunosupresseur.
L'invention se rapporte aussi à une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend .
- un vecteur du type comportant un noyau hydrophile non liquide constitué d'une matrice de polysaccharides ou d'oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés, sur lequel sont greffés des ligands ioniques, et une couche externe constituée au moins en partie de composés amphiphiles, associée au noyau par des interactions hydrophobes et/ou des liaisons ioniques, et - au moins une protéine d'intérêt thérapeutique et/ou un adjuvant ou un mélange de ceux-ci.
5 Le vecteur, la protéine d'intérêt thérapeutique et l'adjuvant étant définis comme précédemment.
L'invention concerne encore tout particulièrement l'utilisation de vecteurs, comme définis 10 précédemment, pour la préparation d'une composition vaccinale thérapeutique ou prophylactique, lesdites particules étant mélangées dans la composition avec au moins un antigène et au moins une substance capable de moduler la réponse immunologique audit antigène. Dans le cas d'une
15 utilisation thérapeutique, l'invention s'intéresse tout particulièrement au traitement et/ou à la prévention des maladies virales, notamment le sida et l'hépatite chronique, mais aussi des cancers ayant un caractère immunogénique.
L'invention concerne donc tout spécialement une composition vaccinale caractérisée en ce qu'elle comprend des vecteurs comme définis précédemment et un antigène ou un mélange d'antigènes, et au moins une substance capable de moduler la réponse immunologique audit antigène.
La substance capable de moduler la réponse immunologique à l'antigène présent dans la composition de l'invention est de préférence un adjuvant. Parmi ceux-ci, l'invention envisage des produits bactériens (endotoxines, composants de la paroi), des cytokines, des oligonucléotides (CpG). On peut citer plus particulièrement parmi celles-ci .
- des enterotoxines bactériennes, comme CT, CTB, LT, - des dérivés liposaccharidiques, comme MPL et dérivés de lipide A, - des dérivés de la saponine type QS21, - des sels d'ammonium et leurs dérivés, comme l'alum, - des protéines type DT, TT, ou un mélange de ceux-ci.
L'invention concerne donc tout spécialement une composition vaccinale caractérisée en ce qu'elle comprend des vecteurs comme définis précédemment et un antigène ou un mélange d'antigènes, et au moins une substance capable de moduler la réponse immunologique audit antigène.
La substance capable de moduler la réponse immunologique à l'antigène présent dans la composition de l'invention est de préférence un adjuvant. Parmi ceux-ci, l'invention envisage des produits bactériens (endotoxines, composants de la paroi), des cytokines, des oligonucléotides (CpG). On peut citer plus particulièrement parmi celles-ci .
- des enterotoxines bactériennes, comme CT, CTB, LT, - des dérivés liposaccharidiques, comme MPL et dérivés de lipide A, - des dérivés de la saponine type QS21, - des sels d'ammonium et leurs dérivés, comme l'alum, - des protéines type DT, TT, ou un mélange de ceux-ci.
16 Comme indiqué précédemment, le rapport pondéral substance/particules est compris entre environ 1~ et 20%, de préférence entre environ 5~ et 10~.
L'invention est tout particulièrement adaptée à
la préparation de composition, plus particulièrement, pour l'administration mucosale, notamment nasale, mais tout autre mode d'administration, par exemple parentérale, peut être envisagée.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent concernant:
- Exemple 1 . la préparation et l'activité
biologique de BVSM-IL2.
- Exemple 2 . (ii) l'effet chez la souris du BVSM sur l'immunogénicité d'un split Influenza trivalent à
celui de différents adjuvants, et (iii) l'effet chez la souris de la co-administration de la formulation et de différents adjuvants sur l'immunogénicité d'un split Influenza trivalent.
Les exemples qui suivent sont destinés à
illustrer l'invention, sans toutefois être limitatifs. En particulier les valeurs données ne le sont qu'à titre d'exemple et peuvent être optimisées lors d'une mise en ouvre de la présente invention.
I1 sera fait référence dans l'exemple 1 aux figures suivantes .
Figure 1 . Analyse ELISA des interactions BVSM
IL2, permettant en particulier de calculer le rapport massique optimal entre la protéine d'intérêt et le vecteur.
Les valeurs sont données en Unités Arbitraires (UA).
Figure 2 . Analyse des BVSM-IL2 sur un appareil Biacore . Comparaison de la réfraction entre une composition d'IL-2 libre et la composition BVSM-IL2. Les valeurs sont données en Unités de Réfraction (RU).
Figure 3 . Prolifération de cellules mononucléaires périphériques stimulées préalablement stimulées par PHA, et par des BVSM-IL2 de diverses WO 01/80836 PCT/F'RO1/01289
L'invention est tout particulièrement adaptée à
la préparation de composition, plus particulièrement, pour l'administration mucosale, notamment nasale, mais tout autre mode d'administration, par exemple parentérale, peut être envisagée.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent concernant:
- Exemple 1 . la préparation et l'activité
biologique de BVSM-IL2.
- Exemple 2 . (ii) l'effet chez la souris du BVSM sur l'immunogénicité d'un split Influenza trivalent à
celui de différents adjuvants, et (iii) l'effet chez la souris de la co-administration de la formulation et de différents adjuvants sur l'immunogénicité d'un split Influenza trivalent.
Les exemples qui suivent sont destinés à
illustrer l'invention, sans toutefois être limitatifs. En particulier les valeurs données ne le sont qu'à titre d'exemple et peuvent être optimisées lors d'une mise en ouvre de la présente invention.
I1 sera fait référence dans l'exemple 1 aux figures suivantes .
Figure 1 . Analyse ELISA des interactions BVSM
IL2, permettant en particulier de calculer le rapport massique optimal entre la protéine d'intérêt et le vecteur.
Les valeurs sont données en Unités Arbitraires (UA).
Figure 2 . Analyse des BVSM-IL2 sur un appareil Biacore . Comparaison de la réfraction entre une composition d'IL-2 libre et la composition BVSM-IL2. Les valeurs sont données en Unités de Réfraction (RU).
Figure 3 . Prolifération de cellules mononucléaires périphériques stimulées préalablement stimulées par PHA, et par des BVSM-IL2 de diverses WO 01/80836 PCT/F'RO1/01289
17 compositions. La prolifération est mesurée par incorporation de thymidine marquée au 3H et est proportionnelle au nombre de coups par minutes (cpm) relevés.
Figure 4 . Effet de différentes formulations d'IL-2 sur l'implantation et la croissance d'une tumeur dans un modèle TS/A, après co-administration. Les symboles représentent . PBS, tampon de saline ; IL-2, interleukine 2 non formulée ; KY, vecteur à cour cationique et couche DPPC
/ Cholestérol ; KY / IL-2, vecteur KY formulé avec IL-2.
Figure 5 . Effet de différentes formulations d'IL-2 sur l'implantation et la croissance d'une tumeur dans un modèle TS/A, après administration dans le flanc contralatéral de souris BALB/c. Les symboles sont les mêmes que précédemment, les valeurs numériques indiquées correspondent aux valeurs UI de l'IL-2.
Figure 6 . A. Propriétés de rejet d'une tumeur TS/A implantée par administration sous cutanée de KY / IL-2 dans le flanc contralatéral de souris BALB/c à un ou cinq site(s), six jours après implantation. Les symboles sont les mêmes que précédemment, les valeurs numériques indiquées correspondent aux valeurs UI de l'IL-2. B. protection de souris guéries après ré-injection de cellules tumorales TS/A. Dans les deux figures, le nombre de souris présentant des tumeurs est indiqué entre parenthèses.
Figure 7 . A. Propriétés de rejet d'une tumeur TS/A implantée par administration intranasale de KY / IL-2 dans le flanc contralatéral de souris BALB/c une ou deux fois par jour, pendant cinq jours, six jours après implantation. Les symboles sont les mêmes que précédemment, les valeurs numériques indiquées correspondent aux valeurs UI de l'IL-2. B. protection de souris guéries après ré-injection de cellules tumorales TS/A. Dans les deux figures, le nombre de souris présentant des tumeurs est indiqué entre parenthèses.
Figure 8 . activité CTL antitumorale chez les souris ayant rejeté les cellules TS/A après administration de KY / IL-2. A. Souris ayant reçu une administration sous cutanée. B. Souris ayant reçu une administration intranasale.
Figure 4 . Effet de différentes formulations d'IL-2 sur l'implantation et la croissance d'une tumeur dans un modèle TS/A, après co-administration. Les symboles représentent . PBS, tampon de saline ; IL-2, interleukine 2 non formulée ; KY, vecteur à cour cationique et couche DPPC
/ Cholestérol ; KY / IL-2, vecteur KY formulé avec IL-2.
Figure 5 . Effet de différentes formulations d'IL-2 sur l'implantation et la croissance d'une tumeur dans un modèle TS/A, après administration dans le flanc contralatéral de souris BALB/c. Les symboles sont les mêmes que précédemment, les valeurs numériques indiquées correspondent aux valeurs UI de l'IL-2.
Figure 6 . A. Propriétés de rejet d'une tumeur TS/A implantée par administration sous cutanée de KY / IL-2 dans le flanc contralatéral de souris BALB/c à un ou cinq site(s), six jours après implantation. Les symboles sont les mêmes que précédemment, les valeurs numériques indiquées correspondent aux valeurs UI de l'IL-2. B. protection de souris guéries après ré-injection de cellules tumorales TS/A. Dans les deux figures, le nombre de souris présentant des tumeurs est indiqué entre parenthèses.
Figure 7 . A. Propriétés de rejet d'une tumeur TS/A implantée par administration intranasale de KY / IL-2 dans le flanc contralatéral de souris BALB/c une ou deux fois par jour, pendant cinq jours, six jours après implantation. Les symboles sont les mêmes que précédemment, les valeurs numériques indiquées correspondent aux valeurs UI de l'IL-2. B. protection de souris guéries après ré-injection de cellules tumorales TS/A. Dans les deux figures, le nombre de souris présentant des tumeurs est indiqué entre parenthèses.
Figure 8 . activité CTL antitumorale chez les souris ayant rejeté les cellules TS/A après administration de KY / IL-2. A. Souris ayant reçu une administration sous cutanée. B. Souris ayant reçu une administration intranasale.
18 Il sera fait référence dans l'exemple 2 au figures suivantes Figure 9 . analyse au Biacore (résonance plasmonique de surface) de l'association de la CTB avec les BVSMTM en fonction de la concentration en CTB.
Figure 10 . analyse au Biacore de l'association du MPL avec les BVSMTM en fonction de la concentration en MPL.
Figure 11 . inhibition de l'association du split B Harbin sur les BVSM en présence d'une quantité croissante de CTB.
Figure 12 . inhibition de l'association de split B Harbin sur les BVSM en présence d'une quantité croissante de MPL.
Figure 13 . sensorgrammes obtenus en comparant les deux modes de préparation de la CTB et des antigènes grippe sur les BVSM immobilisés sur la sensorship HPA. Dans un premier temps la CTB puis l'antigène sont déposés successivement sur les BVSM (courbe A) et inversement (courbe B) .
Figure 14 . sensorgrammes obtenus en comparant les deux modes de préparation du MPL et des antigènes de la grippe sur les BVSM immobilisés sur la sensorship HPA. Dans un premier temps, le MPL puis l'antigène sont déposés successivement sur les BVSM (courbe A) et inversement (courbe B).
Figure 15 . titration spécifique du split B/Harbin des pools de sérums (IgG) et des secrétions nasales (IgA) de souris administrées par les formulations trivalentes et les témoins antigènes associês ou non à la CTB.
Figure 16 . titration spécifique du split B/Harbin des pools de sérums (IgG) et des secrétions nasales (IgA) de souris administrées par les formulations trivalentes et les témoins antigènes associés ou non au MPL.
Figure 17 . représente la titration spécifique du split B/Harbin des pools de sérums (IgG) et des secrétions nasales (IgA) de souris administrées par les
Figure 10 . analyse au Biacore de l'association du MPL avec les BVSMTM en fonction de la concentration en MPL.
Figure 11 . inhibition de l'association du split B Harbin sur les BVSM en présence d'une quantité croissante de CTB.
Figure 12 . inhibition de l'association de split B Harbin sur les BVSM en présence d'une quantité croissante de MPL.
Figure 13 . sensorgrammes obtenus en comparant les deux modes de préparation de la CTB et des antigènes grippe sur les BVSM immobilisés sur la sensorship HPA. Dans un premier temps la CTB puis l'antigène sont déposés successivement sur les BVSM (courbe A) et inversement (courbe B) .
Figure 14 . sensorgrammes obtenus en comparant les deux modes de préparation du MPL et des antigènes de la grippe sur les BVSM immobilisés sur la sensorship HPA. Dans un premier temps, le MPL puis l'antigène sont déposés successivement sur les BVSM (courbe A) et inversement (courbe B).
Figure 15 . titration spécifique du split B/Harbin des pools de sérums (IgG) et des secrétions nasales (IgA) de souris administrées par les formulations trivalentes et les témoins antigènes associês ou non à la CTB.
Figure 16 . titration spécifique du split B/Harbin des pools de sérums (IgG) et des secrétions nasales (IgA) de souris administrées par les formulations trivalentes et les témoins antigènes associés ou non au MPL.
Figure 17 . représente la titration spécifique du split B/Harbin des pools de sérums (IgG) et des secrétions nasales (IgA) de souris administrées par les
19 formulations trivalentes et les témoins antigènes associés ou non aux oligonucléotides.
Exemple 1 Préparation et activité biologique de BVSM-IL2.
1) Caractérisation des particules chargées en IL-2.
A. Préparation des vecteurs chargés en IL-2.
Les vecteurs utilisés (BVSM) dans cet exemple ont été décrits précédemment. I1 s'agit de vecteurs cationiques possédant une couche lipidique en DPPC-Cholestérol.
L'interleukine 2 (IL-2) utilisée provient de chez Chiron. Elle se présente sous forme d'IL-2 recombinante lyophilisée, telle que 18.106 UI - 1,1 mg de protéine lyophilisée.
Une composition selon l'invention est obtenue par la liaison BVSM-IL2 par simple mélange des deux composés, dans un rapport en poids de 10/1, et dans une solution de saline tamponnée (PBS).
B. Détermination du rapport optimal BVSM-IL2.
Le rapport massique optimal de BVSM par rapport à la protéine est déterminé par analyse par ELISA, selon une méthode bien connue de l'homme du métiér.
Brièvement, on couvre les puits avec un anticorps anti-IL2, et on sature avec de la BSA (albumine de sérum bovine). On ajoute la préparation d'IL-2 à tester, puis on ajoute un second anticorps anti-IL2, biotinylê.
L'ajout de streptavidine liée à une peroxydase suivi de l'addition d'un substrat de ladite peroxydase permet de déterminer la quantité d'IL-2 présente dans la solution, par colorimétrie. Les valeurs obtenues sont exprimées en Unités Arbitraires, une valeur étant d'autant plus élevée qu'il y a d'IL-2 présente dans la solution testée.
Les préparations testées sont des préparations dans lesquelles une même quantité d'IL-2 a été introduite, en présence de vecteurs dans des proportions diverses, ou en leur absence, avec ou sans BSA en tant que stabilisateur des protéines.
Les résultats sont exprimés dans la figure 1. On observe que l'on obtient environ le même taux d'IL-2 5 disponible dans les préparations contenant de la BSA, ou un taux de vecteurs particulaires tel que le rapport massique BVSM/IL-2 soit de 10/1. Lorsque l'IL-2 est seule dans le PBS
ou que le rapport massique est inférieur, il y a moins d'IL-2 disponible en solution.
10 Ces résultats montrent donc que les vecteurs sont aussi efficaces que l'albumine pour stabiliser l'IL-2 et empêcher une baisse de la concentration efficace.
C. Détermination du taux d'association de l'IL-2 15 aux BVSM.
On détermine le taux d'association de l'IL-2 aux vecteurs par la technique de résonance de surface du plasmon dans un appareil Biacore X, en suivant les instructions du fabricant. Cette méthode permet la détection des différences
Exemple 1 Préparation et activité biologique de BVSM-IL2.
1) Caractérisation des particules chargées en IL-2.
A. Préparation des vecteurs chargés en IL-2.
Les vecteurs utilisés (BVSM) dans cet exemple ont été décrits précédemment. I1 s'agit de vecteurs cationiques possédant une couche lipidique en DPPC-Cholestérol.
L'interleukine 2 (IL-2) utilisée provient de chez Chiron. Elle se présente sous forme d'IL-2 recombinante lyophilisée, telle que 18.106 UI - 1,1 mg de protéine lyophilisée.
Une composition selon l'invention est obtenue par la liaison BVSM-IL2 par simple mélange des deux composés, dans un rapport en poids de 10/1, et dans une solution de saline tamponnée (PBS).
B. Détermination du rapport optimal BVSM-IL2.
Le rapport massique optimal de BVSM par rapport à la protéine est déterminé par analyse par ELISA, selon une méthode bien connue de l'homme du métiér.
Brièvement, on couvre les puits avec un anticorps anti-IL2, et on sature avec de la BSA (albumine de sérum bovine). On ajoute la préparation d'IL-2 à tester, puis on ajoute un second anticorps anti-IL2, biotinylê.
L'ajout de streptavidine liée à une peroxydase suivi de l'addition d'un substrat de ladite peroxydase permet de déterminer la quantité d'IL-2 présente dans la solution, par colorimétrie. Les valeurs obtenues sont exprimées en Unités Arbitraires, une valeur étant d'autant plus élevée qu'il y a d'IL-2 présente dans la solution testée.
Les préparations testées sont des préparations dans lesquelles une même quantité d'IL-2 a été introduite, en présence de vecteurs dans des proportions diverses, ou en leur absence, avec ou sans BSA en tant que stabilisateur des protéines.
Les résultats sont exprimés dans la figure 1. On observe que l'on obtient environ le même taux d'IL-2 5 disponible dans les préparations contenant de la BSA, ou un taux de vecteurs particulaires tel que le rapport massique BVSM/IL-2 soit de 10/1. Lorsque l'IL-2 est seule dans le PBS
ou que le rapport massique est inférieur, il y a moins d'IL-2 disponible en solution.
10 Ces résultats montrent donc que les vecteurs sont aussi efficaces que l'albumine pour stabiliser l'IL-2 et empêcher une baisse de la concentration efficace.
C. Détermination du taux d'association de l'IL-2 15 aux BVSM.
On détermine le taux d'association de l'IL-2 aux vecteurs par la technique de résonance de surface du plasmon dans un appareil Biacore X, en suivant les instructions du fabricant. Cette méthode permet la détection des différences
20 dans l'index de réfraction d'une couche de surface d'une solution en contact avec la puce de détection, par illumination avec une lumière polarisée monochromatique.
Le protocole opératoire est le suivant .
- on adsorbe les BVSM (0,05 g/1) sur la surface de la puce de détection ;
- on injecte l'IL-2 libre (1-6 mg/ml) afin de déterminer la courbe standard (exprimée comme unités de résonance, RU) qui est fonction de la concentration de protéine injectée ;
- après régénération, on injecte une préparation telle que préparée dans l'exemple 1.A, dans laquelle sont présents les BVSM-IL2, ainsi que de l'IL-2 libre. Seule cette dernière peut s'associer aux BVSM fixés à la surface de la puce de détection.
Ce protocole permet de déterminer la concentration d'IL-2 libre dans la formulation de l'exemple 1.A et d'en déduire le taux d'association BVSM-IL2.
Les données de la figure 2 permettent de calculer que ledit taux d'association est de 85 ~.
Le protocole opératoire est le suivant .
- on adsorbe les BVSM (0,05 g/1) sur la surface de la puce de détection ;
- on injecte l'IL-2 libre (1-6 mg/ml) afin de déterminer la courbe standard (exprimée comme unités de résonance, RU) qui est fonction de la concentration de protéine injectée ;
- après régénération, on injecte une préparation telle que préparée dans l'exemple 1.A, dans laquelle sont présents les BVSM-IL2, ainsi que de l'IL-2 libre. Seule cette dernière peut s'associer aux BVSM fixés à la surface de la puce de détection.
Ce protocole permet de déterminer la concentration d'IL-2 libre dans la formulation de l'exemple 1.A et d'en déduire le taux d'association BVSM-IL2.
Les données de la figure 2 permettent de calculer que ledit taux d'association est de 85 ~.
21 2) Analyse de l'activité biologique de l'IL-2 ow.e.r,n.i ô0 3 ~-7i ~~~roni-o ~rcn~ciirc Cet exemple montre l'importance de la composition des noyaux et couches du vecteur sur l'activité
biologique de l'IL-2.
On utilise quatre types différents de vecteurs .
- deux vecteurs possédant un coeur anionique avec une couche lipidique contenant a. un mélange Phospholipon / Cholestérol (P
PLpon/Chol), ou b. un mélange DPPC / Cholestérol (P DPPC/Chol, ou PY) deux vecteurs possédant un coeur cationique et une membrane contenant c. un mélange Phospholipon / Cholestérol (QAE
PLpon/Chol), ou d. un mélange DPPC / Cholestérol (QAE
DPPC/Chol, ou KY) L'IL-2 est ajoutée aux BVSM dans un rapport massique de 1/10.
On évalue l'activité biologique de l'IL-2 associée aux différents BVSM en mesurant la prolifération de cellules mononucléaires sanguines, calculée par incorporation de thymidine marquée à 1'3H. Ces cellules ont préalablement été stimulées par des composés (PHA) qui induisent l'expression du récepteur CD25, qui possède une forte affinité pour l'IL-2.
On observe (figure 3) que tous les BVSM
permettent d'obtenir une activité équivalente à celle de l'IL-2 contrôle non formulée in vitro, les BVSM QAE
DPPC/Chol permettant même d'améliorer cette activité
biologique.
3) Etude de la stabilité des préparations d'IL-2.
Les préparations d'IL-2 en solution ne sont en général pas stables en solution à 4 °C, l'IL-2 perdant son activité biologique.
biologique de l'IL-2.
On utilise quatre types différents de vecteurs .
- deux vecteurs possédant un coeur anionique avec une couche lipidique contenant a. un mélange Phospholipon / Cholestérol (P
PLpon/Chol), ou b. un mélange DPPC / Cholestérol (P DPPC/Chol, ou PY) deux vecteurs possédant un coeur cationique et une membrane contenant c. un mélange Phospholipon / Cholestérol (QAE
PLpon/Chol), ou d. un mélange DPPC / Cholestérol (QAE
DPPC/Chol, ou KY) L'IL-2 est ajoutée aux BVSM dans un rapport massique de 1/10.
On évalue l'activité biologique de l'IL-2 associée aux différents BVSM en mesurant la prolifération de cellules mononucléaires sanguines, calculée par incorporation de thymidine marquée à 1'3H. Ces cellules ont préalablement été stimulées par des composés (PHA) qui induisent l'expression du récepteur CD25, qui possède une forte affinité pour l'IL-2.
On observe (figure 3) que tous les BVSM
permettent d'obtenir une activité équivalente à celle de l'IL-2 contrôle non formulée in vitro, les BVSM QAE
DPPC/Chol permettant même d'améliorer cette activité
biologique.
3) Etude de la stabilité des préparations d'IL-2.
Les préparations d'IL-2 en solution ne sont en général pas stables en solution à 4 °C, l'IL-2 perdant son activité biologique.
22 La préparation BVSM-IL2 (QAE/DPPC/Chol) reste stable après deux mois de stockage à 4 °C, 9 5~ de l'activité biologique de l'IL-2 fraîche étant maintenue, comme mesurée par incorporation de thymidine marquée à 3H
dans les cellules murines CTLL-2.
4) Tests in vivo. Tumeur TS/A.
On a testé l'activité des BVSM-IL2 (KY / IL2, rapport massique 10/1) dans le modèle de tumeur TS/A
(adénocarcinome mammaire non différencié, non immunogénique), dans un modèle de rejet d'implantation tumorale, ou un modèle de traitement de tumeurs préalablement implantées.
A. Rejet de l'implantation tumorale.
A. 1. Coadministration dans le même flanc On co-administre 5.104 cellules tumorales à des souris femelles BALB/c par voie sous cutanée (s.c.), ainsi que les BVSM-IL2 (KY/IL-2) correspondant à la concentration en IL-2 indiquée sur la figure 4. En tant que contrôle, on administre également les vecteurs seuls ou l'IL-2 non formulée, ou du simple PBS. On mesure l'implantation et l'évolution de la taille des tumeurs.
La figure 4 montre clairement qu'il y a implantation des cellules tumorales et croissance de la tumeur après administration des vecteurs seuls ou de l'IL-2 seule, alors que l'IL-2 formulée avec les vecteurs KY permet de retarder la croissance tumorale.
A.2. Administration contralatérale On administre 5.104 cellules tumorales TS/A à
des souris BALB/c, par voie s.c., ainsi que les KY / IL-2 correspondant aux concentrations en IL-2 indiquée sur la figure 5, dans le flanc contralatéral. On administre de l'IL-2 non formulée ou du PBS en tant que contrôles.
La figure 5 montre que l'administration contralatérale de l'IL-2 complexée aux vecteurs permet la diminution de la croissance tumorale, un résultat non observé avec l'IL-2 non formulée, même utilisée à une dose 100 fois supérieure.
dans les cellules murines CTLL-2.
4) Tests in vivo. Tumeur TS/A.
On a testé l'activité des BVSM-IL2 (KY / IL2, rapport massique 10/1) dans le modèle de tumeur TS/A
(adénocarcinome mammaire non différencié, non immunogénique), dans un modèle de rejet d'implantation tumorale, ou un modèle de traitement de tumeurs préalablement implantées.
A. Rejet de l'implantation tumorale.
A. 1. Coadministration dans le même flanc On co-administre 5.104 cellules tumorales à des souris femelles BALB/c par voie sous cutanée (s.c.), ainsi que les BVSM-IL2 (KY/IL-2) correspondant à la concentration en IL-2 indiquée sur la figure 4. En tant que contrôle, on administre également les vecteurs seuls ou l'IL-2 non formulée, ou du simple PBS. On mesure l'implantation et l'évolution de la taille des tumeurs.
La figure 4 montre clairement qu'il y a implantation des cellules tumorales et croissance de la tumeur après administration des vecteurs seuls ou de l'IL-2 seule, alors que l'IL-2 formulée avec les vecteurs KY permet de retarder la croissance tumorale.
A.2. Administration contralatérale On administre 5.104 cellules tumorales TS/A à
des souris BALB/c, par voie s.c., ainsi que les KY / IL-2 correspondant aux concentrations en IL-2 indiquée sur la figure 5, dans le flanc contralatéral. On administre de l'IL-2 non formulée ou du PBS en tant que contrôles.
La figure 5 montre que l'administration contralatérale de l'IL-2 complexée aux vecteurs permet la diminution de la croissance tumorale, un résultat non observé avec l'IL-2 non formulée, même utilisée à une dose 100 fois supérieure.
23 B. Effet thérapeutiaue et protecteur sur une tumeur implantée ; administration par voie sous-cutanée.
B.1. Effet thérapeutique Six jours après administration s.c. de 5.104 cellules TS/A à 10 souris/groupe, on administre les KY / IL
2, par voie s.c., dans le flanc contralatéral. On effectue l'administration à un site (5.103 Unités d'IL-2) ou à cinq sites distincts, la dose injectée étant alors 1.103 Unités par site.
Dans un tel modèle, la tumeur est implantée et est palpable (surface d'environ 40 mm). On évalue l'augmentation de la taille de la tumeur. La figure 6.A.t montre que l'IL-2 complexée aux vecteurs permet de ralentir la croissance tumorale, d'une façon plus importante que l'IL-2 seule. Par ailleurs, il semble que l'injections de petites doses à de multiples sites soit plus efficace que l'injection d'une dose plus forte à un site unique.
Trois animaux sur les 10 souris ayant reçu les KY / IL-2 à un site unique ne présentent pas de tumeur détectable après 30 jours, alors que 6 souris sur les 10 ayant reçu les KY / IL-2 à cinq sites d'administration sont également sans tumeur détectable. Ces neufs animaux ne redéveloppent pas de tumeurs plus tard.
B.2. Effet protecteur On réinjecte 25.104 cellules TS/A aux neuf souris décrites précédemment, qui ne présentent plus de tumeurs 46 jours après l'administration de l'IL-2. Des souris naïves sont utilisées comme contrôles.
La figure 6.B montre que l'administration préalable de KY / IL-2 permet de protéger partiellement les animaux contre un nouveau challenge. En effet, quatre souris sur neuf ne développent pas de tumeurs, et le développement tumoral est ralenti chez les autres animaux, par rapport aux animaux naïfs.
C. Effet thérapeutique et protecteur sur une tumeur implantée ; administration par voie intranasale.
C.1. Effet thérapeutique
B.1. Effet thérapeutique Six jours après administration s.c. de 5.104 cellules TS/A à 10 souris/groupe, on administre les KY / IL
2, par voie s.c., dans le flanc contralatéral. On effectue l'administration à un site (5.103 Unités d'IL-2) ou à cinq sites distincts, la dose injectée étant alors 1.103 Unités par site.
Dans un tel modèle, la tumeur est implantée et est palpable (surface d'environ 40 mm). On évalue l'augmentation de la taille de la tumeur. La figure 6.A.t montre que l'IL-2 complexée aux vecteurs permet de ralentir la croissance tumorale, d'une façon plus importante que l'IL-2 seule. Par ailleurs, il semble que l'injections de petites doses à de multiples sites soit plus efficace que l'injection d'une dose plus forte à un site unique.
Trois animaux sur les 10 souris ayant reçu les KY / IL-2 à un site unique ne présentent pas de tumeur détectable après 30 jours, alors que 6 souris sur les 10 ayant reçu les KY / IL-2 à cinq sites d'administration sont également sans tumeur détectable. Ces neufs animaux ne redéveloppent pas de tumeurs plus tard.
B.2. Effet protecteur On réinjecte 25.104 cellules TS/A aux neuf souris décrites précédemment, qui ne présentent plus de tumeurs 46 jours après l'administration de l'IL-2. Des souris naïves sont utilisées comme contrôles.
La figure 6.B montre que l'administration préalable de KY / IL-2 permet de protéger partiellement les animaux contre un nouveau challenge. En effet, quatre souris sur neuf ne développent pas de tumeurs, et le développement tumoral est ralenti chez les autres animaux, par rapport aux animaux naïfs.
C. Effet thérapeutique et protecteur sur une tumeur implantée ; administration par voie intranasale.
C.1. Effet thérapeutique
24 En commençant six jours après l'administration s.c. de 5.104 cellules TS/A à 10 souris/groupe, on administre les KY / IL-2, par voie intranasale, pendant une période de 5 jours. On effectue l'administration une ou deux fois par jour. Les contrôles utilisés sont l'IL-2 seule (administrée deux fois par jour), les vecteurs seuls ou du PBS.
Dans un tel modèle, la tumeur est implantée et est palpable (surface d'environ 40 mm-). On évalue l'augmentation de la taille de la tumeur. La figure 7.A.
montre que l'IL-2 complexée aux vecteurs permet de ralentir la croissance tumorale, d'une façon plus importante que l'IL-2 seule. I1 ne semble pas que le nombre d'administrations mène à des différences sur les résultats observés.
Quatre animaux sur les 10 souris ayant reçu les KY / IL-2 par voie intranasale, une fois par jour ne présentent pas de tumeur détectable après 35 jours, et 6 souris sur les 10 ayant reçu les KY / IL-2 deux fois par jour sont également sans tumeur détectable. Ces dix animaux ne redéveloppent pas de tumeurs plus tard.
C.2. Effet protecteur On réinjecte 25.104 cellules TS/A aux dix souris décrites précédemment, qui ne présentent plus de tumeurs 48 jours après l'administration de l'IL-2. Des souris naïves sont utilisées comme contrôles.
La figure 7.B montre que l'administration préalable de KY / IL-2 permet de protéger partiellement les animaux contre un nouveau challenge. En effet, quatre souris sur dix ne développent pas de tumeurs, et le développement tumoral est ralenti chez les autres animaux, par rapport aux animaux naïfs.
5) Induction de CTL.
On isole les splénocytes des quatre souris traitées par voie sous cutanée (après 75 jours) ou intranasale (après 79 jours), qui ont rejeté la tumeur implantée et n'ont pas redéveloppé de tumeurs après un nouveau challenge avec une dose plus importante (sections 4.B et 4.C).
Les splénocytes sont stimulés in vitro avec les cellules TS/A pendant 6 jours et 1 'activité CTL contre les 5 cellules TS/A est étudiée.
On observe que les souris ayant reçu les KY /
IL-2 par voie sous-cutanée expriment une activité CTL
spécifique des TS/A (figure 8.A), puisque les cellules syngéniques WEHI 164 ou les cellules YAC ne sont pas lysées.
10 On observe également une activité CTL spécifique chez les souris ayant reçu les KY / IL-2 par voie intranasale.
Exemple 2 . Effet chez la souris du BVSM sur 15 l'immunogénicité d'un split Influenza trivalent à celui de différents adjuvants, et effet chez la souris de la co-administration de la formulation et de différents adjuvants sur l'immunoqénicité d'un split Influenza trivalent.
20 I - Matériel et méthodes.
1) Materiel.
Les animaux utilisés sont des souris femelles BALB/cJ/Rj (âgées de 10 semaines au début de l'étude)
Dans un tel modèle, la tumeur est implantée et est palpable (surface d'environ 40 mm-). On évalue l'augmentation de la taille de la tumeur. La figure 7.A.
montre que l'IL-2 complexée aux vecteurs permet de ralentir la croissance tumorale, d'une façon plus importante que l'IL-2 seule. I1 ne semble pas que le nombre d'administrations mène à des différences sur les résultats observés.
Quatre animaux sur les 10 souris ayant reçu les KY / IL-2 par voie intranasale, une fois par jour ne présentent pas de tumeur détectable après 35 jours, et 6 souris sur les 10 ayant reçu les KY / IL-2 deux fois par jour sont également sans tumeur détectable. Ces dix animaux ne redéveloppent pas de tumeurs plus tard.
C.2. Effet protecteur On réinjecte 25.104 cellules TS/A aux dix souris décrites précédemment, qui ne présentent plus de tumeurs 48 jours après l'administration de l'IL-2. Des souris naïves sont utilisées comme contrôles.
La figure 7.B montre que l'administration préalable de KY / IL-2 permet de protéger partiellement les animaux contre un nouveau challenge. En effet, quatre souris sur dix ne développent pas de tumeurs, et le développement tumoral est ralenti chez les autres animaux, par rapport aux animaux naïfs.
5) Induction de CTL.
On isole les splénocytes des quatre souris traitées par voie sous cutanée (après 75 jours) ou intranasale (après 79 jours), qui ont rejeté la tumeur implantée et n'ont pas redéveloppé de tumeurs après un nouveau challenge avec une dose plus importante (sections 4.B et 4.C).
Les splénocytes sont stimulés in vitro avec les cellules TS/A pendant 6 jours et 1 'activité CTL contre les 5 cellules TS/A est étudiée.
On observe que les souris ayant reçu les KY /
IL-2 par voie sous-cutanée expriment une activité CTL
spécifique des TS/A (figure 8.A), puisque les cellules syngéniques WEHI 164 ou les cellules YAC ne sont pas lysées.
10 On observe également une activité CTL spécifique chez les souris ayant reçu les KY / IL-2 par voie intranasale.
Exemple 2 . Effet chez la souris du BVSM sur 15 l'immunogénicité d'un split Influenza trivalent à celui de différents adjuvants, et effet chez la souris de la co-administration de la formulation et de différents adjuvants sur l'immunoqénicité d'un split Influenza trivalent.
20 I - Matériel et méthodes.
1) Materiel.
Les animaux utilisés sont des souris femelles BALB/cJ/Rj (âgées de 10 semaines au début de l'étude)
25 provenant du centre d'élevage Janvier (Route des Chênes-Sec - B.P.5 - Le Genest-Saint-Isle), sont acclimatées pendant 7 jours, à raison de 6 souris par cage avant le début de l'étude.
3 0 2) Produits.
a ) BVSMTM .
Le BVSM1'~' utilisé est de type KY . QAE - 2 mEg -DPPC/Cholesterol. Il correspond à un noyau polysaccharidique greffé par le glycidyl trimethylammonium et entouré d'une couche de DPPC / Cholesterol. Ce type de vecteur est décrit dans EP 687 173 .
b) Adjuvants.
Les 4 adjuvants suivants ont été utilisés .
3 0 2) Produits.
a ) BVSMTM .
Le BVSM1'~' utilisé est de type KY . QAE - 2 mEg -DPPC/Cholesterol. Il correspond à un noyau polysaccharidique greffé par le glycidyl trimethylammonium et entouré d'une couche de DPPC / Cholesterol. Ce type de vecteur est décrit dans EP 687 173 .
b) Adjuvants.
Les 4 adjuvants suivants ont été utilisés .
26 - Sous-unité B de la choléra toxine (CTB) (réf .
C9903, Sigma, St Quentin Fallavier, France).
- Monophosphoryl, Lipide A (MPL) (réf. R-350, Ribi Immunochem Research, Inc, Hamilton, MO).
- IL-2 recombinante, Proleukin, activité 16,3.
106 U/mg (Chiron France, Suresnes, France).
- Oligonucléotides ODN . 5TCCATGACGTTCCTGAC' (Eurogentec, Bruxelles, Belgique).
c) Split Influenza trivalent.
Une solution à 250 }zg d' HA/ml ( 83 , 3 ~.zg/souche) de split Influenza trivalent est préparée avec 3 split neuf monovalents de chez Biochem Pharma (Canada).
- le split neuf monovalent produit à partir de la souche B/Harbin 7/94.
- le split neuf monovalent produit à partir de la souche A/Johannesburg 82/96.
- le split neuf monovalent produit à partir de la souche A/Nanchang 933/95.
Ces split sont constitués d'un mélange de protéines virales, notamment d'hémagglutinine (HA) et de neuraminidase.
d) Formulation.
- Formulation antigène + BVSMTM
Une formulation à 250 ~g d'HA/ml (83,3 ~zg/souche) de split Influenza trivalent est préparée avec les 3 split neuf monovalents ci-dessus afin d'obtenir un rapport d'HA/BVSM égal à 1/89 . 250 ~zg d'HA trivalente /
22,25 mg de BVSM / ml.
Cette formulation est obtenue par mélange, à
volume égal, de 3 formulations à 250 ~g d'HA / 22,25 mg de BVSMTT' /ml, de chacun des split monovalents.
- Formulation antigène + BVSMTM + adjuvant.
A partir de la formulation antigène + BVSMTM, quatre autres formulations avec adjuvant ont été préparées.
Ces formulations sont obtenues par dilution de la formulation trivalente à 250 ~zg d'HA / ml en présence et par ajout d'adjuvant. La dilution permet d'ajuster la dose d'HA
monovalente / souris / immunisation à 1,2 ug, soit 60 ug WO 01/80836 PCT/F'RO1/01289
C9903, Sigma, St Quentin Fallavier, France).
- Monophosphoryl, Lipide A (MPL) (réf. R-350, Ribi Immunochem Research, Inc, Hamilton, MO).
- IL-2 recombinante, Proleukin, activité 16,3.
106 U/mg (Chiron France, Suresnes, France).
- Oligonucléotides ODN . 5TCCATGACGTTCCTGAC' (Eurogentec, Bruxelles, Belgique).
c) Split Influenza trivalent.
Une solution à 250 }zg d' HA/ml ( 83 , 3 ~.zg/souche) de split Influenza trivalent est préparée avec 3 split neuf monovalents de chez Biochem Pharma (Canada).
- le split neuf monovalent produit à partir de la souche B/Harbin 7/94.
- le split neuf monovalent produit à partir de la souche A/Johannesburg 82/96.
- le split neuf monovalent produit à partir de la souche A/Nanchang 933/95.
Ces split sont constitués d'un mélange de protéines virales, notamment d'hémagglutinine (HA) et de neuraminidase.
d) Formulation.
- Formulation antigène + BVSMTM
Une formulation à 250 ~g d'HA/ml (83,3 ~zg/souche) de split Influenza trivalent est préparée avec les 3 split neuf monovalents ci-dessus afin d'obtenir un rapport d'HA/BVSM égal à 1/89 . 250 ~zg d'HA trivalente /
22,25 mg de BVSM / ml.
Cette formulation est obtenue par mélange, à
volume égal, de 3 formulations à 250 ~g d'HA / 22,25 mg de BVSMTT' /ml, de chacun des split monovalents.
- Formulation antigène + BVSMTM + adjuvant.
A partir de la formulation antigène + BVSMTM, quatre autres formulations avec adjuvant ont été préparées.
Ces formulations sont obtenues par dilution de la formulation trivalente à 250 ~zg d'HA / ml en présence et par ajout d'adjuvant. La dilution permet d'ajuster la dose d'HA
monovalente / souris / immunisation à 1,2 ug, soit 60 ug WO 01/80836 PCT/F'RO1/01289
27 d'HA monovalente / ml et d'ajouter l'adjuvant dans le volume utilisé pour diluer.
e) Témoin.
Trois types de témoins ont été préparés .
- des témoins split trivalent, dénommés ci-après AS et AN, préparés par mélange, à volume égal, de 3 solutions à 250 ug d'HA/ml de chacun des split monovalents, - des témoins split trivalent + adjuvant, - un contrôle naïf (PBS 0,22X).
Selon la voie d'administration sous-cutanée (AS) ou intranasale (AN) la solution de split trivalent est respectivement préparée en Phosphate Buffered Saline ou en eau stérile.
3) Méthodes.
Les différentes formules (adjuvant ~ BVSM ~ Ag) sont administrées à j0 et 21 selon le schéma suivant .
Contrôle PBS i. n.
C . Contrôle naïf i. n.
AS . Ag s. c.
AN . Ag i. n.
FA . Ag + BVSM i. n.
Ax . Ag + Adj X i. n.
FX . Ag + BVSM + Adj X i. n.
L'immunogénicité est évaluée après le rappel, à
j35 au niveau sérique, détection par ELISA des IgG
spécifiques de chaque split monovalent - au niveau muqueux, détection par ELISA dans les sécrétions nasales et/ou vaginales des IgA spécifiques de chaque split monovalent.
a) Immunisation des souris.
- Administrations.
L'administration des formules (BVSM ~ Adj ~ Ag) est réalisée sans anesthésie soit par voie .
. sous-cutanée . 100 u1 à la seringue de 1 ml au niveau dorsal pour les contrôles, WO 01/80836 PCT/F'It01/01289
e) Témoin.
Trois types de témoins ont été préparés .
- des témoins split trivalent, dénommés ci-après AS et AN, préparés par mélange, à volume égal, de 3 solutions à 250 ug d'HA/ml de chacun des split monovalents, - des témoins split trivalent + adjuvant, - un contrôle naïf (PBS 0,22X).
Selon la voie d'administration sous-cutanée (AS) ou intranasale (AN) la solution de split trivalent est respectivement préparée en Phosphate Buffered Saline ou en eau stérile.
3) Méthodes.
Les différentes formules (adjuvant ~ BVSM ~ Ag) sont administrées à j0 et 21 selon le schéma suivant .
Contrôle PBS i. n.
C . Contrôle naïf i. n.
AS . Ag s. c.
AN . Ag i. n.
FA . Ag + BVSM i. n.
Ax . Ag + Adj X i. n.
FX . Ag + BVSM + Adj X i. n.
L'immunogénicité est évaluée après le rappel, à
j35 au niveau sérique, détection par ELISA des IgG
spécifiques de chaque split monovalent - au niveau muqueux, détection par ELISA dans les sécrétions nasales et/ou vaginales des IgA spécifiques de chaque split monovalent.
a) Immunisation des souris.
- Administrations.
L'administration des formules (BVSM ~ Adj ~ Ag) est réalisée sans anesthésie soit par voie .
. sous-cutanée . 100 u1 à la seringue de 1 ml au niveau dorsal pour les contrôles, WO 01/80836 PCT/F'It01/01289
28 nasale . 20u1 (10 ul/narine) à la micropipette de 10 u1 pour les échantillons testés et les contrôles, Pour chaque groupe l'immunisation comprend deux administrations, à JO et J21 effectuées selon le même mode.
- Prélèvement sanguin.
Un prélèvement sanguin d'environ 0,3 ml est réalisé à la veine rétroorbitale à JO (contrôle) et J35.
Après formation d'un caillot et centrifugation le sérum est congelé à -20°C jusqu'à utilisation.
. Prélèvement des sécrétions nasales.
Le lavage des cavités nasales est réalisé à
l'aide de 500 ~1 de tampon phosphate salin - BSA 1~
introduit dans la trachée en direction des turbines nasales.
L'opération est ainsi répétée 3 fois avec le même PBS- BSA
1~. Le prélèvement nasal est conservé dans un tube Eppendorf à -20°C. Les sécrétions nasales sont récupérées à J35.
b) Analyse des prélèvements.
L'analyse des sérums et des sécrétions nasale est réalisée par un test ELISA. Brièvement, les microplaques (Nunc, Immunoplate maxisorb, polylabo) sont coatées par le vaccin de la grippe (100 ng de HA/puits dans un tampon carbonate, pH 9,6, 2h00 à 37°C). Après rinçage ( trois fois en tampon PBS-tween pH 7,6) puis saturation par 250 ~l/puits d'une solution de PBS-BSA 3% (1h00 à 37°C), les gammes de sérums ou de sécrétions nasales sont incubées 1 heure à
37°C. et rincées de nouveau avec une solution de PBS-tween, pH 7,6. Après rinçage (trois fois) les anticorps sont détectés par des anti IgG murines (réf. A4416 Sigma) ou , anti IgA murines (réf. A4789 Sigma), couplés à la péroxydase. Après une dernière étape de rinçage (cinq fois), le substrat OPD est ajouté (réf. P8287, Sigma 1 pastille dans 5 ml de tampon de révélation + 50u1 d'H202, 100 ~..L1/puits). Après 30 minutes d'incubation à 37°C, l'acide chlorydrique 1N (réf. 30024-290, Prolabo) est ajouté
(50~.z1/puits) et l'absorbance est mesurée à 490 nm. Les titres sont définis comme l'inverse de la dilution permettant d'obtenir une DO de 0,1.
WO 01/80836 PCT/F'RO1/01289
- Prélèvement sanguin.
Un prélèvement sanguin d'environ 0,3 ml est réalisé à la veine rétroorbitale à JO (contrôle) et J35.
Après formation d'un caillot et centrifugation le sérum est congelé à -20°C jusqu'à utilisation.
. Prélèvement des sécrétions nasales.
Le lavage des cavités nasales est réalisé à
l'aide de 500 ~1 de tampon phosphate salin - BSA 1~
introduit dans la trachée en direction des turbines nasales.
L'opération est ainsi répétée 3 fois avec le même PBS- BSA
1~. Le prélèvement nasal est conservé dans un tube Eppendorf à -20°C. Les sécrétions nasales sont récupérées à J35.
b) Analyse des prélèvements.
L'analyse des sérums et des sécrétions nasale est réalisée par un test ELISA. Brièvement, les microplaques (Nunc, Immunoplate maxisorb, polylabo) sont coatées par le vaccin de la grippe (100 ng de HA/puits dans un tampon carbonate, pH 9,6, 2h00 à 37°C). Après rinçage ( trois fois en tampon PBS-tween pH 7,6) puis saturation par 250 ~l/puits d'une solution de PBS-BSA 3% (1h00 à 37°C), les gammes de sérums ou de sécrétions nasales sont incubées 1 heure à
37°C. et rincées de nouveau avec une solution de PBS-tween, pH 7,6. Après rinçage (trois fois) les anticorps sont détectés par des anti IgG murines (réf. A4416 Sigma) ou , anti IgA murines (réf. A4789 Sigma), couplés à la péroxydase. Après une dernière étape de rinçage (cinq fois), le substrat OPD est ajouté (réf. P8287, Sigma 1 pastille dans 5 ml de tampon de révélation + 50u1 d'H202, 100 ~..L1/puits). Après 30 minutes d'incubation à 37°C, l'acide chlorydrique 1N (réf. 30024-290, Prolabo) est ajouté
(50~.z1/puits) et l'absorbance est mesurée à 490 nm. Les titres sont définis comme l'inverse de la dilution permettant d'obtenir une DO de 0,1.
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29 II - Influence du mode de preparation des formulations BVSMTM/ Adjuvant /influenza.
Afin d'évaluer le meilleur mode de préparation des formulations BVSM / Adjuvant / Influenza, l'association de split Influenza sur les BVSM est étudiée en présence d'adjuvant (CTB ou MPL) en utilisant la résonnance plasmonique de surface (RPS) Biacore X (Pharmacia Biosensor Inc.). Dans cette étude, 201 d'une suspension de BVSM
(50pg/ml en PBS 0,3 X) sont introduits sur des sensorchips hydrophobes (HPA, Biacore, BR-1000-30) à 5~.z1 /min.
La figure 9 montre le sensorgramme obtenu par association de la CTB et des BVSM immobilisés sur la sensorchip HPA en fonction de la concentration en CTB ( 1) 2,5ug/ml ; 2) 25ug/ml ; 3) 250ug/ml en PBS 45mM ) (ce qui correspond à 0,3 X).
La figure 10 montre le sensorgramme obtenu par association du MPL et des BVSM immobilisés sur la sensorchip HPA en fonction de la concentration en MPL (1) 1,56ug/ml ;
2) 3,125ug/ml ; 3) 6,25ug/ml ; 4) 12,5ug/ml ; 5) 25ug/ml ;
6) 50~zg/ml en PBS 45mM) .
Dans les deux cas, CTB et MPL, les sensorgrammes obtenus confirment la capacité d'association des BVSM et des adjuvants.
Le mode de préparation des formulations BVSM/Adjuvant/split Influenza est alors étudié. Deux méthodes sont utilisées .
Dans la première, une solution d'adjuvant est introduite avant l'ajout du split Influenza.
Dans la seconde, le split Influenza est introduit avant l'ajout de l'adjuvant.
La figure 11 résume les résultats obtenus dans le cas d'un split B Harbin. Des quantités variables de CTB
sont introduites sur les BVSM immobilisés ( 1) Pas de CTB, 2) 2,5Mg/ml, 3) 25ug/ml, 4) 250ug/ml en PBS 45mM ). Le split monovalent B Harbin à 25~zg/ml est ensuite déposé sur le BVSM
adjuvanté. On note clairement une inhibition de l'association du split sur le BVSM lorsque la CTB est ajoutée avant le split.
De la même façon, la figure 12 résume les résultats obtenus dans le cas du MPL et d'un split B Harbin.
5 Des quantités variables de MPL sont introduites sur les BVSM
immobilisés ( 1) 1,56~g/ml ; 2) 3,12ug/ml ;
3 ) 6 , 2 5~.zg/ml ; 4 ) 12 , 5~zg/ml ; 5 ) 2 5~zg/ml ; 6 ) 5 0}zg/ml en PBS 45 mM ). Le split à 25ug/ml est ensuite déposé sur les BVSM adjuvantés. Comme pour la CTB et proportionnellement à
10 la quantité de MPL, il existe une inhibition de l'association du split sur les BVSM lorsque l'adjuvant est ajoutê avant le split.
La figure 13 représente les sensorgrammes obtenus en comparant les deux modes de préparation dans le 15 cas de la CTB. En A, la CTB est ajoutée sur les BVSM
immobilisés, puis le split monovalent est introduit.
En B, le split monovalent est ajouté sur les BVSM immobilisés, on introduit ensuite la CTB.
On constate que lorsque l'antigène est ajouté
20 avant la CTB, il existe une diminution de cette association du split sur les BVSM. A l'inverse, lorsque la CTB est ajoutée après le split, le BVSM permet l'association d'une quantité supplémentaire de matériel correspondant à la CTB.
Ainsi pour préserver le rôle du BVSM comme " Antigen 25 Carrier ", il est important de maintenir un mode de préparation dans lequel la CTB est ajoutée sur les formulations BVSM/split.
De la même façon, la figure 14 représente les sensorgrammes obtenus en comparant les deux modes de
Afin d'évaluer le meilleur mode de préparation des formulations BVSM / Adjuvant / Influenza, l'association de split Influenza sur les BVSM est étudiée en présence d'adjuvant (CTB ou MPL) en utilisant la résonnance plasmonique de surface (RPS) Biacore X (Pharmacia Biosensor Inc.). Dans cette étude, 201 d'une suspension de BVSM
(50pg/ml en PBS 0,3 X) sont introduits sur des sensorchips hydrophobes (HPA, Biacore, BR-1000-30) à 5~.z1 /min.
La figure 9 montre le sensorgramme obtenu par association de la CTB et des BVSM immobilisés sur la sensorchip HPA en fonction de la concentration en CTB ( 1) 2,5ug/ml ; 2) 25ug/ml ; 3) 250ug/ml en PBS 45mM ) (ce qui correspond à 0,3 X).
La figure 10 montre le sensorgramme obtenu par association du MPL et des BVSM immobilisés sur la sensorchip HPA en fonction de la concentration en MPL (1) 1,56ug/ml ;
2) 3,125ug/ml ; 3) 6,25ug/ml ; 4) 12,5ug/ml ; 5) 25ug/ml ;
6) 50~zg/ml en PBS 45mM) .
Dans les deux cas, CTB et MPL, les sensorgrammes obtenus confirment la capacité d'association des BVSM et des adjuvants.
Le mode de préparation des formulations BVSM/Adjuvant/split Influenza est alors étudié. Deux méthodes sont utilisées .
Dans la première, une solution d'adjuvant est introduite avant l'ajout du split Influenza.
Dans la seconde, le split Influenza est introduit avant l'ajout de l'adjuvant.
La figure 11 résume les résultats obtenus dans le cas d'un split B Harbin. Des quantités variables de CTB
sont introduites sur les BVSM immobilisés ( 1) Pas de CTB, 2) 2,5Mg/ml, 3) 25ug/ml, 4) 250ug/ml en PBS 45mM ). Le split monovalent B Harbin à 25~zg/ml est ensuite déposé sur le BVSM
adjuvanté. On note clairement une inhibition de l'association du split sur le BVSM lorsque la CTB est ajoutée avant le split.
De la même façon, la figure 12 résume les résultats obtenus dans le cas du MPL et d'un split B Harbin.
5 Des quantités variables de MPL sont introduites sur les BVSM
immobilisés ( 1) 1,56~g/ml ; 2) 3,12ug/ml ;
3 ) 6 , 2 5~.zg/ml ; 4 ) 12 , 5~zg/ml ; 5 ) 2 5~zg/ml ; 6 ) 5 0}zg/ml en PBS 45 mM ). Le split à 25ug/ml est ensuite déposé sur les BVSM adjuvantés. Comme pour la CTB et proportionnellement à
10 la quantité de MPL, il existe une inhibition de l'association du split sur les BVSM lorsque l'adjuvant est ajoutê avant le split.
La figure 13 représente les sensorgrammes obtenus en comparant les deux modes de préparation dans le 15 cas de la CTB. En A, la CTB est ajoutée sur les BVSM
immobilisés, puis le split monovalent est introduit.
En B, le split monovalent est ajouté sur les BVSM immobilisés, on introduit ensuite la CTB.
On constate que lorsque l'antigène est ajouté
20 avant la CTB, il existe une diminution de cette association du split sur les BVSM. A l'inverse, lorsque la CTB est ajoutée après le split, le BVSM permet l'association d'une quantité supplémentaire de matériel correspondant à la CTB.
Ainsi pour préserver le rôle du BVSM comme " Antigen 25 Carrier ", il est important de maintenir un mode de préparation dans lequel la CTB est ajoutée sur les formulations BVSM/split.
De la même façon, la figure 14 représente les sensorgrammes obtenus en comparant les deux modes de
30 préparation dans le cas du MPL.
En A, le MPL est abouté avant le split. En B, c'est l'inverse.
Lorsque l'antigène est ajouté avant le MPL, il n'existe pas de modification significative de l'association split/BVSM, mais le BVSM permet d'associer une quantité
supplémentaire de matériel correspondant au MPL.
Il semble donc possible de définir un mode de préparation des formulations adjuvantées dans lequel .
WO 01/80836 PCT/F'RO1/01289
En A, le MPL est abouté avant le split. En B, c'est l'inverse.
Lorsque l'antigène est ajouté avant le MPL, il n'existe pas de modification significative de l'association split/BVSM, mais le BVSM permet d'associer une quantité
supplémentaire de matériel correspondant au MPL.
Il semble donc possible de définir un mode de préparation des formulations adjuvantées dans lequel .
WO 01/80836 PCT/F'RO1/01289
31 - l'adjuvant est ajouté sur les formulations BVSM/antigène - le rôle du BVSM comme " Antigen Carrier " est préservé.
III - Effet de la CTB sur la réponse immunologique des formulations BVSM/Influenza.
1) Protocole.La formulation antigène + BVSM~" est préparée comme mentionné dans la partie " Matériel et méthodes ".
Un contrôle est réalisé dans les mêmes conditions mais en absence de BVSMT"" aboutissant à un Split trivalent à 250~.zg d' HA ( 831.zg/souche) /ml .
Une solution de CTB est ajoutée sur chacune de ces préparations afin d'obtenir les formulations et contrôles correspondants adjuvantés.
36 souris femelles BALB/cJ/Rj (âgées de 10 semaines au début de l'étude) sont divisées en 6 groupes à
raison de 6 souris par groupe. Pour chaque groupe le traitement est réalisé comme décrit précédemment. Le tableau 1 ci-dessous résume le traitement de chaque groupe.
Tableau 1 Code Groupe Route Formule (nombre administre de Quantit souris) / dose C Contrle i.n. 20 ~1 PBS 80mOsm/kg ' naf FA Ag + BVSM . i . 3 , 6 ~g + 3 2 0 , 4 ~.,Ig n . HA BVSM
AS Ag s.c. s.c. 3,6 ~g HA
AN Ag i.n. i.n. 3,6 ~g HA
F~TB Ag + BVSM + CTB i.n. 3,6 ~g HA + 320,4 ~g BVSM
+ 1 ~.Ig CTB
A~TB Ag + CTB i . 3 , 6 ~g + 1 ~.lg CTB
n . HA
Pour chaque groupe, on réalise les prélèvements sanguins et les prélèvements de sécrétions nasales et leurs analyses comme indiqué dans la partie " Matériel et méthodes ".
III - Effet de la CTB sur la réponse immunologique des formulations BVSM/Influenza.
1) Protocole.La formulation antigène + BVSM~" est préparée comme mentionné dans la partie " Matériel et méthodes ".
Un contrôle est réalisé dans les mêmes conditions mais en absence de BVSMT"" aboutissant à un Split trivalent à 250~.zg d' HA ( 831.zg/souche) /ml .
Une solution de CTB est ajoutée sur chacune de ces préparations afin d'obtenir les formulations et contrôles correspondants adjuvantés.
36 souris femelles BALB/cJ/Rj (âgées de 10 semaines au début de l'étude) sont divisées en 6 groupes à
raison de 6 souris par groupe. Pour chaque groupe le traitement est réalisé comme décrit précédemment. Le tableau 1 ci-dessous résume le traitement de chaque groupe.
Tableau 1 Code Groupe Route Formule (nombre administre de Quantit souris) / dose C Contrle i.n. 20 ~1 PBS 80mOsm/kg ' naf FA Ag + BVSM . i . 3 , 6 ~g + 3 2 0 , 4 ~.,Ig n . HA BVSM
AS Ag s.c. s.c. 3,6 ~g HA
AN Ag i.n. i.n. 3,6 ~g HA
F~TB Ag + BVSM + CTB i.n. 3,6 ~g HA + 320,4 ~g BVSM
+ 1 ~.Ig CTB
A~TB Ag + CTB i . 3 , 6 ~g + 1 ~.lg CTB
n . HA
Pour chaque groupe, on réalise les prélèvements sanguins et les prélèvements de sécrétions nasales et leurs analyses comme indiqué dans la partie " Matériel et méthodes ".
32 2) Résultats.
La figure 15 résume les résultats obtenus en titration spécifique du split B/Harbin des pools de sérums (IgG) et des sécrétions nasales (IgA) de souris. Elle permet de comparer les résultats des formulations trivalentes contenant la CTB (F-CTB)à différents témoins. Ces témoins sont soit des témoins antigènes seuls, soit des témoins antigènes associés à la CTB, soit la formulation de référence (ratio HA / BVSM . 1/89). Ces résultats ont été
confirmés par l'analyse de la réponse individuelle contre les split B/Harbin et A/Nanchang.
De façon attendue, la formulation de référence (FA) induit un taux d'anticorps de type G équivalent au témoin antigène seul administré par voie sous cutanée (AS) et un taux plus élevé d'IgG que le témoin seul administré
par voie nasale (AN) (22,4X).
Les témoins antigènes associés à la CTB ( ACTB) administrés par voie nasale induisent des IgG nettement plus élevés que l'antigène libre administré par la même voie (augmentation de 22,4X). Parallèlement ces formulations (Ag +CTB) (ACTB) induisent une forte immunité mucosale.
La formulation associée à l'adjuvant CTB (FCTB) induit une réponse IgG spécifique nettement supérieure à la formulation de référence (FA) et à son témoin de référence (ACTB). Pour cet adjuvant, il existe une effet de synergie important entre la CTB et les BVSMT"" ainsi, les taux d'IgG
sérique obtenus sont multipliés par un facteur de 3,7 par rapport à la formulation de référence FA. A l'inverse, et en présence d'une activité adjuvante mucosale importante de la CTB, avec certainement un effet de saturation de la réponse biologique, il est difficile à ce stade de définir le potentiel de synergie de la réponse IgA pour ce type adjuvant et les BVSM~".
IV - Effet du MPL sur la réponse immunoloqic~ue des formulations BVSM~/Influenza.
1 ) Protocole .
La figure 15 résume les résultats obtenus en titration spécifique du split B/Harbin des pools de sérums (IgG) et des sécrétions nasales (IgA) de souris. Elle permet de comparer les résultats des formulations trivalentes contenant la CTB (F-CTB)à différents témoins. Ces témoins sont soit des témoins antigènes seuls, soit des témoins antigènes associés à la CTB, soit la formulation de référence (ratio HA / BVSM . 1/89). Ces résultats ont été
confirmés par l'analyse de la réponse individuelle contre les split B/Harbin et A/Nanchang.
De façon attendue, la formulation de référence (FA) induit un taux d'anticorps de type G équivalent au témoin antigène seul administré par voie sous cutanée (AS) et un taux plus élevé d'IgG que le témoin seul administré
par voie nasale (AN) (22,4X).
Les témoins antigènes associés à la CTB ( ACTB) administrés par voie nasale induisent des IgG nettement plus élevés que l'antigène libre administré par la même voie (augmentation de 22,4X). Parallèlement ces formulations (Ag +CTB) (ACTB) induisent une forte immunité mucosale.
La formulation associée à l'adjuvant CTB (FCTB) induit une réponse IgG spécifique nettement supérieure à la formulation de référence (FA) et à son témoin de référence (ACTB). Pour cet adjuvant, il existe une effet de synergie important entre la CTB et les BVSMT"" ainsi, les taux d'IgG
sérique obtenus sont multipliés par un facteur de 3,7 par rapport à la formulation de référence FA. A l'inverse, et en présence d'une activité adjuvante mucosale importante de la CTB, avec certainement un effet de saturation de la réponse biologique, il est difficile à ce stade de définir le potentiel de synergie de la réponse IgA pour ce type adjuvant et les BVSM~".
IV - Effet du MPL sur la réponse immunoloqic~ue des formulations BVSM~/Influenza.
1 ) Protocole .
33 Une formulation trivalente et le contrôle correspondant sont préparés à 250 pg d'HA/ml (83,3 ug/souche)/ de split Influenza.
Une solution de MPL est ajoutée sur chacune de ces préparations afin d'obtenir les formulations et contrôles correspondants adjuvantés.
36 souris femelles BALB/cJ/Rj (âgées de 10 semaines au début de l'étude) sont divisés en 6 groupes à
raison de 6 souris par groupe. Pour chaque groupe le traitement est réalisé comme décrit dans la partie " Matériel et méthodes ". Le tableau 2 ci-dessous résume le traitement de chaque groupe.
Tableau 2 ,Code Groupe Route Formule administre (nombre de souris) Quantit/dose C Contrle naf (6) i.n. 20 ~.ll PBS 80mOsm/kg FA Ag + BVSM i . 3 , 6 ~g HA + 32 0 , 4 n . )..lg BVSM
AS Ag s.c. s.c. 3,6 ~.tg HA
AN Ag i.n. i.n. 3,6 ~,HA
FMPL Ag + BVSM + MPL i . 3 ' 6 ~,.l.g HA + 3 2 0 n . , 4 ~..l,g BVSM
+ 5 ~Lg MPL
AMPL Ag + MPL i.n. 3 flg HA + 5 ~.ig MPL
Pour chaque groupe, on réalise les prélèvements sanguins et les prélèvements de sécrétions nasales comme décrit dans la partie méthodes.
L'analyse des sérums et des sécrétions nasale est réalisée par test ELISA.
2) Résultats.
La figure 16 résume les résultats obtenus en titration spécifique du split B/Harbin des pools de sérums (IgG) et des sécrétions nasales (IgA) de souris administrés avec les formulations adjuvantées par le MPL. Ces résulats ont été confirmés par l'analyse de la réponse individuelle contre les split B/Harbin et A/Nanchang.
Les split influenza virus associés au BVSMTM ou au MPL administrés par voie nasale induisent une réponse IgG
sérique nettement plus élevés que l'antigène libre
Une solution de MPL est ajoutée sur chacune de ces préparations afin d'obtenir les formulations et contrôles correspondants adjuvantés.
36 souris femelles BALB/cJ/Rj (âgées de 10 semaines au début de l'étude) sont divisés en 6 groupes à
raison de 6 souris par groupe. Pour chaque groupe le traitement est réalisé comme décrit dans la partie " Matériel et méthodes ". Le tableau 2 ci-dessous résume le traitement de chaque groupe.
Tableau 2 ,Code Groupe Route Formule administre (nombre de souris) Quantit/dose C Contrle naf (6) i.n. 20 ~.ll PBS 80mOsm/kg FA Ag + BVSM i . 3 , 6 ~g HA + 32 0 , 4 n . )..lg BVSM
AS Ag s.c. s.c. 3,6 ~.tg HA
AN Ag i.n. i.n. 3,6 ~,HA
FMPL Ag + BVSM + MPL i . 3 ' 6 ~,.l.g HA + 3 2 0 n . , 4 ~..l,g BVSM
+ 5 ~Lg MPL
AMPL Ag + MPL i.n. 3 flg HA + 5 ~.ig MPL
Pour chaque groupe, on réalise les prélèvements sanguins et les prélèvements de sécrétions nasales comme décrit dans la partie méthodes.
L'analyse des sérums et des sécrétions nasale est réalisée par test ELISA.
2) Résultats.
La figure 16 résume les résultats obtenus en titration spécifique du split B/Harbin des pools de sérums (IgG) et des sécrétions nasales (IgA) de souris administrés avec les formulations adjuvantées par le MPL. Ces résulats ont été confirmés par l'analyse de la réponse individuelle contre les split B/Harbin et A/Nanchang.
Les split influenza virus associés au BVSMTM ou au MPL administrés par voie nasale induisent une réponse IgG
sérique nettement plus élevés que l'antigène libre
34 administré par la même voie (augmentation respective de 22,4X et 7,3X). Parallèlement ces formulations induisent une forte immunité mucosale.
La formulation associée à l'adjuvant MPL induit une réponse IgG spécifique similaire à la formulation de référence. A l'inverse, pour cet adjuvant il existe un effet de synergie important entre le MPL et les BVSMTM. Ainsi les taux d'IgA obtenus sont multipliés par un facteur de 2.7 par rapport à la formulation de réf. (Ag/BVSM) (FA). Ainsi, à
l'inverse de la réponse IgG, un fort potentiel de synergie entre la MPL et les BVSMTM peut être démontré pour la réponse mucosale.
V - Effet des Oliqonucleotides sur la reponse immunologigue des formulations BVSM/Influenza.
1 ) Protocole .
Une formulation trivalente et le contrôle correspondant sont préparés à 250 ug d'HA/ml (83,3 ug/souche)/ de split Influenza Une solution d'oligonucléotide (ODN) est ajoutée sur chacune de ces préparations afin d'obtenir les formulations et contrôles correspondants adjuvantés.
42 souris femelles BALB/cJ/Rj (âgées de 10 semaines au début de l'étude) sont divisés en 7 groupes à
raison de 6 souris par groupe. Pour chaque groupe le traitement est réalisé comme décrit dans la partie " Matériel et méthodes ". Le tableau 3 résume le traitement de chaque groupe.
Tableau 3 Code Groupe Route Formule administre (nombre de souris) Quantit/dose C Contrle naf i.n. 20 X11 PBS 80mOsm/kg FA Ag + BVSM i . 3 , 6 dag HA + 32 0 , 4 n . ~.tg BVSM
AS Ag s.c. s.c. 3,6 ~g HA
AN Ag i.n. i.n. 3,6 ~..~g HA
FODN Ag + BVSM + ODN i.n. 3'6 ~g HA + 320,4 ~g BVSM
' + 1 ~..lg ODN1 AoDrr Ag + ODN i .
n . 3 , 6 ~..lg HA + 1 ~.Lg Pour chaque groupe, on réalise les prélèvements sanguins et les prélèvements de sécrétions nasales comme indiqué dans la partie méthode.
5 L'analyse des sérums et des sécrétions nasales est réalisée par test ELISA comme décrit précédemment.
2) Résultats.
La figure 17 résume les résultats obtenus en 10 titration spécifique du split B/Harbin des pools de sérums (IgG) et des sécrétions nasales (IgA) de souris administrées avec les formulations adjuvantées par les oligonucléotides.
Ces résulats ont été confirmés par l'analyse de la réponse individuelle contre les split B/Harbin et A/Nanchang.
15 Les split influenza virus associé au BVSMTM ou aux ODN administrés par voie nasale induisent une réponse IgG sérique nettement plus élevée que l'antigène libre administré par la même voie (augmentation respective de 22,4X et 7,3X). Parallèlement ces formulations induisent une 20 forte immunité mucosale.
La formulation associée à l'adjuvant ODN induit une réponse IgG supérieure à la formulation de référence et à son témoin de référence (Ag + ODN) . Pour cet adjuvant, il semble exister une additivité des réponses, les titres IgG
25 obtenus pour la formulation étant égaux à la somme des réponses obtenues pour l'antigène + ODN1(ApDNl) et pour la formulation de référence (Ag + BVSMTM) (FA).
VI - Modification de la balance IqG2a/IqGl par 30 ad~uvantation des formulations BVSM/Influenza.
1 ) Protocole .
Une formulation trivalente et le contrôle correspondant sont préparés à 250 ~Zg d'HA/ml (83,3
La formulation associée à l'adjuvant MPL induit une réponse IgG spécifique similaire à la formulation de référence. A l'inverse, pour cet adjuvant il existe un effet de synergie important entre le MPL et les BVSMTM. Ainsi les taux d'IgA obtenus sont multipliés par un facteur de 2.7 par rapport à la formulation de réf. (Ag/BVSM) (FA). Ainsi, à
l'inverse de la réponse IgG, un fort potentiel de synergie entre la MPL et les BVSMTM peut être démontré pour la réponse mucosale.
V - Effet des Oliqonucleotides sur la reponse immunologigue des formulations BVSM/Influenza.
1 ) Protocole .
Une formulation trivalente et le contrôle correspondant sont préparés à 250 ug d'HA/ml (83,3 ug/souche)/ de split Influenza Une solution d'oligonucléotide (ODN) est ajoutée sur chacune de ces préparations afin d'obtenir les formulations et contrôles correspondants adjuvantés.
42 souris femelles BALB/cJ/Rj (âgées de 10 semaines au début de l'étude) sont divisés en 7 groupes à
raison de 6 souris par groupe. Pour chaque groupe le traitement est réalisé comme décrit dans la partie " Matériel et méthodes ". Le tableau 3 résume le traitement de chaque groupe.
Tableau 3 Code Groupe Route Formule administre (nombre de souris) Quantit/dose C Contrle naf i.n. 20 X11 PBS 80mOsm/kg FA Ag + BVSM i . 3 , 6 dag HA + 32 0 , 4 n . ~.tg BVSM
AS Ag s.c. s.c. 3,6 ~g HA
AN Ag i.n. i.n. 3,6 ~..~g HA
FODN Ag + BVSM + ODN i.n. 3'6 ~g HA + 320,4 ~g BVSM
' + 1 ~..lg ODN1 AoDrr Ag + ODN i .
n . 3 , 6 ~..lg HA + 1 ~.Lg Pour chaque groupe, on réalise les prélèvements sanguins et les prélèvements de sécrétions nasales comme indiqué dans la partie méthode.
5 L'analyse des sérums et des sécrétions nasales est réalisée par test ELISA comme décrit précédemment.
2) Résultats.
La figure 17 résume les résultats obtenus en 10 titration spécifique du split B/Harbin des pools de sérums (IgG) et des sécrétions nasales (IgA) de souris administrées avec les formulations adjuvantées par les oligonucléotides.
Ces résulats ont été confirmés par l'analyse de la réponse individuelle contre les split B/Harbin et A/Nanchang.
15 Les split influenza virus associé au BVSMTM ou aux ODN administrés par voie nasale induisent une réponse IgG sérique nettement plus élevée que l'antigène libre administré par la même voie (augmentation respective de 22,4X et 7,3X). Parallèlement ces formulations induisent une 20 forte immunité mucosale.
La formulation associée à l'adjuvant ODN induit une réponse IgG supérieure à la formulation de référence et à son témoin de référence (Ag + ODN) . Pour cet adjuvant, il semble exister une additivité des réponses, les titres IgG
25 obtenus pour la formulation étant égaux à la somme des réponses obtenues pour l'antigène + ODN1(ApDNl) et pour la formulation de référence (Ag + BVSMTM) (FA).
VI - Modification de la balance IqG2a/IqGl par 30 ad~uvantation des formulations BVSM/Influenza.
1 ) Protocole .
Une formulation trivalente et le contrôle correspondant sont préparés à 250 ~Zg d'HA/ml (83,3
35 ug/souche)/ de split Influenza. A partir de la formulation trivalente, trois formulations adjuvantées sont obtenues:
BVSMTM /Ag/CTB: Par ajout sur la formulation trivalente d'une solution de CTB.
BVSMTM /Ag/CTB: Par ajout sur la formulation trivalente d'une solution de CTB.
36 PCT/F'RO1/01289 BVSMTM /Ag/IL2: Par ajout sur la formulation trivalente d'une solution d'IL-2 recombinante BVSMTM /Ag/MPL: Par ajout sur la formulation trivalente d'une solution de MPL
54 souris femelles BALB/cJ/Rj (âgées de 10 semaines au début de l'étude) sont divisés en 9 groupes à
raison de 6 souris par groupe. Pour chaque groupe le traitement et les prélèvements sont réalisés comme décrit dans la partie " Matériel et méthodes ".
Le tableau 4 ci-dessous récapitule ces traitements.
Tableau 4 Code Groupe Route Formule administre (nombre Quantit/dose de souris) C Contrle i.n. 20 ~l PBS mOsm/kg ' naf 80 FA Ag + BVSM i . 3 , 6 ~..lg 3 2 0 BVSM
n HA + , 4 . ~..Lg AS Ag s.c. s.c. 3,6 ~..lg HA
3 ' 6 ~..tg 3 2 0 BVSM
HA + , 4 ~.I,g FcTB Ag + BVSM + CTB i .
n .
+ 1 ~..lg CTB
AcTS Ag + CTB i . 3 , 6 E.l,g 1 ~.Ig n HA + CTB
.
3 ' 6 j~g 3 2 0 BVSM
HA + , 4 ~.lg FMPL Ag + BVSM + MPL i .
n .
+ 5 ~tg MPL
AMPL Ag + MPL ( 6 ) i . 3 ~.Lg HA ~.~g n + 5 MPL
.
3'6 ~..lg 320,4 BVSM
HA + ~..lg FIL Ag + BVSM + IL-2 i.n. + 0, 613 ~.lgL-2 I
3' 6 ~.lg 0, 613 IL-2 HA + ~.Lg I
AIL Ag + IL-2 i.n. I
L'analyse des sérums est réalisée par test ELISA
tel que décrit précédemment, en utilisant soit un anti IgG2a murine, soit un anti IgGl murine.
2) Résultats.
Le tableau 5 ci-dessous résume les résultats obtenus en terme de sous-type de gamma globuline (IgG2a et IgGl) des différentes formulations BVSMTM/influenza adjuvantées et des contrôles correspondants après administration nasale. Par rapport à l'antigène libre administré par voie sous-cutanée, la formulation BVSMTT'/influenza administrée par voie nasale induit une modeste augmentation de production IgG2a spécifique.
54 souris femelles BALB/cJ/Rj (âgées de 10 semaines au début de l'étude) sont divisés en 9 groupes à
raison de 6 souris par groupe. Pour chaque groupe le traitement et les prélèvements sont réalisés comme décrit dans la partie " Matériel et méthodes ".
Le tableau 4 ci-dessous récapitule ces traitements.
Tableau 4 Code Groupe Route Formule administre (nombre Quantit/dose de souris) C Contrle i.n. 20 ~l PBS mOsm/kg ' naf 80 FA Ag + BVSM i . 3 , 6 ~..lg 3 2 0 BVSM
n HA + , 4 . ~..Lg AS Ag s.c. s.c. 3,6 ~..lg HA
3 ' 6 ~..tg 3 2 0 BVSM
HA + , 4 ~.I,g FcTB Ag + BVSM + CTB i .
n .
+ 1 ~..lg CTB
AcTS Ag + CTB i . 3 , 6 E.l,g 1 ~.Ig n HA + CTB
.
3 ' 6 j~g 3 2 0 BVSM
HA + , 4 ~.lg FMPL Ag + BVSM + MPL i .
n .
+ 5 ~tg MPL
AMPL Ag + MPL ( 6 ) i . 3 ~.Lg HA ~.~g n + 5 MPL
.
3'6 ~..lg 320,4 BVSM
HA + ~..lg FIL Ag + BVSM + IL-2 i.n. + 0, 613 ~.lgL-2 I
3' 6 ~.lg 0, 613 IL-2 HA + ~.Lg I
AIL Ag + IL-2 i.n. I
L'analyse des sérums est réalisée par test ELISA
tel que décrit précédemment, en utilisant soit un anti IgG2a murine, soit un anti IgGl murine.
2) Résultats.
Le tableau 5 ci-dessous résume les résultats obtenus en terme de sous-type de gamma globuline (IgG2a et IgGl) des différentes formulations BVSMTM/influenza adjuvantées et des contrôles correspondants après administration nasale. Par rapport à l'antigène libre administré par voie sous-cutanée, la formulation BVSMTT'/influenza administrée par voie nasale induit une modeste augmentation de production IgG2a spécifique.
37 Par comparaison l'adjonction de la CTB à la formülation Ag/BVSMTM induit une nette augmentation de la production Ig2a (multiplication par 5.4 de l'index Ig2a/Igl versus Ag S.c). Il est important de noter que cette modification de la balance Thl/Th2 n'est pas prévisible à
partir des résultats obtenus par l'association de la CTB aux antigènes. En effet, dans ce groupe contrôle, il existe un abaissement de l'index Ig2a/IgGl.
Tahl eam 5 Route IgG2A IgGl Index Ratio versus IgG2a/IgGl Ag s.c.
Contrle naf i.n. 0 0 0 0,0 Ag s.c. s.c. 157 233556,7 1,0 Ag i.n. i.n. 0 9793 0,0 0,0 Ag+BVSM i.n. 572 656998,7 1,3 Ag+CTB i.n. 87 447711,9 0,3 Ag+BVSM+CTB i.n. 2506 6887736,4 5,4 Ag+MPL i.n. 143 3003 47,6 7,1 Ag+BVSM+MPL i.n. 101 105619,6 1,4 Ag+IL-2 i.n. 0 3234 0,0 0,0 Ag+BVSM+IL-2 i.n. 26 249521,0 0,2 A l'inverse, le MPL qui lorsqu'il est associé au split influenza favorise la production IgG2a (index 47.6 versus 6.7 pour les Ag s.c) n'entraîne qu'une modification mineure de la balance Thl/Th2 après association avec les formulation Ag/BVSMTM.
Finalement, l'association ILZ aux formulations Ag/BVSMTM permettent de modifier la balance Thl/Th2 comme nous pouvons le visualiser sur l'abaissement de l'index IgG2a/Igl.
Ainsi, même en absence de modification quantitative de la réponse immunologique l'association d'adjuvant aux formulations Antigène/BVSMTM permet d'induire une modification qualitative de la réponse immunologique.
Cette association devrait permettre par un choix correct de l'adjuvant utilisé d'adapter la balance Thl/Th2 à la stratégie vaccinale proposée.
partir des résultats obtenus par l'association de la CTB aux antigènes. En effet, dans ce groupe contrôle, il existe un abaissement de l'index Ig2a/IgGl.
Tahl eam 5 Route IgG2A IgGl Index Ratio versus IgG2a/IgGl Ag s.c.
Contrle naf i.n. 0 0 0 0,0 Ag s.c. s.c. 157 233556,7 1,0 Ag i.n. i.n. 0 9793 0,0 0,0 Ag+BVSM i.n. 572 656998,7 1,3 Ag+CTB i.n. 87 447711,9 0,3 Ag+BVSM+CTB i.n. 2506 6887736,4 5,4 Ag+MPL i.n. 143 3003 47,6 7,1 Ag+BVSM+MPL i.n. 101 105619,6 1,4 Ag+IL-2 i.n. 0 3234 0,0 0,0 Ag+BVSM+IL-2 i.n. 26 249521,0 0,2 A l'inverse, le MPL qui lorsqu'il est associé au split influenza favorise la production IgG2a (index 47.6 versus 6.7 pour les Ag s.c) n'entraîne qu'une modification mineure de la balance Thl/Th2 après association avec les formulation Ag/BVSMTM.
Finalement, l'association ILZ aux formulations Ag/BVSMTM permettent de modifier la balance Thl/Th2 comme nous pouvons le visualiser sur l'abaissement de l'index IgG2a/Igl.
Ainsi, même en absence de modification quantitative de la réponse immunologique l'association d'adjuvant aux formulations Antigène/BVSMTM permet d'induire une modification qualitative de la réponse immunologique.
Cette association devrait permettre par un choix correct de l'adjuvant utilisé d'adapter la balance Thl/Th2 à la stratégie vaccinale proposée.
Claims (49)
1) Utilisation d'un vecteur du type comportant un noyau hydrophile non liquide pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des cancers et/ou des maladies virales, ledit vecteur étant associé dans le médicament avec au moins une substance, autre qu'un antigène, capable de moduler la réponse immunitaire.
2) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le vecteur est du type comportant un noyau hydrophile non liquide et une couche externe constituée au moins en partie de composés amphiphiles, associée au noyau par des interactions hydrophobes et/ou des liaisons ioniques.
3) Utilisation selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que le noyau hydrophile non liquide est constitué d'une matrice de polysaccharides ou d'oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés, sur lequel sont greffés des ligands ioniques.
4) Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que les ligands ioniques sont à charge positive.
5) Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que les ligands ioniques à charge positive sont des ammoniums quaternaires.
6) Utilisation d'un vecteur selon l'une des revendications 2 à 5, caractérisée en ce que la couche externe est formée de dipalmitoyl phosphatidyl choline (DDPC) et de cholestérol.
7) Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que le rapport massique DPPC/cholestérol est de 70/30.
8) Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le rapport pondéral substance/vecteur est compris entre environ 1% et 20%, de préférence entre environ 5% et 10%.
9) Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la substance, autre qu'un antigène, capable de moduler la réponse immunitaire est une protéine d'intérêt thérapeutique qui joue un rôle dans le fonctionnement du système immunitaire, un adjuvant, ou une substance capable de modifier la balance Th1/Th2, ou un mélange de ceux-ci.
10) Utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce que la protéine d'intérêt thérapeutique est une cytokine ou une chémokine, de préférence choisie dans le groupe comprenant les interleukines, les interférons, les TNF, les TGF, le G-CSF, le GM-CSF, le MIF, le RANTES, ou un mélange de ceux-ci.
11) Utilisation selon la revendication 10, caractérisée en ce que la protéine d'intérêt thérapeutique est l'interleukine 2.
12) Utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce que l'adjuvant est choisi dans le groupe comprenant les enterotoxines bactériennes, les dérivés de liposaccharides, les oligonucléotides, les dérivés de la saponine, les sels d'ammonium et leurs dérivés, les protéines de type DT ou TT, ou un mélange de ceux-ci.
13) Utilisation d'un vecteur selon l'une des quelconques des revendications précédentes, caractérisée en ce que le cancer à traiter est de type non immunogénique ou faiblement immunogénique.
14) Utilisation d'un vecteur selon l'une des quelconques des revendications précédentes, caractérisée en ce que le médicament est destiné à l'administration par voie nasale ou orale.
15) Utilisation d'un vecteur comportant (a) un noyau hydrophile non liquide constitué
d'une matrice polysaccharidique ou d'oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés, sur lequel sont greffés des ligands ioniques de charge positive ou négative, et (b) une couche externe constituée au moins en partie de composés amphiphiles associée au noyau par des interactions hydrophobes et/ou des liaisons ioniques, et (c) incorporant l'IL-2 pour la préparation d'un médicament destiné à
l'administration sous forme injectable d'IL-2 en l'absence d'albumine.
d'une matrice polysaccharidique ou d'oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés, sur lequel sont greffés des ligands ioniques de charge positive ou négative, et (b) une couche externe constituée au moins en partie de composés amphiphiles associée au noyau par des interactions hydrophobes et/ou des liaisons ioniques, et (c) incorporant l'IL-2 pour la préparation d'un médicament destiné à
l'administration sous forme injectable d'IL-2 en l'absence d'albumine.
16) Procédé pour améliorer les propriétés immunomodulatrices d'une substance, autre qu'un antigène, capable de moduler la réponse immunitaire, caractérisé en ce qu'il comprend le mélange de ladite substance avec des vecteurs du type comportant un noyau hydrophile non liquide.
17) Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que les vecteurs sont du type comportant un noyau hydrophile non liquide et une couche externe constituée au moins en partie de composés amphiphiles, associée au noyau par des interactions hydrophobes et/ou des liaisons ioniques.
18) Procédé selon l'une des revendications 16 ou 17, caractérisé en ce que le noyau hydrophile non liquide est constitué d'une matrice de polysaccharides ou d'oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés, sur lequel sont greffés des ligands ioniques.
19) Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que les ligands ioniques sont à charge positive.
20) Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que les ligands ioniques à charge positive sont des ammoniums quaternaires.
21) Procédé selon l'une quelconque des revendications 17 à 20, caractérisée en ce que la couche externe est formée de dipalmitoyl phosphatidyl choline (DDPC) et de cholestérol.
22) Procédé selon la revendication 21, caractérisée en ce que le rapport massique DPPC/cholestérol est de 70/30.
23) Procédé selon la revendication l'une quelconque des revendications 16 à 22, caractérisé en ce que le rapport pondéral substance/vecteur est compris entre environ 1% et 20%, de préférence entre environ 5% et 10%.
24) Procédé selon l'une quelconque des revendications 16 à 23, caractérisé en ce que la substance, autre qu'un antigène, capable de moduler la réponse immunitaire est une protéine d'intérêt thérapeutique qui joue un rôle dans le fonctionnement du système immunitaire.
25) Procédé selon la revendication 24, caractérisé en ce que la protéine d'intérêt thérapeutique est une cytokine ou une chémokine, de préférence choisie dans le groupe comprenant les interleukines, les interférons, les TNF, les TGF, le G-CSF, le GM-CSF, le MIF, le RANTES, ou un mélange de ceux-ci.
26) Procédé selon l'une quelconque des revendications 16 à 23, caractérisé en ce que la substance, autre qu'un antigène, capable de moduler la réponse immunitaire est un adjuvant.
27) Procédé selon la revendication 26, caractérisé en ce que l'adjuvant est choisi dans le groupe comprenant les enterotoxines bactériennes, les dérivés de liposaccharides, les oligonucléotides, des saponines, les sels d'ammonium et leurs dérivés, les protéines de type DT
ou TT ou un mélange de ceux-ci.
ou TT ou un mélange de ceux-ci.
28) Procédé selon l'une quelconque des revendications 16 à 23, caractérisé en ce que la substance, autre qu'un antigène, capable de moduler la réponse immunitaire est une substance capable de modifier la balance Th1/Th2.
29) Procédé selon l'une quelconque des revendications 16 à 23, caractérisé en ce que la substance, autre qu'un antigène, capable de moduler la réponse immunitaire est un immunosupresseur.
30) Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend :
- un vecteur du type comportant un noyau hydrophile non liquide constitué d'une matrice de polysaccharides ou d'oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés, sur lequel sont greffés des ligands ioniques, et éventuellement une couche externe constituée au moins en partie de composés amphiphiles, associée au noyau par des interactions hydrophobes et/ou des liaisons ioniques, et - au moins une protéine d'intérêt thérapeutique, et/ou un adjuvant et/ou une substance capable de modifier la balance Th1/Th2.
- un vecteur du type comportant un noyau hydrophile non liquide constitué d'une matrice de polysaccharides ou d'oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés, sur lequel sont greffés des ligands ioniques, et éventuellement une couche externe constituée au moins en partie de composés amphiphiles, associée au noyau par des interactions hydrophobes et/ou des liaisons ioniques, et - au moins une protéine d'intérêt thérapeutique, et/ou un adjuvant et/ou une substance capable de modifier la balance Th1/Th2.
31) Composition pharmaceutique selon la revendication 30, caractérisée en ce que la couche externe est formée de dipalmitoyl phosphatidyl choline (DDPC) et de cholestérol.
32) Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 30 ou 31, caractérisée en ce que le rapport pondéral substance/vecteur est compris entre environ 1% et 20%, de préférence entre environ 5% et 10%.
33) Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 30 à 32, caractérisée en ce que la protéine d'intérêt thérapeutique est une cytokine ou une chémokine, de préférence choisie dans le groupe comprenant les interleukines, les interférons, les TNF, les TGF, le G-CSF, le GM-CSF, le MIF, le RANTES, ou un mélange de ceux-ci.
34) Composition pharmaceutique selon la revendication 33, caractérisée en ce que la protéine d'intérêt thérapeutique est l'interleukine 2.
35) Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 30 à 32, caractérisée en ce que l'adjuvant est choisi dans le groupe comprenant les enterotoxines bactériennes, les dérivés de liposaccharides, les oligonucléotides, les dérivés de la saponine, les sels d'ammonium et leurs dérivés, les protéines de type DT ou TT, ou un mélange de ceux-ci.
36) Utilisation d'un vecteur du type comportant un noyau hydrophile non liquide pour la préparation d'une composition vaccinale, ledit vecteur étant mélangé dans la composition avec au moins un antigène et au moins une substance capable de moduler la réponse immunologique audit antigène.
37) Utilisation selon la revendication 36, caractérisée en ce que le vecteur est du type comportant un noyau hydrophile non liquide et une couche externe constituée au moins en partie de composés amphiphiles, associée au noyau par des interactions hydrophobes et/ou des liaisons ioniques.
38) Utilisation selon l'une des revendications 36 ou 37, caractérisée en ce que le noyau hydrophile non liquide est constitué d'une matrice de polysaccharides ou d'oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés, sur lequel sont greffés des ligands ioniques.
39) Utilisation selon la revendication 38, caractérisée en ce que les ligands ioniques sont à charge positive.
40) Utilisation selon la revendication 39, caractérisée en ce que les ligands ioniques à charge positive sont des ammoniums quaternaires.
41) Utilisation selon l'une des revendications 37 à 40, caractérisée en ce que la couche externe est formée de dipalmitoyl phosphatidyl choline (DDPC) et de cholestérol.
42) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 36 à 41, caractérisée en ce que le rapport pondéral substance/vecteur est compris entre environ 1% et 20%, de préférence entre environ 5% et 10%.
43) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 36 à 42, caractérisée en ce que substance capable de moduler la réponse immunologique de l'antigène est un adjuvant et/ou une protéine d'intérêt thérapeutique et/ou une substance capable de modifier la balance Th1/Th2.
44) Utilisation selon la revendication 43, caractérisée en ce l'adjuvant est choisi parmi les enterotoxines bactériennes, les dérivés de la saponine, les sels d'ammonium et leurs dérivés, les protéines de type DT
ou TT, les cytokines, les oligonucléotides, ou un mélange de ceux-ci.
ou TT, les cytokines, les oligonucléotides, ou un mélange de ceux-ci.
45) Utilisation selon la revendication 43, caractérisée en ce que la protéine d'intérêt thérapeutique est une cytokine ou une chémokine, de préférence choisie dans le groupe comprenant les interleukines, les interférons, les TNF, les TGF, le G-CSF, le GM-CSF, le MIF, le RANTES, ou un mélange de ceux-ci.
46) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 36 à 45, pour la préparation d'une composition vaccinale destinée au traitement et/ou à la prévention des maladies virales, notamment le sida et l'hépatite chronique, ou des cancers.
47) Composition vaccinale, caractérisée en ce qu'elle comprend:
- un antigène ou un mélange d'antigènes, - un vecteur du type comportant un noyau hydrophile non liquide constitué d'une matrice de polysaccharides ou d'oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés, sur lequel sont greffés des ligands ioniques, et éventuellement une couche externe constituée au moins en partie de composés amphiphiles, associée au noyau par des interactions hydrophobes et/ou des liaisons ioniques, et - au moins une substance capable de moduler la réponse immunologique audit antigène.
- un antigène ou un mélange d'antigènes, - un vecteur du type comportant un noyau hydrophile non liquide constitué d'une matrice de polysaccharides ou d'oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés, sur lequel sont greffés des ligands ioniques, et éventuellement une couche externe constituée au moins en partie de composés amphiphiles, associée au noyau par des interactions hydrophobes et/ou des liaisons ioniques, et - au moins une substance capable de moduler la réponse immunologique audit antigène.
48) Composition pharmaceutique selon la revendication 47, caractérisée en ce que la couche externe est formée de dipalmitoyl phosphatidyl choline (DDPC) et de cholestérol.
49) Composition vaccinale selon l'une des revendications 47 ou 48, caractérisée en ce que substance capable de moduler la réponse immunologique de l'antigène est un adjuvant et/ou une protéine d'intérêt thérapeutique et/ou une substance capable de modifier la balance Th1/Th2.
50) Composition vaccinale selon la revendication 49, caractérisée en ce que l'adjuvant est choisi parmi les enterotoxines bactériennes, les dérivés de la saponine, les sels d'ammonium et leurs dérivés, les protéines de type DT
ou TT, les cytokines, les oligonucléotides, ou un mélange de ceux-ci.
51) Composition vaccinale selon la revendication
49) Composition vaccinale selon l'une des revendications 47 ou 48, caractérisée en ce que substance capable de moduler la réponse immunologique de l'antigène est un adjuvant et/ou une protéine d'intérêt thérapeutique et/ou une substance capable de modifier la balance Th1/Th2.
50) Composition vaccinale selon la revendication 49, caractérisée en ce que l'adjuvant est choisi parmi les enterotoxines bactériennes, les dérivés de la saponine, les sels d'ammonium et leurs dérivés, les protéines de type DT
ou TT, les cytokines, les oligonucléotides, ou un mélange de ceux-ci.
51) Composition vaccinale selon la revendication
49, caractérisée en ce que la protéine d'intérêt thérapeutique est une cytokine ou une chémokine, de préférence choisie dans le groupe comprenant les interleukines, les interférons, les TNF, les TGF, le G-CSF, le GM-CSF, le MIF, le RANTES, ou un mélange de ceux-ci.
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