EP1276468A1 - Utilisation de vecteurs particulaires dans l' immunomodulation - Google Patents

Utilisation de vecteurs particulaires dans l' immunomodulation

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Publication number
EP1276468A1
EP1276468A1 EP01931773A EP01931773A EP1276468A1 EP 1276468 A1 EP1276468 A1 EP 1276468A1 EP 01931773 A EP01931773 A EP 01931773A EP 01931773 A EP01931773 A EP 01931773A EP 1276468 A1 EP1276468 A1 EP 1276468A1
Authority
EP
European Patent Office
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substance
antigen
vector
use according
adjuvant
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP01931773A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Roger Kravtzoff
Didier Betbeder
Michel Major
Olivier Balland
Samir El Mir
Frédéric Triebel
Anne Casanova
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut Gustave Roussy (IGR)
Ceva Sante Animale SA
Original Assignee
Institut Gustave Roussy (IGR)
Biovector Therapeutics SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from FR0005295A external-priority patent/FR2808193B1/fr
Priority claimed from FR0005304A external-priority patent/FR2808194B1/fr
Application filed by Institut Gustave Roussy (IGR), Biovector Therapeutics SA filed Critical Institut Gustave Roussy (IGR)
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
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    • C12N2760/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • the subject of the present invention is a process for improving the immunomodulatory properties of a substance, other than an antigen, capable of modulating the immunological response consisting in mixing said substance with hydrophilic particles carrying or not carrying ionic ligands and optionally covered with a layer of amphiphilic compounds.
  • the invention relates to the treatment and / or prevention of diseases comprising an immunogenic character such as cancers or infections.
  • the invention relates very particularly to a therapeutic composition, in particular a vaccine composition, and to their method of preparation.
  • the invention particularly relates to the use of particulate vectors incorporating interleukin 2 for the preparation of medicaments intended for the treatment of cancers.
  • Cancer is a disease characterized by an uncontrolled proliferation of certain cells, which escape the surveillance of the immune system.
  • the role of the immune system is not only to reject pathogenic foreign bodies (viruses, bacteria, parasites ...) which can enter the human body, but also to eliminate cells with abnormal characteristics.
  • Cancer cells may sometimes escape the vigilance of the immune system, for example by decreasing the expression of certain tumor-specific antigens, or of molecules involved in recognition by the immune system (proteins of the major histocompatibility complex ).
  • the tumors are strongly immunogenic, the immune system cannot fight them, the lymphocytes being in an anergic state near the cancerous clusters.
  • a new strategy developed in recent years consists in stimulating the immune system by injecting proteins of therapeutic interest, having a role in the regulation of the immune system.
  • proteins of therapeutic interest having a role in the regulation of the immune system.
  • proteins of therapeutic interest we can of course mention cytokines, but also other agents such as chemokines.
  • cytokines we can focus on interleukins, interferons, TNF (tumor necrotizing factors), TGF (transforming growth factors), hematopoietic growth factors such as M-CSF and GM-CSF, but also factors that attract immune cells, such as MIF or RAMTES.
  • IL-2 interleukin 2
  • Thl type 1 helper T lymphocytes
  • B T lymphocytes, natural killer cells NK
  • IL-2 has anti-tumor properties, in that it can induce a regression of different solid tumors, of melanomas, of leukemias or of lymphomas, etc.
  • IL-2 in chemotherapy faces many problems. To achieve the desired effect, it is often necessary to administer large doses of protein, which can cause annoying side effects (fever, erythema, edema). Furthermore, the purification of this protein is difficult, it is generally produced by genetic engineering, and is therefore expensive. In addition, cytokines are often unstable in solution, even at 4 ° C, which poses a conservation problem. In addition, the processes for preparing the solutions comprising IL-2 contain a step of adding stabilizing protein, often albumin, which becomes difficult to accept for regulatory agencies, due to the risks posed by the use of albumin.
  • stabilizing protein often albumin
  • the present invention proposes to solve these various problems, by implementing a new way of formulating the compositions containing IL-2, which makes it possible to obtain solutions having an activity, in particular anti-tumor activity, greater than the usual formulations.
  • This new formulation also increases the stability of IL-2.
  • the invention can be used for the manufacture of a medicament which can be administered intranasally or orally, an active principle delivery system having a very significant improvement over the systems previously described.
  • a formulation according to the invention makes it possible to dispense with the presence of albumin in the compositions comprising IL-2, intended for administration in injectable form.
  • BVSM also referred to below as "BVSM”.
  • BVSM A first type of BVSM, and its preparation process, have been described in European patent No. 344 040. These are particles comprising from the inside to the outside: a non-liquid hydrophilic central core consisting of a matrix of naturally or chemically crosslinked polysaccharides or oligosaccharides which can be modified by various ionic groups; - a layer of fatty acids grafted by covalent bonds to the nucleus; one or more lipid layers consisting in particular of phospholipids.
  • Patent applications published under the numbers WO 94/20078, WO 96/06638 and EP 782 851 describe these BVSMs, their manufacture, their association with various active ingredients and their use for the preparation of pharmaceutical compositions.
  • the hydrophilic nucleus can be obtained by various methods already described previously (thus the patents EP344040, WO92 / 21329, WO94 / 20078), and the crosslinking methods are known to those skilled in the art, the polysaccharide can be positively charged or negatively, by the grafting of ionic, cationic or anionic groups, to the sugars composing the polymer. These groups can be chosen from quaternary ammonium or carboxymethyl functions. The methods have been described in WO92 / 21329 and the patents cited above.
  • the charge of the polysaccharide core of the vectors of the compositions according to the invention is generally preferably a positive charge.
  • the vectors whose hearts contain negative charges may sometimes be preferred, in particular in a composition for use in injectable form.
  • the aforementioned patents also describe the protocols that a person skilled in the art can use for the incorporation of the external lipid layer. It is preferably composed of "DPPC-like", that is to say of DPPC (dipalmitoyl phosphatidyl choline) or any other compound having the same properties as this product, in which cholesterol is added.
  • Other lipid compounds can be used in particular phospholipids or ceramides, to which other constituents, for example constituents of biological membranes, can be added.
  • the DPPC / Cholesterol mass ratio is 70/30.
  • BVSMs are formed from a crosslinked hydrophilic polymer, preferably polysaccharides, in the form of nanoparticulate gel, these BVSMs are said to be of PSC type (or NPS in French). As indicated above, this polymer can optionally carry positive ionic ligands, BVSM said cationic, or negative, BVSM said anionic. This charged or uncharged polymer is optionally covered with a layer of amphiphilic compounds, preferably phospholipids, BVSM called Light type described in PCT patent application WO94 / 20078.
  • the size of the BVSM is between 20 and 200 nm, preferably between 50 and 100 nm and more preferably between 60 and 80 nm.
  • the BVSMs can be sterilized by filtration and their association with the active ingredients is made on fully manufactured BVSMs (Major et al., Biochem. & Biophys. Acta (1997), 1327, 32-40). This allows biological molecules, which are particularly fragile, to be worked under optimal conditions.
  • BVSM protects biological molecules from degradation (Prieur R. et al. Vaccines (1996) Vol 14, N ° 6 pp. 511-520 Combination of hCMV recombinant IE1 protein with 80 nm cationic biovectors: protection from proteolysis and potentiation of presentation to CD4).
  • BVSM are known to be used as transporters of active substances, for example peptides, antigens or oligonucleotides.
  • active substances for example peptides, antigens or oligonucleotides.
  • the active substance such as ionic interactions between the cationic nucleus of the BVSM and the anionic oligonucleotide.
  • the oligonucleotide / BVSM ratio is 5 to 10% and the measured association yield is greater than 90%.
  • BVSM allow to improve the immunomodulatory properties of a substance other than an antigen capable of modulating the immunological response.
  • substances are more particularly:
  • - adjuvants capable of amplifying, regulating or modifying the immune response, - cytokines and chemokines whose intrinsic property is to modify the activity of cells of the immune system, immunosuppressants due to their use in the treatment of allergies , and / or rejection of the transplant,
  • lymphocyte cells in particular B cells and T lymphocytes.
  • the latter can be classified into two subtypes based on their expression of surface antigens CD4 and CD8.
  • CD4 + cells are generally involved in "helper” functions. In particular, they secrete cytokines which induce the proliferation and maturation of other lymphocyte cells.
  • helper T lymphocytes Two profiles of helper T lymphocytes can be defined:
  • Thl profile which characterizes a cell-mediated response, with the induction of cytokines in particular of IL2, IL7 and gamma interferon, the stimulation of CTLs and the induction of antibodies type IgG2a, and
  • Th2 profile which characterizes a humoral mediation response, with the induction of cytokines including IL4, IL5 and IL10, and the presence of antibodies of the IgGl and IgE type.
  • Protein antigens the presentation of which by antigen presenting cells (APC) is mainly done by MHC class II, induce a Th2-oriented response.
  • APC antigen presenting cells
  • the DNA which allows, after transfection, to present the antigens directly on MHC class I, orients the immune response towards Thl.
  • Certain adjuvants are known to orient the response mainly towards Thl or Th2.
  • the aluminum salts which induce an IgG1-type serum response are considered to be Th2.
  • adjuvants such as lipid A derivatives (MPL) or QuilA derivatives, which induce an IgG2a and CTL response, are considered to be Thl. It would therefore be useful to have means allowing to act on the Thl / Th2 balance, which is precisely what the present invention proposes to achieve.
  • the BVSM does not act as an adjuvant, because only it does not induce activation of the immune system, but as a "carrier" allowing better penetration and / or better presentation of the antigen to the presenting cells.
  • the results obtained showed the contribution of BVSM on the adjuvant power of BTC, MPL and ODN.
  • the adjuvant power is visualized in a different way:
  • the invention therefore firstly relates to the use of a vector of the type comprising a non-liquid hydrophilic nucleus for the preparation of a medicament intended for the treatment of cancers and / or viral diseases, said vector being associated in the drug with at least one substance, other than an antigen, capable of modulating the immune response.
  • the vector is advantageously of the type comprising a non-liquid hydrophilic nucleus and an external layer constituted at least in part of amphiphilic compounds, associated with the nucleus by hydrophobic interactions and / or ionic bonds.
  • the outer layer consists of dipalmitoyl phosphatidyl choline (DDPC) and cholesterol.
  • DDPC dipalmitoyl phosphatidyl choline
  • the non-liquid hydrophilic nucleus consists of a matrix of naturally or chemically crosslinked polysaccharides or oligosaccharides, onto which ionic ligands are grafted.
  • the ionic ligands are preferably positively charged, like quaternary ammoniums.
  • Particulate vectors having a non-liquid hydrophilic core and an external layer made up of amphiphilic compounds have already been described, in particular in patent application WO94 / 20078.
  • the hydrophilic nucleus can be obtained by various methods already described above (thus the patents EP344040, WO92 / 21329, WO94 / 20078), and the crosslinking methods are known to those skilled in the art, the polysaccharide can be positively or negatively charged, by the grafting of ionic, cationic or anionic groups, to the sugars composing the polymer. These groups can be chosen from quaternary ammonium or carboxymethyl functions.
  • the methods have been described in WO92 / 21329 and the patents cited above.
  • the charge of the polysaccharide core of the vectors of the compositions according to the invention is generally preferably a positive charge. However, vectors whose hearts contain negative charges can sometimes be preferred, in particular in a composition for use in injectable form.
  • the aforementioned patents also describe the protocols that a person skilled in the art can use for the incorporation of the external lipid layer.
  • This is preferably composed of "DPPC-like", that is to say of DPPC (dipalmitoyl phosphatidyl choline) or any other compound having the same properties as this product, in which cholesterol is added.
  • DPPC-like that is to say of DPPC (dipalmitoyl phosphatidyl choline) or any other compound having the same properties as this product, in which cholesterol is added.
  • other lipid compounds can be used in particular phospholipids or ceramides, to which other constituents can be added, for example constituents of biological membranes.
  • the DPPC / Cholesterol mass ratio is 70/30.
  • the substance / particle weight ratio is between approximately 1% and 20%, preferably between approximately 5% and 10%.
  • the weight ratio (substance) / (core + outer layer) is 1 to 10.
  • a first class of substances, other than an antigen, capable of modulating the immune response includes proteins of therapeutic interest which play a role in the functioning of the immune system. It is more particularly a cytokine or a chemokine, preferably chosen from the group comprising interleukins, interferons, TNF, TGF, G-CSF, GM-CSF, MIF, RANTES , or a mixture of these.
  • adjuvant is meant a molecule making it possible to amplify, regulate or orient the specific immune response of an antigen.
  • various molecules belonging to the main categories of adjuvants have been tested in the context of the present invention, such as bacterial products (endotoxins, wall components), cytokines, oligonucleotides (CpG).
  • bacterial products endotoxins, wall components
  • cytokines oligonucleotides
  • - bacterial enterotoxins such as CT, CTB, LT,
  • the substance, other than an antigen, capable of modulating the immune response is preferably chosen from: adjuvants, capable of amplifying, regulating or modifying the immune response, cytokines and chemokines whose intrinsic property is to modify the activity of cells of the immune system, immunosuppressants due to their use in the treatment of allergies and / or transplant rejection, - substances capable of modifying the balance
  • the invention envisages more particularly as a substance, the immunomodulatory properties of which it is desired to improve, cytokines which stimulate the activity of immune cells, and among these, IL2, IL11 and GM- CSF. Indeed, cytokines stimulate or inhibit the activity of immune cells.
  • a very preferred embodiment of the invention relates to the use of a vector comprising: a) a non-liquid hydrophilic core, consisting of a matrix of polysaccharides or of oligosaccharides naturally or chemically crosslinked, onto which ionic ligands are grafted, b) an external layer constituted at least in part of amphiphilic compounds, associated with the nucleus by hydrophobic interactions and / or ionic bonds and c) incorporating interleukin 2 for the preparation of a medicament intended for the treatment of cancers.
  • Such a pharmaceutical composition containing a vector comprising: a) a non-liquid hydrophilic nucleus, consisting of a matrix of naturally or chemically cross-linked polysaccharides or oligosaccharides, onto which ionic ligands are grafted, b) an outer layer consisting at least partly of amphiphilic compounds, associated with the nucleus by hydrophobic interactions and / or ionic bonds and c) incorporating interleukin 2 also forms part of the invention.
  • a vector comprising: a) a non-liquid hydrophilic nucleus, consisting of a matrix of naturally or chemically cross-linked polysaccharides or oligosaccharides, onto which ionic ligands are grafted, b) an outer layer consisting at least partly of amphiphilic compounds, associated with the nucleus by hydrophobic interactions and / or ionic bonds and c) incorporating interleukin 2 also forms part of the invention.
  • the invention relates to the treatment of cancers of the non-immunogenic or weakly immunogenic type, and / or to the treatment of infections, in particular viral infections such as AIDS or chronic hepatitis where the immunomodulators have been proposed in addition to therapeutic treatments. to activate the immune response.
  • a composition for the implementation of this use comprises hydrophilic particles carrying or not ionic ligands and optionally covered with a layer of amphiphilic compounds in which are incorporated proteins of therapeutic interest or adjuvants as defined above. Such a composition does not include an antigen.
  • the cancers which can be treated with a composition according to the invention can be of all kinds.
  • cancers of the ENT sphere, the esophagus, the stomach, the colon, the rectum, the prostate, the liver, the pancreas, the breast, the cervix or the uterine body, the ovary, kidney, bladder, bone, or thyroid we also add bronchopulmonary cancers, malignant melanomas, brain tumors, lymphomas (Hodgskinian or not), leukemias (myeloids or lymphoids), cancers of unknown primary location. These cancers can be primary or metastatic.
  • compositions according to the invention can be immunogenic or not.
  • the Applicant has shown that the compositions according to the invention are particularly effective in the treatment and control of cancers with little or no immunogenicity.
  • compositions and medicaments according to the invention can be administered in various ways, in particular parenterally.
  • the compositions according to the invention can thus be administered intravenously, subcutaneously, intramuscularly, or intradermally. Administration can also be carried out (and this is a big advantage of the invention) orally or intranasally.
  • the compositions allowing an oral intake can be tablets, capsules, powders, granules or oral suspensions or solutions. They also include forms of sublingual and oral administration. It is optionally possible to add certain excipients to the pharmaceutical compositions according to the invention. It is thus possible to use any kind of binding, surfactant, coating, dispersion or wetting agents.
  • the Applicant has shown that these vectors are capable of fixing IL-2 very efficiently, that the protein retains its biological activity, and that, unexpectedly, this activity is increased compared to the unformulated protein.
  • the Applicant has also shown that a formulation according to the invention makes it possible to stabilize the protein in solution, in the same way as in the presence of albumin.
  • a vector comprising: (a) a non-liquid hydrophilic nucleus consisting of a polysaccharide matrix or of naturally or chemically crosslinked oligosaccharides, onto which ionic ligands of positive or negative charge are grafted, (b) an external layer constituted at least in part of amphiphilic compounds associated with the nucleus by hydrophobic interactions and / or ionic bonds and (c) incorporating IL-2 for the preparation of a medicament intended for the administration in injectable form of said IL-2 protein in the absence of albumin is also part of the invention.
  • the Applicant has shown that the vector-protein association remains stable (measured by a maintenance of the activity after several months of storage), which presents an improvement compared to the previous technique, in which the therapeutic preparations d 'IL-2 cannot be stored, which further increases the cost.
  • the Applicant has shown that, surprisingly, the IL-2 formulated according to the invention, and administered by the intranasal route has an activity similar or superior to IL-2 administered by more conventional routes, such as subcutaneously. The use of a vector according to the invention therefore makes it possible to get rid of all the various problems previously posed when using IL-2.
  • a vector according to the invention can therefore be used for the treatment of cancers where a potentiation of the immune response is sought.
  • a subject of the invention is also a method for improving the immunomodulatory properties of a substance, other than an antigen, capable of modulating the immune response, characterized in that it comprises the mixing of said substance with vectors of the type comprising a non-liquid hydrophilic nucleus.
  • the vectors are of the type comprising a non-liquid hydrophilic core and an external layer made up at least in part of compounds amphiphilic, associated with the nucleus by hydrophobic interactions and / or ionic bonds.
  • the non-liquid hydrophilic nucleus consists of a matrix of naturally or chemically crosslinked polysaccharides or oligosaccharides, onto which ionic ligands, in particular of positive charge, are grafted, such as quaternary ammoniums.
  • the outer layer is for example formed of dipalmitoyl phosphatidyl choline (DDPC) and cholesterol, in particular according to the mass ratio DPPC / cholesterol is 70/30.
  • DDPC dipalmitoyl phosphatidyl choline
  • DPPC / cholesterol is 70/30.
  • the weight ratio substance / vectors in the mixture is between approximately 1% and 20%, preferably between approximately 5% and 10%.
  • the substance, other than an antigen, capable of modulating the immune response is chosen from:
  • a protein of therapeutic interest which plays a role in the functioning of the immune system, such as a cytokine or a chemokine, preferably chosen from the group comprising interleukins, interferons, TNF, TGF, G-CSF, GM-CSF, MIF, RANTES, or a mixture of these,
  • an adjuvant in particular chosen from the group comprising bacterial enterotoxins, liposaccharide derivatives, oligonucleotides, saponins, ammonium salts and their derivatives, DT or TT type proteins or a mixture thereof. a substance capable of modifying the Thl / Th2 balance. - an immunosuppressant.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition, characterized in that it comprises: a vector of the type comprising a non-liquid hydrophilic nucleus consisting of a matrix of naturally or chemically crosslinked polysaccharides or oligosaccharides, onto which are grafted ionic ligands, and an outer layer consisting at least of part of amphiphilic compounds, associated with the nucleus by hydrophobic interactions and / or ionic bonds, and
  • the vector, the protein of therapeutic interest and the adjuvant being defined as above.
  • the invention also relates very particularly to the use of vectors, as defined above, for the preparation of a therapeutic or prophylactic vaccine composition, said particles being mixed in the composition with at least one antigen and at least one substance capable of modulating the immunological response to said antigen.
  • the invention is particularly interested in the treatment and / or prevention of viral diseases, in particular AIDS and chronic hepatitis, but also cancers having an immunogenic character.
  • the invention therefore relates very specifically to a vaccine composition characterized in that it comprises vectors as defined above and an antigen or a mixture of antigens, and at least one substance capable of modulating the immunological response to said antigen.
  • the substance capable of modulating the immunological response to the antigen present in the composition of the invention is preferably an adjuvant.
  • the invention contemplates bacterial products (endotoxins, wall components), cytokines, oligonucleotides (CpG).
  • bacterial products endotoxins, wall components
  • cytokines cytokines
  • oligonucleotides CpG
  • - bacterial enterotoxins such as CT, CTB,
  • the substance / particle weight ratio is between approximately 1% and 20%, preferably between approximately 5% and 10%.
  • the invention is very particularly suitable for the preparation of a composition, more particularly for mucosal administration, in particular nasal administration, but any other mode of administration, for example parenteral, can be envisaged.
  • Example 1 the preparation and the biological activity of BVSM-IL2.
  • Example 2 (ii) the effect in mice of
  • BVSM on the immunogenicity of a trivalent split Influenza to that of different adjuvants, and (iii) the effect in mice of the co-administration of the formulation and of various adjuvants on the immunogenicity of a trivalent split Influenza.
  • Figure 1 ELISA analysis of BVSM-IL2 interactions, in particular to calculate the optimal mass ratio between the protein of interest and the vector. Values are given in Arbitrary Units (AU).
  • AU Arbitrary Units
  • Figure 2 Analysis of BVSM-IL2 on a Biacore device. Comparison of the refraction between a free IL-2 composition and the BVSM-IL2 composition. Values are given in Units of Refraction (UK).
  • Figure 3 Proliferation of stimulated peripheral mononuclear cells previously stimulated by PHA, and by BVSM-IL2 of various compositions. The proliferation is measured by incorporation of H-labeled thymidine and is proportional to the number of counts per minute (cpm) noted.
  • Figure 4 Effect of different IL-2 formulations on the implantation and growth of a tumor in a TS / A model, after co-administration.
  • the symbols represent: PBS, saline buffer; IL-2, unformulated interleukin 2; KY, cationic core vector and DPPC / Cholesterol layer; KY / IL-2, KY vector formulated with IL-2.
  • Figure 5 Effect of different IL-2 formulations on the implantation and growth of a tumor in a TS / A model, after administration into the contralateral flank of BALB / c mice.
  • the symbols are the same as before, the numerical values indicated correspond to the UI values of IL-2.
  • FIG. 6 A. Rejection properties of a TS / A tumor implanted by subcutaneous administration of KY / IL-2 in the contralateral flank of BALB / c mice at one or five site (s), six days after implantation. The symbols are the same as before, the numerical values indicated correspond to the UI values of IL-2.
  • B protection of cured mice after re-injection of TS / A tumor cells. In the two figures, the number of mice presenting tumors is indicated in brackets.
  • Figure 7 A. Rejection properties of a tumor
  • the symbols are the same as before, the numerical values indicated correspond to the UI values of IL-2.
  • Figure 8 CTL anti-tumor activity in mice having rejected TS / A cells after administration of KY / IL-2.
  • Figure 9 Biacore analysis (surface plasmon resonance) of the association of CTB with BVSM TM as a function of CTB concentration.
  • Figure 10 Biacore analysis of the association of MPL with BVSM TM as a function of the MPL concentration.
  • Figure 11 inhibition of the association of Harbin split B on BVSM in the presence of an increasing amount of CTB.
  • Figure 12 inhibition of the Harbin split B association on BVSM in the presence of an increasing amount of MPL.
  • Figure 13 sensorgrams obtained by comparing the two modes of preparation of BTC and influenza antigens on the BVSM immobilized on the HPA sensorship. First, the CTB then the antigen are deposited successively on the BVSM (curve A) and vice versa (curve B).
  • Figure 14 sensorgrams obtained by comparing the two modes of preparation of MPL and influenza antigens on the BVSM immobilized on the HPA sensorship. First, the MPL and then the antigen are deposited successively on the BVSM (curve A) and vice versa (curve B).
  • FIG. 15 specific titration of the B / Harbin split of the pools of sera (IgG) and of the nasal secretions (IgA) of mice administered by the trivalent formulations and the antigen controls associated or not with BTC.
  • Figure 16 specific titration of the B / Harbin split of the pools of sera (IgG) and of the nasal secretions (IgA) of mice administered by the trivalent formulations and the antigen controls associated or not with MPL.
  • FIG. 17 represents the specific titration of the B / Harbin split of the pools of sera (IgG) and of the nasal secretions (IgA) of mice administered by the trivalent formulations and the antigen controls associated or not with the oligonucleotides.
  • Example 1 Preparation and biological activity of BVSM-IL2.
  • vectors loaded with IL-2 The vectors used (BVSM) in this example have been described previously. These are cationic vectors having a lipid layer of DPPC-
  • a composition according to the invention is obtained by the BVSM-IL2 bond by simple mixing of the two compounds, in a weight ratio of 10/1, and in a buffered saline solution (PBS).
  • PBS buffered saline solution
  • the optimal mass ratio of BVSM with respect to the protein is determined by ELISA analysis, according to a method well known to those skilled in the art.
  • the wells are covered with an anti-IL2 antibody, and saturated with BSA (bovine serum albumin).
  • BSA bovine serum albumin
  • the preparation of IL-2 to be tested is added, then a second biotinylated anti-IL2 antibody is added.
  • streptavidin linked to a peroxidase followed by the addition of a substrate of said peroxidase makes it possible to determine the amount of IL-2 present in the solution, by colorimetry.
  • the values obtained are expressed in Arbitrary Units, a value being all the higher as there is IL-2 present in the solution tested.
  • the preparations tested are preparations into which the same amount of IL-2 has been introduced, in the presence of vectors in various proportions, or in their absence, with or without BSA as a protein stabilizer.
  • the rate of association of IL-2 with the vectors is determined by the surface resonance technique of the plasmon in a Biacore X device, following the manufacturer's instructions. This method allows the detection of differences in the refractive index of a surface layer of a solution in contact with the detection chip, by illumination with polarized monochromatic light.
  • the operating protocol is as follows:
  • the BVSM (0.05 g / l) are adsorbed on the surface of the detection chip;
  • the free IL-2 is injected (1-6 mg / ml) in order to determine the standard curve (expressed as resonance units, RU) which is a function of the concentration of protein injected; - After regeneration, a preparation is injected as prepared in Example l.A, in which the BVSM-IL2 are present, as well as free IL-2. Only the latter can associate with the BVSMs fixed to the surface of the detection chip. This protocol makes it possible to determine the concentration of free IL-2 in the formulation of Example 1.A and to deduce therefrom the rate of association BVSM-IL2.
  • This example shows the importance of the composition of the nuclei and layers of the vector on the biological activity of IL-2.
  • IL-2 associated with the various BVSMs.
  • the biological activity of IL-2 associated with the various BVSMs is evaluated by measuring the proliferation of blood mononuclear cells, calculated by incorporating H-labeled thymidine. These cells have previously been stimulated by compounds (PHA) which induce expression of the CD25 receptor, which has a strong affinity for IL-2.
  • PHA compounds
  • Preparations of IL-2 in solution are generally not stable in solution at 4 ° C, IL-2 losing its biological activity.
  • the BVSM-IL2 preparation (QAE / DPPC / Chol) remains stable after two months of storage at 4 ° C., 95% of the biological activity of fresh IL-2 being maintained, as measured by incorporation of thymidine labeled with H in CTLL-2 murine cells.
  • BVSM-IL2 The activity of BVSM-IL2 (KY / IL2, mass ratio 10/1) was tested in the TS / A tumor model (undifferentiated, non immunogenic breast adenocarcinoma), in a tumor implantation rejection model, or a model for the treatment of previously implanted tumors.
  • A. Co-administration in the same flank 5.10 tumor cells are co-administered to female BALB / c mice subcutaneously (sc), as well as the BVSM-IL2 (KY / IL-2) corresponding to the IL-2 concentration indicated on Figure 4.
  • the vectors are also administered alone or unformulated IL-2, or simple PBS. The implantation and the evolution of the size of the tumors are measured.
  • FIG. 4 clearly shows that there is implantation of the tumor cells and tumor growth after administration of the vectors alone or of IL-2 alone, while the IL-2 formulated with the KY vectors makes it possible to retard growth. tumor.
  • FIG. 5 shows that the contralateral administration of IL-2 complexed with the vectors allows the reduction of tumor growth, a result not observed with IL-2 not formulated, even used at a dose 100 times higher.
  • Figure 6.B shows that the prior administration of KY / IL-2 partially protects the animals against a new challenge. In fact, four out of nine mice do not develop tumors, and tumor development is slowed down in other animals, compared to naive animals.
  • the tumor is implanted and is palpable (surface of approximately 40 mm 2).
  • the increase in tumor size is evaluated.
  • Figure 7.A. shows that IL-2 complexed with vectors slows tumor growth, more significantly than IL-2 alone. The number of administrations does not seem to lead to differences in the results observed.
  • mice 25.10 TS / A cells are reinjected into the ten mice described above, which no longer have tumors 48 days after administration of IL-2. Naive mice are used as controls.
  • Figure 7.B shows that the prior administration of KY / IL-2 partially protects the animals against a new challenge. Indeed, four out of ten mice do not develop tumors, and tumor development is slowed down in other animals, compared to naive animals.
  • the splenocytes are stimulated in vitro with TS / A cells for 6 days and the CTL activity against TS / A cells is studied.
  • mice having received the KY / IL-2 by the subcutaneous route express a CTL activity specific for TS / A (FIG. 8.A), since the syngenic cells WEHI 164 or the YAC cells are not lysed.
  • a specific CTL activity is also observed in the mice having received KY / IL-2 intranasally.
  • Example 2 Effect of BVSM in Mice on the Immunogenicity of a Split Influenza Trivalent to That of Different Adjuvants, and Effect in Mice of Co-Administration of the Formulation and Different Adjuvants on the Immunogenicity of a Split Trivalent influenza.
  • mice BALB / cJ / Rj female mice (10 weeks old at the start of the study) from the Janvier breeding center (Route des Chênes-Sec - BP5 - Le Genest-Saint-Isle), are acclimated for 7 days, 6 mice per cage before the start of the study.
  • DPPC / Cholesterol corresponds to a polysaccharide core grafted with glycidyl trimethylammonium and surrounded by a layer of DPPC / Cholesterol. This type of vector is described in EP 687 173. b) Ad uvants.
  • CTB cholera toxin subunit
  • Trivalent Split Influenza A solution with 250 ⁇ g of HA / ml (83.3 ⁇ g / strain) of trivalent split Influenza is prepared with 3 split monovalent eggs from Biochem Pharma (Canada).
  • HA hemagglutinin
  • neuraminidase neuraminidase
  • a formulation containing 250 ⁇ g of HA / ml (83.3 ⁇ g / strain) of trivalent split Influenza is prepared with the 3 monovalent split eggs above in order to obtain a HA / BVSM ratio equal to 1/89: 250 ⁇ g of trivalent HA /
  • This formulation is obtained by mixing, at equal volume, 3 formulations with 250 ⁇ g of HA / 22.25 mg of BVSM / ml, each of the monovalent split.
  • AS and AN prepared by mixing, at equal volume, 3 solutions with 250 ⁇ g of HA / ml of each of the monovalent split,
  • the trivalent split solution is respectively prepared in phosphate buffered saline or in sterile water.
  • subcutaneous 100 ⁇ l using a 1 ml syringe at the dorsal level for controls
  • nasal 20 ⁇ l (10 ⁇ l / nostril) with a 10 ⁇ l micropipette for the samples tested and the controls
  • the immunization includes two administrations, at OJ and D21 carried out in the same mode.
  • - Blood sample - Blood sample.
  • a blood sample of approximately 0.3 ml is taken from the retroorbital vein on D0 (control) and D35.
  • the nasal cavities are washed using 500 ⁇ l of phosphate buffered saline - BSA 1% introduced into the trachea in the direction of the nasal turbines. The operation is thus repeated 3 times with the same PBS-BSA 1%.
  • the nasal swab is stored in an Eppendorf tube at -20 ° C.
  • the nasal secretions are collected on D35. b) Analysis of samples.
  • the microplates (Nunc, Immunoplate maxisorb, polylabo) are coated with the influenza vaccine (100 ng HA / well in carbonate buffer, pH 9.6, 2 hrs at 37 ° C). After rinsing (three times in PBS-tween pH 7.6 buffer) then saturation with 250 ⁇ l / well of a 3% PBS-BSA solution (lhOO at 37 ° C), the ranges of serums or nasal secretions are incubated 1 hour to
  • FIG. 9 shows the sensorgram obtained by association of the CTB and the BVSM immobilized on the HPA sensorchip as a function of the CTB concentration (1) 2.5 ⁇ g / ml; 2) 25 ⁇ g / ml; 3) 250 ⁇ g / ml in 45 mM PBS) (which corresponds to 0.3 X).
  • Figure 10 shows the sensorgram obtained by association of MPL and BVSM immobilized on the sensorchip
  • HPA as a function of the concentration of MPL (1) l, 56 ⁇ g / ml; 2) 3.125 ⁇ g / ml; 3) 6.25 ⁇ g / ml; 4) 12.5 ⁇ g / ml; 5) 25 ⁇ g / ml;
  • BVSM / Adjuvant / split Influenza is then studied. Two methods are used:
  • an adjuvant solution is introduced before adding the Influenza split.
  • the Influenza split is introduced before adding the adjuvant.
  • Figure 11 summarizes the results obtained in the case of a Harbin split B.
  • Variable amounts of CTB are introduced on immobilized BVSM (1) No CTB, 2) 2.5Mg / ml, 3) 25 ⁇ g / ml, 4) 250 ⁇ g / ml in 45mM PBS).
  • the Harbin monovalent split B at 25 ⁇ g / ml is then deposited on the adjuvant BVSM. There is clearly an inhibition of the association of the split on the BVSM when the CTB is added before the split.
  • Figure 12 summarizes the results obtained in the case of MPL and a Harbin split B.
  • Variable quantities of MPL are introduced into the immobilized BVSM (1) 1.56 ⁇ g / ml; 2) 3.12 ⁇ g / ml; 3) 6.25 ⁇ g / ml; 4) 12.5 ⁇ g / ml; 5) 25 ⁇ g / ml; 6) 50 ⁇ g / ml in 45 mM PBS).
  • the 25 ⁇ g / ml split is then deposited on the adjuvant BVSM.
  • BTC and in proportion to the amount of MPL, there is an inhibition of the association of the split on the BVSM when the adjuvant is added before the split.
  • FIG. 13 represents the sensorgrams obtained by comparing the two modes of preparation in the case of BTC.
  • the CTB is added to the immobilized BVSMs, then the monovalent split is introduced.
  • the monovalent split is added to the immobilized BVSMs, then the CTB is introduced.
  • FIG. 14 represents the sensorgrams obtained by comparing the two modes of preparation in the case of MPL.
  • the BVSM makes it possible to associate an additional quantity of material corresponding to the MPL.
  • BVSM / antigen the role of the BVSM as "Antigen Carrier" is preserved.
  • a control is carried out under the same conditions but in the absence of BVSM TM resulting in a trivalent split at 250 ⁇ g of HA (83 ⁇ g / strain) / ml.
  • a CTB solution is added to each of these preparations in order to obtain the corresponding adjuvant formulations and controls.
  • mice 36 female BALB / cJ / Rj mice (10 weeks old at the start of the study) are divided into 6 groups at a rate of 6 mice per group. For each group, the treatment is carried out as described above. Table 1 below summarizes the treatment for each group.
  • FIG. 15 summarizes the results obtained in specific titration of the B / Harbin split of the pools of sera (IgG) and of the nasal secretions (IgA) of mice. It allows the results of trivalent formulations containing CTB (F-CTB) to be compared with different controls. These controls are either antigen controls alone, or antigen controls associated with BTC, or the reference formulation (HA / BVSM ratio: 1/89). These results were confirmed by the analysis of the individual response against split B / Harbin and A / Nanchang.
  • the reference formulation (FA) induces a level of type G antibody equivalent to the antigen control alone administered subcutaneously (AS) and a higher level of IgG than the control alone administered by the nasal route ( AN) (22, 4X).
  • control antigens associated with CTB (ACTB) administered by the nasal route induce IgG markedly higher than the free antigen administered by the same route (increase of 22, 4X).
  • these formulations (Ag + CTB) (ACTB) induce a strong mucosal immunity.
  • FCTB CTB adjuvant
  • ACTB reference control
  • Protocol A trivalent formulation and the corresponding control are prepared at 250 ⁇ g of HA / ml (83.3 ⁇ g / strain) / of split Influenza.
  • mice 36 female BALB / cJ / Rj mice (10 weeks old at the start of the study) are divided into 6 groups at a rate of 6 mice per group. For each group the treatment is carried out as described in the section "Materials and methods". Table 2 below summarizes the treatment of each group.
  • FIG. 16 summarizes the results obtained in specific titration of the B / Harbin split of the pools of sera (IgG) and of the nasal secretions (IgA) of mice administered with the formulations adjuvanted by MPL. These results were confirmed by the analysis of the individual response against the split B / Harbin and A / Nanchang.
  • the formulation combined with the MPL adjuvant induces a specific IgG response similar to the reference formulation. Conversely, for this adjuvant there is an effect
  • a trivalent formulation and the corresponding control are prepared at 250 ⁇ g of HA / ml (83.3 ⁇ g / strain) / of split Influenza
  • ODN oligonucleotide solution
  • mice 42 female BALB / cJ / Rj mice (10 weeks old at the start of the study) are divided into 7 groups at a rate of 6 mice per group. For each group the treatment is carried out as described in the section "Materials and methods". Table 3 summarizes the treatment for each group.
  • FIG. 17 summarizes the results obtained in specific titration of the B / Harbin split of the pools of sera (IgG) and of the nasal secretions (IgA) of mice administered with the formulations adjuvanted by the oligonucleotides. These results were confirmed by the analysis of the individual response against the split B / Harbin and A / Nanchang.
  • the split influenza viruses associated with the BVSM or with the ODN administered by the nasal route induce a serum IgG response markedly higher than the free antigen administered by the same route (respective increase of 22, 4X and 7.3X). At the same time these formulations induce a strong mucosal immunity.
  • the formulation associated with the ODN adjuvant induces an IgG response superior to the reference formulation and to its reference control (Ag + ODN).
  • Ag + ODN the reference formulation
  • the IgG titers obtained for the formulation being equal to the sum of the responses obtained for the antigen + ODN 1 (A ODN1 ) and for the
  • a trivalent formulation and the corresponding control are prepared at 250 ⁇ g of HA / ml (83.3 ⁇ g / strain) / of split Influenza. From the trivalent formulation, three adjuvant formulations are obtained:
  • BVSM TM / Ag / CTB By adding a CTB solution to the trivalent formulation. -TM
  • BVSM / Ag / IL2 By adding to the trivalent formulation of a recombinant IL-2 solution
  • mice 54 female BALB / cJ / Rj mice (10 weeks old at the start of the study) are divided into 9 groups at a rate of 6 mice per group. For each group, processing and sampling are carried out as described in the "Materials and methods" section.
  • the analysis of the sera is carried out by ELISA test as described above, using either a murine anti IgG2a or a murine anti IgG1.
  • Table 5 summarizes the results obtained in terms of the gamma globulin subtype (IgG2a and IgGl) of the various adjuvanted BVSM / influenza formulations and of the corresponding controls after nasal administration. Compared to the free antigen administered subcutaneously, the formulation
  • BVSM / influenza administered via the nasal route induces a modest increase in specific IgG2a production.
  • the addition of BTC to the Ag / BVSM TM formulation induces a marked increase in Ig2a production (multiplication by 5.4 of the Ig2a / Igl index versus Ag Sc). It is important to note that this modification of the Thl / Th2 balance is not predictable from the results obtained by the association of BTC with antigens. In fact, in this control group, there is a lowering of the Ig2a / lgGl index.
  • MPL which when associated with split influenza promotes IgG2a production (index 47.6 versus 6.7 for Ag sc) only causes a minor change in the Thl / Th.2 balance after association with the Ag / BVSM TM formulation.
  • the combination of adjuvant with the Antigen / BVSM formulations makes it possible to induce a qualitative modification of the immunological response.
  • This association should allow, by a correct choice of the adjuvant used, to adapt the Thl / Th2 balance to the proposed vaccination strategy.

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Abstract

La présente invention a pour objet un procédé pour améliorer les propriétés immunomodulatrices d'une substance, autre qu'un antigène, capable de moduler la réponse immunologique, caractérisé en ce qu'il comprend le mélange de ladite substance avec des particules hydrophiles portant ou non des ligands ioniques et éventuellement recouvertes d'une couche de composés amphiphiles. L'invention concerne aussi les compositions pharmaceutiques ainsi obtenues et leurs utilisations pour le traitement et/ou la prévention des cancers, des maladies virales et des maladies infectieuses.

Description

UTILISATION DE VECTEURS PARTICULAIRES DANS L ' IMMUNOMODULATION
La présente invention a pour objet un procédé pour améliorer les propriétés immunomodulatrices d'une substance, autre qu'un antigène, capable de moduler la réponse immunologique consistant à mélanger ladite substance avec des particules hydrophiles portant ou non des ligands ioniques et éventuellement recouvertes d'une couche de composés amphiphiles. L'invention concerne le traitement et/ou la prévention des maladies comprenant un caractère immunogénique comme les cancers ou les infections. L'invention s'intéresse tout particulièrement une composition thérapeutique notamment vaccinale et à leur procédé de préparation.
L'invention vise tout spécialement l'utilisation de vecteurs particulaires incorporant de l' interleukine 2 pour la préparation de médicaments destinés au traitement des cancers.
Le cancer est une maladie caractérisée par une prolifération incontrôlée de certaines cellules, qui échappent à la surveillance du système immunitaire. En effet, le rôle du système immunitaire est non seulement de rejeter les corps étrangers (virus, bactéries, parasites...) pathogènes qui peuvent pénétrer dans le corps humain, mais aussi d' éliminer les cellules présentant des caractéristiques anormales. Il est parfois possible que les cellules cancéreuses échappent à la vigilance du système immunitaire, par exemple en diminuant l'expression de certains antigènes spécifiques de la tumeur, ou de molécules impliquées dans la reconnaissance par le système immunitaire (protéines du complexe majeur d' histocompatibilité) . Dans d'autres cas, bien que les tumeurs soient fortement immunogéniques , le système immunitaire ne peut les combattre, les lymphocytes étant dans un état anergique à proximité des amas cancéreux. Une nouvelle stratégie développée dans les dernières années consiste à stimuler le système immunitaire par l'injection de protéines d'intérêt thérapeutique, ayant un rôle dans la régulation du système immunitaire. Parmi ces protéines, on peut citer bien sûr les cytokines, mais aussi d'autres agents comme les chémokines . En particulier, on peut mettre l'accent sur les interleukines, les interférons, les TNF (facteurs nécrosants de tumeurs) , les TGF (facteurs transformants de croissance) , les facteurs de croissance hématopoïétique tels que les M-CSF et GM-CSF, mais aussi des facteurs d'attraction de cellules immunitaires, tels que le MIF ou RAMTES.
Une cytokine particulièrement intéressante dans la stimulation du système immunitaire est 1 ' interleukine 2 (IL-2) . Elle est synthétisée majoritairement par les lymphocytes T helper de type 1 (Thl) en réponse à une stimulation par l'antigène présenté par des cellules appropriées. Elle est impliquée dans le développement de réponses immunitaires spécifiques et non spécifiques, en ce qu'elle interagit avec de nombreuses cellules (lymphocytes B, T, cellules tueurs naturels NK) pour les activer et induire leur différentiation et/ou leur prolifération. Ainsi, il a été montré que l'IL-2 possède des propriétés antitumorales, en ce qu'elle peut induire une régression de différentes tumeurs solides, de mélanomes, de leucémies ou de lymphomes, etc..
Toutefois, l'utilisation de l'IL-2 en chimiothérapie se heurte à de nombreux problèmes . Pour obtenir l'effet recherché, il est souvent nécessaire d'administrer des doses importantes de protéine, ce qui peut provoquer des effets secondaires gênants (fièvre, erythème, œdème). Par ailleurs, la purification de cette protéine est difficile, elle est en général produite par génie génétique, et est donc coûteuse. Par ailleurs, les cytokines sont souvent instables en solution, même à 4°C, ce qui pose un problème de conservation. De plus, les procédés de préparation des solutions comprenant de l'IL-2 contiennent une étape d'ajout de protéine stabilisatrice, souvent l'albumine, ce qui devient difficilement acceptable pour les agences de régulation, en raison des risques posés par l'utilisation de l'albumine.
La présente invention se propose de résoudre ces différents problèmes, en mettant en œuvre une nouvelle façon de formuler les compositions contenant de l'IL-2, qui permet d'obtenir des solutions ayant une activité, en particulier anti-tumorale, plus importante que les formulations usuelles. Cette nouvelle formulation permet également d'augmenter la stabilité de l'IL-2. De plus, l'invention peut-être utilisée pour la fabrication d'un médicament qui peut être administré par voie intranasale ou orale, un système de délivrance de principe actif présentant une amélioration très importante par rapport aux systèmes précédemment décrits. Enfin, une formulation selon l'invention permet de s'affranchir de la présence d'albumine dans les compositions comprenant de l'IL-2, destinées à une administration sous forme injectable.
La Demanderesse a développé son expertise dans la préparation de vecteurs particulaires synthétiques,
TM désignés aussi ci-apres "BVSM ".
Un premier type de BVSM, et son procédé de préparation, ont été décrits dans le brevet européen No. 344 040. Il s'agit de particules comprenant de l'intérieur vers l'extérieur : un noyau central hydrophile non liquide constitué d'une matrice de polysaccharides ou d' oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés, pouvant être modifiés par des groupements ioniques divers; - une couche d'acides gras greffés par des liaisons covalentes au noyau; une ou plusieurs couches lipidiques constituées notamment de phospholipides .
Les développements de cette première génération de BVSM ont conduit la Demanderesse à concevoir et préparer de nouveaux BVSM, aux propriétés améliorées notamment en fonction des principes actifs transportés.
Les demandes de brevet publiées sous les numéros WO 94/20078, WO 96/06638 et EP 782 851 décrivent ces BVSM, leur fabrication, leur association à divers principes actifs et leur utilisation pour la préparation de compositions pharmaceutiques .
Ainsi, le noyau hydrophile peut être obtenu par différentes méthodes déjà décrites précédemment (ainsi les brevets EP344040, W092/21329, WO94/20078), et les procédés de réticulation sont connus de l'homme du métier, le polysaccharide peut être chargé positivement ou négativement, par la greffe de groupements ioniques, cationiques ou anioniques, aux sucres composant le polymère. Ces groupements peuvent être choisis parmi des fonctions ammoniums quaternaires ou carboxyméthyles . Les procédés ont été décrits dans W092/21329 et les brevets cités précédemment . La charge du cœur polysaccharidique des vecteurs des compositions selon l'invention est en général de préférence une charge positive. Toutefois les vecteurs dont les cœurs contiennent des charges négatives peuvent parfois être préférés, en particulier dans une composition pour une utilisation sous forme injectable. Les brevets précédemment cités décrivent également les protocoles que l'homme du métier peut utiliser pour l'incorporation de la couche externe lipidique. Celle- ci est de préférence composée de " DPPC-like ", c'est à dire de DPPC (dipalmitoyl phosphatidyl choline) ou de tout autre composé possédant les mêmes propriétés que ce produit, dans lequel est ajouté du cholestérol. Toutefois, d'autres composés lipidiques, peuvent être utilisés en particulier des phospholipides ou des céramides, auxquels on peut additionner d'autres constituants, par exemple des constituants des membranes biologiques. De façon préférée, le rapport massique DPPC/Cholestérol est de 70/30.
Le savoir-faire dont dispose aujourd'hui la Demanderesse sur la préparation des BVSM lui permet de disposer d'une gamme étendue de type de BVSM. Ces BVSM sont formés d'un polymère hydrophile réticulé, préférentiellement des polysaccharides, sous forme de gel nanoparticulaire, ces BVSM sont dits de type PSC (ou NPS en français) . Comme indiqué ci-dessus, ce polymère peut éventuellement porter des ligands ioniques positifs, BVSM dit cationique, ou négatifs, BVSM dit anionique. Ce polymère chargé ou non est optionnellement recouvert d'une couche de composés amphiphiles, préfèrentiellement des phospholipides, BVSM dit de type Light décrit dans la demande de brevet PCT WO94/20078.
La taille des BVSM est comprise entre 20 et 200 nm, préférentiellement entre 50 et 100 nm et plus préférentiellement entre 60 et 80 nm.
Les BVSM sont stérilisables par filtration et leur association aux principes actifs se fait sur les BVSM complètement fabriqués (Major et al., Biochem. & Biophys. Acta (1997) , 1327, 32-40) . Ceci permet de travailler les molécules biologiques, particulièrement fragiles, dans des conditions optimales.
Les BVSM protègent les molécules biologiques de la dégradation (Prieur R. et al. Vaccins (1996) Vol 14, N°6 pp. 511-520 Combination of hCMV recombinant IE1 protein with 80 nm cationic biovectors : protection from proteolysis and potentiation of présentation to CD4) .
Il a aussi été montré qu' ils augmentent l'activité biologique de peptides et de protéines comme des enzymes, des antigènes, etc....
Les BVSM sont connus pour être utilisés comme transporteurs de substances actives, par exemple peptides, antigènes ou oligonucléotides . Dans cette utilisation, il y a formation d'un réel complexe entre le BVSM et la substance active, comme des interactions ioniques entre le noyau cationique du BVSM et 1 ' oligonucléotide anionique. Il y a donc formation d'un conjugué ionique stable dans un milieu biologique. Dans ce type de préparation, le rapport oligonucléotide / BVSM est de 5 à 10 % et le rendement d'association mesuré est supérieur à 90 %.
La demande de brevet PCT publiée sous le numéro WO 96/06638 rapporte l'augmentation de 1 ' immunogénicité d'un antigène, obtenue par un simple mélange antigène/BVSM. L'antigène est là aussi associé au vecteur particulaire par des liaisons ioniques et/ou hydrophobes. Pour obtenir ce résultat, on incube par exemple 1 mg de protéine GST-e4 pour 10 mg de BVSM, ce qui permet d'obtenir des taux d'association moyens de 90 % quel que soit le type de BVSM utilisé (Prieur R. et al. Vaccins (1996) Vol 14, N°6 pp 511- 520) .
La Demanderesse a maintenant découvert que les
BVSM permettent d'améliorer les propriétés immunomodulatrices d'une substance autre qu'un antigène capable de moduler la réponse immunologique . Ces substances sont plus particulièrement :
- des adjuvants capables d'amplifier, de réguler ou de modifier la réponse immune, - des cytokines et chemokines dont la propriété intrinsèque est de modifier l'activité des cellules du système immunitaire, des immunosuppresseurs du fait de leur utilisation dans le traitement des allergies, et/ou du rejet de greffe,
- des substances capables de modifier la balance Thl/Th2.
On peut rappeler que la réponse immunitaire est relayée par les cellules lymphocytaires notamment les cellules B et les lymphocytes T. Ces derniers peuvent être classés en deux sous-types sur la base de leur expression d'antigènes de surface CD4 et CD8. Les cellules CD4+ sont généralement impliquées dans les fonctions " helper " . En particulier, ils sécrètent des cytokines qui induisent la prolifération et la maturation des autres cellules lymphocytaires . Ainsi, deux profils des lymphocytes T helper peuvent être définis :
- d'une part, un profil Thl, qui caractérise une réponse à médiation cellulaire, avec l'induction de cytokines notamment d'IL2, d' IL7 et d' interféron gamma, la stimulation des CTL et l'induction d'anticorps de type IgG2a, et
- d'autre part, un profil Th2 , qui caractérise une réponse à médiation humorale, avec l'induction de cytokines notamment d'IL4, d' IL5 et d'ILlO, et la présence d'anticorps de type IgGl et IgE .
Les antigènes protéiques, dont la présentation par les cellules présentatrices d'antigènes (APC) est majoritairement faite par le CMH de classe II, induisent une réponse orientée vers les Th2. A l'inverse, l'ADN qui permet après transfection de présenter les antigènes directement sur les CMH de classe I, oriente la réponse immunitaire vers les Thl. Certains adjuvants sont connus pour orienter la réponse majoritairement vers Thl ou Th2. Par exemple, les sels d'aluminium qui induisent une réponse sérique de type IgGl sont considérés comme Th2. A l'inverse des adjuvants comme les dérivés du lipid A (MPL) ou les dérivés du QuilA, qui induisent une réponse IgG2a et CTL, sont considérés comme Thl. Il serait donc utile de disposer de moyens permettant d'agir sur la balance Thl/Th2, ce que précisément se propose de réaliser la présente invention.
Les travaux de recherche réalisés par la Demanderesse dans le cadre de la présente invention montrent que le BVSM n'agit pas comme un adjuvant, car seul il n'induit pas d'activation du système immunitaire, mais comme un " carrier " permettant une meilleure pénétration et/ou une meilleure présentation de l'antigène aux cellules présentatrices. Ainsi, les résultats obtenus ont montré l'apport de BVSM sur le pouvoir adjuvant de la CTB, des MPL et des ODN. De façon surprenante, le pouvoir adjuvant est visualisé de manière différente :
- sur la réponse IgG sérique, pour laquelle, une forte synergie, dans le cas de la CTB, ou une addition des réponses, dans le cas des ODN CpG, a été obtenue, sur la réponse IgA, où une synergie est clairement démontrée pour les MPL,
- sur la balance Thl/Th2, où même dans le cas d'une réponse quantitativement équivalente (IL2) , on observe une différence qualitative de la réponse notamment dans la balance Igl/IgG2a qui reflète un différentiel dans la réponse cellulaire. L'invention a donc tout d'abord pour objet l'utilisation d'un vecteur du type comportant un noyau hydrophile non liquide pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des cancers et/ou des maladies virales, ledit vecteur étant associé dans le médicament avec au moins une substance, autre qu'un antigène, capable de moduler la réponse immunitaire.
Le vecteur est avantageusement du type comportant un noyau hydrophile non liquide et une couche externe constituée au moins en partie de composés amphiphiles, associée au noyau par des interactions hydrophobes et/ou des liaisons ioniques. La couche externe est formée de dipalmitoyl phosphatidyl choline (DDPC) et de cholestérol . Le noyau hydrophile non liquide est constitué d'une matrice de polysaccharides ou d' oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés, sur lequel sont greffés des ligands ioniques.
Les ligands ioniques sont de préférence à charge positive, comme des ammoniums quaternaires.
Les vecteurs particulaires possédant un noyau hydrophile non liquide et une couche externe constituée de composés amphiphiles ont déjà été décrits, en particulier dans la demande de brevet WO94/20078. Le noyau hydrophile peut être obtenu par différentes méthodes déjà décrites précédemment (ainsi les brevets EP344040, W092/21329, WO94/20078), et les procédés de réticulation sont connus de l'homme du métier, le polysaccharide peut être chargé positivement ou négativement, par la greffe de groupements ioniques, cationiques ou anioniques, aux sucres composant le polymère. Ces groupements peuvent être choisis parmi des fonctions ammoniums quaternaires ou carboxyméthyles . Les procédés ont été décrits dans W092/21329 et les brevets cités précédemment. La charge du cœur polysaccharidique des vecteurs des compositions selon l'invention est en général de préférence une charge positive. Toutefois les vecteurs dont les cœurs contiennent des charges négatives peuvent parfois être préférés, en particulier dans une composition pour une utilisation sous forme injectable.
Les brevets précédemment cités décrivent également les protocoles que l'homme du métier peut utiliser pour l'incorporation de la couche externe lipidique. Celle- ci est de préférence composée de " DPPC-like ", c'est à dire de DPPC (dipalmitoyl phosphatidyl choline) ou de tout autre composé possédant les mêmes propriétés que ce produit, dans lequel est ajouté du cholestérol. Toutefois, d'autres composés lipidiques peuvent être utilisés en particulier des phospholipides ou des céramides, auxquels on peut additionner d'autres constituants, par exemple des constituants des membranes biologiques. De façon préférée, le rapport massique DPPC/Cholestérol est de 70/30. Dans l'utilisation de l'invention, le rapport pondéral substance / particules est compris entre environ 1% et 20%, de préférence entre environ 5% et 10%. Avantageusement, le rapport pondéral (substance) / (noyau + couche externe) est de 1 contre 10.
Une première classe de substances, autres qu'un antigène, capables de moduler la réponse immunitaire comprend des protéines d'intérêt thérapeutique qui jouent un rôle dans le fonctionnement du système immunitaire. Il s'agit plus particulièrement d'une cytokine ou d'une chémokine, de préférence choisie dans le groupe comprenant les interleukines, les interférons, les TNF, les TGF, le G- CSF, le GM-CSF, le MIF, le RANTES, ou un mélange de ceux-ci.
Une seconde classe de substances, autres qu'un antigène, capables de moduler la réponse immunitaire, recouvrant partiellement la précédente, comprend les adjuvants. On entend par adjuvant, une molécule permettant d'amplifier, de réguler ou d'orienter la réponse immune spécifique d'un antigène. Ainsi, afin d'évaluer les propriétés des BVSM sur le pouvoir immunomodulateur de substances autres que des antigènes, diverses molécules appartenant aux principales catégories d'adjuvants ont été testées dans le cadre de la présente invention, comme des produits bactériens (endotoxines, composants de la paroi) , des cytokines, des oligonucléotides (CpG) . On peut citer plus particulièrement parmi celles-ci :
- des enterotoxines bactériennes, comme CT, CTB, LT,
- des dérivés liposaccharidiques, comme MPL et dérivés de lipide A,
- des dérivés de la saponine type QS21,
- des sels d'ammonium et leurs dérivés, comme l'alum,
- des protéines type DT, TT, ou un mélange de ceux-ci
La substance, autre qu'un antigène, capable de moduler la réponse immunitaire est choisie de préférence parmi : les adjuvants, capables d'amplifier, de réguler ou de modifier la réponse immune, les cytokines et chemokines dont la propriété intrinsèque est de modifier l'activité des cellules du système immunitaire, les immunosuppresseurs du fait de leur utilisation dans le traitement des allergies et/ou du rejet de greffe, - les substances capables de modifier la balance
Thl/Th2.
Parmi celles-ci, l'invention envisage plus particulièrement comme substance, dont on souhaite améliorer les propriétés immunomodulatrices, les cytokines qui stimulent l'activité des cellules immunitaires, et parmi celles-ci, l'IL2, l'ILll et le GM-CSF. En effet, les cytokines stimulent ou inhibent l'activité des cellules immunitaires .
Une forme de mise en oeuvre toute préfère de l'invention concerne l'utilisation d'un vecteur comportant : a) un noyau hydrophile non liquide, constitué d'une matrice de polysaccharides ou d' oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés, sur lequel sont greffés des ligands ioniques, b) une couche externe constituée au moins en partie de composés amphiphiles, associée au noyau par des interactions hydrophobes et/ou des liaisons ioniques et c) incorporant de l' interleukine 2 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des cancers.
Une telle composition pharmaceutique, contenant un vecteur comportant : a) un noyau hydrophile non liquide, constitué d'une matrice de polysaccharides ou d' oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés, sur lequel sont greffés des ligands ioniques, b) une couche externe constituée au moins en partie de composés amphiphiles, associée au noyau par des interactions hydrophobes et/ou des liaisons ioniques et c) incorporant de l' interleukine 2 fait également partie de l'invention.
Dans cette utilisation, l'invention s'intéresse au traitement des cancers du type non immunogénique ou faiblement immunogénique, et/ou au traitement des infections notamment virales comme le sida ou l'hépatite chronique où les immunomodulateurs ont été proposés en complément de traitements thérapeutiques pour activer la réponse immunitaire. Une composition pour la mise en œuvre de cette utilisation comprend des particules hydrophiles portant ou non des ligands ioniques et éventuellement recouvertes d'une couche de composés amphiphiles dans lesquelles sont incorporées des protéines d' intérêt thérapeutique ou des adjuvants comme définis ci -dessus. Une telle composition ne comprend pas d'antigène.
Les cancers pouvant être traités par une composition selon l'invention peuvent être de toutes sortes. En particulier, on cite les cancers de la sphère ORL, de l'œsophage, de l'estomac, du colon, du rectum, de la prostate, du foie, du pancréas, du sein, du col ou du corps utérin, de l'ovaire, du rein, de la vessie, de l'os, ou de la thyroïde. On ajoute aussi les cancers bronchopulmonaires, les mélanomes malins, les tumeurs cérébrales, les lymphomes (Hodgskiniens ou non) , les leucémies (myéloides ou lymphoïdes) , les cancers de localisation primitive inconnue. Ces cancers peuvent être primaires ou métastatiques . Ils peuvent être de type sarcome, adénome, carcinome, adénocarcinome, lymphome, myélome, gliome, blastome, glioblastome. Les cancers pouvant être traités par une composition selon l'invention peuvent être immunogéniques ou non. La Demanderesse a montré que les compositions selon l'invention sont particulièrement efficaces dans le traitement et le contrôle de cancers peu ou pas immunogéniques .
Les compositions et médicaments selon l'invention peuvent être administrés de diverses façons, en particulier par voie parenterale. On peut ainsi administrer les compositions selon l'invention par voie intraveineuse, sous-cutanée, intramusculaire, ou intradermale . L'administration peut également être effectuée (et c'est un gros avantage de l'invention) par voie orale ou intranasale. Les compositions permettant une prise orale peuvent être des comprimés, des gélules, des poudres, des granules ou des suspensions ou solutions orales. Elles comprennent également les formes d'administration sublinguale et buccale. On peut éventuellement rajouter certains excipients aux compositions pharmaceutiques selon l'invention. On peut ainsi utiliser toute sorte d'agents liant, tensioactif, d'enrobage, de dispersion, ou de mouillage . La Demanderesse a montré que ces vecteurs sont capables de fixer l'IL-2 de façon très efficace, que la protéine conserve son activité biologique, et que, de façon inattendue, cette activité est augmentée par rapport à la protéine non formulée . La Demanderesse a également montré qu'une formulation selon l'invention permet de stabiliser la protéine en solution, de la même manière qu'en présence d'albumine. Ainsi, l'utilisation d'un vecteur comportant : (a) un noyau hydrophile non liquide constitué d'une matrice polysaccharidique ou d' oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés, sur lequel sont greffés des ligands ioniques de charge positive ou négative, (b) une couche externe constituée au moins en partie de composés amphiphiles associée au noyau par des interactions hydrophobes et/ou des liaisons ioniques et (c) incorporant l'IL-2 pour la préparation d'un médicament destiné à l'administration sous forme injectable de ladite protéine IL-2 en l'absence d'albumine fait également partie de l' invention.
De plus, la Demanderesse a montré que l'association vecteur-protéine reste stable (mesurée par un maintien de l'activité après plusieurs mois de stockage), ce qui présente une amélioration par rapport à la technique précédente, dans laquelle les préparations thérapeutiques d'IL-2 ne peuvent être conservées, ce qui en augmente d'autant plus le coût. Enfin, la Demanderesse a montré que, de façon surprenante, l'IL-2 formulée selon l'invention, et administrée par la voie intranasale possède une activité similaire ou supérieure à l'IL-2 administrée par des voies plus classiques, telles la voie sous-cutanée. L'utilisation d'un vecteur selon l'invention permet donc de s'affranchir de tous les différents problèmes précédemment posés lors de l'utilisation de l'IL-2.
Un vecteur selon l'invention est donc utilisable pour la traitement des cancers où l'on recherche une potentiation de la réponse immunitaire.
L'invention a aussi pour objet un procédé pour améliorer les propriétés immunomodulatrices d'une substance, autre qu'un antigène, capable de moduler la réponse immunitaire, caractérisé en ce qu'il comprend le mélange de ladite substance avec des vecteurs du type comportant un noyau hydrophile non liquide. Avantageusement, les vecteurs sont du type comportant un noyau hydrophile non liquide et une couche externe constituée au moins en partie de composés amphiphiles, associée au noyau par des interactions hydrophobes et/ou des liaisons ioniques. Comme indiqué précédemment, le noyau hydrophile non liquide est constitué d'une matrice de polysaccharides ou d' oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés, sur lequel sont greffés des ligands ioniques, notamment de charge positive, comme des ammoniums quaternaires. La couche externe est par exemple formée de dipalmitoyl phosphatidyl choline (DDPC) et de cholestérol, notamment selon le rapport massique DPPC/cholestérol est de 70/30. De préférence, le rapport pondéral substance/vecteurs dans le mélange est compris entre environ 1% et 20%, de préférence entre environ 5% et 10%.
Comme précédemment, la substance, autre qu'un antigène, capable de moduler la réponse immunitaire est choisie parmi :
- une protéine d'intérêt thérapeutique qui joue un rôle dans le fonctionnement du système immunitaire, comme une cytokine ou une chémokine, de préférence choisie dans le groupe comprenant les interleukines, les interférons, les TNF, les TGF, le G-CSF, le GM-CSF, le MIF, le RANTES, ou un mélange de ceux-ci,
- un adjuvant, notamment choisi dans le groupe comprenant les enterotoxines bactériennes, les dérivés de liposaccharides, les oligonucléotides, des saponines, les sels d'ammonium et leurs dérivés, les protéines de type DT ou TT ou un mélange, de ceux-ci. une substances capable de modifier la balance Thl/Th2. - un immunosupresseur .
L'invention se rapporte aussi à une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend : un vecteur du type comportant un noyau hydrophile non liquide constitué d'une matrice de polysaccharides ou d' oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés, sur lequel sont greffés des ligands ioniques, et une couche externe constituée au moins en partie de composés amphiphiles, associée au noyau par des interactions hydrophobes et/ou des liaisons ioniques, et
- au moins une protéine d'intérêt thérapeutique et/ou un adjuvant ou un mélange de ceux-ci. Le vecteur, la protéine d' intérêt thérapeutique et l'adjuvant étant définis comme précédemment.
L' invention concerne encore tout particulièrement l'utilisation de vecteurs, comme définis précédemment, pour la préparation d'une composition vaccinale thérapeutique ou prophylactique, lesdites particules étant mélangées dans la composition avec au moins un antigène et au moins une substance capable de moduler la réponse immunologique audit antigène. Dans le cas d'une utilisation thérapeutique, l'invention s'intéresse tout particulièrement au traitement et/ou à la prévention des maladies virales, notamment le sida et l'hépatite chronique, mais aussi des cancers ayant un caractère immunogénique.
L'invention concerne donc tout spécialement une composition vaccinale caractérisée en ce qu'elle comprend des vecteurs comme définis précédemment et un antigène ou un mélange d'antigènes, et au moins une substance capable de moduler la réponse immunologique audit antigène.
La substance capable de moduler la réponse immunologique à l'antigène présent dans la composition de l'invention est de préférence un adjuvant. Parmi ceux-ci, l'invention envisage des produits bactériens (endotoxines, composants de la paroi) , des cytokines, des oligonucléotides (CpG) . On peut citer plus particulièrement parmi celles-ci : - des enterotoxines bactériennes, comme CT, CTB,
LT,
- des dérivés liposaccharidiques, comme MPL et dérivés de lipide A,
- des dérivés de la saponine type QS21, - des sels d'ammonium et leurs dérivés, comme l' alum,
- des protéines type DT, TT, ou un mélange de ceux-ci. Comme indiqué précédemment, le rapport pondéral substance/particules est compris entre environ 1% et 20%, de préférence entre environ 5% et 10%.
L' invention est tout particulièrement adaptée à la préparation de composition, plus particulièrement, pour l'administration mucosale, notamment nasale, mais tout autre mode d'administration, par exemple parenterale, peut être envisagée .
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent concernant :
Exemple 1 : la préparation et l'activité biologique de BVSM-IL2. - Exemple 2 : (ii) l'effet chez la souris du
BVSM sur 1 ' immunogénicité d'un split Influenza trivalent à celui de différents adjuvants, et (iii) l'effet chez la souris de la co-administrâtion de la formulation et de différents adjuvants sur 1 ' immunogénicité d'un split Influenza trivalent.
Les exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention, sans toutefois être limitatifs. En particulier les valeurs données ne le sont qu'à titre d'exemple et peuvent être optimisées lors d'une mise en œuvre de la présente invention.
Il sera fait référence dans l'exemple 1 aux figures suivantes :
Figure 1 : Analyse ELISA des interactions BVSM- IL2, permettant en particulier de calculer le rapport massique optimal entre la protéine d'intérêt et le vecteur. Les valeurs sont données en Unités Arbitraires (UA) .
Figure 2 : Analyse des BVSM-IL2 sur un appareil Biacore . Comparaison de la réfraction entre une composition d'IL-2 libre et la composition BVSM-IL2. Les valeurs sont données en Unités de Réfraction (RU) .
Figure 3 : Prolifération de cellules mononucléaires périphériques stimulées préalablement stimulées par PHA, et par des BVSM-IL2 de diverses compositions. La prolifération est mesurée par incorporation de thymidine marquée au H et est proportionnelle au nombre de coups par minutes (cpm) relevés.
Figure 4 : Effet de différentes formulations d'IL-2 sur l'implantation et la croissance d'une tumeur dans un modèle TS/A, après co-administration. Les symboles représentent : PBS, tampon de saline ; IL-2, interleukine 2 non formulée ; KY, vecteur à cœur cationique et couche DPPC / Cholestérol ; KY / IL-2, vecteur KY formulé avec IL-2. Figure 5 : Effet de différentes formulations d'IL-2 sur l'implantation et la croissance d'une tumeur dans un modèle TS/A, après administration dans le flanc contralatéral de souris BALB/c . Les symboles sont les mêmes que précédemment, les valeurs numériques indiquées correspondent aux valeurs UI de l'IL-2.
Figure 6 : A. Propriétés de rejet d'une tumeur TS/A implantée par administration sous cutanée de KY / IL-2 dans le flanc contralatéral de souris BALB/c à un ou cinq site (s), six jours après implantation. Les symboles sont les mêmes que précédemment, les valeurs numériques indiquées correspondent aux valeurs UI de l'IL-2. B. protection de souris guéries après ré-injection de cellules tumorales TS/A. Dans les deux figures, le nombre de souris présentant des tumeurs est indiqué entre parenthèses . Figure 7 : A. Propriétés de rejet d'une tumeur
TS/A implantée par administration intranasale de KY / IL-2 dans le flanc contralatéral de souris BALB/c une ou deux fois par jour, pendant cinq jours, six jours après implantation. Les symboles sont les mêmes que précédemment, les valeurs numériques indiquées correspondent aux valeurs UI de l'IL-2. B. protection de souris guéries après réinjection de cellules tumorales TS/A. Dans les deux figures, le nombre de souris présentant des tumeurs est indiqué entre parenthèses . Figure 8 : activité CTL antitumorale chez les souris ayant rejeté les cellules TS/A après administration de KY / IL-2. A. Souris ayant reçu une administration sous cutanée. B. Souris ayant reçu une administration intranasale . Il sera fait référence dans l'exemple 2 au figures suivantes :
Figure 9 : analyse au Biacore (résonance plasmonique de surface) de l'association de la CTB avec les BVSM™ en fonction de la concentration en CTB.
Figure 10 : analyse au Biacore de 1 ' association du MPL avec les BVSM TM en fonction de la concentration en MPL.
Figure 11 : inhibition de l'association du split B Harbin sur les BVSM en présence d'une quantité croissante de CTB.
Figure 12 : inhibition de l'association de split B Harbin sur les BVSM en présence d'une quantité croissante de MPL. Figure 13 : sensorgrammes obtenus en comparant les deux modes de préparation de la CTB et des antigènes grippe sur les BVSM immobilisés sur la sensorship HPA. Dans un premier temps la CTB puis l'antigène sont déposés successivement sur les BVSM (courbe A) et inversement (courbe B) .
Figure 14 : sensorgrammes obtenus en comparant les deux modes de préparation du MPL et des antigènes de la grippe sur les BVSM immobilisés sur la sensorship HPA. Dans un premier temps, le MPL puis l'antigène sont déposés successivement sur les BVSM (courbe A) et inversement (courbe B) .
Figure 15 : titration spécifique du split B/Harbin des pools de sérums (IgG) et des sécrétions nasales (IgA) de souris administrées par les formulations trivalentes et les témoins antigènes associés ou non à la CTB.
Figure 16 : titration spécifique du split B/Harbin des pools de sérums (IgG) et des sécrétions nasales (IgA) de souris administrées par les formulations trivalentes et les témoins antigènes associés ou non au MPL.
Figure 17 : représente la titration spécifique du split B/Harbin des pools de sérums (IgG) et des sécrétions nasales (IgA) de souris administrées par les formulations trivalentes et les témoins antigènes associés ou non aux oligonucléotides.
Exemple 1 : Préparation et activité biologique de BVSM-IL2.
1) Caractérisation des particules chargées en
IL-2
A. Préparation des vecteurs chargés en IL-2. Les vecteurs utilisés (BVSM) dans cet exemple ont été décrits précédemment. Il s'agit de vecteurs cationiques possédant une couche lipidique en DPPC-
Cholestérol .
L' interleukine 2 (IL-2) utilisée provient de chez Chiron. Elle se présente sous forme d'IL-2 recombinante lyophilisée, telle que 18.10 UI = 1,1 mg de protéine lyophilisée .
Une composition selon l'invention est obtenue par la liaison BVSM-IL2 par simple mélange des deux composés, dans un rapport en poids de 10/1, et dans une solution de saline tamponnée (PBS) .
B. Détermination du rapport optimal BVSM-IL2.
Le rapport massique optimal de BVSM par rapport à la protéine est déterminé par analyse par ELISA, selon une méthode bien connue de l'homme du métier.
Brièvement, on couvre les puits avec un anticorps anti-IL2, et on sature avec de la BSA (albumine de sérum bovine) . On ajoute la préparation d' IL-2 à tester, puis on ajoute un second anticorps anti-IL2, biotinylé. L'ajout de streptavidine liée à une peroxydase suivi de l'addition d'un substrat de ladite peroxydase permet de déterminer la quantité d' IL-2 présente dans la solution, par colorimétrie . Les valeurs obtenues sont exprimées en Unités Arbitraires, une valeur étant d'autant plus élevée qu'il y a d'IL-2 présente dans la solution testée.
Les préparations testées sont des préparations dans lesquelles une même quantité d'IL-2 a été introduite, en présence de vecteurs dans des proportions diverses, ou en leur absence, avec ou sans BSA en tant que stabilisateur des protéines .
Les résultats sont exprimés dans la figure 1. On observe que l'on obtient environ le même taux d' IL-2 disponible dans les préparations contenant de la BSA, ou un taux de vecteurs particulaires tel que le rapport massique BVSM/IL-2 soit de 10/1. Lorsque l'IL-2 est seule dans le PBS ou que le rapport massique est inférieur, il y a moins d' IL- 2 disponible en solution. Ces résultats montrent donc que les vecteurs sont aussi efficaces que l'albumine pour stabiliser l'IL-2 et empêcher une baisse de la concentration efficace.
C. Détermination du taux d'association de l'IL-2 aux BVSM.
On détermine le taux d'association de l'IL-2 aux vecteurs par la technique de résonance de surface du plasmon dans un appareil Biacore X, en suivant les instructions du fabricant. Cette méthode permet la détection des différences dans l'index de réfraction d'une couche de surface d'une solution en contact avec la puce de détection, par illumination avec une lumière polarisée monochromatique.
Le protocole opératoire est le suivant :
- on adsorbe les BVSM (0,05 g/1) sur la surface de la puce de détection ;
- on injecte l'IL-2 libre (1-6 mg/ml) afin de déterminer la courbe standard (exprimée comme unités de résonance, RU) qui est fonction de la concentration de protéine injectée ; - après régénération, on injecte une préparation telle que préparée dans l'exemple l.A, dans laquelle sont présents les BVSM-IL2, ainsi que de l'IL-2 libre. Seule cette dernière peut s'associer aux BVSM fixés à la surface de la puce de détection. Ce protocole permet de déterminer la concentration d' IL-2 libre dans la formulation de l'exemple l.A et d'en déduire le taux d'association BVSM-IL2.
Les données de la figure 2 permettent de calculer que ledit taux d'association est de 85 %. 2) Analyse de l'activité biologique de l'IL-2 associée à différents vecteurs.
Cet exemple montre l'importance de la composition des noyaux et couches du vecteur sur l'activité biologique de l'IL-2.
On utilise quatre types différents de vecteurs :
- deux vecteurs possédant un cœur anionique avec une couche lipidique contenant a. un mélange Phospholipon / Cholestérol (P
PLpon/Chol) , ou b. un mélange DPPC / Cholestérol (P DPPC/Chol, ou PY)
- deux vecteurs possédant un cœur cationi ue et une membrane contenant c. un mélange Phospholipon / Cholestérol (QAE PLpon/Chol) , ou d. un mélange DPPC / Cholestérol (QAE DPPC/Chol, ou KY) L'IL-2 est ajoutée aux BVSM dans un rapport massique de 1/10.
On évalue l'activité biologique de l'IL-2 associée aux différents BVSM en mesurant la prolifération de cellules mononucléaires sanguines, calculée par incorporation de thymidine marquée à l' H. Ces cellules ont préalablement été stimulées par des composés (PHA) qui induisent l'expression du récepteur CD25, qui possède une forte affinité pour l'IL-2.
On observe (figure 3) que tous les BVSM permettent d'obtenir une activité équivalente à celle de l'IL-2 contrôle non formulée in vitro, les BVSM QAE DPPC/Chol permettant même d'améliorer cette activité biologique .
3) Etude de la stabilité des préparations d' IL-
2.
Les préparations d'IL-2 en solution ne sont en général pas stables en solution à 4 °C, l'IL-2 perdant son activité biologique. La préparation BVSM-IL2 (QAE/DPPC/Chol) reste stable après deux mois de stockage à 4 °C, 9 5% de l'activité biologique de l'IL-2 fraîche étant maintenue, comme mesurée par incorporation de thymidine marquée à H dans les cellules murines CTLL-2.
4) Tests in vivo. Tumeur TS/A.
On a testé l'activité des BVSM-IL2 (KY / IL2, rapport massique 10/1) dans le modèle de tumeur TS/A (adénocarcinome mammaire non différencié, non immunogénique), dans un modèle de rejet d'implantation tumorale, ou un modèle de traitement de tumeurs préalablement implantées.
A. Rejet de l'implantation tumorale.
A. 1 . Coadministration dans le même flanc On co-administre 5.10 cellules tumorales à des souris femelles BALB/c par voie sous cutanée (s.c), ainsi que les BVSM-IL2 (KY/IL-2) correspondant à la concentration en IL-2 indiquée sur la figure 4. En tant que contrôle, on administre également les vecteurs seuls ou l'IL-2 non formulée, ou du simple PBS. On mesure l'implantation et l'évolution de la taille des tumeurs.
La figure 4 montre clairement qu'il y a implantation des cellules tumorales et croissance de la tumeur après administration des vecteurs seuls ou de l'lL-2 seule, alors que l'IL-2 formulée avec les vecteurs KY permet de retarder la croissance tumorale.
A.2. Administration contralatérale On administre 5.10 cellules tumorales TS/A à des souris BALB/c, par voie s.c, ainsi que les KY / IL-2 correspondant aux concentrations en IL-2 indiquée sur la figure 5, dans le flanc contralatéral. On administre de l'IL-2 non formulée ou du PBS en tant que contrôles. La figure 5 montre que l'administration contralatérale de l'IL-2 complexée aux vecteurs permet la diminution de la croissance tumorale, un résultat non observé avec l'IL-2 non formulée, même utilisée à une dose 100 fois supérieure. B. Effet thérapeutique et protecteur sur une tumeur implantée ; administration par voie sous-cutanée.
B.l. Effet thérapeutique
Six jours après administration s.c. de 5.10 cellules TS/A à 10 souris/groupe, on administre les KY / IL- 2, par voie s.c, dans le flanc contralatéral. On effectue l'administration à un site (5.10 Unités d'IL-2) ou à cinq
3 sites distincts, la dose injectée étant alors 1.10 Unîtes par site. Dans un tel modèle, la tumeur est implantée et est palpable (surface d'environ 40 mm). On évalue l'augmentation de la taille de la tumeur. La figure 6.A. montre que l'IL-2 complexée aux vecteurs permet de ralentir la croissance tumorale, d'une façon plus importante que l'IL-2 seule. Par ailleurs, il semble que l'injections de petites doses à de multiples sites soit plus efficace que l'injection d'une dose plus forte à un site unique.
Trois animaux sur les 10 souris ayant reçu les KY / IL-2 à un site unique ne présentent pas de tumeur détectable après 30 jours, alors que 6 souris sur les 10 ayant reçu les KY / IL-2 à cinq sites d'administration sont également sans tumeur détectable. Ces neufs animaux ne redéveloppent pas de tumeurs plus tard. B.2. Effet protecteur On réinjecte 25.104 cellules TS/A aux neuf souris décrites précédemment, qui ne présentent plus de tumeurs 46 jours après l'administration de l'IL-2. Des souris naïves sont utilisées comme contrôles.
La figure 6.B montre que l'administration préalable de KY / IL-2 permet de protéger partiellement les animaux contre un nouveau challenge. En effet, quatre souris sur neuf ne développent pas de tumeurs, et le développement tumoral est ralenti chez les autres animaux, par rapport aux animaux naïfs.
C. Effet thérapeutique et protecteur sur une tumeur implantée ; administration par voie intranasale . Cl. Effet thérapeutique En commençant six jours après l'administration s.c. de 5.104 cellules TS/A à 10 souris/groupe, on administre les KY / IL-2, par voie intranasale, pendant une période de 5 jours. On effectue l'administration une ou deux fois par jour. Les contrôles utilisés sont l'IL-2 seule (administrée deux fois par jour) , les vecteurs seuls ou du PBS.
Dans un tel modèle, la tumeur est implantée et est palpable (surface d'environ 40 mm_) . On évalue l'augmentation de la taille de la tumeur. La figure 7.A. montre que l'IL-2 complexée aux vecteurs permet de ralentir la croissance tumorale, d'une façon plus importante que l'IL-2 seule. Il ne semble pas que le nombre d'administrations mène à des différences sur les résultats observés .
Quatre animaux sur les 10 souris ayant reçu les KY / IL-2 par voie intranasale, une fois par jour ne présentent pas de tumeur détectable après 35 jours, et 6 souris sur les 10 ayant reçu les KY / IL-2 deux fois par jour sont également sans tumeur détectable. Ces dix animaux ne redéveloppent pas de tumeurs plus tard. C.2. Effet protecteur
On réinjecte 25.10 cellules TS/A aux dix souris décrites précédemment, qui ne présentent plus de tumeurs 48 jours après l'administration de l'IL-2. Des souris naïves sont utilisées comme contrôles.
La figure 7.B montre que l'administration préalable de KY / IL-2 permet de protéger partiellement les animaux contre un nouveau challenge. En effet, quatre souris sur dix ne développent pas de tumeurs, et le développement tumoral est ralenti chez les autres animaux, par rapport aux animaux naïfs.
5) Induction de CTL. On isole les splénocytes des quatre souris traitées par voie sous cutanée (après 75 jours) ou intranasale (après 79 jours) , qui ont rejeté la tumeur implantée et n'ont pas redéveloppé de tumeurs après un nouveau challenge avec une dose plus importante (sections 4.B et 4.C) .
Les splénocytes sont stimulés in vi tro avec les cellules TS/A pendant 6 jours et 1 'activité CTL contre les cellules TS/A est étudiée.
On observe que les souris ayant reçu les KY / IL-2 par voie sous-cutanée expriment une activité CTL spécifique des TS/A (figure 8.A), puisque les cellules syngéniques WEHI 164 ou les cellules YAC ne sont pas lysées . On observe également une activité CTL spécifique chez les souris ayant reçu les KY / IL-2 par voie intranasale .
Exemple 2 : Effet chez la souris du BVSM sur 1' immunogénicité d'un split Influenza trivalent à celui de différents adjuvants, et effet chez la souris de la co- administration de la formulation et de différents adjuvants sur l' immunogénicité d'un split Influenza trivalent.
I - Matériel et méthodes.
1) Matériel .
Les animaux utilisés sont des souris femelles BALB/cJ/Rj (âgées de 10 semaines au début de l'étude) provenant du centre d'élevage Janvier (Route des Chênes-Sec - B.P.5 - Le Genest-Saint-Isle) , sont acclimatées pendant 7 jours, à raison de 6 souris par cage avant le début de 1 ' étude .
2) Produits. a) BVSM TM .
TM
Le BVSM utilisé est de type KY : QAE = 2 mEq -
DPPC/Cholesterol . Il correspond à un noyau polysaccharidique greffé par le glycidyl trimethylammonium et entouré d'une couche de DPPC / Cholestérol. Ce type de vecteur est décrit dans EP 687 173 . b) Ad uvants.
Les 4 adjuvants suivants ont été utilisés : - Sous-unité B de la choléra toxine (CTB) (réf. C9903, Sigma, St Quentin Fallavier, France).
- Monophosphoryl , Lipide A (MPL) (réf. R-350, Ribi Immunochem Research, Inc , Hamilton, MO). - IL-2 recombinante, Proleukin, activité 16,3.
106 U/mg (Chiron France, Suresnes, France) .
Oligonucléotides ODN : 5TCCATGACGTTCCTGAC (Eurogentec, Bruxelles, Belgique). c) Split Influenza trivalent . Une solution à 250 μg d'HA/ml (83,3 μg/souche) de split Influenza trivalent est préparée avec 3 split œuf monovalents de chez Biochem Pharma (Canada) .
- le split œuf monovalent produit à partir de la souche B/Harbin 7/94. - le split œuf monovalent produit à partir de la souche A/Johannesburg 82/96.
- le split œuf monovalent produit à partir de la souche A/Nanchang 933/95.
Ces split sont constitués d'un mélange de protéines virales, notamment d' hémagglutinine (HA) et de neuraminidase . d) Formulation.
- Formulation antigène + BVSM TM .
Une formulation à 250 μg d'HA/ml (83,3 μg/souche) de split Influenza trivalent est préparée avec les 3 split œuf monovalents ci -dessus afin d'obtenir un rapport d'HA/BVSM égal à 1/89 : 250 μg d'HA trivalente /
22,25 mg de BVSM / ml.
Cette formulation est obtenue par mélange, à volume égal, de 3 formulations à 250 μg d'HA / 22,25 mg de BVSM /ml, de chacun des split monovalents.
- Formulati •on antigène + BVSMTM + adjuvant.
A partir de la formulation antigène + BVSM™, quatre autres formulations avec adjuvant ont été préparées. Ces formulations sont obtenues par dilution de la formulation trivalente à 250 μg d'HA / ml en présence et par ajout d'adjuvant. La dilution permet d'ajuster la dose d'HA monovalente / souris / immunisation à 1,2 μg, soit 60 μg d'HA monovalente / ml et d'ajouter l'adjuvant dans le volume utilisé pour diluer. e) Témoin.
Trois types de témoins ont été préparés : - des témoins split trivalent, dénommés ci-après
AS et AN, préparés par mélange, à volume égal, de 3 solutions à 250 μg d'HA/ml de chacun des split monovalents,
- des témoins split trivalent + adjuvant,
- un contrôle naïf (PBS 0,22X). Selon la voie d'administration sous-cutanée (AS) ou intranasale (AN) la solution de split trivalent est respectivement préparée en Phosphate Buffered Saline ou en eau stérile.
3) Méthodes .
Les différentes formules (adjuvant ± BVSM ± Ag) sont administrées à jO et 21 selon le schéma suivant :
Contrôle PBS i . n. c Contrôle naï f i . n.
AS Ag s . c .
AN Ag i . n.
FA Ag + BVSM i . n.
Ax Ag + Adj X i . n.
FX Ag + BVSM + Adj X i . n. L' immunogénicité est évaluée après le rappel, à
J35 :
- au niveau sérique, détection par ELISA des IgG spécifiques de chaque split monovalent
- au niveau muqueux, détection par ELISA dans les sécrétions nasales et/ou vaginales des IgA spécifiques de chaque split monovalent.
a) Immunisation des souris.
- Administrations . L'administration des formules (BVSM ± Adj ± Ag) est réalisée sans anesthésie soit par voie :
. sous-cutanée : 100 μl à la seringue de 1 ml au niveau dorsal pour les contrôles, . nasale : 20μl (10 μl/narine) à la micropipette de 10 μl pour les échantillons testés et les contrôles,
Pour chaque groupe l'immunisation comprend deux administrations, à JO et J21 effectuées selon le même mode. - Prélèvement sanguin.
Un prélèvement sanguin d'environ 0,3 ml est réalisé à la veine rétroorbitale à J0 (contrôle) et J35.
Après formation d'un caillot et centrifugation le sérum est congelé à -20°C jusqu'à utilisation. . Prélèvement des sécrétions nasales.
Le lavage des cavités nasales est réalisé à l'aide de 500 μl de tampon phosphate salin - BSA 1% introduit dans la trachée en direction des turbines nasales. L'opération est ainsi répétée 3 fois avec le même PBS- BSA 1%. Le prélèvement nasal est conservé dans un tube Eppendorf à -20°C. Les sécrétions nasales sont récupérées à J35. b) Analyse des prélèvements.
L'analyse des sérums et des sécrétions nasale est réalisée par un test ELISA. Brièvement, les microplaques (Nunc, Immunoplate maxisorb, polylabo) sont coatées par le vaccin de la grippe (100 ng de HA/puits dans un tampon carbonate, pH 9,6, 2h00 à 37°C) . Après rinçage ( trois fois en tampon PBS-tween pH 7,6) puis saturation par 250 μl/puits d'une solution de PBS-BSA 3% (lhOO à 37°C) , les gammes de sérums ou de sécrétions nasales sont incubées 1 heure à
37°C. et rincées de nouveau avec une solution de PBS-tween, pH 7,6. Après rinçage (trois fois) les anticorps sont détectés par des anti IgG murines (réf. A4416 Sigma) ou , anti IgA murines (réf. A4789 Sigma), couplés à la peroxydase. Après une dernière étape de rinçage (cinq fois), le substrat OPD est ajouté (réf. P8287, Sigma 1 pastille dans 5 ml de tampon de révélation + 50μl d'H202, 100 μl/puits). Après 30 minutes d'incubation à 37°C, l'acide chlorydrique IN (réf. 30024-290, Prolabo) est ajouté (50μl/puits) et 1 ' absorbance est mesurée à 490 nm. Les titres sont définis comme 1 ' inverse de la dilution permettant d'obtenir une DO de 0,1. II - Influence du mode de préparation des formulations BVSM / Adjuvant /influenza .
Afin d'évaluer le meilleur mode de préparation des formulations BVSM / Adjuvant / Influenza, l'association de split Influenza sur les BVSM est étudiée en présence d'adjuvant (CTB ou MPL) en utilisant la résonnance plasmonique de surface (RPS) Biacore X (Pharmacia Biosensor Inc.) . Dans cette étude, 20μl d'une suspension de BVSM (50μg/ml en PBS 0,3 X) sont introduits sur des sensorchips hydrophobes (HPA, Biacore, BR-1000-30) à 5μl /min.
La figure 9 montre le sensorgramme obtenu par association de la CTB et des BVSM immobilisés sur la sensorchip HPA en fonction de la concentration en CTB ( 1) 2,5μg/ml ; 2) 25μg/ml ; 3) 250μg/ml en PBS 45mM ) (ce qui correspond à 0,3 X) .
La figure 10 montre le sensorgramme obtenu par association du MPL et des BVSM immobilisés sur la sensorchip
HPA en fonction de la concentration en MPL (1) l,56μg/ml ; 2) 3,125μg/ml ; 3) 6,25μg/ml ; 4) 12 , 5μg/ml ; 5) 25μg/ml ;
6) 50μg/ml en PBS 45mM) .
Dans les deux cas, CTB et MPL, les sensorgrammes obtenus confirment la capacité d'association des BVSM et des adjuvants . Le mode de préparation des formulations
BVSM/Adjuvant/split Influenza est alors étudié. Deux méthodes sont utilisées :
Dans la première, une solution d'adjuvant est introduite avant l'ajout du split Influenza.
Dans la seconde, le split Influenza est introduit avant l'ajout de l'adjuvant.
La figure 11 résume les résultats obtenus dans le cas d'un split B Harbin. Des quantités variables de CTB sont introduites sur les BVSM immobilisés ( 1) Pas de CTB, 2) 2,5Mg/ml, 3) 25μg/ml, 4) 250μg/ml en PBS 45mM ). Le split monovalent B Harbin à 25μg/ml est ensuite déposé sur le BVSM adjuvante. On note clairement une inhibition de l'association du split sur le BVSM lorsque la CTB est ajoutée avant le split.
De la même façon, la figure 12 résume les résultats obtenus dans le cas du MPL et d'un split B Harbin. Des quantités variables de MPL sont introduites sur les BVSM immobilisés ( 1) l,56μg/ml ; 2) 3,12μg/ml ; 3) 6,25μg/ml ; 4) 12,5μg/ml ; 5) 25μg/ml ; 6) 50μg/ml en PBS 45 mM ) . Le split à 25μg/ml est ensuite déposé sur les BVSM adjuvantes. Comme pour la CTB et proportionnellement à la quantité de MPL, il existe une inhibition de l'association du split sur les BVSM lorsque l'adjuvant est ajouté avant le split.
La figure 13 représente les sensorgrammes obtenus en comparant les deux modes de préparation dans le cas de la CTB. En A, la CTB est ajoutée sur les BVSM immobilisés, puis le split monovalent est introduit.
En B, le split monovalent est ajouté sur les BVSM immobilisés, on introduit ensuite la CTB.
On constate que lorsque l'antigène est ajouté avant la CTB, il existe une diminution de cette association du split sur les BVSM. A l'inverse, lorsque la CTB est ajoutée après le split, le BVSM permet l'association d'une quantité supplémentaire de matériel correspondant à la CTB. Ainsi pour préserver le rôle du BVSM comme " Antigen Carrier ", il est important de maintenir un mode de préparation dans lequel la CTB est ajoutée sur les formulations BVSM/split.
De la même façon, la figure 14 représente les sensorgrammes obtenus en comparant les deux modes de préparation dans le cas du MPL.
En A, le MPL est ajouté avant le split. En B, c'est l'inverse.
Lorsque l'antigène est ajouté avant le MPL, il n'existe pas de modification significative de l'association split/BVSM, mais le BVSM permet d'associer une quantité supplémentaire de matériel correspondant au MPL.
Il semble donc possible de définir un mode de préparation des formulations adjuvantées dans lequel : l'adjuvant est ajouté sur les formulations
BVSM/antigène le rôle du BVSM comme " Antigen Carrier " est préserve .
III - Effet de la CTB sur la réponse immunologique des formulations BVSM/Influenza.
1) Protocole. La formulation antigène + BVSM™ est préparée comme mentionné dans la partie " Matériel et méthodes " .
Un contrôle est réalisé dans les mêmes conditions mais en absence de BVSM™ aboutissant à un Split trivalent à 250μg d'HA(83μg/souche) /ml .
Une solution de CTB est ajoutée sur chacune de ces préparations afin d'obtenir les formulations et contrôles correspondants adjuvantes.
36 souris femelles BALB/cJ/Rj (âgées de 10 semaines au début de l'étude) sont divisées en 6 groupes à raison de 6 souris par groupe. Pour chaque groupe le traitement est réalisé comme décrit précédemment. Le tableau 1 ci-dessous résume le traitement de chaque groupe.
Tableau 1
Pour chaque groupe, on réalise les prélèvements sanguins et les prélèvements de sécrétions nasales et leurs analyses comme indiqué dans la partie " Matériel et méthodes " . 2) Résultats .
La figure 15 résume les résultats obtenus en titration spécifique du split B/Harbin des pools de sérums (IgG) et des sécrétions nasales (IgA) de souris. Elle permet de comparer les résultats des formulations trivalentes contenant la CTB (F-CTB)à différents témoins. Ces témoins sont soit des témoins antigènes seuls, soit des témoins antigènes associés à la CTB, soit la formulation de référence (ratio HA / BVSM : 1/89) . Ces résultats ont été confirmés par l'analyse de la réponse individuelle contre les split B/Harbin et A/Nanchang.
De façon attendue, la formulation de référence (FA) induit un taux d'anticorps de type G équivalent au témoin antigène seul administré par voie sous cutanée (AS) et un taux plus élevé d'IgG que le témoin seul administré par voie nasale (AN) (22, 4X) .
Les témoins antigènes associés à la CTB ( ACTB) administrés par voie nasale induisent des IgG nettement plus élevés que l'antigène libre administré par la même voie (augmentation de 22, 4X). Parallèlement ces formulations (Ag +CTB) (ACTB) induisent une forte immunité mucosale.
La formulation associée à l'adjuvant CTB (FCTB) induit une réponse IgG spécifique nettement supérieure à la formulation de référence (FA) et à son témoin de référence (ACTB) . Pour cet adjuvant, il existe une effet de synergie important entre la CTB et les BVSM™ ainsi, les taux d'IgG sérique obtenus sont multipliés par un facteur de 3,7 par rapport à la formulation de référence FA. A l'inverse, et en présence d'une activité adjuvante mucosale importante de la CTB, avec certainement un effet de saturation de la réponse biologique, il est difficile à ce stade de définir le potentiel de synergie de la réponse IgA pour ce type adjuvant et les BVSM™.
IV - Effet du MPL sur la réponse immunologique des formulations BVSM /Influenza.
1) Protocole. Une formulation trivalente et le contrôle correspondant sont préparés à 250 μg d'HA/ml (83,3 μg/souche)/ de split Influenza.
Une solution de MPL est ajoutée sur chacune de ces préparations afin d'obtenir les formulations et contrôles correspondants adjuvantes.
36 souris femelles BALB/cJ/Rj (âgées de 10 semaines au début de l'étude) sont divisés en 6 groupes à raison de 6 souris par groupe. Pour chaque groupe le traitement est réalisé comme décrit dans la partie " Matériel et méthodes " . Le tableau 2 ci -dessous résume le traitement de chaque groupe.
Pour chaque groupe, on réalise les prélèvements sanguins et les prélèvements de sécrétions nasales comme décrit dans la partie méthodes.
L'analyse des sérums et des sécrétions nasale est réalisée par test ELISA.
2) Résultats .
La figure 16 résume les résultats obtenus en titration spécifique du split B/Harbin des pools de sérums (IgG) et des sécrétions nasales (IgA) de souris administrés avec les formulations adjuvantées par le MPL. Ces résulats ont été confirmés par l'analyse de la réponse individuelle contre les split B/Harbin et A/Nanchang.
Les split influenza virus associés au BVSM ou au MPL administrés par voie nasale induisent une réponse IgG sérique nettement plus élevés que l'antigène libre administré par la même voie (augmentation respective de 22, 4X et 7,3X) . Parallèlement ces formulations induisent une forte immunité mucosale.
La formulation associée à l'adjuvant MPL induit une réponse IgG spécifique similaire à la formulation de référence. A l'inverse, pour cet adjuvant il existe un effet
TM de synergie important entre le MPL et les BVSM . Ainsi les taux d'IgA obtenus sont multipliés par un facteur de 2.7 par rapport à la formulation de réf. (Ag/BVSM) (FA). Ainsi, à l'inverse de la réponse IgG, un fort potentiel de synergie entre la MPL et les BVSM peut être démontré pour la réponse mucosale .
V - Effet des Oligonucléotides sur la réponse immunologique des formulations BVSM/Influenza.
1) Protocole .
Une formulation trivalente et le contrôle correspondant sont préparés à 250 μg d'HA/ml (83,3 μg/souche) / de split Influenza
Une solution d' oligonucléotide (ODN) est ajoutée sur chacune de ces préparations afin d'obtenir les formulations et contrôles correspondants adjuvantes.
42 souris femelles BALB/cJ/Rj (âgées de 10 semaines au début de l'étude) sont divisés en 7 groupes à raison de 6 souris par groupe. Pour chaque groupe le traitement est réalisé comme décrit dans la partie " Matériel et méthodes " . Le tableau 3 résume le traitement de chaque groupe .
Pour chaque groupe, on réalise les prélèvements sanguins et les prélèvements de sécrétions nasales comme indiqué dans la partie méthode.
L'analyse des sérums et des sécrétions nasales est réalisée par test ELISA comme décrit précédemment.
2) Résultats.
La figure 17 résume les résultats obtenus en titration spécifique du split B/Harbin des pools de sérums (IgG) et des sécrétions nasales (IgA) de souris administrées avec les formulations adjuvantées par les oligonucléotides. Ces résulats ont été confirmés par l'analyse de la réponse individuelle contre les split B/Harbin et A/Nanchang. Les split influenza virus associé au BVSM ou aux ODN administrés par voie nasale induisent une réponse IgG sérique nettement plus élevée que l'antigène libre administré par la même voie (augmentation respective de 22, 4X et 7,3X). Parallèlement ces formulations induisent une forte immunité mucosale.
La formulation associée à l'adjuvant ODN induit une réponse IgG supérieure à la formulation de référence et à son témoin de référence (Ag + ODN) . Pour cet adjuvant, il semble exister une additivité des réponses, les titres IgG obtenus pour la formulation étant égaux à la somme des réponses obtenues pour l'antigène + ODN1(AODN1) et pour la
TM formulation de référence (Ag + BVSM ) (FA) .
VI - Modification de la balance IgG2a/lgGl par adjuvantation des formulations BVSM/Influenza.
1) Protocole .
Une formulation trivalente et le contrôle correspondant sont préparés à 250 μg d'HA/ml (83,3 μg/souche)/ de split Influenza. A partir de la formulation trivalente, trois formulations adjuvantées sont obtenues:
BVSM™ /Ag/CTB: Par ajout sur la formulation trivalente d'une solution de CTB. -TM
BVSM /Ag/IL2: Par ajout sur la formulation trivalente d'une solution d'IL-2 recombinante
TM
BVSM /Ag/MPL: Par ajout sur la formulation trivalente d'une solution de MPL
54 souris femelles BALB/cJ/Rj (âgées de 10 semaines au début de l'étude) sont divisés en 9 groupes à raison de 6 souris par groupe. Pour chaque groupe le traitement et les prélèvements sont réalisés comme décrit dans la partie " Matériel et méthodes " .
Le tableau 4 ci -dessous récapitule ces traitements .
Tableau 4
L'analyse des sérums est réalisée par test ELISA tel que décrit précédemment, en utilisant soit un anti IgG2a murine, soit un anti IgGl murine.
2) Résultats.
Le tableau 5 ci -dessous résume les résultats obtenus en terme de sous -type de gamma globuline (IgG2a et IgGl) des différentes formulations BVSM /influenza adjuvantées et des contrôles correspondants après administration nasale. Par rapport à l'antigène libre administré par voie sous-cutanée, la formulation
,TM
BVSM /influenza administrée par voie nasale induit une modeste augmentation de production IgG2a spécifique. Par comparaison l ' adj onction de la CTB à la formulation Ag/BVSM TM induit une nette augmentation de la production Ig2a (multiplication par 5.4 de l'index Ig2a/Igl versus Ag S.c). Il est important de noter que cette modification de la balance Thl/Th2 n'est pas prévisible à partir des résultats obtenus par l'association de la CTB aux antigènes. En effet, dans ce groupe contrôle, il existe un abaissement de l'index Ig2a/lgGl.
Tableau 5
A l'inverse, le MPL qui lorsqu'il est associé au split influenza favorise la production IgG2a (index 47.6 versus 6.7 pour les Ag s.c) n'entraîne qu'une modification mineure de la balance Thl/Th.2 après association avec les formulation Ag/BVSM™.
Finalement, l'association IL2 aux formulations Ag/BVSM™ permettent de modifier la balance Thl/Th2 comme nous pouvons le visualiser sur l'abaissement de l'index IgG2a/Igl.
Ainsi, même en absence de modification quantitative de la réponse immunologique l'association d'adjuvant aux formulations Antigène/BVSM permet d'induire une modification qualitative de la réponse immunologique. Cette association devrait permettre par un choix correct de l'adjuvant utilisé d'adapter la balance Thl/Th2 à la stratégie vaccinale proposée.

Claims

REVENDICATIONS
1) Utilisation d'un vecteur du type comportant un noyau hydrophile non liquide pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des cancers et/ou des maladies virales, ledit vecteur étant associé dans le médicament avec au moins une substance, autre qu'un antigène, capable de moduler la réponse immunitaire.
2) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le vecteur est du type comportant un noyau hydrophile non liquide et une couche externe constituée au moins en partie de composés amphiphiles, associée au noyau par des interactions hydrophobes et/ou des liaisons ioniques.
3) Utilisation selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que le noyau hydrophile non liquide est constitué d'une matrice de polysaccharides ou d' oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés, sur lequel sont greffés des ligands ioniques.
4) Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que les ligands ioniques sont à charge positive .
5) Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que les ligands ioniques à charge positive sont des ammoniums quaternaires.
6) Utilisation d'un vecteur selon l'une des revendications 2 à 5, caractérisée en ce que la couche externe est formée de dipalmitoyl phosphatidyl choline (DDPC) et de cholestérol.
7) Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que le rapport massique DPPC/cholestérol est de 70/30. 8) Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le rapport pondéral substance/vecteur est compris entre environ 1% et 20%, de préférence entre environ 5% et 10%.
9) Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la substance, autre qu'un antigène, capable de moduler la réponse immunitaire est une protéine d'intérêt thérapeutique qui joue un rôle dans le fonctionnement du système immunitaire, un adjuvant, ou une substance capable de modifier la balance Thl/Th2, ou un mélange de ceux-ci.
10) Utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce que la protéine d' intérêt thérapeutique est une cytokine ou une chémokine, de préférence choisie dans le groupe comprenant les interleukines, les interférons, les TNF, les TGF, le G-CSF, le GM-CSF, le MIF, le RANTES, ou un mélange de ceux-ci.
11) Utilisation selon la revendication 10, caractérisée en ce que la protéine d' intérêt thérapeutique est 1 ' interleukine 2.
12) Utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce que l'adjuvant est choisi dans le groupe comprenant les enterotoxines bactériennes, les dérivés de liposaccharides, les oligonucléotides, les dérivés de la saponine, les sels d'ammonium et leurs dérivés, les protéines de type DT ou TT, ou un mélange de ceux-ci.
13) Utilisation d'un vecteur selon l'une des quelconques des revendications précédentes, caractérisée en ce que le cancer à traiter est de type non immunogénique ou faiblement immunogénique .
14) Utilisation d'un vecteur selon l'une des quelconques des revendications précédentes, caractérisée en ce que le médicament est destiné à l'administration par voie nasale ou orale.
15) Utilisation d'un vecteur comportant : (a) un noyau hydrophile non liquide constitué d'une matrice polysaccharidique ou d' oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés, sur lequel sont greffés des ligands ioniques de charge positive ou négative, et (b) une couche externe constituée au moins en partie de composés amphiphiles associée au noyau par des interactions hydrophobes et/ou des liaisons ioniques, et (c) incorporant l'IL-2 pour la préparation d'un médicament destiné à l'administration sous forme injectable d'IL-2 en l'absence d' albumine.
16) Procédé pour améliorer les propriétés immunomodulatrices d'une substance, autre qu'un antigène, capable de moduler la réponse immunitaire, caractérisé en ce qu'il comprend le mélange de ladite substance avec des vecteurs du type comportant un noyau hydrophile non liquide.
17) Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que les vecteurs sont du type comportant un noyau hydrophile non liquide et une couche externe constituée au moins en partie de composés amphiphiles, associée au noyau par des interactions hydrophobes et/ou des liaisons ioniques.
18) Procédé selon l'une des revendications 16 ou 17, caractérisé en ce que le noyau hydrophile non liquide est constitué d'une matrice de polysaccharides ou d' oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés, sur lequel sont greffés des ligands ioniques.
19) Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que les ligands ioniques sont à charge positive . 20) Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que les ligands ioniques à charge positive sont des ammoniums quaternaires.
21) Procédé selon l'une quelconque des revendications 17 à 20, caractérisée en ce que la couche externe est formée de dipalmitoyl phosphatidyl choline (DDPC) et de cholestérol.
22) Procédé selon la revendication 21, caractérisée en ce que le rapport massique DPPC/cholestérol est de 70/30.
23) Procédé selon la revendication l'une quelconque des revendications 16 à 22, caractérisé en ce que le rapport pondéral substance/vecteur est compris entre environ 1% et 20%, de préférence entre environ 5% et 10%.
24) Procédé selon l'une quelconque des revendications 16 à 23, caractérisé en ce que la substance, autre qu'un antigène, capable de moduler la réponse immunitaire est une protéine d'intérêt thérapeutique qui joue un rôle dans le fonctionnement du système immunitaire.
25) Procédé selon la revendication 24, caractérisé en ce que la protéine d' intérêt thérapeutique est une cytokine ou une chémokine, de préférence choisie dans le groupe comprenant les interleukines, les interférons, les TNF, les TGF, le G-CSF, le GM-CSF, le MIF, le RANTES, ou un mélange de ceux-ci.
26) Procédé selon l'une quelconque des revendications 16 à 23, caractérisé en ce que la substance, autre qu'un antigène, capable de moduler la réponse immunitaire est un adjuvant.
27) Procédé selon la revendication 26, caractérisé en ce que l'adjuvant est choisi dans le groupe comprenant les enterotoxines bactériennes, les dérivés de liposaccharides, les oligonucléotides, des saponines, les sels d'ammonium et leurs dérivés, les protéines de type DT ou TT ou un mélange de ceux-ci.
28) Procédé selon l'une quelconque des revendications 16 à 23, caractérisé en ce que la substance, autre qu'un antigène, capable de moduler la réponse immunitaire est une substance capable de modifier la balance Thl/Th2.
29) Procédé selon l'une quelconque des revendications 16 à 23, caractérisé en ce que la substance, autre qu'un antigène, capable de moduler la réponse immunitaire est un immunosupresseur .
30) Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend : un vecteur du type comportant un noyau hydrophile non liquide constitué d'une matrice de polysaccharides ou d' oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés, sur lequel sont greffés des ligands ioniques, et éventuellement une couche externe constituée au moins en partie de composés amphiphiles, associée au noyau par des interactions hydrophobes et/ou des liaisons ioniques, et
- au moins une protéine d'intérêt thérapeutique, et/ou un adjuvant et/ou une substance capable de modifier la balance Thl/Th2.
31) Composition pharmaceutique selon la revendication 30, caractérisée en ce que la couche externe est formée de dipalmitoyl phosphatidyl choline (DDPC) et de cholestérol .
32) Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 30 ou 31, caractérisée en ce que le rapport pondéral substance/vecteur est compris entre environ 1% et 20%, de préférence entre environ 5% et 10%. 33) Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 30 à 32, caractérisée en ce que la protéine d'intérêt thérapeutique est une cytokine ou une chémokine, de préférence choisie dans le groupe comprenant les interleukines, les interférons, les TNF, les TGF, le G-CSF, le GM-CSF, le MIF, le RANTES, ou un mélange de ceux-ci.
34) Composition pharmaceutique selon la revendication 33, caractérisée en ce que la protéine d'intérêt thérapeutique est 1 ' interleukine 2.
35) Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 30 à 32, caractérisée en ce que l'adjuvant est choisi dans le groupe comprenant les enterotoxines bactériennes, les dérivés de liposaccharides, les oligonucléotides, les dérivés de la saponine, les sels d'ammonium et leurs dérivés, les protéines de type DT ou TT, ou un mélange de ceux-ci.
36) Utilisation d'un vecteur du type comportant un noyau hydrophile non liquide pour la préparation d'une composition vaccinale, ledit vecteur étant mélangé dans la composition avec au moins un antigène et au moins une substance capable de moduler la réponse immunologique audit antigène.
37) Utilisation selon la revendication 36, caractérisée en ce que le vecteur est du type comportant un noyau hydrophile non liquide et une couche externe constituée au moins en partie de composés amphiphiles, associée au noyau par des interactions hydrophobes et/ou des liaisons ioniques.
38) Utilisation selon l'une des revendications
36 ou 37, caractérisée en ce que le noyau hydrophile non liquide est constitué d'une matrice de polysaccharides ou d' oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés, sur lequel sont greffés des ligands ioniques. 39) Utilisation selon la revendication 38, caractérisée en ce que les ligands ioniques sont à charge positive .
40) Utilisation selon la revendication 39, caractérisée en ce que les ligands ioniques à charge positive sont des ammoniums quaternaires.
41) Utilisation selon l'une des revendications
37 à 40, caractérisée en ce que la couche externe est formée de dipalmitoyl phosphatidyl choline (DDPC) et de cholestérol .
42) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 36 à 41, caractérisée en ce que le rapport pondéral substance/vecteur est compris entre environ 1% et 20%, de préférence entre environ 5% et 10%.
43) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 36 à 42, caractérisée en ce que substance capable de moduler la réponse immunologique de l'antigène est un adjuvant et/ou une protéine d'intérêt thérapeutique et/ou une substance capable de modifier la balance Thl/Th2.
44) Utilisation selon la revendication 43, caractérisée en ce l'adjuvant est choisi parmi les enterotoxines bactériennes, les dérivés de la saponine, les sels d'ammonium et leurs dérivés, les protéines de type DT ou TT, les cytokines, les oligonucléotides, ou un mélange de ceux-ci .
45) Utilisation selon la revendication 43, caractérisée en ce que la protéine d' intérêt thérapeutique est une cytokine ou une chémokine, de préférence choisie dans le groupe comprenant les interleukines, les interférons, les TNF, les TGF, le G-CSF, le GM-CSF, le MIF, le RANTES, ou un mélange de ceux-ci. 46) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 36 à 45, pour la préparation d'une composition vaccinale destinée au traitement et/ou à la prévention des maladies virales, notamment le sida et l'hépatite chronique, ou des cancers.
47) Composition vaccinale, caractérisée en ce qu'elle comprend :
- un antigène ou un mélange d'antigènes, - un vecteur du type comportant un noyau hydrophile non liquide constitué d'une matrice de polysaccharides ou d' oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés, sur lequel sont greffés des ligands ioniques, et éventuellement une couche externe constituée au moins en partie de composés amphiphiles, associée au noyau par des interactions hydrophobes et/ou des liaisons ioniques, et
- au moins une substance capable de moduler la réponse immunologique audit antigène.
48) Composition pharmaceutique selon la revendication 47, caractérisée en ce que la couche externe est formée de dipalmitoyl phosphatidyl choline (DDPC) et de cholestérol .
49) Composition vaccinale selon l'une des revendications 47 ou 48, caractérisée en ce que substance capable de moduler la réponse immunologique de l'antigène est un adjuvant et/ou une protéine d'intérêt thérapeutique et/ou une substance capable de modifier la balance Thl/Th2.
50) Composition vaccinale selon la revendication 49, caractérisée en ce que l'adjuvant est choisi parmi les enterotoxines bactériennes, les dérivés de la saponine, les sels d'ammonium et leurs dérivés, les protéines de type DT ou TT, les cytokines, les oligonucléotides, ou un mélange de ceux-ci . 51) Composition vaccinale selon la revendication 49, caractérisée en ce que la protéine d'intérêt thérapeutique est une cytokine ou une chémokine, de préférence choisie dans le groupe comprenant les interleukines, les interférons, les TNF, les TGF, le G-CSF, le GM-CSF, le MIF, le RANTES, ou un mélange de ceux-ci.
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