CA2460779A1 - Utilisation d'une fraction membranaire de bacteries a gram negatif pour induire la maturation des cellules dendritiques - Google Patents
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Abstract
La présente invention se rapporte à l'utilisation d'une fraction membranaire de bactéries à gram négatif, notamment de Klebsiella pneumoniae, pour induir e la maturation des cellules dendritiques.
Description
i UTILISATION D'UNE FRACTION MEMBRANAIRE DE BACTERIES A GRAM
NEGATIF POUR INDUIRE LA MATURATION DES CELLULES
DENDRITIQUES
La présente invention concerne (utilisation d'une fraction membranaire de bactéries à gram négatif, notamment de Klebsiella pneumoniae pour induire la maturation des cellules dendritiques et ainsi favoriser le développement d'une réponse immune spécifique.
Les cellules dendritiques jouent un rôle dans le développement d'une réponse 1o immune et dans (initiation d'une réponse lymphocytaire T spécifique (Steinman RM et al Immuno Rev (1997) 156, 25 & Cella M et al Curr Opin Immunol (1997) 9, 10). Les cellules dendritiques immatures sont localisées dans les tissus non lymphoïdes. Au niveau de la peau, dans tous les épidermes hormis (intestin, elles sont alors appelées cellules de Langerhans ; des cellules dendritiques, en plus faible quantité, sont aussi localisées dans les 1s organes tels que le poumon, le foie et (intestin. Ces cellules dendritiques immatures captent et digèrent les antigènes de façon très efficace. Après une stimulation antigénique in vivo ou stimulation par des molécules proinflammatoires, les cellules dendritiques qui ont capté les antigènes migrent dans les organes lymphoïdes secondaires.
Durant cette migration, les cellules dendritiques subissent des modifications fonctionnelles et 2o phénotypiques qui sont regroupées sous le terme de maturation. Cette maturation se caractérise par une augmentation à la surface des cellules dendritiques de molécules impliquëes dans l'activation des lymphocytes T (telles que CD40, CD54, CD58, CD86 et MHC classe I/II), la production de cytokines proinflammatoires (IL-6) et de chemokines (telles que TNFa, IL-8, MCP-1 et MIP-la) et perdent leur capacité à processer l'antigène.
25 Les chemokines recrutent des cellules inflammatoires et favorisent l'initiation d'une réponse immune. En particulier, l'IL-8, le MCP-1 et le MIP-la attirent non seulement des cellules:inflammatoires mais également des lymphocytes T naïfs et mémoires.
Ainsi, les cellules dendritiques en sécrétant des chemokines augmentent leurs chances d'entrer en contact avec les lymphocytes T. Les cytokines proinflammatoires vont également agir en 3o activant directement les CD.
NEGATIF POUR INDUIRE LA MATURATION DES CELLULES
DENDRITIQUES
La présente invention concerne (utilisation d'une fraction membranaire de bactéries à gram négatif, notamment de Klebsiella pneumoniae pour induire la maturation des cellules dendritiques et ainsi favoriser le développement d'une réponse immune spécifique.
Les cellules dendritiques jouent un rôle dans le développement d'une réponse 1o immune et dans (initiation d'une réponse lymphocytaire T spécifique (Steinman RM et al Immuno Rev (1997) 156, 25 & Cella M et al Curr Opin Immunol (1997) 9, 10). Les cellules dendritiques immatures sont localisées dans les tissus non lymphoïdes. Au niveau de la peau, dans tous les épidermes hormis (intestin, elles sont alors appelées cellules de Langerhans ; des cellules dendritiques, en plus faible quantité, sont aussi localisées dans les 1s organes tels que le poumon, le foie et (intestin. Ces cellules dendritiques immatures captent et digèrent les antigènes de façon très efficace. Après une stimulation antigénique in vivo ou stimulation par des molécules proinflammatoires, les cellules dendritiques qui ont capté les antigènes migrent dans les organes lymphoïdes secondaires.
Durant cette migration, les cellules dendritiques subissent des modifications fonctionnelles et 2o phénotypiques qui sont regroupées sous le terme de maturation. Cette maturation se caractérise par une augmentation à la surface des cellules dendritiques de molécules impliquëes dans l'activation des lymphocytes T (telles que CD40, CD54, CD58, CD86 et MHC classe I/II), la production de cytokines proinflammatoires (IL-6) et de chemokines (telles que TNFa, IL-8, MCP-1 et MIP-la) et perdent leur capacité à processer l'antigène.
25 Les chemokines recrutent des cellules inflammatoires et favorisent l'initiation d'une réponse immune. En particulier, l'IL-8, le MCP-1 et le MIP-la attirent non seulement des cellules:inflammatoires mais également des lymphocytes T naïfs et mémoires.
Ainsi, les cellules dendritiques en sécrétant des chemokines augmentent leurs chances d'entrer en contact avec les lymphocytes T. Les cytokines proinflammatoires vont également agir en 3o activant directement les CD.
2 Ces cellules dendritiques matures présentent les antigènes aux lymphocytes T
et initient les réponses T spécifiques de façon très efficace, les molécules de costimulation étant exprimées en quantité importante sur ces cellules. Les cellules en devenant matures perdent leur capacité à capter et processer (antigène. Dans les zones thymo-dépendantes des organes lymphoïdes, les cellules dendritiques qui ont migré ont acquis de puissantes propriétées -immunostimulatrices et vont donc activer de façon très e~cace les lymphocytes T naïfs circulants.
La fraction membranaire de K. pneumoniae I145 entre dans la composition d'une préparation pharmaceutique prévenant la survenue et la récidive d' infections respiratoires 1o d'origine bactérienne et utilisée chez l'homme depuis 20 ans. A ce titre, il existe un recul de non toxicité du produit.
Dans la demande FR9903154 il a été montré que la FMKp ou l'un de ses constituants majeurs, la protéine de membrane externe OmpA, dénommée P40 était capable d'induire la production notamment par les monocytes de TNF-a et d'IL-12, cytokines impliquées dans la réponse immunitaire asti-tumorale.
Dans la demande FR9903153, il a été montré que la ladite fraction membranaire FMKp associée à un antigène avait non seulement la capacité de réorienter la réponse cytokinique vers un profil Thl/Th2 et ce quel que soit le mode d'administration desdites fractions membranaires.
2o Les auteurs de la présente invention ont maintenant mis en évidence qu'une fraction membranaire de bactéries à grain négatif, préférentiellement de Klebsiella pneumoniae induit la maturation des cellules dendritiques humaines permettant ainsi le développement d'une réponse lymphocytaire T spécifique.
La présente invention concerne ainsi (utilisation d'au moins une fraction membranaire de bactéries à grain négatif, préférentiellement de Klebsiella pneumoniae pour induire la maturation des cellules dendritiques.
La présente invention concerne aussi (utilisation d'au moins une fraction membranaire de bactéries à grain négatif, notamment de Klebsiella pneumoniae pour la fabrication d'un médicament destiné à induire la maturation des cellules dendritiques.
et initient les réponses T spécifiques de façon très efficace, les molécules de costimulation étant exprimées en quantité importante sur ces cellules. Les cellules en devenant matures perdent leur capacité à capter et processer (antigène. Dans les zones thymo-dépendantes des organes lymphoïdes, les cellules dendritiques qui ont migré ont acquis de puissantes propriétées -immunostimulatrices et vont donc activer de façon très e~cace les lymphocytes T naïfs circulants.
La fraction membranaire de K. pneumoniae I145 entre dans la composition d'une préparation pharmaceutique prévenant la survenue et la récidive d' infections respiratoires 1o d'origine bactérienne et utilisée chez l'homme depuis 20 ans. A ce titre, il existe un recul de non toxicité du produit.
Dans la demande FR9903154 il a été montré que la FMKp ou l'un de ses constituants majeurs, la protéine de membrane externe OmpA, dénommée P40 était capable d'induire la production notamment par les monocytes de TNF-a et d'IL-12, cytokines impliquées dans la réponse immunitaire asti-tumorale.
Dans la demande FR9903153, il a été montré que la ladite fraction membranaire FMKp associée à un antigène avait non seulement la capacité de réorienter la réponse cytokinique vers un profil Thl/Th2 et ce quel que soit le mode d'administration desdites fractions membranaires.
2o Les auteurs de la présente invention ont maintenant mis en évidence qu'une fraction membranaire de bactéries à grain négatif, préférentiellement de Klebsiella pneumoniae induit la maturation des cellules dendritiques humaines permettant ainsi le développement d'une réponse lymphocytaire T spécifique.
La présente invention concerne ainsi (utilisation d'au moins une fraction membranaire de bactéries à grain négatif, préférentiellement de Klebsiella pneumoniae pour induire la maturation des cellules dendritiques.
La présente invention concerne aussi (utilisation d'au moins une fraction membranaire de bactéries à grain négatif, notamment de Klebsiella pneumoniae pour la fabrication d'un médicament destiné à induire la maturation des cellules dendritiques.
3 Par fraction membranaire de bactérie, on entend désigner dans la présente invention toute fraction ou extrait membranaire purifié ou partiellement purifié obtenu à
partir d'une culture de ladite bactérie et dont le procédé de préparation comprend au moins une étape de lyse des bactéries obtenues après culture et une étape de séparation de la fraction contenant les membranes desdites bactéries du lysat total obtenu après l'étape de lyse, notamment par centrifugation ou filtration. Ainsi, au sens de la présente invention, une fraction membranaire comprend au moins des protéoglycanes membranaires. Ainsi, au sens de la présente invention, une fraction membranaire peut aussi être définie comme un une fraction comprenant au moins des protéines 1o membranaires associées aux LPS (lipopolysaccharides), connus de l'homme du métier.
Le titre en protéoglycane des fractions membranaires selon l' invention est représenté par la somme des teneurs en galactose et en protéines, est de préférence compris - pour le galactose : entre 1,2 g/1 et 3,4 g/1 ;
- pour les protéines : entre 7,5 g/1 et 14,9 g/1.
De manière plus préférée, ce titre sera - pour le galactose : entre 1,8 g/1 et 2,6 g/1 ;
- pour les protéines : entre 9,3 g/1 et 11,7 g/1.
Les fractions membranaires selon l'invention sont susceptibles d'être obtenues 2o par les procédés décrits ci après ou par tout autre procédé équivalent, notamment ceux décrits dans les demandes de brevet FR9903154 et FR9903153.
Ces fractions membranaires pourront être utilisées à des concentrations de 0,1 à
100, préférentiellement de 1 à 50, et plus préférentiellement de 1 à 20 microgrammes par millilitre de milieu de culture.
2s Dans un mode de réalisation préféré de l' invention, les bactéries à gram négatif sont choisies parmi les bactéries de genre Klebsiella et préférentiellement d'espèce pneumoniae.
Dans un mode de réalisation préféré de (invention, les fractions membranaires selon l'invention peuvent servir à favoriser la maturation des cellules dendritiques in vitro, 30 les cellules matures pouvant ensuite être réinjectées in vivo.
partir d'une culture de ladite bactérie et dont le procédé de préparation comprend au moins une étape de lyse des bactéries obtenues après culture et une étape de séparation de la fraction contenant les membranes desdites bactéries du lysat total obtenu après l'étape de lyse, notamment par centrifugation ou filtration. Ainsi, au sens de la présente invention, une fraction membranaire comprend au moins des protéoglycanes membranaires. Ainsi, au sens de la présente invention, une fraction membranaire peut aussi être définie comme un une fraction comprenant au moins des protéines 1o membranaires associées aux LPS (lipopolysaccharides), connus de l'homme du métier.
Le titre en protéoglycane des fractions membranaires selon l' invention est représenté par la somme des teneurs en galactose et en protéines, est de préférence compris - pour le galactose : entre 1,2 g/1 et 3,4 g/1 ;
- pour les protéines : entre 7,5 g/1 et 14,9 g/1.
De manière plus préférée, ce titre sera - pour le galactose : entre 1,8 g/1 et 2,6 g/1 ;
- pour les protéines : entre 9,3 g/1 et 11,7 g/1.
Les fractions membranaires selon l'invention sont susceptibles d'être obtenues 2o par les procédés décrits ci après ou par tout autre procédé équivalent, notamment ceux décrits dans les demandes de brevet FR9903154 et FR9903153.
Ces fractions membranaires pourront être utilisées à des concentrations de 0,1 à
100, préférentiellement de 1 à 50, et plus préférentiellement de 1 à 20 microgrammes par millilitre de milieu de culture.
2s Dans un mode de réalisation préféré de l' invention, les bactéries à gram négatif sont choisies parmi les bactéries de genre Klebsiella et préférentiellement d'espèce pneumoniae.
Dans un mode de réalisation préféré de (invention, les fractions membranaires selon l'invention peuvent servir à favoriser la maturation des cellules dendritiques in vitro, 30 les cellules matures pouvant ensuite être réinjectées in vivo.
4 Dans un mode de réalisation encore plus préféré de (invention ce médicament peut servir à favoriser la génération et la maturation des cellules dendritiques in vitro, après mise en contact avec un agent biologique. Ainsi, (invention concerne (utilisation d'une fraction membranaire selon l' invention et en outre d'au moins un agent biologique pour la fabrication d'un médicament. Ce dernier pourra par exemple augmenter la réponse immunologique vis-à-vis de cet agent biologique.
Cet agent biologique peut être choisi parmi les acides nucléiques, les protéines, les lipides, les lipopeptides ou les polysaccharides.
Il peut être plus particulièrement choisi parmi les antigènes vaccinants et/ou les 1o antigènes de bactéries, de virus, de levures, de parasites, de champignons.
Plus préférentiellement, (agent biologique est un antigène tumoral. Au sens de la présente invention, un antigène tumorâl est défini comme une protéine ou un peptide tumoral, et notamment comme un épitope, notamment un épitope CTL (séquences peptidiques interagissant avec les molécules de classe I et présentés aux lymphocytes T
CD8 +) ou comme la séquence nucléique codant pour de tels protéines, peptides ou épitopes. On peut citer à titre non limitatif les antigènes tumoraux suivants : MAGE-2, MAGE-3, MUC-1, MUC-2, HER-2, GD2, carcinoembryonic antigen (CEA), TAG-72, ovarian-associated antigens OV-TL3 et MOV 18, TUAN, alpha-feto protein (AFP), OFP, CA-125, CA-50, CA-19-9, renal tumor-associated antigen 6250, EGP-40 (ou EpCAM), 2o S 100 (malignant melanoma-associated antigen), p53, prostate tumor-associated antigens (e.g., PSA and PSMA), et p2lras.
L'agent biologique peut encore être choisi parmi un lysat de cellules tumorales autologues et/ou hétérologues. Au sens de la présente invention on entend par cellules tumorales autologues, des cellules de tumeurs appartenant au sujet qui va recevoir les compositions selon l'invention. Par cellules tumorales hétérologues, il faut comprendre des cellules issues de tumeurs provenant d'un individu différent de celui à
qui la composition selon l'invention est destinée. L'utilisation de cellules hétérologues permet d' obtenir des compositions pharmaceutiques permettant notamment de traiter des patients atteints de cancer chez qui un prélèvement de cellules tumorales n'est pas possible.
3o L'utilisation de cellules hétérologues permet aussi d'obtenir des compositions selon l'invention standardisées comprenant des antigènes retrouvés dans de nombreux types de cancer et ainsi utilisables chez une majorité de patients.
Les cellules tumorales peuvent être obtenues suite à un prélèvement de tissus cancéreux, par exemple suite à une biopsie ou résection chirurgicale. Ces cellules
Cet agent biologique peut être choisi parmi les acides nucléiques, les protéines, les lipides, les lipopeptides ou les polysaccharides.
Il peut être plus particulièrement choisi parmi les antigènes vaccinants et/ou les 1o antigènes de bactéries, de virus, de levures, de parasites, de champignons.
Plus préférentiellement, (agent biologique est un antigène tumoral. Au sens de la présente invention, un antigène tumorâl est défini comme une protéine ou un peptide tumoral, et notamment comme un épitope, notamment un épitope CTL (séquences peptidiques interagissant avec les molécules de classe I et présentés aux lymphocytes T
CD8 +) ou comme la séquence nucléique codant pour de tels protéines, peptides ou épitopes. On peut citer à titre non limitatif les antigènes tumoraux suivants : MAGE-2, MAGE-3, MUC-1, MUC-2, HER-2, GD2, carcinoembryonic antigen (CEA), TAG-72, ovarian-associated antigens OV-TL3 et MOV 18, TUAN, alpha-feto protein (AFP), OFP, CA-125, CA-50, CA-19-9, renal tumor-associated antigen 6250, EGP-40 (ou EpCAM), 2o S 100 (malignant melanoma-associated antigen), p53, prostate tumor-associated antigens (e.g., PSA and PSMA), et p2lras.
L'agent biologique peut encore être choisi parmi un lysat de cellules tumorales autologues et/ou hétérologues. Au sens de la présente invention on entend par cellules tumorales autologues, des cellules de tumeurs appartenant au sujet qui va recevoir les compositions selon l'invention. Par cellules tumorales hétérologues, il faut comprendre des cellules issues de tumeurs provenant d'un individu différent de celui à
qui la composition selon l'invention est destinée. L'utilisation de cellules hétérologues permet d' obtenir des compositions pharmaceutiques permettant notamment de traiter des patients atteints de cancer chez qui un prélèvement de cellules tumorales n'est pas possible.
3o L'utilisation de cellules hétérologues permet aussi d'obtenir des compositions selon l'invention standardisées comprenant des antigènes retrouvés dans de nombreux types de cancer et ainsi utilisables chez une majorité de patients.
Les cellules tumorales peuvent être obtenues suite à un prélèvement de tissus cancéreux, par exemple suite à une biopsie ou résection chirurgicale. Ces cellules
5 peuvent ensuite être utilisées telles qu'elles ou être mises en culture avant d'être lycées.
Un lysat cellulaire peut être défini au sens de la présente invention comme un mélange d'antigènes infra-cellulaires et/ou membranaires, préférentiellement infra et membranaires. Ledit lysat de cellules tumorales autologues et/ou hétérologues selon l'invention peut-être obtenu par une lyse mécanique, chimique ou enzymatique de 1o cellules tumorales. Pour lyser les cellules de façon mécanique on peut notamment citer les techniques connues de l'homme de métier, à savoir notamment la sonication, l'ultrasonication ou la congélation/décongélation. On préfère tout particulièrement la congélation/décongélation, et tout particulièrement l'utilisation de plusieurs cycles de congélation/décongélation. On peut aussi lyser les cellules en utilisant des composés chimiques ou des enzymes, comme par exemple un tampon de lyse à digitonine, du triton X-100 ou du Nonidet P40. Toute méthode permettant de rompre la membrane cellulaire des cellules de tumeurs pourra être utilisée afin d'obtenir un lysat.
Les cellules dendritiques sont ainsi modifiëes en utilisant ces antigènes ou lysats cellulaires de sorte qu'elles expriment des antigènes tumoraux. Ainsi, ledit médicament 2o pourra être injecté en même temps que les cellules dendritiques ou de façon préférée ledit médicament pourra. être mis en oeuvre in vitro, afin de favoriser la maturation des cellules dendritiques avant de les réinjecter aux patients.
L'administration d'une fraction membranaire de bactéries à grain négâtif en même temps que (antigène permettra d'augmenter la présentation de (antigène par les cellules dendritiques et par là même (efficacité du traitement thérapeutique.
Ainsi, grâce à leur efficacité à présenter les antigènes et à stimuler le système immunitaire, les cellules dendritiques en présence d'une fraction membranaire de bactéries à grain négatif pourront être utilisées pour générer des réponses CTL
anticancéreuses (Nestle F.O. et al., 1998, Nat. Med., 4, 328-332). Cette approche, dénommée "ex vivo"
3o consiste donc à charger les cellules dendritiques ex vivo avec l'antigène d'intérêt (peptides ou lysat cellulaire) en présence d'une fraction membranaire de bactéries à grain
Un lysat cellulaire peut être défini au sens de la présente invention comme un mélange d'antigènes infra-cellulaires et/ou membranaires, préférentiellement infra et membranaires. Ledit lysat de cellules tumorales autologues et/ou hétérologues selon l'invention peut-être obtenu par une lyse mécanique, chimique ou enzymatique de 1o cellules tumorales. Pour lyser les cellules de façon mécanique on peut notamment citer les techniques connues de l'homme de métier, à savoir notamment la sonication, l'ultrasonication ou la congélation/décongélation. On préfère tout particulièrement la congélation/décongélation, et tout particulièrement l'utilisation de plusieurs cycles de congélation/décongélation. On peut aussi lyser les cellules en utilisant des composés chimiques ou des enzymes, comme par exemple un tampon de lyse à digitonine, du triton X-100 ou du Nonidet P40. Toute méthode permettant de rompre la membrane cellulaire des cellules de tumeurs pourra être utilisée afin d'obtenir un lysat.
Les cellules dendritiques sont ainsi modifiëes en utilisant ces antigènes ou lysats cellulaires de sorte qu'elles expriment des antigènes tumoraux. Ainsi, ledit médicament 2o pourra être injecté en même temps que les cellules dendritiques ou de façon préférée ledit médicament pourra. être mis en oeuvre in vitro, afin de favoriser la maturation des cellules dendritiques avant de les réinjecter aux patients.
L'administration d'une fraction membranaire de bactéries à grain négâtif en même temps que (antigène permettra d'augmenter la présentation de (antigène par les cellules dendritiques et par là même (efficacité du traitement thérapeutique.
Ainsi, grâce à leur efficacité à présenter les antigènes et à stimuler le système immunitaire, les cellules dendritiques en présence d'une fraction membranaire de bactéries à grain négatif pourront être utilisées pour générer des réponses CTL
anticancéreuses (Nestle F.O. et al., 1998, Nat. Med., 4, 328-332). Cette approche, dénommée "ex vivo"
3o consiste donc à charger les cellules dendritiques ex vivo avec l'antigène d'intérêt (peptides ou lysat cellulaire) en présence d'une fraction membranaire de bactéries à grain
6 négatif et à réimplanter ces cellules chez le patient. Une étape de lavage des cellules dendritiques de manière à supprimer la fraction membranaire de bactéries à
grain négatif du milieu contenant les cellules dendritiques pourra être effectuée avant de réimplanter ces cellules chez le patient.
Une autre approche selon l'invention consiste à transfecter ex vivo les cellules dendritiques avec le gène codant pour l' antigène d' intérêt et notamment avec un gène codant pour un antigènes de bactérie, de virus, de levure, de parasite, de champignon, ou pour un antigène tumoral, tels que ceux décrits ci-dessus, et/ou avec un gène codant pour une cytokine ou un facteur de croissance, tels que ceux décrits ci-dessous, et de mettre les 1o cellules dendritiques, avant et/ou pendant et/ou après la transfection, en présence d'une fraction membranaire de bactéries à grain négatif et à réinjecter ces cellules transfectées (Gilboa E. et al., 1998, Cancer Im~munol. Immunother., 46, 82-87). Une étape de lavage des cellules dendritiques de manière à supprimer 1a fraction membranaire de bactéries à
grain négatif du milieu contenant les cellules dendritiques pourra être effectuée avant de réimplanter ces cellules chez le patient. De telles approches ont été
utilisées avec succès chez la souris et chez l'homme (Hsu F.J. et al., 1996, Nat. Med., 2, 52-58).
Le médicament selon l'invention peut comprendre en outre une cytokine ou un facteur de croissance, notamment (interféron alpha ou gamma, le TNFa, le GM-CSF, fIL-2, fIL,-12, fIL-4, fIL-6 et IL-18, une HSP (Heat Shock Protein) telle que par exemple 2o fhsp70, fhsp90, fhsp96, qui permet de potentialiser la réponse immunitaire;
et/ou des fibroblastes modifiés génétiquement de façon à relarguer une cytokine ou un facteur de croissance. On peut citer les fibroblastes exprimant du GM-CSF commercialisés par la société Immune Response Corporation. L'utilisation d'une fraction membranaire de bactéries à grain négatif avec au moins un agent biologique associé au TNF
alpha peut être utilisë pour la fabrication d'un médicament destiné à augmenter la prolifération des lymphocytes T.
Le médicament selon l'invention peut comprendre en outre un adjuvant permettant d'augmenter la réponse immunitaire, notamment choisi dans le groupe d'adjuvant comprenant le MPL-A, le Quil-A, l'ISCOM, les CpG, Leif, la CT
(toxine 3o cholérique) ou la LT (LT pour « Heat labile enterotoxin » entérotoxine labile à la chaleur), tout comme les versions détoxifiées de la CT ou la LT, ou des protéines membranaires
grain négatif du milieu contenant les cellules dendritiques pourra être effectuée avant de réimplanter ces cellules chez le patient.
Une autre approche selon l'invention consiste à transfecter ex vivo les cellules dendritiques avec le gène codant pour l' antigène d' intérêt et notamment avec un gène codant pour un antigènes de bactérie, de virus, de levure, de parasite, de champignon, ou pour un antigène tumoral, tels que ceux décrits ci-dessus, et/ou avec un gène codant pour une cytokine ou un facteur de croissance, tels que ceux décrits ci-dessous, et de mettre les 1o cellules dendritiques, avant et/ou pendant et/ou après la transfection, en présence d'une fraction membranaire de bactéries à grain négatif et à réinjecter ces cellules transfectées (Gilboa E. et al., 1998, Cancer Im~munol. Immunother., 46, 82-87). Une étape de lavage des cellules dendritiques de manière à supprimer 1a fraction membranaire de bactéries à
grain négatif du milieu contenant les cellules dendritiques pourra être effectuée avant de réimplanter ces cellules chez le patient. De telles approches ont été
utilisées avec succès chez la souris et chez l'homme (Hsu F.J. et al., 1996, Nat. Med., 2, 52-58).
Le médicament selon l'invention peut comprendre en outre une cytokine ou un facteur de croissance, notamment (interféron alpha ou gamma, le TNFa, le GM-CSF, fIL-2, fIL,-12, fIL-4, fIL-6 et IL-18, une HSP (Heat Shock Protein) telle que par exemple 2o fhsp70, fhsp90, fhsp96, qui permet de potentialiser la réponse immunitaire;
et/ou des fibroblastes modifiés génétiquement de façon à relarguer une cytokine ou un facteur de croissance. On peut citer les fibroblastes exprimant du GM-CSF commercialisés par la société Immune Response Corporation. L'utilisation d'une fraction membranaire de bactéries à grain négatif avec au moins un agent biologique associé au TNF
alpha peut être utilisë pour la fabrication d'un médicament destiné à augmenter la prolifération des lymphocytes T.
Le médicament selon l'invention peut comprendre en outre un adjuvant permettant d'augmenter la réponse immunitaire, notamment choisi dans le groupe d'adjuvant comprenant le MPL-A, le Quil-A, l'ISCOM, les CpG, Leif, la CT
(toxine 3o cholérique) ou la LT (LT pour « Heat labile enterotoxin » entérotoxine labile à la chaleur), tout comme les versions détoxifiées de la CT ou la LT, ou des protéines membranaires
7 bactériennes telles que les OMPC de Neisseria menihgitidis (Vella et al., Infect. Immun.
60 1992, 4977-4983), TraT d'Escherichia coli (Croft et al., J. linmunol. 146, 1991, 793-798) ou PorB de Neisser~ia meningitidis (Fusco et al., J. Infect. Dis. 175, 1997, 364-372), et préférentiellement une OmpA~ d'une bactérie du genre Klebsiella, protéine majeure de la membrane externe baptisée P40, présentant une activité adjuvante pour des antigènes sous-unitaires peptidiques (W0 95/27787 et WO 96/14415 ; Haeuw et al., Eur. J.
Biochem. 255 ,1998, 446-454 ; Plotnicky-Gilquin et al., J. Virol. 73 1999, 5637-5645).
Le médicament selon l'invention peut encore comprendre un milieu pharmaceutiquement acceptable. Au sens de la présente invention, le milieu 1o pharmaceutiquement acceptable est le milieu dans lequel les composés de (invention sont administrés, préférentiellement un milieu injectable chez (homme. Il peut être constitué
d'eau, d'une solution aqueuse saline ou d'une solution aqueuse à base de dextrose et/ou de glycérol.
Le médicament selon l'invention peut en outre être véhiculé sous une forme permettant d'améliorer sa stabilité etlou son immunogénicité; ainsi, il peut être véhiculé
sous forme de liposomes, virosomes, nanosphères, microsphères ou microcapsules. Le médicament ou l'association d'une fraction membranaire de bactéries à grain négatif - agent biologique pourra aussi se présenter sous une forme facilement administrable telle qu'une pommade, une lotion, une solution ou encore sous forme d'une composition adhésive 2o emplâtre, « patch ».
Le médicament selon l'invention pourra être utilisé notamment pour le traitement - des infections microbiennes, en particulier les infections de type chronique associëes au développement d'une réponse immune spécifique inefficace (virus :
par exemple le virus de fimmunodéficience humaine (VIH), les virus hépatiques, en particulier les virus hépatiques A, B, C et D et le parainfluenza virus, bactéries, parasites et levures), - des cancers, en particulier chez les sujets porteurs du VIH et/ou atteints de myélomes, lymphomes, leucémies, mélanomes, carcinomes, du rein, du cerveau. de la prostate, du rectum, du pancréas, des ovaires, du poumon, de la remise, par exemple.
60 1992, 4977-4983), TraT d'Escherichia coli (Croft et al., J. linmunol. 146, 1991, 793-798) ou PorB de Neisser~ia meningitidis (Fusco et al., J. Infect. Dis. 175, 1997, 364-372), et préférentiellement une OmpA~ d'une bactérie du genre Klebsiella, protéine majeure de la membrane externe baptisée P40, présentant une activité adjuvante pour des antigènes sous-unitaires peptidiques (W0 95/27787 et WO 96/14415 ; Haeuw et al., Eur. J.
Biochem. 255 ,1998, 446-454 ; Plotnicky-Gilquin et al., J. Virol. 73 1999, 5637-5645).
Le médicament selon l'invention peut encore comprendre un milieu pharmaceutiquement acceptable. Au sens de la présente invention, le milieu 1o pharmaceutiquement acceptable est le milieu dans lequel les composés de (invention sont administrés, préférentiellement un milieu injectable chez (homme. Il peut être constitué
d'eau, d'une solution aqueuse saline ou d'une solution aqueuse à base de dextrose et/ou de glycérol.
Le médicament selon l'invention peut en outre être véhiculé sous une forme permettant d'améliorer sa stabilité etlou son immunogénicité; ainsi, il peut être véhiculé
sous forme de liposomes, virosomes, nanosphères, microsphères ou microcapsules. Le médicament ou l'association d'une fraction membranaire de bactéries à grain négatif - agent biologique pourra aussi se présenter sous une forme facilement administrable telle qu'une pommade, une lotion, une solution ou encore sous forme d'une composition adhésive 2o emplâtre, « patch ».
Le médicament selon l'invention pourra être utilisé notamment pour le traitement - des infections microbiennes, en particulier les infections de type chronique associëes au développement d'une réponse immune spécifique inefficace (virus :
par exemple le virus de fimmunodéficience humaine (VIH), les virus hépatiques, en particulier les virus hépatiques A, B, C et D et le parainfluenza virus, bactéries, parasites et levures), - des cancers, en particulier chez les sujets porteurs du VIH et/ou atteints de myélomes, lymphomes, leucémies, mélanomes, carcinomes, du rein, du cerveau. de la prostate, du rectum, du pancréas, des ovaires, du poumon, de la remise, par exemple.
8 Comme décrit ci dessus, (invention concerne particulièrement l'immunothérapie cellulaire utilisant des vaccins anti-cancéreux et anti-infectieux en particulier, en générant in vitro des cellules dendritiques autologues, en y introduisant un antigène tumoral et en les réinjeciant après une étape de lavage facultative. L'exposition des cellules dendritiques in s vitro à la fraction membranaire de bactéries à grain négatif permettra d'augmenter la maturation des cellules dendritiques et donc d'augmenter l'efficacité du vaccin.
Aussi, la présente invention concerne particulièrement l'utilisation d'une fraction membranaire de bactéries à grain négatif, et plus particulièrement de la fraction membranaire de Klebsiella pneumoniae pour la préparation d'un médicament pour 1o augmenter la réponse immunologique vis-à-vis d'un agent biologique tel que défini ci dessus. Ce médicament peut être un vaccin pour le traitement ou la prévention des maladies infectieuses d'origine virale -comme notamment le VIH, les virus hépatiques et le parainfluenza virus-, bactérienne, fongique, ou provoquées par une levure ou un parasite.
La présente invention concerne encore l'utilisation d'une fraction membranaire de 15 bactéries à grain négatif avec au moins un agent biologique pour la fabrication d'un médicament pour le traitement ou la prévention des cancers et particûlièrement des cancers parmi les myélomes, lymphomes, leucémies, carcinomes du rein, du cerveau, de la prostate, du rectum, du pancréas, des ovaires, du poumon, et pour la fabrication d'un médicament pour le traitement ou la prévention des cancers cutanés choisi parmi les 2o kératinomes et les carcinomes.
En effet, dans les cancers de la peau tels que les mélanomes et les kératinomes, les cellules cancéreuses sont en contact direct avec les cellules de Langerhans, situées dans l'épiderme, l'utilisation selon la présente invention par application cutanée permet d'agir directement, localement sur les cellules de Langerhans. Ainsi, le médicament selon 25 (invention pourra être appliqué au niveau de la peau notamment par voie cutanée, sous-cutanée, transdermique, intra-épidermique ou au niveau des muqueuses, il agit alors de façon systémique par la maturation des cellules dendritiques et localement par la maturation des cellules de Langerhans.
Comme décrit ci dessus le traitement de ces cancers, peut aussi être envisagé
en 3o injectant des cellules dendritiques autologues, et notamment des cellules dendritiques
Aussi, la présente invention concerne particulièrement l'utilisation d'une fraction membranaire de bactéries à grain négatif, et plus particulièrement de la fraction membranaire de Klebsiella pneumoniae pour la préparation d'un médicament pour 1o augmenter la réponse immunologique vis-à-vis d'un agent biologique tel que défini ci dessus. Ce médicament peut être un vaccin pour le traitement ou la prévention des maladies infectieuses d'origine virale -comme notamment le VIH, les virus hépatiques et le parainfluenza virus-, bactérienne, fongique, ou provoquées par une levure ou un parasite.
La présente invention concerne encore l'utilisation d'une fraction membranaire de 15 bactéries à grain négatif avec au moins un agent biologique pour la fabrication d'un médicament pour le traitement ou la prévention des cancers et particûlièrement des cancers parmi les myélomes, lymphomes, leucémies, carcinomes du rein, du cerveau, de la prostate, du rectum, du pancréas, des ovaires, du poumon, et pour la fabrication d'un médicament pour le traitement ou la prévention des cancers cutanés choisi parmi les 2o kératinomes et les carcinomes.
En effet, dans les cancers de la peau tels que les mélanomes et les kératinomes, les cellules cancéreuses sont en contact direct avec les cellules de Langerhans, situées dans l'épiderme, l'utilisation selon la présente invention par application cutanée permet d'agir directement, localement sur les cellules de Langerhans. Ainsi, le médicament selon 25 (invention pourra être appliqué au niveau de la peau notamment par voie cutanée, sous-cutanée, transdermique, intra-épidermique ou au niveau des muqueuses, il agit alors de façon systémique par la maturation des cellules dendritiques et localement par la maturation des cellules de Langerhans.
Comme décrit ci dessus le traitement de ces cancers, peut aussi être envisagé
en 3o injectant des cellules dendritiques autologues, et notamment des cellules dendritiques
9 PCT/FR02/00906 autologues ~ qui ont été modifiées afin d'exprimer des antigènes tumoraux. La maturation des cellules dendritiques sera assurée par la fraction membranaire de bactéries à grain négatif.
L'invention a encore pour objet un dispositif pour la maturation des cellules dendritiques, tel que par exemple un kit, comprenant au moins la fraction membranaire de bactéries à grain négatif.
Ce kit pourra être adapté pour la maturation des cellules dendritiques in vitro et pourra être utilisé par exemple dans les laboratoires de recherche. Ce kit peut contenir en outre de la fraction membranaire de bactéries à grain négatif des cellules dendritiques 1o immatures et/ou les moyens nécessaires à isoler des cellules dendritiques immatures, tels que par exemple des moyens de purification de cellules mononucléaires sanguines. Il pourra ainsi comprendre par exemple diffërents milieux de culture, des solutions de lavage, des plaques de culture, des réactifs, des contrôles tels que par exemple des anticorps, et une notice explicative pour la mise en oeuvre de la méthode selon (invention de maturation des cellules dendritiques.
Un kit selon (invention pourra aussi être adapté à la mise en oeuvre de la méthode thérapeutique ci-dessus mentionnée. Ce kit peut contenir en outre de la fraction membranaire de bactéries à grain négatif des cellules dendritiques immatures etlou les moyens nécessaires à isoler des cellules dendritiques immatures, tels que par exemple des 2o moyens de purification de cellules mononucléaires sanguines. Il pourra ainsi comprendre par exemple différents milieux de culture, des solutions de lavage, des plaques de culture, des réactifs, des contrôles, et une notice explicative pour la mise en oeuvre de la méthode thérapeutique ci-dessus mentionnéé. Le cas échéant il pourra encore contenir des antigènes hétérologues ou des moyens pour obtenir un lysat de cellules autologues.
Les légendes des figures et exemples qui suivent sont destinés à illustrer (invention sans aucunement en limiter la portée. Ces exemples démontrent faction d'une fraction membranaire de bactéries à grain négatif sur les cellules dendritiques : la fraction membranaire de bactéries à grain négatif induit la maturation des cellules dendritiques humaines immatures et leur conf'ere de puissantes propriétés stimulatrices et présentatrice d'antigène.
Dans ces exemples, on se référera à la figure 1 annexée qui illustre le fait que i) La fraction membranaire de Klebsiella Pneumonia induit (expression de la 5 molécule CD83, au~nente l'expression CD86 ainsi que la production d'IL-8.
Les résultats d'analyse par FACS des molécules de surface sont exprimés en MFI
(moyenne d'intensité de fluorescence) et sont représentatifs d'une expérience parmi 3.
Concernant CD83 et CD86, les résultats sont également exprimés en pourcentage de cellules positives. Les résultats du dosage d'IL-8 sont exprimés en ng/ml et sont exprimés l0 en moyenne ~ s.d. de 4 expériences.
ü1 : La fraction membranaire de Klebsiella Pneumonia augmente les propriétés costimulatrices des lymphoc es T (voir 4~"'e colonne MLR
Des CD immatures ont été ou non traitées pendant 24 heures avec de la fraction membranaire de Klebsiella Pneumonia ou du LPS. Puis elles ont été irradiées et cultivées avec des lymphocytes T allogénique de 2 donneurs différents. La prolifération des lymphocytes T a été mesurée au bout de 5 jours. Les résultats sont exprimés en coup par minute (cpm) et représente la moyenne de 5 valeurs et sont représentatif d'une expérience parmi 3.
EXEMPLES
Exemple 1 : Obtention d'une fraction membranaire de K. pneumoniae Après décongélation à + 4°C pendant 48 h minimum, 1 kg de cellules sèches de K. pneumoniae est remis en suspension à 5 % cellules sèches. La DNase est ajoutée à 5 mg/1. On procède ensuite au broyage en boucle au Manton Gaulin pendant 30 min puis à
' une clarification sur SHARPLES à 501/h, suivie d'une précipitation à l'acide acétique à
pH = 4,2 + 0,1 pendant 30 min. Le culot est éliminé (SHARPLES à 25 1/h) et le surnageant est neutralisé, dilué à 2 fois le volume initial avec de l'eau osmosée. Une 3o dialyse à volume constant est alors effectuée sur PUF 100 jusqu'à 800 S2cm, suivie d'une concentration de la suspension membranaire (SM) ainsi obtenue, à 11 1/kg de cellules 11 _ o _ _.
sèches. On procède alors à l'autoclavage de la SM à + 121°C durant 35 min que l'on peut conserver à + 4°C pendant 6 semaines.
Caractéristiques de la fraction membranaire obtenue Par définition, le titre en protéoglycanne, est égal à la somme des teneurs en galactose et en protéines.
- Galactose : en moyenne 2,2 g /1 - Protéines : en moyenne 10,5 g/1 Exemple 2 : La fraction membranaire de Klebsiella Pneumonie augmente 1o fexnression de CD 83 A. Méthodologie A.l.Génération in vitro de CD humaines immatures.
Les cellules dendritiques humaines sont générées à partir de monocytes isolés du sang périphérique. Le . sang est prélevé par leucophérèse en présence d'anticoagulant comme par exemple fhéparinate de lithium. Les cellules mononucléées (CMI~ sont isolées de sujets sains par centrifugation sur un gradient de Ficoll-Hypaque (densité=1,077) (Amersham Pharmacie Biotech, Uppsala, Suède). Les cellules du sang sont centrifugées à
1500 rpm pendant 30 minutes à température ambiante. Les CMN, localisées à
l'interface Ficoll-plasma, sont rëcupérées et lavées deux fois en présence de milieu RPMI
1640 (Life 2o technologies, Cergy Pontoise, France). Les monocytes sont purifiés par sélection positive en utilisant un séparateur magnétique de cellules (MACST""; Miltenyi Biotex, Bergisch Gladbach, Allemagne) en accord avec les instructions du fabriquant. Les CMN
sont incubées pendant 20 minutés à 4°C avec des billes magnétiques sur lesquelles sont fixées un anticorps monoclonal anti-CD 14 -humain. Après lavage, la suspension cellulaire plus billes est déposée sur une colonne et soumise à un champ magnétique. Après trois lavages, la colonne n' est plus soumise au champ magnétique et les monocytes sont collectés par gravitation. La pureté des monocytes est évaluée par cytofluoromëtrie (cytofluoromètre FACScan ; Becton Dickinson, Erembodegem, Belgique) sur la base des paramètres taille-granulosité des cellules. La pureté est supérieure à 98%. Les monocytes sont ensuite mis en 3o culture à la concentration de 5x106 cellules/ml dans le milieu suivant (dénommé par la suite milieu de culture complet) : milieu RPMI 1640 supplémenté de 10% de sérum de veau foetal (chauffage à 56°C pendant 30 minutes), 2 mM de L-glutamine, 50 U/ml de pénicilline et 50 ug/ml de streptomycine (Life technologies) dans des plaques de culture 6 puits (Nunc, Roskilde, Danemark) à raison de 5 ml de milieu par puits. Les cellules sont activées avec 20 nglml d'IL-4 humaine recombinante et 20 ng/ml de GM-CSF
humain recombinant (R&D Systems, Abingdon, Royaume Uni). Après 5 à 7 jours de culture (37°C, 5% C02 en atmosphère humide), le phénotype des cellules est défini par cytofluorométrie.
Brièvement, une aliquote de la suspension cellulaire est prélevée. Les cellules sont lavëes dans du tampon FACS (tampon phosphate 10 mM pH 7,4 contenant 1 % de sérum albumine bovine et 0,01% d'azide de sodium) puis réparties dans des puits d'une plaque de 1o culture 96 puits à fond conique (Nunc) à raison de 2x105 cellules dans un volume de 50 ml de tampon FACS. Dans chaque puits est ajouté soit un anticorps anti-CDla humain marqué
à la fluorescéine (Becton Dickinson) soit un anticorps anti-CD83 humain non marqué
révélé par un anticorps anti-immunoglobuline de souris marqué à la fluorescéine (Becton Dickinson). Après 20 minutes d'incubation à 4°C, les cellules sont lavées trois fois avec 200 p,1 de tampon FACS puis sont remises en suspension dans 200 p,1 de ce même tampon.
L'analyse de l'expression de CDla versus CD83 est évaluée par FACS. Seules les cellules dendritiques immatures caractérisées par une expression de la molécules CD 1 a (intensité
moyenne de fluorescence (IMF)>100) et l'absence d'expression de la molécule CD83 ont été utilisëes.
A.2. Analyse par cytofluorométrie de l'expression des marqueurs de différenciation induite par la fraction membranaire de Klebsiella pneumoniae sur des cellules dendritiques humaines.
Les cellules dendritiques immatures ont été collectées, lavées puis remises en culture en milieu complet à la concentration de 105 cellules dans un volume de 200 p,1 dans des plaques de culture 96 puits à fond plat (Costar, Cabridge, USA). Les cellules sont activées avec de la fraction membranaire de Klebsiella pneumoniae à des concentrations de
L'invention a encore pour objet un dispositif pour la maturation des cellules dendritiques, tel que par exemple un kit, comprenant au moins la fraction membranaire de bactéries à grain négatif.
Ce kit pourra être adapté pour la maturation des cellules dendritiques in vitro et pourra être utilisé par exemple dans les laboratoires de recherche. Ce kit peut contenir en outre de la fraction membranaire de bactéries à grain négatif des cellules dendritiques 1o immatures et/ou les moyens nécessaires à isoler des cellules dendritiques immatures, tels que par exemple des moyens de purification de cellules mononucléaires sanguines. Il pourra ainsi comprendre par exemple diffërents milieux de culture, des solutions de lavage, des plaques de culture, des réactifs, des contrôles tels que par exemple des anticorps, et une notice explicative pour la mise en oeuvre de la méthode selon (invention de maturation des cellules dendritiques.
Un kit selon (invention pourra aussi être adapté à la mise en oeuvre de la méthode thérapeutique ci-dessus mentionnée. Ce kit peut contenir en outre de la fraction membranaire de bactéries à grain négatif des cellules dendritiques immatures etlou les moyens nécessaires à isoler des cellules dendritiques immatures, tels que par exemple des 2o moyens de purification de cellules mononucléaires sanguines. Il pourra ainsi comprendre par exemple différents milieux de culture, des solutions de lavage, des plaques de culture, des réactifs, des contrôles, et une notice explicative pour la mise en oeuvre de la méthode thérapeutique ci-dessus mentionnéé. Le cas échéant il pourra encore contenir des antigènes hétérologues ou des moyens pour obtenir un lysat de cellules autologues.
Les légendes des figures et exemples qui suivent sont destinés à illustrer (invention sans aucunement en limiter la portée. Ces exemples démontrent faction d'une fraction membranaire de bactéries à grain négatif sur les cellules dendritiques : la fraction membranaire de bactéries à grain négatif induit la maturation des cellules dendritiques humaines immatures et leur conf'ere de puissantes propriétés stimulatrices et présentatrice d'antigène.
Dans ces exemples, on se référera à la figure 1 annexée qui illustre le fait que i) La fraction membranaire de Klebsiella Pneumonia induit (expression de la 5 molécule CD83, au~nente l'expression CD86 ainsi que la production d'IL-8.
Les résultats d'analyse par FACS des molécules de surface sont exprimés en MFI
(moyenne d'intensité de fluorescence) et sont représentatifs d'une expérience parmi 3.
Concernant CD83 et CD86, les résultats sont également exprimés en pourcentage de cellules positives. Les résultats du dosage d'IL-8 sont exprimés en ng/ml et sont exprimés l0 en moyenne ~ s.d. de 4 expériences.
ü1 : La fraction membranaire de Klebsiella Pneumonia augmente les propriétés costimulatrices des lymphoc es T (voir 4~"'e colonne MLR
Des CD immatures ont été ou non traitées pendant 24 heures avec de la fraction membranaire de Klebsiella Pneumonia ou du LPS. Puis elles ont été irradiées et cultivées avec des lymphocytes T allogénique de 2 donneurs différents. La prolifération des lymphocytes T a été mesurée au bout de 5 jours. Les résultats sont exprimés en coup par minute (cpm) et représente la moyenne de 5 valeurs et sont représentatif d'une expérience parmi 3.
EXEMPLES
Exemple 1 : Obtention d'une fraction membranaire de K. pneumoniae Après décongélation à + 4°C pendant 48 h minimum, 1 kg de cellules sèches de K. pneumoniae est remis en suspension à 5 % cellules sèches. La DNase est ajoutée à 5 mg/1. On procède ensuite au broyage en boucle au Manton Gaulin pendant 30 min puis à
' une clarification sur SHARPLES à 501/h, suivie d'une précipitation à l'acide acétique à
pH = 4,2 + 0,1 pendant 30 min. Le culot est éliminé (SHARPLES à 25 1/h) et le surnageant est neutralisé, dilué à 2 fois le volume initial avec de l'eau osmosée. Une 3o dialyse à volume constant est alors effectuée sur PUF 100 jusqu'à 800 S2cm, suivie d'une concentration de la suspension membranaire (SM) ainsi obtenue, à 11 1/kg de cellules 11 _ o _ _.
sèches. On procède alors à l'autoclavage de la SM à + 121°C durant 35 min que l'on peut conserver à + 4°C pendant 6 semaines.
Caractéristiques de la fraction membranaire obtenue Par définition, le titre en protéoglycanne, est égal à la somme des teneurs en galactose et en protéines.
- Galactose : en moyenne 2,2 g /1 - Protéines : en moyenne 10,5 g/1 Exemple 2 : La fraction membranaire de Klebsiella Pneumonie augmente 1o fexnression de CD 83 A. Méthodologie A.l.Génération in vitro de CD humaines immatures.
Les cellules dendritiques humaines sont générées à partir de monocytes isolés du sang périphérique. Le . sang est prélevé par leucophérèse en présence d'anticoagulant comme par exemple fhéparinate de lithium. Les cellules mononucléées (CMI~ sont isolées de sujets sains par centrifugation sur un gradient de Ficoll-Hypaque (densité=1,077) (Amersham Pharmacie Biotech, Uppsala, Suède). Les cellules du sang sont centrifugées à
1500 rpm pendant 30 minutes à température ambiante. Les CMN, localisées à
l'interface Ficoll-plasma, sont rëcupérées et lavées deux fois en présence de milieu RPMI
1640 (Life 2o technologies, Cergy Pontoise, France). Les monocytes sont purifiés par sélection positive en utilisant un séparateur magnétique de cellules (MACST""; Miltenyi Biotex, Bergisch Gladbach, Allemagne) en accord avec les instructions du fabriquant. Les CMN
sont incubées pendant 20 minutés à 4°C avec des billes magnétiques sur lesquelles sont fixées un anticorps monoclonal anti-CD 14 -humain. Après lavage, la suspension cellulaire plus billes est déposée sur une colonne et soumise à un champ magnétique. Après trois lavages, la colonne n' est plus soumise au champ magnétique et les monocytes sont collectés par gravitation. La pureté des monocytes est évaluée par cytofluoromëtrie (cytofluoromètre FACScan ; Becton Dickinson, Erembodegem, Belgique) sur la base des paramètres taille-granulosité des cellules. La pureté est supérieure à 98%. Les monocytes sont ensuite mis en 3o culture à la concentration de 5x106 cellules/ml dans le milieu suivant (dénommé par la suite milieu de culture complet) : milieu RPMI 1640 supplémenté de 10% de sérum de veau foetal (chauffage à 56°C pendant 30 minutes), 2 mM de L-glutamine, 50 U/ml de pénicilline et 50 ug/ml de streptomycine (Life technologies) dans des plaques de culture 6 puits (Nunc, Roskilde, Danemark) à raison de 5 ml de milieu par puits. Les cellules sont activées avec 20 nglml d'IL-4 humaine recombinante et 20 ng/ml de GM-CSF
humain recombinant (R&D Systems, Abingdon, Royaume Uni). Après 5 à 7 jours de culture (37°C, 5% C02 en atmosphère humide), le phénotype des cellules est défini par cytofluorométrie.
Brièvement, une aliquote de la suspension cellulaire est prélevée. Les cellules sont lavëes dans du tampon FACS (tampon phosphate 10 mM pH 7,4 contenant 1 % de sérum albumine bovine et 0,01% d'azide de sodium) puis réparties dans des puits d'une plaque de 1o culture 96 puits à fond conique (Nunc) à raison de 2x105 cellules dans un volume de 50 ml de tampon FACS. Dans chaque puits est ajouté soit un anticorps anti-CDla humain marqué
à la fluorescéine (Becton Dickinson) soit un anticorps anti-CD83 humain non marqué
révélé par un anticorps anti-immunoglobuline de souris marqué à la fluorescéine (Becton Dickinson). Après 20 minutes d'incubation à 4°C, les cellules sont lavées trois fois avec 200 p,1 de tampon FACS puis sont remises en suspension dans 200 p,1 de ce même tampon.
L'analyse de l'expression de CDla versus CD83 est évaluée par FACS. Seules les cellules dendritiques immatures caractérisées par une expression de la molécules CD 1 a (intensité
moyenne de fluorescence (IMF)>100) et l'absence d'expression de la molécule CD83 ont été utilisëes.
A.2. Analyse par cytofluorométrie de l'expression des marqueurs de différenciation induite par la fraction membranaire de Klebsiella pneumoniae sur des cellules dendritiques humaines.
Les cellules dendritiques immatures ont été collectées, lavées puis remises en culture en milieu complet à la concentration de 105 cellules dans un volume de 200 p,1 dans des plaques de culture 96 puits à fond plat (Costar, Cabridge, USA). Les cellules sont activées avec de la fraction membranaire de Klebsiella pneumoniae à des concentrations de
10 microgrammes, 20 microgrammes et 50 microgrammes par millilitre de milieu final. 24 heures après stimulation, l'expression des molécules CD83 et CD86 est évaluée par 3o cytofluorométrie à l'aide d'anticorps monoclonaux spécifiques marqués à la fluorescéine (Becton Dickinson). Les anticorps isotypiques contrôles utilisés proviennent de Becton Dickinson. Les cellules sont lavées dans du tampon FACS puis réparties dans des puits d'une plaque de culture 96 puits à fond conique à raison de 2x105 cellules dans un volume de 50 ~.1 de tampon FACS. Dans chaque puits est ajouté un anticorps. Après 20 minutes d'incubation à 4°C, les cellules sont lavées trois fois avec 200 ~,l de tampon FACS puis sont remises en suspension dans 200 ~l de ce même tampon. L'analyse de l'expression des marqueurs de surface est évaluée par FACS.
B. Résultats Les résultats présentés dans la figure 1 montrent que la fraction membranaire de Klebsiella pneumoniae augmente l'expression par les cellules dendritiques immatures de l0 molécules de surface impliquêes dans l'activation des lymphocytes T
- Comme cela a été préalablement démontré la majorité de la population de cellules dendritiques immatures n'exprime pas de CD83. La fraction membranaire de Klebsiella pneumoniae induit l'expression de la molécule de costimulation.
- La fraction membranaire de Klebsiella pneumoniae augmente aussi l'expression d'autres molécules impliqués dans l'activation des lymphocytes T, telle que CD86.
Exemple III. : La fraction membranaire de Klebsiella Pneumonia induit l'expression d'IL-8 par les CD
A. Méthodologie 2o Des cellules dendritiques humaines immatures ont été générées comme décrit dans l'exemple 1. Après 5 à 7 jours de culture, les cellules sont remises en culture en milieu complet à la concentration de 105 cellules dans un volume de 200 ml dans des plaques de culture 96 puits à fond plat. Les cellules sont activées avec de la fraction membranaire de Klebsiella pneumoniae à des concentrations de 10 microgrammes et 50 microgrammes par millilitre de milieu de culture et après 24 heures de culture, les surnageants de culture sont centrifugés à 10000 rpm pendant 15 minutes à 4°C et 11L-8 est dosée à
l'aide de kits de dosage commercial type ELISA (RAD Systems) selon les instructions du fabricant.
B. Résultats Les résultats présentés dans la figure 1 montrent que la fraction membranaire de 3o Klebsiella pneumoniae induit l'expression d'IL-8. Il peut ainsi être conclu que les fractions membranaires de bactéries à gram négatif activent les cellules dendritiques immatures.
Exemple IV. La fraction membranaire de HIebsiella nneumoniae augmente les nrouriétés costimulatrices des cellules dendritigues A. Méthodologie A.1. Réaction lymphocytaire mixte.
Les cellules dendritiques humaines immatures sont générées comme décrit dans l'exemple 1. Après 5 à 7 jours de culture, les cellules sont lavées en milieu puis remises en culture dans le milieu complet à la concentration de 2,5x105 cellules/puits dans une plaque de culture 6 puits (5 ml/puits). Les cellules ne sont pas stimulées ou sont 1o stimulées en présence de la fraction membranaire de Klebsiella pneumoniae à
des concentrations de IO microgrammes et 50 microgrammes ou 10 ng/lnl LPS. Après heures de culture, les cellules sont collectées et lavées trois fois en milieu RPMI 1640. Les cellules sont ensuite irradiées à 3000 rad. Les lymphocytes T humains fraîchement isolés du sang périphérique ont été préparés par la technique des rosettes avec des érythrocytes de mouton. Brièvement, les cellules mononucléées sont isolées sur gradient de Ficoll-Hypaque, comme décrit dans l'exemple 1. Les cellules mononucléées sont remises en suspension dans du milieu complet à la concentration de 200x106 cellules/m1 et mélangées avec 1 ml d'une suspension à 50% d'érythrocytes de mouton (BioMérieux, Marcy l'Etoile, France). La suspension cellulaire est incubée à 4°C pendant une nuit.
Après remise en 2o suspension douce, les cellules T sont isolées par centrifugation sur un gradient de Ficoll-Hypaque (1500 rpm pendant 30 minutes à température ambiante). Les complexes cellules T/érythrocytes sont collectés au fond du tube. Les globules rouges sont lysés par deux chocs hypotoniques successifs. La pureté des cellules ainsi isolées est évaluée par cytofluorométrie à 1 'aide d'un anticorps anti-CD3 humain marqué à la fluorescéine (Becton Dickinson). La pureté est >95%. Après lavage, les cellules sont remises en suspension dans le milieu de culture complet à la concentration de 2,5x105 cellules/ml.
Les cellules dendritiques activées et irradiées sont mises en culture à la concentration de 104 cellules/200 microlitres dans une plaque de culture 96 puits en présence ou non de 5x104 lymphocytes allogéniques. Après 5 jours de culture, la 3o prolifération des cellules T est évaluée par mesure de l'incorporation de thymidine tritiée (3H-Thy) (Amersham, Amersham, Royaume Uni). Brièvement, 0.25 mCi de 3H-Thy sont ajoutés dans chaque puits de culture. L'incorporation de 3H-Thy est mesurée par un compteur à scintillation liquide (Packard Instruments, Australie). Les résultats sont présentés en coups par minute (cpm). Les réactions lymphocytaires mixtes sont réalisées avec les lymphocytes T provenant de deux donneurs sains différents.
5 B. Résultats Les résultats présentés dans la figure 1 montrent que les cellules dendritiques stimulées par la fraction membranaire de Klebsiella pneumoniae présentent une capacité
accrue à fournir des signaux de costimulation aux lymphocytes T et induisent une prolifération de lymphocytes T plus importante que les CD non stimulées.
Exemple V. KpOmnA agit en synergie avec le LPS pour induire la maturation des cellules dendritiaues Parmi les protéines membranaires contenues dans la FMKp (fraction membranaire) figure la KpOmpA dont la capacité à induire la maturation des cellules dendritiques humaines a déjà été montrée (Jeannin et al., 2000, Nat Immunol, 1(6), 502-9).
Toutefois, la FMKp, contenant un taux de protéines compris entre 1,2 g!1 et 3,4 g/1 et de galactose compris entre 7,5 et 14,9 g/1, est beaucoup plus efficace pour induire la maturation des cellules dendritiques que la protéine seule, ainsi que le démontre le tableau II, où la maturation des cellules dendritiques humaines est objectivée par la production 2o d'IL-12.
Ainsi, la FMKp induit la production de 134 pg/ml d'Ih-12 à 0,1 ~,g de protéines/ml alors que parmi ces protéines totales KpOmpA ne représente qu'un faible pourcentage (environ 10%).
En revanche, même à forte concentration (20 ~.g/ml) KpOmpA seule, ne déclenche la production que de 30 pg/ml d'IL-12 (valeurs extraites de Jeannin et al., op. cit.).
Des cellules dendritiques à 10 x 106/m1 préparées comme décrit précédemment ont été stimulées avec~des doses croissantes de FMKp ou KpOmpA. Après 24 heures, fIL-12, indicatrice de maturation des cellules dendritiques a été dosée dans les surnageants par ELISA (R&D Systems).
IL-12 en pg/ml KpOmpA
4 ~.g/ml 10 20 ~,g/ml30 FMKp 0,01 ~,g/ml55 0,1 ~g/ml134 1 pg/ml 241 ~g/ml 196 Tableau II: maturation de cellules dendritiques humaines en présence de KpOmpA
ou de FMKy Sans être lié par cette théorie, le Déposant pense que l'efficacité de la FMKp à
5 induire la maturation des cellules dendritiques humaines peut s'expliquer par un effet synergique entre KpOmpA et le LPS contenu dans la FMKp.
Les résultats présentés dans le tableau III permettent d'étayer cette hypothèse. Des cellules dendritiques à 10 x 106/m1 préparées comme décrit précédemment ont été
1o stimulées avec des doses croissantes de LPS en présence ou en absence de kpOmpA
(10~.g/ml). Après 24 heures, l'IL-8 a été dosée dans les surnageants par ELISA
(R&D
Systems). Les résultats présentés sont exprimés en ng/ml et sont représentatifs d'une expérience parmi trois.
LPS (ng/ml) sans KpOmpA avec KpOmpA
0,08 6 1130 0,4 467 2395 Tableau III. Maturation des cellules dendritiaues humaines avec du LPS. en présence ou absence de K~OmpA.
B. Résultats Les résultats présentés dans la figure 1 montrent que la fraction membranaire de Klebsiella pneumoniae augmente l'expression par les cellules dendritiques immatures de l0 molécules de surface impliquêes dans l'activation des lymphocytes T
- Comme cela a été préalablement démontré la majorité de la population de cellules dendritiques immatures n'exprime pas de CD83. La fraction membranaire de Klebsiella pneumoniae induit l'expression de la molécule de costimulation.
- La fraction membranaire de Klebsiella pneumoniae augmente aussi l'expression d'autres molécules impliqués dans l'activation des lymphocytes T, telle que CD86.
Exemple III. : La fraction membranaire de Klebsiella Pneumonia induit l'expression d'IL-8 par les CD
A. Méthodologie 2o Des cellules dendritiques humaines immatures ont été générées comme décrit dans l'exemple 1. Après 5 à 7 jours de culture, les cellules sont remises en culture en milieu complet à la concentration de 105 cellules dans un volume de 200 ml dans des plaques de culture 96 puits à fond plat. Les cellules sont activées avec de la fraction membranaire de Klebsiella pneumoniae à des concentrations de 10 microgrammes et 50 microgrammes par millilitre de milieu de culture et après 24 heures de culture, les surnageants de culture sont centrifugés à 10000 rpm pendant 15 minutes à 4°C et 11L-8 est dosée à
l'aide de kits de dosage commercial type ELISA (RAD Systems) selon les instructions du fabricant.
B. Résultats Les résultats présentés dans la figure 1 montrent que la fraction membranaire de 3o Klebsiella pneumoniae induit l'expression d'IL-8. Il peut ainsi être conclu que les fractions membranaires de bactéries à gram négatif activent les cellules dendritiques immatures.
Exemple IV. La fraction membranaire de HIebsiella nneumoniae augmente les nrouriétés costimulatrices des cellules dendritigues A. Méthodologie A.1. Réaction lymphocytaire mixte.
Les cellules dendritiques humaines immatures sont générées comme décrit dans l'exemple 1. Après 5 à 7 jours de culture, les cellules sont lavées en milieu puis remises en culture dans le milieu complet à la concentration de 2,5x105 cellules/puits dans une plaque de culture 6 puits (5 ml/puits). Les cellules ne sont pas stimulées ou sont 1o stimulées en présence de la fraction membranaire de Klebsiella pneumoniae à
des concentrations de IO microgrammes et 50 microgrammes ou 10 ng/lnl LPS. Après heures de culture, les cellules sont collectées et lavées trois fois en milieu RPMI 1640. Les cellules sont ensuite irradiées à 3000 rad. Les lymphocytes T humains fraîchement isolés du sang périphérique ont été préparés par la technique des rosettes avec des érythrocytes de mouton. Brièvement, les cellules mononucléées sont isolées sur gradient de Ficoll-Hypaque, comme décrit dans l'exemple 1. Les cellules mononucléées sont remises en suspension dans du milieu complet à la concentration de 200x106 cellules/m1 et mélangées avec 1 ml d'une suspension à 50% d'érythrocytes de mouton (BioMérieux, Marcy l'Etoile, France). La suspension cellulaire est incubée à 4°C pendant une nuit.
Après remise en 2o suspension douce, les cellules T sont isolées par centrifugation sur un gradient de Ficoll-Hypaque (1500 rpm pendant 30 minutes à température ambiante). Les complexes cellules T/érythrocytes sont collectés au fond du tube. Les globules rouges sont lysés par deux chocs hypotoniques successifs. La pureté des cellules ainsi isolées est évaluée par cytofluorométrie à 1 'aide d'un anticorps anti-CD3 humain marqué à la fluorescéine (Becton Dickinson). La pureté est >95%. Après lavage, les cellules sont remises en suspension dans le milieu de culture complet à la concentration de 2,5x105 cellules/ml.
Les cellules dendritiques activées et irradiées sont mises en culture à la concentration de 104 cellules/200 microlitres dans une plaque de culture 96 puits en présence ou non de 5x104 lymphocytes allogéniques. Après 5 jours de culture, la 3o prolifération des cellules T est évaluée par mesure de l'incorporation de thymidine tritiée (3H-Thy) (Amersham, Amersham, Royaume Uni). Brièvement, 0.25 mCi de 3H-Thy sont ajoutés dans chaque puits de culture. L'incorporation de 3H-Thy est mesurée par un compteur à scintillation liquide (Packard Instruments, Australie). Les résultats sont présentés en coups par minute (cpm). Les réactions lymphocytaires mixtes sont réalisées avec les lymphocytes T provenant de deux donneurs sains différents.
5 B. Résultats Les résultats présentés dans la figure 1 montrent que les cellules dendritiques stimulées par la fraction membranaire de Klebsiella pneumoniae présentent une capacité
accrue à fournir des signaux de costimulation aux lymphocytes T et induisent une prolifération de lymphocytes T plus importante que les CD non stimulées.
Exemple V. KpOmnA agit en synergie avec le LPS pour induire la maturation des cellules dendritiaues Parmi les protéines membranaires contenues dans la FMKp (fraction membranaire) figure la KpOmpA dont la capacité à induire la maturation des cellules dendritiques humaines a déjà été montrée (Jeannin et al., 2000, Nat Immunol, 1(6), 502-9).
Toutefois, la FMKp, contenant un taux de protéines compris entre 1,2 g!1 et 3,4 g/1 et de galactose compris entre 7,5 et 14,9 g/1, est beaucoup plus efficace pour induire la maturation des cellules dendritiques que la protéine seule, ainsi que le démontre le tableau II, où la maturation des cellules dendritiques humaines est objectivée par la production 2o d'IL-12.
Ainsi, la FMKp induit la production de 134 pg/ml d'Ih-12 à 0,1 ~,g de protéines/ml alors que parmi ces protéines totales KpOmpA ne représente qu'un faible pourcentage (environ 10%).
En revanche, même à forte concentration (20 ~.g/ml) KpOmpA seule, ne déclenche la production que de 30 pg/ml d'IL-12 (valeurs extraites de Jeannin et al., op. cit.).
Des cellules dendritiques à 10 x 106/m1 préparées comme décrit précédemment ont été stimulées avec~des doses croissantes de FMKp ou KpOmpA. Après 24 heures, fIL-12, indicatrice de maturation des cellules dendritiques a été dosée dans les surnageants par ELISA (R&D Systems).
IL-12 en pg/ml KpOmpA
4 ~.g/ml 10 20 ~,g/ml30 FMKp 0,01 ~,g/ml55 0,1 ~g/ml134 1 pg/ml 241 ~g/ml 196 Tableau II: maturation de cellules dendritiques humaines en présence de KpOmpA
ou de FMKy Sans être lié par cette théorie, le Déposant pense que l'efficacité de la FMKp à
5 induire la maturation des cellules dendritiques humaines peut s'expliquer par un effet synergique entre KpOmpA et le LPS contenu dans la FMKp.
Les résultats présentés dans le tableau III permettent d'étayer cette hypothèse. Des cellules dendritiques à 10 x 106/m1 préparées comme décrit précédemment ont été
1o stimulées avec des doses croissantes de LPS en présence ou en absence de kpOmpA
(10~.g/ml). Après 24 heures, l'IL-8 a été dosée dans les surnageants par ELISA
(R&D
Systems). Les résultats présentés sont exprimés en ng/ml et sont représentatifs d'une expérience parmi trois.
LPS (ng/ml) sans KpOmpA avec KpOmpA
0,08 6 1130 0,4 467 2395 Tableau III. Maturation des cellules dendritiaues humaines avec du LPS. en présence ou absence de K~OmpA.
Claims (13)
1. Utilisation d'au moins une fraction membranaire de bactéries à gram négatif, préférentiellement de Klebsiella pneumoniae, comprenant au moins des protéines membranaires associées aux LPS (lipopolysaccharides), pour induire la maturation des cellules dendritiques.
2. Utilisation d'au moins une fraction membranaire de bactéries à gram négatif, et préférentiellement de Klebsiella pneumoniae, comprenant au moins des protéines membranaires associées aux LPS (lipopolysaccharides), pour la fabrication d'un médicament destiné à induire la maturation des cellules dendritiques.
3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ladite fraction membranaire présente un titre en protéoglycane représenté par la somme des teneurs en galactose et en protéines, entre 1,2 g/l et 3,4 g/l pour le galactose et entre 7,5 g/l et 14,9 g/l pour les protéines.
4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la génération et la maturation des cellules dendritiques sont effectuées in vitro.
5. Utilisation selon l'une des revendications 2 à 4, caractérisée en ce que la génération et la maturation des cellules dendritiques sont effectuées in vitro, les cellules matures étant ensuite réinjectées in vivo.
6. Utilisation selon l'une des revendications 2 à 5 et en outre d'au moins un agent biologique pour la fabrication d'un médicament.
7. Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que l'agent biologique est choisi parmi les antigènes de bactérie, de virus, de levure, de parasite, de champignon, les antigènes tumoraux, et les lysats de cellules tumorales autologues et/ou hétérologues.
8. Utilisation selon l'une des revendications 2 à 5, caractérisée en ce que les cellules dendritiques sont 'transfectées ex vivo avec un gène codant pour un antigène et/ou une cytokine ou un facteur de croissance.
9. Utilisation selon l'une des revendications 2 à 8, caractérisée en ce que le médicament contient en outre une cytokine ou un facteur de croissance, préférentiellement l'interféron alpha ou gamma, le TNF.alpha., le GM-CSF, 1'IL-2, 1'IL-4, 1'IL-6 et IL-18 ou une HSP.
10. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 9 pour la fabrication d'un médicament pour le traitement ou la prévention des maladies infectieuses d'origine virale, bactérienne, fongique ou provoquée par une levure, ou un parasite.
11. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 9 pour la fabrication d'un médicament pour lutter contre un virus choisi parmi le VIH, les virus hépatiques et le parainfluenza virus.
12. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 9 pour la fabrication d'un médicament pour le traitement ou la prévention des cancers.
13. Utilisation selon l'une des revendications 8 ou 9 pour la fabrication d'un médicament pour le traitement ou la prévention d'un cancer parmi les myélomes, lymphomes, leucémies, carcinomes du rein, du cerveau, de la prostate, du rectum, du pancréas, des ovaires, du poumon, les kératinomes et les carcinomes.
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