JP2010505883A - 免疫応答を調節するための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

本願発明では、NF-κBシグナル経路の阻害剤と標的抗原に対応する抗原とを含む薬剤の免疫細胞への粒子送達に関係する免疫応答を調節するための方法および組成物を開示している。 本願発明の方法および組成物は、自己免疫疾患、アレルギー、および、移植関連疾患などの標的抗原が関係する好ましくない免疫応答を処置または予防する上で特に有用である。

Description

本願発明は、一般的に、免疫応答を調節するための方法および組成物に関する。 具体的には、本願発明は、NF-κBシグナル経路の阻害剤と標的抗原に対応する抗原とを含む薬剤を免疫細胞へ粒子送達することに関する。 本願発明の方法および組成物は、自己免疫疾患、アレルギー、および、移植関連疾患などの標的抗原が関係する好ましくない免疫応答を処置または予防する上で特に有用である。

NF-κBは、細胞の表面から細胞核へシグナルを伝達する。 中継分子を介してNF-κBおよびMAPキナーゼを活性化する細胞表面の受容体を通るシグナルは、生体のすべての細胞を生存および活性化させる上で非常に重要であり、例えば、樹状細胞(DC)のような抗原を放出する細胞のような、先天性および適応性の免疫を調節するものが該当する。 よって、NF-κBは、自己免疫、および、自己免疫疾患療法での好適な標的における重要なシグナル要素である。

ＮＦ-κＢの作用
哺乳類には、p50、p52、c-Rel、p65/RelAおよびReIBの五つのNF-κBタンパク質が存在している。 これらのすべてが、DNAの結合、二量体化、および、細胞核転移を媒介する rel 相同ドメイン(RHD)を共有している。 p50とp52のホモ二量体は、転写面では不活性であるが、DNAに結合することは可能である。 これに対して、c-relまたはReIAは、DNAに結合することができ、また、転写活性を媒介することもできる。 その結果、サブユニットとアフィニティーを利用すれば、細胞内のNF-κB成分を決定することができる (Hoffmann A, Baltimore D: Circuitry of nuclear factor kappaB signaling. Immunol. Rev. (2006) 210:171-186).
刺激を受けていない細胞にあっては、NF-κBは、阻害タンパク質や、IκBα、IκBβ、IκBε、IκBγ、IκBNS、Bcl-3、plOOおよびpl05を含むIκBSに結合した細胞質に含まれる不活性フォームとして存在する(Ghosh S, M: Missing pieces in the NF-kappaB puzzle. Cell (2002) 109 Suppl:S81-96)。 これらタンパク質は、緊密に収納されたへリックス、それに続く、ループ、および、固定されたヘアピンターンからなり、かつ、NF-κB二量体への結合を促すアンキリンリピートを含んでいる。 NF-κBでのこのNLS領域は、二量体核の取り込みを可能にする。 IκBβは、NLSを隠して、二量体の細胞核の取り込みを防ぐ。 これに対して、IκBαは、p65のNLSだけを隠してしまい、p50のNLSを隠すことはない。 通常、細胞核の維持は、IκBα内の細胞核を運び出す配列の存在によって防がれている。 このNF-κBの運び出し配列がブロックされれば、RelA/p50複合体は、細胞核内で保持される(Huang Tt, Kudo N, Yoshida M, Miyamoto S: A nuclear export signal in the N-terminal regulatory domain of IkappaBalpha controls cytoplasmic localization of inactive NF-kappaB/IkappaBalpha complexes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2000) 97(3): 1014-1019)。

様々な受容体-リガンドの組み合わせによって、TLR/病原体シグナル、炎症性受容体(TNFR/TNFおよびIL-lR/IL-1)、Ｔ細胞(CD40/CD40L、TCR/MHCペプチド)、およびＢ細胞シグナル(BAFFR/BAFF、BCR/Ag)、および、リンフォトキシン/LTβおよびRANK/RANKLなどの分化シグナルを含むNF-κBが活性化される。 これら経路のシグナルを出すことで、セリン/トレオニンキナーゼIκBキナーゼ(IKK)が活性化される(Yamamoto Y, Gaynor RB: IkappaB kinases: key regulators of the NF-kappaB pathway. Trends Biochem. Sci. (2004) 29(2):72-79)。 IKKは、特定のユビキチンリガーゼ複合体であるb-TrCP-SCFによって認識されるIκBをリン酸化する。 ユビキチン化したIκBは、26Sプロテアソームによって分解されて、NF-κBを放出し、細胞核を取り込み、そして、転写活性をもたらす。 このIKK複合体は、IKKα(IKKl)、IKKβ(IKK2)、そして、それらに関連する非触媒性の調節サブユニットIKKγ/NF-κB必須モジュレーター(NEMO)の三つのサブユニットから構成されている。 IKKは、分裂促進活性化タンパク質キナーゼキナーゼキナーゼ (MAPKKK)またはキナーゼを含むNF-κB(NIK)によるリン酸化を通じて活性化され、それに引き続いて、IKK複合体の自己リン酸化と全活性の獲得に至る。 IKKβおよびNEMOを欠損したマウスでは、サイトカインおよびTLRの活性化、特に、RelA/p50の活性化に応答するNF-κBの活性化が損なわれている。 これに対して、IKKαは、RelB/p52複合体の活性化と、NF-κBのDNA結合作用を高めるためのヒストンのリン酸化において、特定の役割を果たしている。

個別のNF-κBサブユニットを活性化するIKKαおよびIKKβ/NEMOの分化作用によって、ＮＦ-κＢ経路は、旧来の代替的経路に分類されることとなる(以下、これらを「ＮＦ-κＢ経路」と総称する)(Xiao G, Rabson AB, Young W, Qing G, Qu Z: Alternative pathways of NF-kappaB activation: a double-edged sword in health and disease. Cytokine Growth Factor Rev. (2006) 17(4):281-293)。 旧来の経路は、TLRと前炎症性サイトカインによって活性化され、それにより、IKKβとNEMO-依存性のリン酸化、IκBの分解、および、それに続く、RelA/p50ヘテロ二量体の活性化を招く。 連続したシグナルが無い場合には、IKKβ活性が低下し、IκBが誘発されるので、その経路は、早々に閉じられてしまう。 これに対して、代替経路は、LTβ、CD40LおよびBAFFなどの細胞の分化に関連するシグナルによって活性化される。 RelB/p52ヘテロ二量体は、p100の調節を受け、また、IKKαによるリン酸化のためのIκBドメイン標的部位を含むp52に対する前駆体を誘発する主要なNF-κBタンパク質である。 IKKαのシグナルに特異的な活性化は、p100からp52への移行と、RelB/p52の活性化を招く。 この経路は、維持されたIKKαとNF-κBの持続的な活性化を特徴としている。 この代替経路は、旧来のＮＦ-κＢ経路を細胞分化プロセスへ適合させると考えられており、また、Ｂ細胞、および、DC分化、それに、リンパ器官形成において重要である。 NIKは、IKKαを活性化する上流キナーゼであると考えられている。 NIK、IKKαおよびReIBノックアウトマウスは、リンパ器官形成において、同様の欠陥を有している。 旧来の経路と代替経路の活性化において幾つかの重複部分があること、例えば、LTβは、双方の経路にシグナルを送り、その結果、標的遺伝子が活性化されることなど、は重要である(Dejardin E, Droin NM, Delhase M et al. : The lymphotoxin-beta receptor induces different patterns of gene expression via two NF-kappaB pathways. Immunity (2002) 17(4):525-535)。 典型的な旧来の経路の活性化因子であるLPSも、代替経路の活性化を招く(Mordmuller B, Krappmann D, Esen M, Wegener E, Scheidereit C: Lymphotoxin and lipopolysaccharide induce NF-kappaB-p52 generation by a co-translational mechanism. EMBO Rep. (2003) 4(l):82-87)。 このことは、ＮＦ-κＢ経路とそれに続く抗原への接近、そして、第二のリンパ器官への移動の双方をアップレギュレートするDCの効率的な分化を行う上で必須であろう。 この代替経路の活性化は、新たに合成されたIκBαがRelA/p50を阻害するものの、新たに合成されたReIBとp100からp52への移行は、二量体の変換、あるいは、RelB/p52との置換、そして、持続的なDC分化をもたらす(Saccani S, Pantano S, Natoli G: Modulation of NF-kappaB activity by exchange of dimers. MoI. Cell (2003) 11(6):1563-1574)。

免疫応答において、NF-κB標的遺伝子は、炎症、細胞の構成、分化、および、増殖に関与する。 組織マクロファージは、NF-κBで誘発した前炎症性サイトカインの主要な供給源である。 TNFα、IL-I、および、IL-6などのサイトカインを誘発するNF-κBは、先天的な応答を活性化させ、そして、c-反応性タンパク質(CRP)と補体を放出し、次いで、局所的な内皮細胞由来の接着分子をアップレギュレーションする。 NF-κBが誘発したIL-8、MIP-lα、MCP-I、RANTES、および、エオタキシンなどのケモカインや、GM-CSFなどの成長因子は、骨髄細胞を局所組織に固定および再誘導する。 感染症に認められるものと同じ応答の組み合わせが、慢性関節リウマチ(RA)や炎症性腸疾患(IBD)などの自己免疫疾患においても認められる。

NF-κBは、ケモカインCXC 12、CXCLl 3、CCL21、および、CCLl 9を通じてリンパ器官形成する役割を担っている。 NF-κBは、Ｂ細胞およびＴ細胞での多くの分化段階において役割を担っており(Claudio E, Brown K, Siebenlist U: NF-kappaB guides the survival and differentation of developing lymphocytes. Cell Death Differ. (2006) 13(5):697-701)、例えば、NKT細胞の発達段階での代替経路での役割や、調節Ｔ細胞(Treg)の発達段階での代替経路での役割などがある(Schmidt-Supprian M, Tian J, Grant EP et al. : Differential dependence of CD4₊CD25₊ regulatory and natural killer-like T cells on signals leading to NF-kappaB activation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2004) 101(13):4566-4571; Schmidt-Supprian M, Courtois G, Tian J et al. : Mature T cells depend on signaling through the IKK complex. Immunity (2003) 19(3):377-389; Zheng Y, Vig M, Lyons J, Van Parijs L, Beg AA: Combined deficiency of p50 and cRel in CD4₊ T cells reveals an essential requirement for nuclear factor kappaB in regulating mature T cell survival and in vivo function. J. Exp. Med. (2003) 197(7):861-874)。 ナイーブＴ細胞による効率的なIL-2生産を行う上でc-Relも必要とされており(Banerjee D, Liou HC, Sen R: c-Rel-dependent priming of naive T cells by inflammatory cytokines. Immunity (2005) 23(4):445-458)、また、T regは、胸腺温存後のIL-2に極度に依存している(D'Cruz LM, Klein L: Development and function of agonist-induced CD25₊Foxp3+ regulatory T cells in the absence of interleukin 2 signaling. Nat. Immunol. (2005) 6(11):1152-1159; Fontenot JD, Rasmussen JP, Gavin MA, Rudensky AY: A function for interleukin 2 in Foxp3- expressing regulatory T cells. Nat. Immunol. (2005) 6(11): 1142-1151)。 NF-κBは、リンパ球の増殖、それに、RAおいて過剰増殖する滑膜細胞のような非造血細胞の増殖において重要な役割を果たす。

関連するNF-κBとして、c-myc、cyclin Dl、それに、c-IAPやBcl-2などの抗-アポトーシス遺伝子がある。

自己免疫炎症でのNF-κB
自己免疫疾患は、互いに相違しつつも、関連性がある三つの要素、すなわち、自己寛容の破壊、一つまたは幾つかの臓器での慢性炎症の拡大、それに、組織崩壊とそれに伴う有害作用に関与するプロセスに起因している。 「中枢」寛容の欠如は、自然突発自己免疫疾患の重要な因子である。 胎児期および新生児期において、中枢寛容は、胸腺内で活発に維持されている(Ardavin C: Thymic dendritic cells. Immunol. Today (1997) 18:350-361)。 このプロセスの間、Ｔ細胞の活動範囲は、胸腺皮質上皮(cTEC)を各個体から選択することで明らかとなる自己MHCにまで限定される。 加えて、脊髄の上皮細胞(mTEC)および脊髄の樹状細胞(DC)を含む抗原供給細胞(APC)によって供給される自己抗原に対して反応性を示すこれらのＴ細胞は、これらAPCによって供給された自己抗原に対するアフィニティーの閾値を利用したネガティブ選択によって除外される(Kappler JW, Roehm N, Marrack P: T cell tolerance by clonal elimination in the thymus. Cell (1987) 49:273-280)。 アフィニティー閾値を、自己反応性Ｔ細胞の大半を削除するために用いているので、低アフィニティーの自己反応性Ｔ細胞が末梢部で循環することは避けられない。

低レベルの胸腺発現と自己抗原の供給は、通常は、末梢の体細胞で発現されている。 これら抗原の発現は、その発現がNF-κBの代替経路によって交互に調節されているAIREによって、転写的に調節されている(Anderson MS, Venanzi Es, Klein L et al.: Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science (2002) 298(5597):1395-1401)。 自然突発自己免疫モデルでは、APCと胸腺細胞との相互作用における様々な欠陥が、ネガティブ選択の通常プロセスに波及して、自己反応性のＴ細胞を、その後の環境因子によって自己免疫疾患が容易に発症しやすい末梢部へと放出することとなる(Yoshitomi H, Sakaguchi N, Kobayashi K et al.: A role for fungal [beta]-glucans and their receptor Dectin-1 in the induction of autoimmune arthritis in genetically susceptible mice. J. Exp. Med. (2005) 201(6):949-960). 一般的に、胸腺で未だ発現されていないウィルスの自己抗原や改変された自己抗原は、自己免疫を開始するために、末梢DCによって供給される。 幾つかの改変された自己抗原が、ヒトの自己免疫疾患において認められている。

樹状細胞
DCが、免疫系における重要な意思決定細胞であるとの提唱がされている(Fazekas de St Groth B. The evolution of self-tolerance: a new cell arises to meet the challenge of self-reactivity. Immunol Today. 1998;19:448-54)。 中枢寛容および末梢寛容の発生、ならびに、免疫応答の開始、それに、メモリーＴ細胞とエフェクターＴ細胞の刺激での役割を通じて、DCは、自己免疫と自己免疫疾患の開始と継続の双方において欠かせない役割を果たしていると考えられている。 しかしながら、末梢寛容へのDCの関与が明らかになるにつれて、自己免疫疾患および移植での抗原特異的免疫療法において、それらを利用することが考えらるようになってきた。

目下のところ、DCは、免疫系の先天的および後天的アームの双方に関する必須のレギュレーターとして認識されている(Banchereau J, Steinman RM. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 1998 Mar 19;392(6673):245-52)。 それらは、ナイーブTリンパ球の刺激に対して反応し、その性質は、その他のすべての抗原供給細胞(APC)での性質から一線を画している。 また、DCは、第一抗体反応の励起において必須のアクセサリー細胞であり(Inaba K, Steinman RM, Van Voorhis WC, Muramatsu S. Dendritic cells are critical accessory cells for thymus-dependent antibody responses in mouse and in man. Proc Natl Acad Sci USA. 1983 Oct;80(19):6041-5)、また、NK細胞の細胞障害の強力なエンハンサーでもある(Kitamura H, Iwakabe K, Yahata T, Nishimura S, Ohta A, Ohmi Y, et al. The natural killer T (NKT) cell ligand alpha-galactosylceramide demonstrates its immunopotentiating effect by inducing interleukin (IL)-12 production by dendritic cells and IL-12 receptor expression on NKT cells. J Exp Med. 1999 Apr 5;189(7):1121-8)。 DCは、ヘルパーＴリンパ球および細胞障害性Ｔリンパ球の双方に関する第一免疫応答の開始において重要であり、それ故に、「天然アジュバント」として機能する(Schuler G, Steinman RM. Dendritic cells as adjuvants for immune-mediated resistance to tumors. J Exp Med. 1997 Oct 20; 186(8):1183-7)。 逆に言えば、DCは、抗原に対する寛容の維持にも関わっていると言える。 DCは、Ｔ細胞に抗原を供給し、次いで、強力な自己反応性を示すこれらＴ細胞を除外することによって、胸腺中枢寛容とＴ細胞の形成に寄与する(Brocker T. Survival of mature CD4 T lymphocytes is dependent on major histocompatibility complex class II-expressing dendritic cells. J Exp Med. 1997 Oct 20;186(8):1223-32)。 しかしながら、DCは、末梢寛容においても役割を果たす。 DCは、自己反応性リンパ球の除外と、調節Ｔ細胞(Treg)集団の増大によって寄与する。 したがって、DCは、自己免疫疾患での寛容性の回復のための保護的手法および治療的手法において極めて有用である。

骨髄由来のDC前駆体は、未発達DCが滞留している末梢組織に向かう血流を介して移動する。 未発達DCは、侵襲性病原体やその他の粒状物、それに、可溶性抗原(Ag)を効率的に捕捉する。 Agを捕捉すると、DCは、迅速にリンパ管の内皮を横断して、排液のための第二リンパ器官へと移動する。 免疫原性Agの取得とリンパ管内の移動の後に、DCを成熟させるためのプロセス、すなわち、Agを捕捉する能力をダウンレギュレーションし、Agの生成と供給をアップレギュレーションし、共刺激分子を発現する能力を付与し、そして、改変した樹状形態を具備せしめるためのプロセスに付す(Steinman RM. The dendritic cell system and its role in immunogenicity. Annu Rev Immunol. 1991;9:271-96; Cella M, Sallusto F, Lanzavecchia A. Origin, maturation and antigen presenting function of dendritic cells. Curr Opin Immunol. 1997 Feb;9(l):10-6; Cella M, Scheidegger D, Palmer-Lehmann K, Lane P, Lanzavecchia A, Alber G. Ligation of CD40 on dendritic cells triggers production of high levels of interleukin-12 and enhances T cells stimulatory capacity: T-T help via APC activation. J Exp Med. 1996 Aug l;184(2):747-52)。 第二リンパ器官のＴ細胞領域でのナイーブＴ細胞に対してAgを供給してから、大半のDCは、おそらくはアポトーシスによって消失する。 よって、至適条件下では、同じDCは、Agの捕捉と修飾、AgによるナイーブAgに特異的である希少なＴ細胞の放出、それに、Ag特異的Ｔ細胞クローンの増殖の誘発などの独特の機能を連続的に奏する。

Agの修飾と放出、それに、免疫反応の調節におけるDCの重大な役割を考慮すると、応答リンパ球とその他のアクセサリー細胞との相互作用は示すものの、DCは、免疫反応における重要な管理体であると言える。 一般的に、安定条件下では、組織内へのDC前駆体の取り込みと、第二のリンパ器官への移動／成熟は、低頻度でしか発生せず、そして、好ましい寛容が誘発されるであろう、とのことが示唆されている。 他方で、未発達DCを刺激することで、DCが成熟し、その活性化によって、生産的免疫応答が誘発される(Sallusto F, Lanzavecchia A. Mobilizing dendtiric cells for tolerance, priming, and chronic inflammation. J Exp Med. 1999 Feb 15;189(4):611-4)。

DCの成熟プロセスは、病原体誘導分子(LPS、DNA、RNA)、前炎症性サイトカイン(TNFα、IL-l、IL-6)、ヒアルロン断片のような組織因子、炎症組織とリンパ管との間の内皮を横断するDCの移動、それに、Ｔ細胞誘導シグナル(CD 154)などの様々なメカニズムによって刺激することができる(Sparwasser T, Koch ES, Vabulas RM, Heeg K, Lipford GB, Ellwart JW, et al. Bacterial DNA and immunostimulatory CpG oligonucleotides trigger maturation and activation of murine dendtiric cells. Eur J Immunol. 1998 Jun;28(6):2045-54; Cella M, Salio M, Sakakibara Y, Langen H, Julkunen I, Lanzavecchia A. Maturation, Activation, and protection of dendtiric cells induced by double-stranded RNA. J Exp Med. 1999 Mar 1;189(5): 821-9; De Smedt T, Pajak B, Muraille E, Lespagnard L, Heinen E, De Baetselier P, et al. Regulation of dendritic cell numbers and maturation by lipopolysaccharide in vivo. J Exp Med. 1996 Oct l;l84(4):1413-24)。 これに対して、IL-10、TGFβ、プロスタグランジン、および、コルチコステロイドのような抗炎症性シグナルは、成熟を阻害する傾向にある(De Smedt T, Van Mechelen M, De Becker G, Urbain J, Leo O, Moser M. Effect of interleukin-10 on dendritic cell maturation and function. Eur J Immunol. 1997 May;27(5): 1229-35; Geissmann F, Revy P, Regnault A, Lepelletier Y, Dy M, Brousse N, et al. TGF-beta 1 prevents the noncognate maturation of human dendritic Langerhans cells. J Immunol. 1999 Apr 15;162(8):4567-75; de Jong EC, Vieira PL, Kalinski P, Kapsenberg ML. Corticosteroids inhibit the production of inflammatory mediators in immature monocyte-derived DC and induce the development of tolerogenic DC3. J Leukoc Biol. 1999 Aug;66(2):201-4)。 このように、疾患を調節する免疫を増進または減退する上で、DCは、望ましい治療標的であると言える。 目下のところ、DCのex vivo調節と、動物またはヒトへの移植を行う以前の抗原への暴露が、保護的免疫および治療的免疫を達成するための主要な手法であった。 このことは、免疫系に障害を抱えるすべてのヒトでのDC系の複雑度、それに、特異的なAgや免疫モジュレーターをin vivoでDCに送達することの困難性が関係している。

DC機能の調節におけるNF-κBの役割
免疫または寛容を誘発する骨髄DCの性質は、その成熟段階と、それに、そのNF-κB活性とも関連している(Dhodapkar MV, Steinman RM, Krasovsky J, Munz C, Bhardwaj N. antigen-specific inhibition of effector T cell function in humans after injection of immature dendritic cells. J Exp Med. 2001 Jan 15;193(2):233-8; Jonuleit H, Schmitt E, Schuler G, Knop J, Enk AH. Induction of interleukin-producing, nonproliferating CD4(+) T cells with regulatory properties by repetitive stimulation with allogeneic immature human dendritic cells. J Exp Med. 2000 Nov 6;192(9):1213-22; Lutz MB, Kukutsch NA, Menges M, Rossner S, Schuler G. Culture of bone marrow cells in GM-CSF plus high doses of lipopolysaccharide generates exclusively immature dendritic cells which induce alloantigen-specific CD4 T cell anergy in vitro. Eur J Immunol. 2000 Apr;30(4): 1048-52: Mehling A, Grabbe S, Voskort M, Schwarz T, Luger TA, Beissert S. Mycophenolate mofetil impairs the maturation and function of murine dendritic cells. J Immunol. 2000 Sep 1;165(5):2374-81)。 マウスBMに由来する未発達DCは、in vitroで反応性を示さず、かつ、心臓移植者の生存を持続するＴ細胞を誘発する(Lutz MB, Suri RM, Niimi M, Ogilvie AL, Kukutsch NA, Rossner S, et al. Immature dendritic cells generated with low doses of GM-CSF in the absence of IL-4 are maturation resistant and prolong allograft survival in vivo. Eur J Immunol. 2000 Jul;30(7):1813-22)。 様々な薬剤およびサイトカイン、それに、NF-κBの阻害剤、例えば、コルチコステロイド、サリチル酸塩、ミコフェノール酸モフェチル、形質転換成長因子(TGF)-β、IL-10などは、骨髄 DCの成熟を阻害する(de Jong EC, Vieira PL, Kalinski P, Kapsenberg ML. Corticosteroids inhibit the production of inflammatory mediators in immature monocyte-derived DC and induce the development of tolerogenic DC3. J Leukoc Biol. 1999 Aug;66(2):201-4; Griffin MD, Lutz W, Phan VA, Bachman LA, McKean DJ, Kumar R. Dendritic cell modulation by lalpha,25 dihydroxyvitamin D3 and its analogs: a vitamin D receptor-dependent pathway that promotes a persistent state of immaturity in vitro and in vivo. 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Effective antigen presentation by dendritic cells is NF-kappaB dependent: coordinate regulation of MHC, co-stimulatory molecules and cytokines Int Immunol. 2001 May;13(5):675-83)。 これら薬剤の存在下で生成したDCは、in vitro およびin vivoで、移植物の生存を促すＴ細胞の機能を改変する(Giannoukakis N, Bonham CA, Qian S, Zhou Z, Peng L, Harnaha J, et al. Prolongation of cardiac allograft survival using dendritic cells treated with NF-κB decoy oligodeoxyribonucleotides. MoI Ther. 2000;l(5 Pt l):430-7; Griffin MD, Lutz W, Phan VA, Bachman LA, McKean DJ, Kumar R. Dendritic cell modulation by lalpha,25 dihydroxyvitamin D3 and its analogs: a vitamin D receptor-dependent pathway that promotes a persistent state of immaturity in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci USA. 2001;98(12):6800-5; Rea D, van Kooten C, van Meijgaarden KE, Ottenhoff TH, Melief CJ, Offringa R. Glucocorticoids transform CD40-triggering of dendritic cells into an alternative activation pathway resulting in antigen-presenting cells that secrete IL-10. 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Antigen-specific suppression of a primed immune response by dendritic cells mediated by regulatory T cells secreting interleukin-10. Immunity. 2003 Jan;18(l):155-67)。

寛容のための樹状細胞の使用
ヒトおよび齧歯動物に関する証明の積み上げによって、未発達のDCまたはNF-κBを欠損したDCが、調節Ｔ細胞の分化を誘発することで、末梢寛容を調節することが示唆されている(Dhodapkar MV, Steinman RM, Krasovsky J, Munz C, Bhardwaj N. antigen-specific inhibition of effector T cell function in humans after injection of immature dendritic cells. J Exp Med. 2001 Jan 15;193(2):233-8; Jonuleit H, Schmitt E, Schuler G, Knop J, Enk AH. Induction of interleukin-producing, nonproliterating CD4(+) Tcells with regulatory properties by repetitive stimulation with allogeneic immature human dendritic cells. J Exp Med. 2000 Nov 6;192(9):1213-22; Martin E, O'Sullivan B, Low P, Thomas R. antigen-specific suppression of a primed immune response by dendritic cells mediated by regulatory T cells secreting interleukin-10. Immunity. 2003 Jan;18(l):155-67; Roncarolo MG, Levings MK, C. Differentiation of T regulatory cells by immature dendritic cells. J Exp Med. 2001 Jan 15;193(2):F5-9)。 よって、未発達の単核細胞由来の樹状細胞を用いて、in vitroで、同種性のヒトＴ細胞を反復して刺激することで、非増殖性の抑制的なインターロイキン-10(IL-lO)を生産するTregの生成に至る(Jonuleit H, Schmitt E, Schuler G, Knop J, Enk AH. Induction of interleukin 10-producing, nonproliferating CD4(+) T cells with regulatory properties by repetitive stimulation with allogeneic immature human dendritic cells. J Exp Med. 2000 Nov 6;192(9):1213-22)。 Dhodapkarらは、二名のボランティアの皮下に、自己単核細胞由来の未発達DCを注射し、インフルエンザマトリックスペプチドとカサガイヘモシアニンを適用している。 彼らは、CD8₊ T-細胞殺傷活性のAg特異的阻害と、インターフェロン(IFN)-γ-産生Ｔ細胞の細胞数の減少に伴って、ペプチド特異的IL-10産生Ｔ細胞が出現することを報告している(Dhodapkar MV, Steinman RM, Krasovsky J, Munz C, Bhardwaj N. antigen-specific inhibition of effector T cell function in humans after injection of immature dendritic cells. J Exp Med. 2001 Jan 15;193(2):233-8)。

CD40は、DCの免疫原性に関する主要決定因子である。 ReIB転写因子の阻害剤またはCD40それ自体の阻害剤は、IL-10-産生T調節細胞をin vivoで生成することができるDCを調節的に生産する(Martin E, O'Sullivan B, Low P, Thomas R. antigen-specific suppression of a primed immune respose by dendritic cells mediated by regulatory T cells secreting interleukin-10. Immunity. 2003 Jan;18(l):155-67)。 これに対して、持続的にCD40をin vivoで発現可能にDCを修飾することによって、腫瘍抗原に特異的な免疫を顕著に高めることができる(Hanks BA, Jiang J, Singh RA, Song W, Barry M, HuIs MH, et al. Re-engineered CD40 receptor enables potent pharmacological activation of dendritic-cell cancer vaccines in vivo. Nat Med. 2005 Feb; 11 (2): 130-7)。 T調節細胞によって生成されたIL-10とTGFβは、MHCクラスIIの限定発現による寛容と、DCによる共刺激分子に寄与するであろう(Jonuleit H, Schmitt E, Schuler G, Knop J, Enk AH. Induction of interleukin 10-producing, nonproliferating CD4(+) T cells with regulatory properties by repetitive stimulation with allogeneic immature human dendritic cells. J Exp Med. 2000 Nov 6; 192(9):1213-22; Roncarolo MG, Levings MR, Traversari C, Differentiation of T regulatory cells by immature dendritic cells. J Exp Med. 2001 Jan 15;193(2):F5-9)。

共刺激分子の発現の減退に伴い、調節的DCによって、ILT3およびILT4の発現は増大するであろう(Chang CC, Ciubotariu R, Manavalan JS, Yuan J, Colovai AI, Piazza F, et al. Tolerization of dendritic cells by T(S) cells: the crucial role of inhibitly receptors ILT3 and ILT4. Nat Immunol. 2002 Mar;3(3):237-43)。 NK細胞キラー阻害受容体と関係するこれらIg様阻害受容体は、CD8₊CD28_-調節Ｔ細胞との相互作用の結果として、APCによってアップレギュレートされる。 これら受容体は、免疫受容体のチロシンを利用した阻害成分(ITIMs)を介して、陰電気を帯びて、シグナルを、単核細胞とDCに送る(Colonna M, Nakajima H, Cella M. A family of inhibitory and activating Ig-like receptors that modulate function of lympho and myeloid cells. Semin Immunol. 2000;12(2):121-7; Colonna M, Navarro F, Bellon T, Llano M, Garcia P, Samaridis J, et al. A common inhibitory receptor for major histocompatibility complex class I molecules on human lymphoid and myelomonocytic cells. J Exp Med. 1997;186(11):1809-18; Colonna M, Samaridis J, Cella M, Angman L, Allen RL, O'Callaghan CA, et al. Human myelomonocytic cells express an inhibitory receptor for classical and nonclassical MHC class I molecules. J Immunol. 1998;160(7):3096-100)。 APCによるCD4₊ Ｔ細胞が誘発するNFKBの活性化は、おそらくは、このシグナル経路を介して、CD8₊CD28_-Ｔ細胞の存在下で減退する(Chang CC, Ciubotariu R, Manavalan JS, Yuan J, Colovai AI, Piazza F, et al. Tolerization of dendritic cells by T(S) cells: the crucial role of inhibitory receptors ILT3 and ILT4. Nat Immunol. 2002;3(3):237-43)。

IL-10は、DCによる調節Ｔ細胞の生成に関与する重要なサイトカインである。 IL-10によってDCを処理すると、NF-κBを抑制して、未発達DCを調節DCに変換し、そして、成熟過程を停止することができる。 この作用は、in vitroおよびin vivoで、１型T調節細胞を供給するIL-10の分化を駆動する(Steinbrink K, Wolfl M, Jonuleit H, Knop J, Enk AH. Induction of tolerance by IL-10-treated dendritic cells. J Immunol. 1997 Nov 15;159(10):4772-80; Steinbrink K, Jonuleit H, Muller G, Schuler G, Knop J, Enk AH. interleukin-10-treated human dendritic cells induce a melanoma-antgen-specific anergy in CD8(+) T cells resulting in a failure to lyse tumor cells. Blood. 1999 Mar 1;93(5): 1634-42; Liu L, Rich BE, Inobe J, Chen W, Weiner HL. Induction of Th2 cell differentation in the primary immune response: dendritic cells isolated from adheren T cell culture treated with IL-1O prime naive CD4₊ T cells to secrete IL-4. Int Immunol. 1998 Aug;10(8):1017-26)。 IL-1Oに曝されたヒトのDCは、DCを免疫調節的状態に同様にして変換することによって、CD4₊ Ｔ細胞およびCD8+ Ｔ細胞において、抗原特異的アネルギーの状態を誘発する(104)。 IL-10は、IL-12の生成、それに、調節DCをもたらすDCによる共刺激的分子発現を阻害する(Kalinski P, Hilkens CM, Wierenga EA, Kapsenberg ML. T-cell priming by type-1 and type-2 polarized dendritic cells: the concept of a third signal. Immunol Today. 1999 Dec;20(12):561-7).
末梢寛容を誘発するために、in situでDCを操作することも可能であった。 例えば、DCの生育を促す成長因子であるFlt3Lは、口腔寛容の誘発をin vivoで高めている (Viney JL, Mowat AM, O'Malley JM, Williamson E, Fanger NA. Expanding dendritic cells in vivo enhances the induction of oral tolerance. J Immunol. 1998 Jun 15;160(12):5815-25)。 これに対して、Flt-3Lで処置を行ったところ、Th1応答の亢進に起因して実験で認められた自己免疫甲状腺炎の重篤度が高まったが、その一方で、GM-CSFの場合は、Th2応答の亢進に起因して、後期段階に至ってもなお、その疾患は予防または顕著に抑制されていた(Vasu C, Dogan RN, Holterman MJ, Prabhakar BS. Selective induction of dendritic cells using granulocyte macrophage-colony stimulating factor, but not fms-like tyrosine kinase receptor 3-ligand, activates thyloglobulin-specific CD4₊/CD25₊ T cells and suppresses experimental autoimmune thyroiditis. J Immunol. 2003 Jun l;170(l 1):5511-22)。

前述したようにして修飾されたDC、または、様々なDCの投与経路のいずれかを用いて、寛容を誘発するための幾つかの手法が開発されている。 例えば、抗原を加えた脾臓のDCまたは表皮性ランゲルハンス細胞の皮下(sc)注射は、抗原特異的免疫を誘発したのに対して、同じ調製物を静脈(iv)注射したところ寛容に至っている(Morikawa Y, Furotani M, Kuribayashi K, Matsuura N, Kakudo K. The role of antigen-presenting cells in the regulation of delayed-type hypersensitivity. I. Spleen dendritic cells. Immunology. 1992 Sep;77(l):81-7; Morikawa Y, Furotani M, Matsuura N, Kakudo K. The role of antigen-presenting cells in the regulation of delayed-type hypersensitivity. II. Epidermal Langerhans' cells and peritoneal exudate macrophage. Cell Immunol. 1993 Nov;152(l):200-10)。 自己免疫疾患に対する特別な手法として、調節DCを用いた調節Ｔ細胞の調製、または、IL-10、TGFβ、Fas-リガンド、ILT3およびILT4などの免疫抑制機能を有する分子を誘発するためのDCの遺伝子工学的加工などがある。 自己免疫炎症疾患などを抑制するDCの性質は、後に詳述するような自己免疫疾患モデルにDCを適用することで明らかとなる。 自己抗原に対する暴露の有無に関わらず、相乗性DCは、実験モデルのアレルギー性脳脊髄炎(EAE)などの神経筋系自己免疫疾患、I型糖尿病などの自己免疫性内分泌障害、それに、コラーゲン誘発性関節炎などの自己免疫性関節炎モデルの進展を阻害することが示されている。

TGFβにin vitroで暴露した後に、健康な共通遺伝子のドナーラットから得た脾臓由来のDCを、EAEを発症していた被移植者を抑制するために移植することができた。 これに対して、TGFβに暴露され、かつEAEを発症していたドナーラットから得たDCは、移植を行っても何も効果が認められなかった。 EAEの初期段階において、ルイスマウスを、脳炎誘発性ミエリン塩基性タンパク質ペプチド68-86(MBP68-86)と完全フロイントアジュバント(CFA)とで免疫処置を行って５日後に、DCを投与した(Huang YM, Yang JS, Xu LY, Link H, Xiao BG. Autoantigen-pulsed dendritic cells induce tolerance to experimental allergic encephalomyelitis (EAE) in Lewis rats. Clin Exp Immunol. 2000 Dec;122(3):437-44)。 未発達で、リポ多糖類(LPS)で処理もされていない骨髄(BM)由来のDCを、免疫処置を行う以前に、Sc注射しても、EAEを予防できた(Xiao BG, Huang YM, Yang JS, Xu LY, Link H. bone marrow-derived dendritic cells from experimental allergic encephalomyelitis induce immune tolerance to EAE in Lewis rats. Clin Exp Immunol. 2001 Aug;125(2):300-9)。 TGFβで修飾したDCも、同様に、自己免疫重症筋無力症の初期段階で投与することで、ルイスラットを用いた実験自己免疫EAMGの臨床徴候の進展を阻害した(Yarilin D, Duan R, Huang YM, Xiao BG. dendritic cells exposed in vitro to TGF-betal ameliorate experimental autoimmune myasthenia gravis. Clin Exp Immunol. 2002 Feb;127(2):214-9)。

眼科系自己免疫疾患において、ペプチドを有する未発達のDCは、ブドウ膜炎Ｔ細胞によるIFN-γの生成を阻害し、それ故、in vivoでの実験自己免疫ブドウ膜網膜炎(EAU)の誘発をも阻害した(Jiang HR, Muckersie E, Robertson M, Forrester JV. antigen-specific inhibition of experimental autoimmune uveoretinitis by bone marrow-derived immature dendritic cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2003 Apr;44(4): 1598-607)。 リンパ節Ｔ細胞を排除することで、IL-10とIL-15が高レベルで分泌された。 その他のモデルでは、光受容体間網膜結合タンパク質を用いたTGFβ²で処理したAPCを、光受容体間網膜結合タンパク質で免疫処置したマウスへ移動することで、マウスでのブドウ膜網膜炎の誘発は、効果的に抑制された(Okamoto S, Kosiewicz M, Caspi R, Streilein J. ACAID as a potential therapy for establishmental autoimmune uveitis. In Science E, editor. Advances in Ocular Immunology. Amsterdam; 1994)。

ミエリン抗原を有する脾臓細胞が、 脳炎誘発性Ｔ細胞においてアネルギーの選択的誘発によってEAEを誘発することが示された(Vandenbark AA, Celnik B, Vainiene M, Miller SD, Offner H. Myelin antigen-coupled splenocytes suppress experimental autoimmune encephalomyelitis in Lewis rats through a partially reversible anergy mechanism. J Immunol. 1995 Dec 15;155(12):5861-7)。 TGFb2およびMBP Agに対する曝露によって生成した調節APCは、EAEを抑制するCD8₊ Tregの生成を促した(Faunce DE, Terajewicz A, Stein-Streilein J. Cutting edge: in vitro-generated tolerogenic APC induce CD8+ T regulatory cells that can suppress ongoing experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 2004 Feb 15; 172(4): 1991-5)。 これら結果は、DCが、Ｔ細胞に応答する効果を介して実験自己免疫疾患において寛容を誘発することができる証拠を指し示すものである。 また別の方法にあっては、MBPおよびCTLA-4-Ig融合タンパク質に対してex vivoで曝露した脾臓のDCをiv注射することで、おそらくは、CD28-CD80相互作用のex vivo遮断が故に、EAEが予防できている(Khoury SJ, Gallon L, Verburg RR, Chandraker A, Peach R, Linsley PS, et al. Ex vivo treatment of antigen-presenting cells with CTLA4Ig and encephalitogenic peptide prevents experimental autoimmune encephalomyelitis in the Lewis rat. J Immunol. 1996 Oct 15;157(8):3700-5)。

幾つかのモデルにおいて、腫瘍壊死因子TNF-αに対してin vitroで曝露して調製した所謂「半成熟」DCを反復して静脈投与すると、Ag特異的な保護作用が誘発された。 TNF-α-DCが、MHCおよびＴ細胞の共刺激分子を高レベルで発現することは知られているものの、成熟DCとは違って、前炎症性サイトカインは低レベルでしか生成せず、また、IL-12p70は分泌しなかった。 これらDCは、自己抗原特異的IL-10を分泌するCD4 Ｔ細胞の生成を介してEAEを抑制するものであり(Menges M, Rossner S, Voigtlander C, Schindler H, Kukutsch NA, Bogdan C, et al. Repetitive injections of dendritic cells matured with tumor necrosis factor alpha induce antigen-specific protection of mice from autoimmunity. J Exp Med. 2002 Jan 7;195(1):15-21)、おそらくは、共刺激性「シグナル３」の発現欠如によるものだと思われる(Thomas R. Signal 3 and its role in autoimmunity. Arthritis Res Ther. 2004;6:26-7)。 最後に、TGF-P¹またはIFN-γに対して曝露されたDCは、未処理DCまたは生理食塩水を注射した動物と比較して、EAEの発症と再発が抑制されていた(Xiao BG, Wu XC, Yang JS, Xu LY, Liu X, Huang YM, et al. Therapeutic potential of IFN-gamma-modified dendritic cells in acute and chronic experimental allergic encephalomyelitis. Int Immunol. 2004 Jan;16(l):13-22)。

糖尿病のNODマウスモデルにおいて、IFN-γで処理したDCを移植することで、I型糖尿病メリタスに対する持続性の保護作用も誘発される(Shinomiya M, Fazle Akbar SM, Shinomiya H, Onji M. Transfer of dendritic cells (DC) ex vivo stimulated with interferon-gamma (IFN-gamrna) down-modulates autoimmune diabetes in non-obese diabetic (NOD) mice. Clin Exp Immunol. 1999 Jul;117(l):38-43)。 膵臓リンパ節DCも、NODマウスの調節細胞を誘発することで、糖尿病の進行を抑制した(Clare-Salzler MJ, Brooks J, Chai A, Van Herle K, Anderson C. Prevention of diabetes in nonobese diabetic mice by dendritic cell transfer. J Clin Invest. 1992 Sep;90(3):741-8)。 他の実験では、ヒトIgGに対して曝露された血糖症NODマウス由来の脾臓DCの共通遺伝子を一回だけiv注射することで、マウスを糖尿病から回避できた。 糖尿病の対照マウスと比較して、高レベルのIL-4とIL-10を含み、かつIFN-γをほとんど有していないこれらマウス由来の島の上清は、この疾患に対して２型サイトカインが示す好ましい効果を示唆している(Papaccio G, Nicoletti F, Pisanti FA, Bendtzen K, Galdieri M. Prevention of spontaneous autoimmune diabetes in NOD mice by transferring in vitro antigen-pulsed syngeneic dendritic cells. Endocrinology. 2000 Apr;141(4):1500-5)。

成熟したBM由来のDCも、Th2サイトカインを分泌するNODマウスにおいて糖尿病の進行を妨げることができ、この効果は、CD25₊CD4₊調節Ｔ細胞の生成に起因するものと考えられる(Feili-Hariri M, Dong X, Alber SM, Watkins SC, Salter RD, Morel PA. Immunotherapy of NOD mice with bone marrow-derived dendritic cells. Diabetes. 1999 Dec;48(12):2300-8)。 NF-κB阻害剤オリゴジヌクレオチドまたは可溶性NF-κB 阻害剤Bayl1-7082の存在下で生成したBM由来のDCも、糖尿病の進行を妨げた(Ma L, Qian S, Liang X, Wang L, Woodward JE, Giannoukakis N, et al. Prevention of diabetes in NOD mice by administration of dendritic cells deficient in nuclear transcription factor-kappaB activity. Diabetes. 2003 Aug;52(8):1976-85)。 しかしながら、移植したDCが、NODマウスで発症したI型糖尿病を緩和できる旨を実証する研究は未だなされていない。

実験自己免疫甲状腺炎(EAT)、すなわち、ヒトのハシモト甲状腺炎のマウスモデルが、チログロブリンとアジュバントで処置した感受性動物を用いた試験で誘発することができた(Charreire J. Immune mechanisms in autoimmune thyroiditis. Adv Immunol. 1989;46:263-334)。 この疾患は、CD4⁺ Ｔ細胞によって媒介されており、また、甲状腺のリンパ球浸潤を特徴としている(Weetman AP, McGregor AM. Autoimmune thyroid disease: further developments in our understanding. Endocr Rev. 1994 Dec;15(6):788-830)。 TNFαおよびAgに対して曝露されたDCは、EATの進行を阻害するAg特異的なCD4₊CD25₊ Ｔ細胞を誘発し、その結果は、EAEモデルに関して先に発行された文献で確認されている(Verginis P, Li HS, Carayanniotis G. Tolerogenic semimature dendritic cells suppress experimental autoimmune thyroiditis by activation of thyroglobulin-specific CD4₊CD25₊ T cells. J Immunol. 2005 Jun l;174(ll):7433-9)。

実験関節炎に関する幾つかの研究によって、様々な免疫調節遺伝子を形質導入したDCの治療効果が評価されている。 TNF関連アポトーシス誘発リガンド(TRAIL)を有するDCの形質導入は、コラーゲンで誘発した関節炎(CIA)を患ったマウスにおいて評価した。 TRAIL発現は、ドキシサイクリンを誘発可能なテトラサイクリン応答要素によって調節されていた。 形質転換したDCは、関節炎を招くＴ細胞のアポトーシスを誘発することができた(Liu Z, Xu X, Hsu HC, Tousson A, Yang PA, Wu Q, et al. CII-DC-AdTRAIL cell gene therapy inhibits infiltration of CII-reactive T cells and CII-induced arthritis. J Clin Invest. 2003 Nov;112(9):1332-41)。 Fas-Lを発現するための初期DCの遺伝子修飾によって、CIAの進行に関与する抗原特異的Ｔ細胞は解消し、あるいは、その細胞数が減少した(Kim SH, Kim S, Oligino TJ, Robbins PD. Effective treatment of established mouse collagen-induced arthritis by systemic administration of dendritic cells genetically modified to express FasL. MoI Ther. 2002 Nov;6(5):584-90)。 さらに、Fas-Lで形質変換したDCは、予め感作させた細胞にペプチドを曝露した後に、抗原特異的な寛容を誘発することができた。 この現象は、修飾したDCを用いた細胞から自己反応性Ｔ細胞を削除することも可能であることを指し示すものである(Matsue H, Matsue K, Walters M, Okumura K, Yagita H, Takashima A. Induction of antigen-specific immunosuppression by CD95L cDNA-transfected 'killer' dendritic cells. Nat Med. 1999 Aug;5(8):930-7)。

アデノウィルス感染した後にIL-4を発現する未発達DCを、CIAを発症したマウスに導入したところ、４週間にわたって疾患は抑制された(Kim SH, Kim S, Evans CH, Ghivizzani SC, Oligino T, Robbins PD. Effective treatment of established murine collagen-induced arthritis by systemic administration of dendritic cells genetically modified to express IL-4. J Immunol. 2001 Mar l;166(5):3499-505)。 同様に、IL-4を形質導入した骨髄由来のDCを、疾患が発症する以前に導入したところ、マウスCIAの発生率と重篤度は改善されたものの、レトロウィルスを形質導入したＴ細胞およびNIH 3T3細胞を用いたIL-4の送達では効果が認められなかった(Morita Y, Yang J, Gupta R, Shimizu K, Shelden EA, Endres J, et al. dendritic cells genetically engineered to express IL-4 inhibit murine collagen-induced arthritis. J Clin Invest. 2001 May; 107(10): 1275-84)。 これらの各方法は、Thl媒介Ｔ細胞と抗体反応を抑制するが、通常、これらは、Th2型または調節応答に免疫応答を振り向けることはない。 これに対して、血管作用性腸内ペプチド(VIP)の存在下で生成したDCは、IL-10依存的にCIAを抑制した(Chorny A, Gonzalez-Rey E, Fernandez-Martin A, Ganea D, Delgado M. vasoactive intestinal peptide induces regulatory dendritic cells that can prevent acute graft-versus-host disease while maintain graft-versus-tumor. Blood. 2006 Jan 17)。 TNF-DCを高用量でi.v.供給した時、特に、IL-10依存的に供給した時に、TNF-DCも、CIPを抑制した(Verginis P, Li HS, Carayanniotis G. Tolerogenic semimature dendritic cells suppress experimental autoimmune thyroiditis by activation of thyroglobulin-specific CD4₊CD25₊ T cells. J Immunol. 2005 Jun l;174(ll):7433-9)。 TNF-DCおよびVIP-DCの双方が、CD4₊CD25₊調節Ｔ細胞とTrI型Tregの末梢変換を刺激する。 VIPが、DCのNF-κB活性化とCD40発現の減退を招くことが知られている(Chorny A, Gonzalez-Rey E, Fernandez-Martin A, Ganea D, Delgado M. Vasoactive intestinal peptide induces regulatory dendritic cells that can prevent acute graft-versus-host disease while maintain graft-versus-tumor. Blood. 2006 Jan 17)。 DC免疫療法は臨床現場に導入されており、そして、癌患者、特に、DCが好適に活性化できる患者において、好適であり、毒性もなく、また、効果的であることが実証されている(Banchereau J, Palucka AK, Dhodapkar M, Burkeholder S, Taquet N, Rolland A, et al. Immune and clinical responses in patients with metastatic melanoma to CD34₍₊₎ progenitor-derived dendritic cell vaccine. Cancer Res. 2001 Sep l;61(17):6451-8; Nestle FO, Banchereau J, Hart D. dendritic cells: On the move from bench to bedside. Nat Med. 2001 Jul;7(7):761-5; Dhodapkar MV, Krasovsky J, Steinman RM, Bhardwaj N. Mature dendritic cells boost functionally superior CD8" T-cell in humans without foreign helper epitopes. J Clin Invest. 2000 Mar;105(6):R9-R14)。 In vivoでのDCの活性化およびDCの標的化、ならびに、自己免疫を抑制するためのDCの活用によって、DCの適用範囲は、様々な免疫媒介疾患へと拡大することとなる。 しかしながら、自己免疫療法を行うにあたっては、投与頻度と投与経路、使用するDCの種類と数量、そして、サイトカインの濃度と治療期間などの幾つかの技術的課題を解決していかなければならない。 例えば、NF-κB 阻害剤で処理された0.5×10₆個のDCの単一iv用量または単一sc用量は、関節炎の発症または抗原が誘発した関節炎を抑制する上で十分量であるが、TNF処理したDCでは、高用量で、繰り返しiv投与する必要がある。

ヒトのDCに関するデータは落胆する内容であるが、ある研究結果は、希望のもてる内容であった。 ヒトのin vitroモデルシステムを用いて、同種特異的CD8₊CD28_" T抑制細胞またはCD4₊CD25₊ Tregに曝露された未発達DCは、阻害分子ILT3および4の表面発現の増大を示した(Chang CC, Ciubotariu R, Manavalan JS, Yuan J, Colovai AI, Piazza F, et al. Tolerization of dendritic cells by T(S) cells: the crucial role of inhibitory receptors ILT3 and ILT4. Nat Immunol. 2002 Mar;3(3):237-43)。 これらのヒトの調節DCは、未駆動または駆動Tヘルパー細胞において可逆的アネルギーを誘発して、同種反応性CD4₊ Ｔ細胞からTregへの変換を促す。 ヒトの血液CD4₊CD123₊CD1 Ic_" 前駆体DCは、IL-3の存在下で培養を行った時に生成することができる(Grouard G, Rissoan MC, Filgueira L, Durand I, Banchereau J, Liu YJ. The enigmatic plasmacytoid T cells develop into dendritic cells with interleukin (IL)-3 and CD40-ligand. J Exp Med. 1997 Mar 17; 185(6): 1101-11; Rissoan MC, Soumelis V, Kadowaki N, Grouard G, Briere F, de Waal Malefyt R, et al. Reciprocal control of T helper cell and dendritic cell differentation. Science. 1999 Feb 19;283(5405):l 183-6; Arpinati M, Green CL, Heimfeld S, Heuser JE, Anasetti C. Granulocyte-colony stimulating factor mobilizes T helper 2-inducing dendritic cells. Blood. 2000 Apr 15;95(8):2484-90)。

TNF-αによってin vitroでの活性化を行った後に、これらのDCは、Ｔ細胞によるIL-4およびIL-10の生成を促した(Rissoan MC, Soumelis V, Kadowaki N, Grouard G, Briere F, de Waal Malefyt R, et al. Reciprocal control of T helper cell and dendritic cell differentation. Science. 1999 Feb 19;283(5405):l 183-6)。 このようなDCは、自己免疫疾患や急性対宿主性移植片病の治療において有用である(Liu YJ, Blom B. Introduction: TH2-inducing DC2 for immunotherapy. Blood. 2000 Apr 15;95(8):2482-3)。

IFN-βに曝露されたPB単核細胞由来のDCは、高レベルのIL-10と低レベルのIL-12を分泌し、また、単核細胞によるIFN-γ生産を抑制する(Huang YM, Hussien Y, Yarilin D, Xiao BG, Liu YJ, Link H. Interferon-beta induces the development of type 2 dendritic cells. Cytokine. 2001 Mar 7;13(5):264-71)。 IFN-βでin vivo治療を受けたMS患者由来のDCでのIFN-γおよびTNF-αの生産は、対照患者由来のDCよりも少なかった(Huang YM, Xiao BG, Ozenci V, Kouwenhoven M, Teleshova N, Fredrikson S, et al. Multiple sclerosis is associated with high levels of circulating dendritic cells secreting pro-inflammatory cytokines. J Neuroimmunol. 1999 Sep l;99(l):82-90)。 これら知見は、IFN-βおよびIL-10にDCを曝露することで、前炎症性サイトカインの生成が調節され、そして、再融合を行って得られたそれらDCは、MSの治療に向けた利用が約束されている、ことを示唆するものである。 NF-κBを介したシグナルは、in vitroにてＴ細胞の増殖を刺激するDCの性質、すなわち、NF-κB 阻害剤の存在下で生成したCD40_-ヒト単核細胞由来のDCが、Ｔ細胞の増殖またはIFN-γの生成をほとんど表示しないという性質を決定することが知られている(Thompson AG, O'Sullivan BJ, Beamish H, Thomas R. T cells signaled by NF-kappa B-dendritic cells are sensitized not anergic to subsequent activation. J Immunol. 2004 Aug l;173(3):1671-80)。

二名の健常者に関する研究によれば、抗原に曝露された未発達DCを健常者に注射したところ、抗原を復元するためのin vivo反応は抑制されていた(Dhodapkar MV, Steinman RM, Krasovsky J, Munz C, Bhardwaj N. 抗原-specific inhibition of effector T cell function in humans after injection of immature dendritic cells. J Exp Med. 2001 Jan 15;193(2):233-8)。 この効果は、調節型CD4₊およびCD8₊ Ｔ細胞の生成とIL-10の生成とに関連しており、そして、成熟DCにおいて認められる活性免疫とは明らかに一線を画している。 この小規模な研究は、免疫抑制のための手段として未発達DCを利用性を、現段階にて示唆する臨床的知見に過ぎない。 しかしながら、自然突発自己免疫疾患に進展する免疫欠陥を有する患者に対して、それらが利用可能であるかどうかは未だ不明である。

全身紅斑性狼蒼(SLE)の患者は、DC恒常性の変化が多様であり、すなわち、血中の血漿細胞DCの量は減少しており、そして、これら患者に由来するIFNα活性化単核細胞がin vitroで効果を示している(Blanco P, Palucka AK, Gill M, Pascual V, Banchereau J. Induction of dendritic cell differentation by IFN-alpha in systemic lupus erythematosus. Science. 2001 ;294(5546): 1540-3)。 単核細胞由来のDCが、アポトーシス細胞やヌクレオソームを効率的に捕捉し、そして、SLE患者の血液や組織に存在しているものと考えられる(Amoura Z, Piette JC, Chabre H, Cacoub P, Papo T, Wechsler B, et al. Circulating plasma levels of nucleosomes in patients with systemic lupus erythematosus: correlation with serum antinucleosonie antibody titers and absence of clear association with disease activity. Arthritis Rheum. 1997;40(12):2217-25)。 血清内の高レベルのIFNαとSLEでの不都合な効果を鑑みれば、IFNαは、SLEの治療に介在する有用な標的であると考えられる(Vallin H, Blomberg S, Aim GV, Cederblad B, Ronnblom L. Patients with systemic lupus erythematosus (SLE) have a circulating inducer of interferon-alpha (IFN-alpha) production acting on leucocytes resembling immature dendritic cells. Clin Exp Immunol. 1999;115(l):196-202)。 IFNαは、単核細胞や骨髄DCなどの骨髄細胞のみならず、SLE患者の皮膚の炎症部位に多く含まれる血漿細胞DCも活性化する(Farkas L, Beiske K, Lund-Johansen F, Brandtzaeg P, Jahnsen FL. Plasmacytoid dendritic cells (Natural Interferon-alpha/beta-Producing Cells) Accumulate in Cutaneous Lupus Erythematosus Lesions. Am J Pathol. 2001;159(l):237-43)。 とりわけ、最近になって、Ro 60およびSm/RNP小規模リボ核酸タンパク質自己抗原のRNA成分が、血漿細胞DC(PDC)の成熟とI型IFNの生成を刺激する内因性アジュバントとして機能することが明らかになったことは興味深い(Kelly KM, Zhuang H, Nacionales DC, Scumpia PO, Lyons R, Akaogi J, et al. "Endogenous adjuvant" activity of the RNA components of lupus autoantigens Sm/RNP and Ro 60. Arthritis Rheum. 2006 Apr 27;54(5): 1557-67; Savarese E, Chae OW, Trowitzsch S, Weber G, Kastner B, Akira S, et al. Ul small nuclear ribonucleoprotein immune complexes induce type I interferon in plasmacytoid dendritic cells through TLR7. Blood. 2006 Apr 15; 107(8):3229-34; Vollmer J, Tluk S, Schmitz C, Hamm S³ Jurk M, Forsbach A, et al. Immune stimulation mediated by autoantigen binding sites within small nuclear RNAs involves Toll-like receptors 7 and 8. J Exp Med. 2005 Dec 5;202(ll):1575-85)。 PDCによるI型IFNの生成も、Ｔ細胞とPDCでのケモカインの局所的生成を刺激する紫外線によって、皮膚LEにおいて惹起することができる。

さらに、幾つかの研究グループは、NF-κB経路の可溶性阻害剤を、それ単独で、あるいは、可溶性抗原と組み合わせてin vivoで投与することによって、自己免疫疾患、アレルギー、それに、対宿主性移植片病の治療のための寛容的DCが惹起される、との仮説を唱えている。 このような手法を例示的に開示している文献として、米国特許第7,078,027号;米国特許出願公開公報第2005/032725号、第2004/072228号、第2004/166095号、第2004/166099号、第2005/208036号、第2004/258688号、第2004/265912号、第2005/0220854号、第2005/0036993号、および、第2003/0153518号;国際公開第WO 99/29865号、第WO 00/61132号、第WO 03/000199号、第WO 2004/084927号、およびWO 2004/084942号;および、欧州特許出願公開公報第1 462 111号などがある。 しかしながら、本願発明者らに対して、これら手法の有用性を裏付ける臨床例に関する知見は開示されていない。

NF-κB阻害剤と抗原の双方が不溶性であるか、あるいは、その一方が可溶性で、他方がカプセル封入されたリポソームである場合に、これらの双方をin vivoで共投与することが、抗原に対する寛容応答を引き出す上で効果的でないという驚くべき発見が、本願発明の一部を指し示している。 しかしながら、本願発明者らは、NF-κB阻害剤と抗原の双方を含む粒子(例えば、リポソーム)を投与することで、強力な寛容応答がin vivoで認められることを知見するに至っている。 この発見は、後述するように、粒子形状物、免疫調節のための組成物、そして、好ましくない免疫応答または有害な免疫応答を処置または予防する方法として具体化している。

したがって、本願発明の一実施態様によれば、免疫応答、特に、標的抗原に対して好ましくない免疫応答または有害な免疫応答を調節する組成物が提供される。 一般的に、これら組成物は、ＮＦ-κＢ経路の阻害剤と標的抗原の少なくとも一部に対応する抗原とを含み、そして、それら阻害剤およびそれら抗原が粒子の形態となっている。 通常は、ＮＦ-κＢ経路の阻害剤と抗原は、一つ以上の粒子に含有されている。 ある実施態様によれば、ＮＦ-κＢ経路の阻害剤と抗原は、同じ粒子に含有されている。 他の実施態様によれば、ＮＦ-κＢ経路の阻害剤と抗原は、異なる粒子に含有されている。 これらの各粒子は、免疫細胞によって(例えば、飲食作用または食作用によって)捕捉できるものが望ましく、また、免疫細胞としては、抗原を放出する細胞(例えば、樹状細胞、マクロファージまたはランゲルハンス細胞)などがあるが、これらに限定されない。 ある実施態様によれば、この粒子は、マトリックス、担体、または、基質を含む。 代表的な粒子として、好適なサイズに加工されたもの、例えば、ナノ粒子や微粒子などがある。 ある実施態様によれば、この粒子は、陽イオン脂質、陰イオン脂質、非イオンおよび／または両性イオン脂質、例えば、ポリグリセリルアルキルエーテル、スフィンゴ脂質または(フォスファチジルコリンなどの)リン脂質などの脂質マトリックスや担体を含む。 この種のタイプの具体例として、リポソームの形態の粒子がある。 他の実施態様によれば、この粒子は、金属粒子(例えば、タングステン、金、プラチナ、または、イリジウム粒子)などの担体粒子を含む。 さらに他の実施態様によれば、この粒子は、重合マトリックスや担体を含み、その具体例として、生体適合性の重合粒子(例えば、ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)を用いて加工された粒子)がある。 さらに他の実施態様によれば、この粒子は、セラミック、または、無機マトリックス、あるいは、担体を含む。

好ましくは、標的抗原の少なくとも一部に対応する抗原は、アレルゲン、自己抗原、および、アロ抗原からなるグループから選択される。 この抗原は、タンパク質抗原、脂質抗原、糖脂質抗原、および、炭水化物抗原からなるグループから選択される。 ある実施態様によえば、この抗原は、非核酸の形態のもの(例えば、抗原を発現することが可能なもの)としている。

ある実施態様によれば、ＮＦ-κＢ経路の阻害剤が、ＮＦ-κＢ経路の構成要素、すなわち、BTK、LYN、BCR Igα、BCR Igβ、Syk、Blnk、PLCγ2、PKCβ、DAG、CARMAl、BCLlO、MALTl、PI3K、PIP3、AKT、p38 MAPK、ERK、COT、IKKa、IKKβ、IKKγ、NIK、RelA/p65、P105/p50、c-ReI、ReIB、p52、NIK、Leul3、CD81、CD19、CD21、および、補体および凝固カスケードでのそれらのリガンド、TRAF6、ユビキチンリガーゼ、Tab2、TAKl、NEMO、NOD2、RIP2、Lck、fyn、Zap70、LAT、GRB2、SOS、CD3ゼータ、Slp-76、GADS、ITK、PLCγl、PKCθ、ICOS、CD28、SHP2、SAP、SLAM、および、2B4からなるグループから好適に選択される構成要素の機能活性レベルを低下させる。 この種のタイプの具体例として、ＮＦ-κＢ経路の阻害剤が、RelA/p65、P105/p50、c-Rel、ReIB、または、p52の一つ以上の構成要素の機能活性レベルを低下させる。 ある実施態様によれば、ＮＦ-κＢ経路の阻害剤が、ＮＦ-κＢ経路の構成要素、すなわち、SHPl、SHIP、PIR-B、CD22、CD72、FcgRIIB、IκB、PlOO、CTLA4、PD-I、CbI、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR2DL、および、Cskからなるグループから好適に選択される構成要素の機能活性レベルを増大させる。 ある実施態様によれば、ＮＦ-κＢ経路の阻害剤は、(例えば、そこから阻害剤の発現が可能な)非核酸の形態である。

概説してきた粒状組成物は、アネルギー反応などの寛容応答の誘発、または、特定の抗原あるいは抗原の集団に対する未知または既存の免疫応答を抑制する上で特に有用である。 例えば、この免疫応答として、免疫グロブリン分子(例えば、IgE)、および／またはＴリンパ球(例えば、細胞障害性Ｔリンパ球(CTLs)およびＴヘルパーリンパ球)によって媒介される応答などがあるが、これらに限定されない。 この免疫応答とは、通常は、タンパク質抗原、粒状抗原、アロ抗原、自己抗原、アレルゲン、細菌抗原、ウィルス抗原、寄生体抗原、または、免疫複合体から選択される抗原に対するものであるが、これらに限定されない。

ある実施態様によれば、この組成物は、薬学的に許容可能な担体または希釈剤をさらに含む。

本願発明の他の態様によれば、被験者の標的抗原に対する免疫応答、特に、好ましくない免疫応答または有害な免疫応答を調節する方法が提供される。 一般的に、これら方法は、概説してきた組成物を被験者に投与することを含む。 この組成物は、標的抗原に対する免疫応答の調節を効果的な期間と用量でもってして、注射、局所または粘膜投与、または、吸入あるいは持続的放出型投与を含む経鼻経路または経口経路で、投与される。 ある特定の実施態様によれば、この組成物は、全身投与される。

通常は、この免疫応答は、アレルギー、自己免疫疾患、および、移植物拒絶から選択される条件と関連している。 よって、他の実施態様によれば、本願発明は、被験者の標的抗原に対する好ましくない免疫応答または有害な免疫応答を招いたり、増長するおそれのある症状または病因を伴う病態を処置または予防するための方法を提供する。 一般的に、これら方法は、これまでに概説してきた有効量の組成物を被験者に投与することを含む。 ある実施態様によれば、被験者とは、概説してきた症状を有する者であったり、かような症状を招く可能性がある者である。 ある実施態様によれば、ＮＦ-κＢ経路の阻害剤と抗原が、異なる粒子で提供される場合、それらは被験者に同時に投与される。

その他の関連する実施態様によれば、本願発明は、標的抗原に対する免疫応答を抑制するための薬剤、または、標的抗原が関係するアレルギーまたは自己免疫疾患を処置または予防するための薬剤、あるいは、標的抗原が関係する移植物拒絶を処置または予防するための薬剤を製造するために用いられる粒状のＮＦ-κＢ経路の阻害剤、および、標的抗原の少なくとも一部に対応する抗原の使用にも及ぶ。

本願発明は、標的抗原に対する免疫応答の研究および調節において、粒状のＮＦ-κＢ経路の阻害剤、および、標的抗原の少なくとも一部に対応する抗原を使用することをも包含している。

１．定義
特に断りの無い限りは、本願明細書で用いるすべての技術用語および科学用語は、当業者に周知の意味で使用されている。 本願明細書で用いるものと同様または同等の方法および物質を、本願発明を実施または試験するために使用することができるが、その中でも好ましい方法および物質を記載している。 本願発明の目的のために、以下の用語について定義することとする。

本願明細書で用いる「ある」ものとは、文法上の一つまたは一つ以上(すなわち、少なくとも一つ)のものを指す。 例えば、「ある要素」とは、一つまたは一つ以上の要素を指す。

本願明細書で用いる「約」という用語は、特定の状態に対して、多くとも30％、好ましくは、多くとも20％、そして、より好ましくは、多くとも10％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％の変化を伴う条件(例えば、量、濃度、時間など)を指す。

「同時投与」または「同時に投与する」あるいは「共投与」などの表現は、二つまたはそれ以上の成分を含む単一組成物の投与、あるいは、各活性成分を個別の組成物および／または誘導物として、すべての活性成分を単一組成物として投与した際に認められるのと同等の有効性を得るに十分な短時間の内に、同時発生的に、または、同時に、あるいは、連続して個別の経路で投与することを指す。 「同時に」の用語は、活性成分を実質的に一緒に投与すること、望ましくは、同じ製剤に取り込んで投与することを指す。 「同時期」の用語は、活性成分を時間間隔を置かずに投与することを指し、例えば、ある薬剤を投与する前後の約１分〜約１日の間に他方の薬剤を投与する。 同時期の時間間隔について特に制約はない。 しかしながら、同時投与をしない場合には、通常は、ある薬剤を投与してから約１分〜約８時間、好ましくは、約１時間〜約４時間の間隔を設けることになるであろう。 同時期に投与を行う場合、好ましくは、薬剤を被験者の同じ部位に投与する。 「同じ部位」の用語は、正確に同じ位置であることを含むが、約0.5cm〜約15cm、好ましくは、約0.5cm〜約15cmの範囲内としてもよい。 本願明細書で用いる「個別に」との用語は、薬剤を時間間隔を設けて投与すること、例えば、約１日〜数週間または数ヶ月の間隔を設けて投与することを指す。 活性薬剤の投与順序については、特に制約はない。 本願明細書で用いる「連続的に」との用語は、薬剤を連続的に投与すること、例えば、所定の時間間隔、あるいは、分、時間、日または週の単位の間隔を設けて投与することを指す。 好ましくは、活性薬剤を、所定の反復サイクルでもってして投与する。

本願明細書で用いる「アネルギー」の用語は、特定の抗原または抗原の集団に対する免疫系による抑制された応答または非応答的状態を指す。 例えば、Tリンパ球とBリンパ球は、至適刺激条件下で、それらの特定抗原に対して応答できない場合は、アネルギー的であると言える。

「抗原」の用語は、脊椎動物、特に、哺乳動物において免疫応答を惹起できるタンパク質、ペプチド、または、その他の分子、あるいは、巨大分子の全部または一部を指す。 このような抗原は、タンパク質、ペプチド、または、その他の分子、あるいは、巨大分子で免疫処置された動物由来の抗体に対しても反応性を示す。

「抗原結合性分子」の用語は、標的抗原に対して結合アフィニティーを示す分子を指す。 この用語が、免疫グロブリン、免疫グロブリン断片、および、抗原結合性を示すタンパク質構造由来の非免疫グロブリンにも及ぶことは容易に理解できるであろう。

「自己」の用語は、同じ生物からの由来物(例えば、細胞、組織など)を指す。

本願明細書で用いる「同種」の用語は、遺伝組成を異にする細胞、組織、生物などを指す。

「アロ抗原」の用語は、血液に含まれる抗原など、ある特定種においてのみ認められる抗原を指す。 これに対して、「ゼノ抗原」とは、ある特定種には認められるものの、その他の種には認められない抗原を指す。 これに対応して、「同種移植片」とは、同じ種の間で取り交わされる移植片のことを、そして、「異種移植片」とは、異なる種の間で取り交わされる移植片のことを指す。

本願明細書において、特に断りのない限りは、「含む」や「含んでいる」との表現は、そこで言及した工程、または、要素、あるいは、工程および要素のグループを包含するが、その他のいかなる工程、または、要素、あるいは、工程および要素のグループを排除しないことを意図している。

「対応する」や「対応している」との表現は、標的抗原のアミノ酸配列と実質的に同様のアミノ酸配列をコードする抗原を指すものである。 一般的には、これら抗原は、標的抗原の少なくとも一部と、少なくとも約30、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％の類似性を示す。

「有効量」の用語は、免疫応答の調節、または、疾患または病態の処置または予防において、調節、処置または予防の効果を引き出す上で有効な組成物を、単一用量または連続投与の一部のいずれかで、所要の対応を必要とする個体に対してその有効量を投与することを指す。 この有効量は、治療を受ける個体の健康状態と身体状態、治療を受ける個体の分類群、組成物の成分、医学的所見、および、その他の関連因子によって変化する。 この有効量は、通常の処置で決定できる範囲において、比較的に広範囲に設定できるものと考えられる。

本願明細書で用いる「免疫相互作用性」の用語は、相互作用、反応、または、分子間ならびに分子の一方が免疫系の成分あるいは模造物である分子間のその他の会合形態などのいかなる作用をも含む。

本願明細書において特定の細胞によって生産される遺伝子発現産物(例えば、タンパク質または転写物)で用いる「レベルまたは機能活性」の表現は、最も広範な意味で解釈されるべきであって、単一の細胞まあは複数の細胞集団において生成される発現産物のレベルまたは機能活性を指す。 したがって、後者の場合、その表現は、複数の細胞または細胞の集団によって生成されたタンパク質の平均的なレベルまたは機能活性をも包含するものである。

本願明細書において互換的に使用されている「患者」、「被験者」、「宿主」または「個体」の用語は、治療または予防を必要とする被験者、特に、脊椎動物の被験者、そして、より具体的には、哺乳動物の被験者を指す。 本願発明の範囲に属する好適な脊椎動物は、脊椎動物亜門に属する霊長類、齧歯動物(例えば、マウス、ラット、モルモット)、ウサギ(例えば、ウサギ、野ウサギ)、ウシ(例えば、畜牛)、ヒツジ(例えば、羊)、ヤギ(例えば、山羊)、ブタ(例えば、豚)、ウマ(例えば、馬)、イヌ(例えば、犬)、ネコ(例えば、猫)、トリ(例えば、鶏、七面鳥、カモ、ガチョウ、それに、カナリヤやセキセイインコなどの鑑賞鳥など)、海洋哺乳類(例えば、イルカ、クジラ)、爬虫類(ヘビ、カエル、トカゲなど)、および魚類などがあるが、これらに限定されない。 好ましい被験者は、問題となる抗原の存在または異常な発現が関係している病態または疾患の治療また予防が必要なヒトである。 しかしながら、前述した用語が、症状の存在を前提としていないことは理解されるであろう。

「薬学的に許容可能な担体」の用語は、固体または液体の充填剤、希釈剤、または、安全に局所投与または全身投与できる被包性物質を指す。

本願明細書において互換的に使用されている「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」の用語は、アミノ酸残基のポリマー、および、その変異体および合成類似体を指す。 よって、これらの用語は、一つまたは一つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然のアミノ酸や天然のアミノ酸ポリマーの化学類似体などの非天然の合成アミノ酸であるアミノ酸ポリマーにも適用される。

「調節リンパ球」の用語は、応答の調節および抑制、それに、他の細胞、特に、Bリンパ球やTヘルパーリンパ球などのその他の免疫細胞の作用に関与するリンパ球を指す。

「抑制」や「抑制する」などの表現は、抗原または抗原の集団に対するB-リンパ球やTリンパ球の免疫応答を含めた免疫応答の弱毒化または調節を指す。 ある実施態様によれば、この弱毒化は、抑制Tリンパ球(例えば、CD4₊CD25₊調節Tリンパ球)によって、その一部が、媒介されている。

本願明細書で用いる「界面活性剤」の用語は、混合不可能な二つの相の界面、例えば、水と有機ポリマー溶媒との間の界面、水／空気の界面、または、有機溶媒／空気の界面などを選択的に吸収する薬剤を指す。 一般的に、界面活性剤は、親水性の部分と親油性の部分を有しているので、微粒子を吸収すると、同様にコーティングされた粒子を寄せ付けない外部環境に親水性と親油性の部分を放出して、粒子の凝集を抑える作用をする。 界面活性剤は、治療剤または診断薬を迅速に吸収し、そして、それら薬剤の生体適合性をも高める。

本願明細書で用いる「界面活性剤を取り込んだ」粒子の表現は、少なくとも粒子の表面に界面活性剤を具備している粒子を指す。 界面活性剤は、粒子内部、そして、粒子形成の間に表面に取り込むことができ、あるいは、粒子が形成された後に粒子にコーティングすることもできる。 粒子表面への界面活性剤のコーティングは、吸着、イオン結合または共有結合、あるいは、取り囲んでいるマトリックスによる物理的な「捕捉」によって行うことができる。 例えば、界面活性剤を、ポリマー微粒子などの所定時間に放出される粒子に取り込むことも可能である。

「処置」、「処置する」、「処置した」などの表現は、治療目的および予防目的の処置の双方を指す。
２．組成物
本願発明の一部は、抗原に対する免疫応答をすでに有する動物に対するNF-κB阻害剤とその抗原の共投与、すなわち、阻害剤と抗原の双方が可溶性であり、あるいは、一方が可溶性で、他方が粒子形態である阻害剤とその抗原の共投与によっても、抗原に対する寛容応答を生成させる上で効果的でないとの知見に基づいている。 これに対して、本願発明者らは、NF-κB阻害剤と抗原の双方を粒子形態で動物に投与することによって、強力な寛容応答を引き出すことが可能であることを突き止めたのである。 したがって、本願発明は、NF-κB経路の阻害剤と標的抗原に対応する抗原の双方を含む組成物、すなわち、アレルギー、自己免疫疾患、または、移植物拒絶で認められる抗原を含む病態において標的抗原に対する寛容を惹起または刺激するために用いられる不要な免疫応答に関連する組成物を提供する。
２.１ 粒子
本願発明によれば、阻害剤と抗原(本願明細書において、「生体作用性薬剤」とも称する)は、同じ粒子または異なる粒子に含まれるか、あるいは、それらと関係している。 様々な粒子を使用することができ、例えば、リポソーム、ミセル、脂質粒子、セラミック／無機粒子、および、ポリマー粒子などがあるが、これらに限定されず、また、通常は、ナノ粒子、および、微粒子から選択される。 これら粒子は、抗原供給細胞によって、食作用または飲食作用に供するために、適切な大きさにされる。 抗原供給細胞には、専門的タイプと条件的タイプの双方のタイプの抗原供給細胞がある。 専門的タイプの抗原供給細胞として、マクロファージ、単核細胞、Bリンパ球、単核細胞顆粒球DC前駆体を含む骨髄系細胞、辺縁性クッパー細胞、小膠細胞、Ｔ細胞、ランゲルハンス細胞、および、交互嵌合樹状細胞および小胞状樹状細胞を含む樹状細胞などがあるが、これらに限定されない。 条件的抗原供給細胞として、活性化Ｔ細胞、星状細胞、小胞状細胞、内皮細胞、および、繊維芽細胞などがあるが、これらに限定されない。 ある実施態様によれば、抗原供給細胞は、単核細胞、マクロファージ、B-リンパ球、骨髄系細胞、樹状細胞、または、ランゲルハンス細胞からなるグループから選択される。 ある特定の実施態様によれば、抗原供給細胞は、CD11cを発現し、そして、樹状細胞を含む。 粒子の大きさは、大きくとも約30μm、そして、小さくとも数nmであるが、ある実施例によれば、この粒子の寸法は、約100μm以下、より好ましくは、約１μm以下の範囲としている。 リポソームは、基本的に、水性コアを取り囲む殻を形成するリン脂質二重層から構成されている。 その利点として、細胞の外膜層を「擬装」している外層の親油性が挙げられ、これにより、様々な細胞によって、比較的容易に捕捉されることとなる。 ポリマー賦形剤は、通常、生物崩壊性(例えば、ポリ乳酸)または非生物崩壊性(例えば、酢酸エチレンビニル)のいずれかの生体適合性ポリマーから形成された、ミクロ微小球／ナノ微小球、および、ミクロカプセル／ナノカプセルから構成されている。 ポリマー素材を用いた場合の利点として、製造の容易さ、荷重耐久性の大きさ、直径の大きさをナノメーターからミクロン単位の範囲であること、それに、薬剤放出と崩壊度の調節がきくことが挙げられる。

ある実施態様によれば、これら粒子は、非抗原供給細胞よりも高レベルで抗原供給細胞(例えば、樹状細胞)を発現するマーカーを有する免疫反応性を示す抗原結合分子をその表面に含んでいる。 このタイプのマーカーの例として、MGL、DCL-I、DEC-205、マクロファージマンノースＲ、DC-SIGN、または、その他のDC、または、骨髄特異的(レクチン)受容体などがあり、その具体例が、Hawiger et al (2001, J Exp Med 194, 769), Kato et al 2003, J Biol Chem 278, 34035), Benito et al. (2004, J Am Chem Soc 126, 10355), Schjetne, et al. (2002, Int Immunol 14, 1423) および van Vliet et al, 2006, Nat Immunol Sep 24; [Epub ahead of print])(van Vliet et al, Immunobiology 2006, 211:577-585)に開示されている。

これら粒子は、生体作用性薬剤と担体マトリックス(例えば、界面活性剤、賦形剤、または、ポリマー物質)との組み合わせから調製することができる。 ある実施態様によれば、マトリックスは、生物崩壊性および生体適合性であり、そして、任意に、治療剤または診断薬を所定の速度で送達する生物崩壊性を具備することができる。 これら粒子は、様々な物質から造ることができる。 有機物質と無機物質の双方に加えて、ポリマー物質や非ポリマー物質も使用することができる。 このタイプの物質の例として、極性脂質、有機ポリマーおよびモノマー、ポリ-およびモノ多糖、セラミック／無機物質、ポリペプチドおよびタンパク質などがある。 その他の好適な物質として、ゼラチン、ポリエチレングリコール、トレハロース、デキストラン、および、キトサンなどがあるが、これらに限定されない。 秒単位から月単位の範囲の崩壊時間と放出時間を具備した粒子を、粒子材料などの要素を勘案してデザインしたり、調製することができる。
２.１.１ ポリマー粒子
ポリマー粒子は、生体適合性ポリマー、および、好ましくは、生物崩壊性ポリマー、コポリマー、または、これらの混合物から形成することができる。 これらポリマーは、粒子に異なる至適な性状、すなわち、ｉ）送達される生体作用性薬剤とポリマーとの間の相互作用性、すなわち、生体作用性薬剤に安定性を付与し、そして、送達時に活性を維持せしめる相互作用性、；ii）ポリマーの崩壊率、そして、それによって得られる薬剤放出速度；iii）表面性状、それに、化学修飾を経て得られた標的性能；および、iv）多孔質の粒子、を実現するための調整を行うこともできる。

ポリ無水物のような表面浸食性ポリマーを、粒子の形成のために用いることができる。

例えば、ポリ[(p-カルボキシフェノキシ)-ヘキサン無水物] (PCPH)のようなポリ無水物も使用することができる。 生物崩壊性ポリ無水物は、米国特許第4,857,311号に開示されている。

他の実施態様によれば、ポリ(ヒドロキシ酸)またはポリ(エステル)などのポリエステルを利用したバルク浸食性ポリマーを使用することができる。 例えば、ポリグリコール酸(PGA)、ポリ乳酸(PLA)、または、そのコポリマーを、粒子の形成のために用いることができる。 ポリエステルは、アミノ酸のような帯電した官能基または機能化可能な官能基を有することができる。 例示目的の実施例にあっては、放出速度が調整された粒子を、ポリ(D,L-乳酸)、および／または、ポリ(D,L-乳酸-コ-グリコール酸)(「PLGA」)から形成することができる。

その他のポリマーとして、ポリ(アルキルシアノアクリレート)、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリエチレンのようなポリアルキレン、ポリプロピレン、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(エチレンオキシド)、ポリ(エチレンテレフタレート)、ポリビニルアルコールのようなポリビニル化合物、ポリビニルエーテル、および、ポリビニルエステル、アクリル酸およびメタクリル酸のポリマー、セルロース、および、その他のポリ多糖、および、ペプチド、または、タンパク質、あるいは、それらのコポリマー、または、混合物などがある。 異なるドラッグデリバリー用途に好適な安定性およびin vivoでの崩壊速度に基づいてポリマーを選択することができ、あるいは、かような性質を付与するために修飾を施すこともできる。

ある実施態様によれば、Hrkach et al.(1995, Macromolecules, 28:4736-4739; and "Poly(L-Lactic acid-co-amino acid) Graft Copolymers: A Class of Functional Biodegradable Biomaterials" in Hydrogels and Biodegradable polymers for Bioapplications, ACS Symposium Series No. 627, Raphael M. Ottenbrite et al., Eds., American Chemical Society, Chapter 8, pp. 93-101, 1996.)に記載されているポリエステルグラフトコポリマーのような機能化ポリマーから粒子が形成される。

粒子を形成するために、生物崩壊性ポリマー以外の物質も使用することができる。 好適な物質として、様々な非生物崩壊性ポリマーや様々な賦形剤がある。 これら粒子は、生体作用性薬剤と界面活性剤だけから形成することもできる。

単純および二重エマルジョン溶媒蒸発、スプレードライ、溶媒抽出、溶媒蒸発、相分離、単純および複合コアセルべーション、界面重合、および、当業者に周知のその他の方法を用いてポリマー粒子を調製することができる。 所望の直径を有する粒子を形成するための至適な条件が整っているのであれば、当該技術分野で周知の微粒子またはマイクロカプセルを製造する方法を用いて粒子を調製することができる。

カプセル封入された薬剤を送達するための微粒子を製造するために開発された方法は、例えば、Doubrow, M., Ed., "Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy," CRC Press, Boca Raton, 1992.の文献に記載されている。 かような方法は、Mathiowitz and Langer (1987, J. Controlled Release 5, 13-22); Mathiowitz et al (1987, Reactive Polymers 6, 275-283); および、Mathiowitz et al (1988, J. Appl. Polymer Sci. 35, 155-11 A)の文献、それに、米国特許第5,213,812号、米国特許第5,417,986号、米国特許第5,360,610号、および、米国特許第5,384,133号にも記載されている。 これら方法は、例えば、Mathiowitz et al (1990, Scanning Microscopy 4: 329-340; 1992, J. Appl. Polymer Sci. 45, 125-134); および、Benita et al (1984, J. Pharm. Sci. 73, 1721-1724)に記載されているように、ポリマーの選択、サイズ、外部的形態、それに、所望されている結晶度に基づいて選択される。

溶媒蒸発にあっては、例えば、Mathiowitz et al.,(1990), Benita; および、Jaffeの米国特許第4,272,398号に記載されているように、ポリマーを、塩化メチレンのような揮発性有機溶媒に溶解する。 幾つかの異なるポリマー濃度、例えば、0.005〜2.0 g/mLの間の濃度を使用することができる。 可溶性形態あるいは微粒子として分散した形態のいずれかの形態の生体作用性薬剤を、このポリマー溶液に添加し、そして、得られた混合物を、ポリ(ビニルアルコール)のような表面活性化剤を含む水性相に懸濁する。 この水性相は、例えば、蒸留水で１％ポリ(ビニルアルコール)w/vの濃度とすることができる。 得られたエマルジョンは、大半の有機溶媒が蒸発するまで撹拌を行い、残された固形微粒子を水洗し、そして、凍結乾燥機で一晩かけて乾燥せしめた。 異なるサイズ(0.1〜1000μm)と異なる形態の微粒子が、この方法によって、得ることができる。

主としてポリ無水物のような安定性を欠いたポリマーの使用のために、溶媒の除去が行われる。 この方法では、塩化メチレンのような揮発性有機溶媒を含む選択したポリマーの溶液に、薬剤を分散または溶解する。 そして、混合物を、シリコン油などの油に懸濁させて、エマルジョンを形成する。 24時間の内に、溶媒は油相に拡散し、そして、エマルジョン滴が硬化して、固形のポリマー微粒子となる。 例えば、Mathiowitz et al. (1987, Reactive Polymers, 6:275)に記載されたようなホットメルトマイクロカプセル化法とは異なり、この方法は、高融点で、しかも、広範な分子量範囲のポリマーから微粒子を調製するために使用することができる。 この手法によって、例えば、１〜300ミクロンの直径を有する微粒子を得ることができる。

ある重合系にあっては、単純または二重エマルジョン法を用いて調製されたポリマー粒子の大きさは、エマルジョン滴の大きさに応じて変化する。 油中水形エマルジョンでの滴の大きさが、所望のサイズ範囲の粒子を形成する上で適度の小ささでない場合には、例えば、エマルジョンの超音波粉砕や均質化、あるいは、界面活性剤の添加などによって、より小さな滴を形成することができる。

前述したいずれかの方法で調製された粒子が、所望の範囲から逸脱したサイズのものである場合には、その粒子を、例えば、篩にかけたり、あるいは、当業者に周知の方法を用いて密度に応じて任意にさらに分離するなどして、サイズ調整することができる。

ポリマー粒子は、スプレードライによって調製することができる。 SuttonとJohnsonによるPCT国際公開公報第WO 96/09814号に開示されているようなスプレードライ法は、粒子の少なくとも90％が１〜10μmの平均サイズに属し、かつ水溶性物質から形成された滑らかな円形微粒子の調製方法を開示している。
２.１.２ セラミック粒子
セラミック粒子も、本願発明の生体作用性薬剤を送達するために用いることができる。

これら粒子は、一般的に、公知のゾルゲル法と同様の手法を用いて調製することができ、また、通常は、例えば、Brinker et al. ("Sol-Gel Science: The Physics and Chemistry of Sol-Gel Processing;" Academic Press: San Diego, 1990, p-60)や、Avnir et al. (1994, Chem. Mater. 6, 1605)に記載されているような、ごく簡単な条件と室温条件とを必要としている。 所望のサイズ、形状および多孔質度を具備した非常に安定なセラミック粒子を調製することができる。 これら粒子は、極端なpHや温度によって誘発される変性(Jain et al, 1998, J. Am. Chem. Soc. 120, 11092-11095)から薬効分子(ポリペプチドや薬剤など)も効果的に保護する。 加えて、それらの表面を異なる官能基で容易に機能化することができる(LaI et al, 2000, Chem. Mater. 12, 2632-2639; Badley et al, 1990, Langmuir, 6, 792-801)ので、所望の部位をin voivoでの標的にするために、それらを、様々なモノクローナル抗体やその他のリガンドに結合することができる。

ペイロードを含有する活性剤をin vivoで送達するための様々なセラミック粒子が報告されている。 例えば、英国特許第1 590 574号は、生物学的に活性な成分をゾルゲルマトリックスに取り込むことを開示している。 国際公開公報第WO 97/45367号は、予め焼結した粒子（１〜500μm）またはディスクに鉱染作用によって生物学的に活性な薬剤を取り込んでいるシリカキセロゲル、すなわち、ゾルゲルプロセスを介して調製した調節溶解可能なシリカキセロゲルを開示している。 米国特許出願公開公報第20040180096号は、生体作用物質を取り込んだセラミックナノ粒子を開示している。 これらセラミックナノ粒子は、染料のミセル組成物の形成によって造られる。 セラミック材料をミセル組成物に添加し、そして、アルカリ加水分解によってセラミックナノ粒子が沈殿する。 米国特許出願公開公報第20050123611号は、粒子内にほぼ均質に分散した活性物質を含む調節放出されるセラミック粒子を開示している。 これら粒子は、界面活性剤と極性溶媒とを混合して、逆性ミセル溶液を調製し、(ｂ)ゲル前駆体、触媒、縮合剤、および、可溶性活性物質を、極性溶媒に溶解して、前駆体溶液を調製し、(ｃ)逆性ミセル溶液と前駆体溶液とを混合して、エマルジョンを調製し、および、(ｄ)エマルジョン内の前駆体を縮合することによって得られる。 米国特許出願公開公報第20060210634号は、蒸発作用によって、生体作用物質を、金属酸化物(例えば、酸化チタン、酸化ジルコニウム、酸化スカンジウム、酸化セリウム、および、酸化イットリウム)を含むセラミック粒子に吸着させることを開示している。 Kortesuo et al. (2000, Int J Pharm. May 10;200(2):223-229)は、クエン酸トレミフェンや塩酸デキスメデトミディンのような薬剤を調節送達するための粒子、すなわち、その粒子サイズ範囲が狭小である球形シリカゲル粒子を製造するためのスプレードライ方法を開示している。 Wang et al (2006, Int J Pharm. 308(1-2): 160-167)は、生体作用物質を送達するために、多孔質炭酸カルシウム微粒子による吸着と多価電解質多層フィルムを用いたカプセル封入とを組み合わせることを開示している。
２.１.３ リポソーム
Kim et al.(1983, Biochim. Biophys. Acta 728, 339-348)、Liu et al.(1992, Biochim. Biophys. Acta 1104, 95-101)、Lee et al.(1992, Biochim. Biophys. Acta. 1103, 185-197)、Brey et al.(米国特許出願公開公報第20020041861号)、Hass et al.(米国特許出願公開公報第20050232984号)、Kisak et al.(米国特許出願公開公報第20050260260)、および、Smyth-Templeton et al.(米国特許出願公開公報第20060204566号)などの文献に記載された標準的な方法によって、リポソームを製造することができる。 加えて、抗原を送達するための脂質由来の粒子製剤に関するCopeland et al.(2005, Immunol. Cell Biol. 83: 95-105)の文献と、タンパク質を担ったリポソームの調製方法などのワクチンのための粒子送達システムに関するBramwell et al.(2005, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 22(2):151-214; 2006, J Pharm Pharmacol. 58(6):717-728)の文献も参照することができる。 多様なin vitro細胞培養や動物実験において、様々な異質の脂質成分を用いた多くのリポソーム製剤が利用されている。 リポソームの性質を決定するパラメーターが幾つも同定されており、例えば、Lee et al.(1992, Biochim. Biophys. Acta. 1103, 185-197)、Liu et al(1992, Biochim. Biophys. Acta, 1104, 95-101)、および、Wang et al.(1989, Biochem. 28, 9508-951)の文献で報告されている。

ある実施態様によれば、乾燥脂質膜の水和作用を利用した調製方法、すなわち、有機溶媒に溶解された選択した脂質(および、有機溶解性生体作用物質)を混合し、そして、真空下のガラス容器の底で乾燥する方法が用いられる。 緩慢な渦巻き撹拌によってカプセル封入される水溶性生体作用物質を含む水性緩衝溶液を用いて、この脂質膜は、改めて水和される。 そして、水和した脂質液胞は、さらに抽出され、一連の凍結-解凍サイクルにかけられ、あるいは、脱水された後に、生体作用物質のカプセル封入を迅速に行うために再水和される。 次に、捕捉されていない生体作用物質をリポソーム製剤から除去するために、遠心分離またはサイズ排除カラムに適用してリポソームの洗浄を行い、そして、４℃で保存することができる。 リポソーム製剤に関する基本的な方法は、Thierry et al. (1992, Nuc. Acids Res. 20:5691-5698)の文献に詳細に記載されている。

生体作用性薬剤のペイロードを有する粒子は、Pautot et al. (2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100(19): 10718-21)に記載の手法を用いて調製することができる。 Pautot et al.の技術を用いてリポソームを製造するために、ストレプトアビジンでコーティングした脂質(DPPC、DSPC、および、同様の脂質)を利用することができる。 一つまたはそれ以上の活性薬剤を液胞に取り込ますために、Needham et al. (2001, Advanced Drug Delivery Reviews, 53(3): 285-305)に記載されている薬剤のカプセル化技術を利用することができる。

様々な脂質混合物のクロロホルム溶液を高真空度に曝し、次いで、得られた脂質膜(DSPC/CHOL)をpH４の緩衝液で水和し、そして、凍結および解凍の処理を行った後に、それらをポリカーボネートフィルターに通すことで、リポソームを調製することができる。 カプセル化を促したり、安定性を向上させるなどのために、DSPCまたはコレステロールを補充したDPPCを使用することができる。 アルカリ化剤を添加して血管外媒体のpHを7.5にまで調整することによって、経膜pH勾配を調製することができる。 そして、リポソーム内部への生体作用性薬剤の蓄積を許容するために、高められた温度下で、生体作用性薬剤の溶液を液胞溶液の小画分に加えることで、生体作用性薬剤(例えば、小分子のNF-κB経路の阻害剤、例えば、弱塩基)を捕捉することができる。

ニオソムのような本願発明の生体作用性薬剤を送達する上で好適なその他の脂質由来の粒子は、Copeland et al.(2005, Immunol. Cell Biol. 83: 95-105)の文献に開示されている。
２.１.４ バリスティック粒子
本願発明の生体作用性薬剤は、注射針を必要としない送達または「バリスティック」(バイオリスティック)デリバリーでの使用に好適な粒子に付着(例えば、コーティングまたは結合)あるいは会合することができる。 バリスティックデリバリー用の粒子として、例えば、国際公開第WO 02/101412号、第WO 02/100380号、第WO 02/43774号、第WO 02/19989号、第WO 01/93829号、第WO 01/83528号、第WO 00/63385号、第WO 00/26385号、第WO 00/19982号、第WO 99/01168号、第WO 98/10750号、および、第WO 97/48485号に記載されたものがある。 しかしながら、これら粒子が、バリスティックデリバリー用機器での使用に限定されるものでもなく、すなわち、免疫細胞への粒子の送達を可能にする代替技術(例えば、注射または極微針)によっても投与可能であることが、理解されるべきである。

当該技術分野で周知の様々な方法を用いて、活性薬剤を、担体粒子(例えば、コア担体)にコーティングまたは化学的に結合することができる。 担体粒子は、細胞内デリバリーにおいてよく利用されている粒子サイズ範囲内に収まる好適な密度を有する物質から選択される。 至適な担体粒子の大きさは、当然のことながら、標的Ｔ細胞の直径に応じて変化する。 粒子のサイズの範囲として、約0.01〜約250μm、約0.05〜約50μm、それに、約１〜約10μmなどのサイズがあり、また、粒子密度の範囲としては、約0.1〜約25g/cm₃の密度がある。 この種のタイプの粒子の例として、タングステン、金、白金、および、イリジウムの担体粒子などの金属粒子がある。 タングステン粒子は、直径の平均値が、0.5〜2.0μmのものが容易に入手することができる。 金粒子または微晶質金(例えば、gold powder A1570、Engelhard社、East Newark, NJ.から入手可能)も使用することができる。 金粒子は、その大きさが均質(Alpha Chemicals社から入手可能な粒子の大きさは、１〜３μmであり、また、Degussa社、South Plainfield, NJ.から入手可能な粒子の大きさは、0.95μm前後である)であり、また、毒性も小さい。 微晶質金は、多様な粒子サイズ分布を示し、通常は、0.1〜５μmの範囲に及んでいる。 微晶質金の不規則な表面積は、本願発明の活性薬剤の効率的なコーティングを可能にする。

金粒子またはタングステン粒子のような粒子に対して生体作用分子(例えば、タンパク質や核酸などの親水性分子)を吸着、結合、あるいは、付着させるための多くの方法が知られており、また、発表もされている。 その例として、所定量の金またはタングステンを、塩化カルシウムやスペルミジンのような生体作用分子に結合させる方法がある。 その他の実施例では、金粒子またはタングステン粒子に生体作用分子を沈殿させるために、エタノールを用いている(例えば、Jumar et al, 2004, Phys Med. Biol. 49:3603-3612を参照されたい)。 反応混合物の均一性を確保するために、得られた溶液を、好ましくは、コーティング作業中に継続して渦巻き撹拌する。 生体作用分子の付着を行った後に、これら粒子を、例えば、好適な膜に移動して、使用に先駆けて乾燥したり、または、サンプルモジュールまたはカセットの表面をコーティングしたり、あるいは、特定の粒子が媒介するデリバリー機器での使用に供するためにデリバリーカセットに適用したりすることができる。

単純蒸発(風乾)、真空乾燥、噴霧乾燥、フリーズドライ(凍結乾燥)、噴霧凍結乾燥、噴霧コーティング、沈殿、超臨界流体粒子形成などの標準的技術を用いて、製剤化組成物を、粒子として、好適に調製することができる。 必要に応じて、得られた粒子を、国際公開公報第WO 97/48485号に記載の方法を用いて仕上げることができる。
２.１.５ 界面活性剤
粒子を調製するために利用または使用することが可能な界面活性剤として、フォスフォグリセリドがある。 フォスフォグリセリドの例として、天然界面活性剤のＬ-α-フォスファチジルコリンジパルミトイル(「DPPC」)などのフォスファチジルコリンがある。 これら界面活性剤は、好ましくは、例えば、粒子間の相互作用を抑えるなどして表面特性を改善し、そして、粒子表面の接着性を抑えることができる。 肺に対して内因性の界面活性剤を使用することで、非生理学的界面活性剤の使用は必要なくなる。

粒子表面の界面活性剤は、静電気的相互作用、ファンデルワールス力、および、毛管現象などの相互作用性に起因する粒子の凝集作用を抑制することができる。 粒子表面に界面活性剤があることで、表面の皺(粗さ)が増すこととなり、それにより、本質的な粒子間の相互作用が関与する表面積が減少することで、エーロゾル化が円滑に進む。

天然の界面活性を含めて、当該技術分野で周知の界面活性剤を使用することができる。

その他の界面活性剤として、ジフォスファチジルグリセロール(DPPG)やフォスファチジルエタノールアミンなどのリン脂質；パルミチン酸やオレイン酸ポリオキシエチレン-９-ラウリルエーテルなどの脂肪アルコールまたは脂肪酸；トリオレイン酸ソルビトール(Span 85)などのソルビタンエステル；胆汁酸塩；および、ポロキサマーまたはタンパク質などの両親媒性ポリマーなどがある。
２.２ ＮＦ-κＢ機能の阻害剤
NF-κB機能の阻害剤は、免疫細胞、特に、抗原供給細胞でのNF-κBの機能活性のレベルを低下させる分子または化合物を含む。 ある実施態様によれば、NF-κB機能の阻害剤は、NF-κB経路の構成要素、すなわち、BTK、LYN、BCR Igα、BCR Igβ、Syk、Blnk、PLCγ2、PKCβ、DAG、CARMAl、BCL10、MALTl、PBK、PIP3、AKT、p38 MAPK、ERK、COT、IKKα、IKKβ、IKKγ、NIK、RelA/p65、P105/p50、c-Rel、ReIB、p52、NIK、Leul3、CD81、CD19、CD21、および、補体および凝固カスケードでのそれらのリガンド、TRAF6、ユビキチンリガーゼ、Tab2、TAKl、NEMO、NOD2、RIP2、Lck、fyn、Zap70、LAT、GRB2、SOS、CD3ζ、Slp-76、GADS、ITK、PLCγl、PKCθ、ICOS、CD28、SHP2、SAP、SLAM、および、2B4から好適に選択されるNF-κB経路の構成要素の機能活性のレベルを低下させる。 この種のタイプの具体例として、NF-κB経路の阻害剤は、RelA/p65、P105/p50、c-Rel、ReIB、または、p52の一つまたはそれ以上の機能活性のレベルを低下させる。 好ましくは、これら実施態様において、NF-κB機能の阻害剤は、それら構成要素の少なくとも一つの機能または活性を、ブロック、阻害、あるいは、中和する。 その他の実施態様において、NF-κB機能の阻害剤は、NF-κB経路の構成要素、すなわち、SHPl、SHIP、PIR-B、CD22、CD72, FcgRIIB、IκB、PlOO、CTLA4、PD-I、CbI、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR2DL、および、Cskから好適に選択されるNF-κB経路の構成要素の機能活性のレベルを増大させる。 これら実施態様において、NF-κB機能の阻害剤は、それら構成要素の少なくとも一つの機能または活性を、増大、刺激、あるいは、激化する。

多数のNF-κB機能の阻害剤が紹介されており、それらの内、代表的なものを、以下の表に例示している。

ある特定の実施態様によれば、ＮＦ-κＢ経路の阻害剤として、BAY 11-7082やBAY-11-7085(BioMol, Plymouth Meeting, PA)などのIκBのリン酸化の阻害剤がある。

NF-κB機能の阻害剤は、宿主に対して非毒性で、また、最小限または僅かな副作用しか呈さないものが望ましい。 好ましくは、本願明細書の段落番号0008(Martin E et al, Immunity 2003, 前出)で言及したように、NF-κBの阻害剤は、NF-κBの代替経路、あるいは、NF-κBの既存経路と代替経路の双方をブロックする。
２.３ 抗原
不必要な免疫応答または有害な免疫応答に関係する様々な標的抗原が存在する。 本願発明によれば、例えば、２.２節で言及した粒子を製造するために、また、例えば、２.１節で言及した標的抗原に対する寛容な免疫応答を誘発するために、標的抗原の少なくとも一部に対応する抗原を、NF-κB阻害剤と組み合わせて使用する。 標的抗原の例として、MHCとの関係で存在するアロ抗原、および、自己抗原、または、そのペプチド断片、ならびに、可溶性タンパク質、および、不溶性複合体の断片、粒状抗原、例えば、細菌、または、寄生体、および、アレルゲンなどがある。 よって、本願発明を実施する上で有用な抗原として、自己免疫応答、アレルゲン、および、移植抗原の標的となる自己抗原などがあるが、これらに限定されない。 自己抗原の例として、硬皮症に関連する狼瘡自己抗原、Smith、Ro、La、Ul-RNP、フィブリリン；全身紅斑性狼蒼に関連する核抗原、ヒストン、糖タンパク質 gp70、および、リボソームタンパク質；初期胆汁閉塞性肝硬変に関連するピルビン酸デヒドロゲナーゼデヒドロリポアミドアセチルトランスフェラーゼ(PCD-E2)；円形脱毛症に関連する毛嚢抗原；潰瘍性大腸炎に関連するヒトトロポミオシンアイソフォーム５(hTM5)；インシュリン依存性糖尿病に関連するプロインシュリン、インシュリン、IA2、および、GAD65：慢性関節リウマチに関連するII型コラーゲン、ヒト軟骨gp39 (HCgp39)、および、gpl30-RAPS、dnaJpl、シトルリン化タンパク質およびペプチド、シトルリン化II型コラーゲン、シトルリン化ビメンチンおよびシトルリン化フィブリノーゲン；多発性硬化症に関連するミエリン塩基性タンパク質、プロテオリピドタンパク質(PLP)、および、ミエリンオリゴデンドログリア糖タンパク質(MOG)；グレーブズ病に関連する甲状腺刺激因子受容体(TSH-R)；重症筋無力症に関連するアセチルコリン受容体(AchR)；セリアック病に関連するグリアジン；ヒストン、PLP、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、チログロブリン、様々なtRNAシンテターゼ、プロテイナーゼ-3、および、ミエロペルオキシダーゼなどがあるが、これらに限定されない。 アレルゲンの例として、FeI d1(すなわち、飼い慣らされたネコ属のネコの皮膚およびおよび唾液腺アレルゲンであって、そのアミノ酸配列は、国際公開公報第WO 91/06571号に開示されている)、Der pI、Der pII、Der fl、または、Der fll(すなわち、家庭内の塵ダニ、表皮ダニ属に由来する主要なタンパク質アレルゲンであって、そのアミノ酸配列は、国際公開公報第WO 94/24281号に開示されている)などがあるが、これらに限定されない。 その他のアレルゲンとして、例えば、牧草、樹木および(ブタクサを含む)雑草の花粉；真菌およびカビ；魚類、貝類、カニ、ロブスター、ピーナッツ、ナッツ類、小麦グルテン、卵、牛乳などの食料品；ハチ、ジガバチ、スズメバチ、ユスリカ(ヌカカではない)などの刺胞昆虫；イエバエ、ミバエ、ヒツジバエ、ラセンウジバエ、グレインゾウムシ、カイコ、ミツバチ、非ヌカカ幼虫、ハチミツガ幼虫、ゴミムシダマシ、ゴキブリ、チャイロコメノゴミムシダマシの幼虫、カブトムシ、クモ、および、家庭内の塵ダニを含むダニなどのその他の昆虫；ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ウサギ、ラット、モルモット、マウス、および、アレチネズミなどの哺乳類の頭垢、尿、唾液、血液またはその他の体液に認められるアレルゲン；一般的な浮遊微粒子；ラテックス；および、タンパク質洗浄用添加物に由来するアレルゲンなどがあるが、これらに限定されない。 移植抗原は、例えば、心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓、神経移植片などに由来するドナー細胞または組織、あるいは、外因性抗原の非存在下で自己抗原を有するMHCを具備したドナー抗原供給細胞から得ることができる。

抗原は、自然界から単離することもでき、あるいは、当該技術分野で周知の組換法によって調製することもできる。 例えば、ペプチド抗原は、MHCや、例えば、他生組織または移植用薬剤での細胞集団などの修飾した免疫応答が望ましい細胞集団または組織から得た抗原供給細胞のその他の供給分子から溶出することができる。 溶出したペプチドは、当該技術分野で周知の標準的なタンパク質精製技術を用いて精製することができる(Rawson et al, 2000, Cancer Res 60(16), 4493-4498)。 必要に応じて、精製したペプチドの配列決定をすることができ、また、後述する実施例に記載の標準的なタンパク質合成技術を用いて、これらペプチドの合成体を調製することもできる。 あるいは、修飾した免疫応答が望ましい細胞集団または組織の試料を単離し、そして、試料を溶解するか、あるいは、アポトーシス細胞の形成を促す条件(例えば、紫外線またはγ線の照射、ウィルス感染、サイトカイン、または、細胞培養培地での栄養成分を削除して細胞を得ること、過酸化水素を用いたインキュベーション、あるいは、デキサメタゾン、セラミド化学療法薬、および、ルプロンやタモキシフェンなどの抗ホルモン剤などを用いたインキュベーション)の下に試料を置くことで、粗製の抗原調製物を製造することもできる。 そして、溶解物またはアポトーシス細胞は、抗原供給細胞との接触に供される粗製抗原の供給源として使用することができる。

抗原が公知である場合は、標準的なプロコトール、例えば、Sambrook, et al, MOLECULAR CLONING. A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Press, 1989)、特に、その第16章および第17章、Ausubel et al, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (John Wiley & Sons, Inc. 1994-1998)、特に、その第10章および第16章、および、Coligan et al, CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE (John Wiley & Sons, Inc. 1995-1997)、特に、その第１章、第５章および第６章に記載のプロコトールに従って、組換法によって調製することができる。 通常、抗原は、以下の工程、すなわち、(a) 標的抗原、または、その類似体、または、その模倣体を発現することが可能な発現ベクターを用意し、(b) 好適な宿主細胞に当該ベクターを導入し、(c) 宿主細胞を培養して、当該ベクターから組換えポリペプチドを発現し、および、(d) 当該組換えポリペプチドを単離する、工程を含む手法によって調製される。

あるいは、抗原を、例えば、Atherton and Sheppard (Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford, England, 1989)、または、Roberge et al (1995, Science 269: 202)に記載されている溶液合成または固相合成を用いて合成することもできる。

ある実施態様によれば、抗原は、一つまたは一つ以上のペプチドの形態をとる。 通常、それらペプチドは、その長さが、少なくとも6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30個のアミノ酸残基であり、好ましくは、その長さが、約500、200、100、80、60、50、40個のアミノ酸残基に過ぎない。 二つまたは二つ以上のペプチドを用いる実施態様では、その配列が標的抗原の少なくとも一部に及んでいる連続する複数の重複ペプチドの形態でペプチドを形成することができる。 好ましくは、このペプチド配列は、標的抗原に対応する配列の少なくとも約30、40、50、60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％に由来している。 ある実施態様によれば、連続する複数の重複ペプチド断片の各ペプチドは、その長さを、30〜90アミノ酸、例えば、その長さを、30、35、40、45、50、55、60、65、70、73、75、80、81、85、86、および、90アミノ酸とすることができる。 様々な実施態様において、連続する重複ペプチド断片のアミノ酸配列は、約10〜約15のアミノ酸、例えば、10、11、12、13、14、および、15のアミノ酸で多重重複している。 かような抗原の製造方法が、例えば、Astori et al (2000 J. Immunol. 165, 3497-3505;および、同文献での引用文献)、および、米国特許出願公開公報第2004/0241178号に記載されている。 これら抗原は、例えば、その物理化学特性を修飾するための脂質修飾を用いて好適に修飾することができる。
２.４ 付属成分
本願発明の実施態様によれば、粒状組成物は、一つまたは一つ以上の免疫抑制物質サイトカイン、すなわち、IL-１受容体アンタゴニスト、IL-IRII、VEGF、IL-4、IL-10(ヒトまたはウィルス)、IL-13、TGF-β、および、FLT3リガンド、または、それらの機能的、組換的、または、化学的等価物または相同物から好適に選択される免疫抑制物質サイトカインをさらに含む。
３．薬学的製剤
本願発明によれば、２.２節に記載の一つまたは一つ以上のＮＦ-κＢ経路の阻害剤と２.３節に記載の一つまたは一つ以上の抗原が、免疫応答、特に、一つまたは一つ以上の標的抗原に対する未知または既存の免疫応答を抑制するなどの寛容応答を誘発する免疫応答を修飾する粒子、例えば、２.１節に記載の粒子を製造するために使用される。 したがって、これら組成物は、例えば、移植物拒絶、対宿主性移植片病、アレルギー、寄生虫病、炎症疾患、および、自己免疫疾患などの好ましくない免疫応答を処置または予防する上で有用である。 本願発明に従って処置または予防可能な移植物拒絶の例として、骨髄移植や、心臓、肝臓、膵臓、腎臓、肺、眼球、皮膚などの臓器移植に伴う拒絶がある。 アレルギーの例として、季節性呼吸器アレルギー、花粉症などの空気アレルゲンに対するアレルギー、血清IgEを低下させることで処置可能なアレルギーおよび好酸球増加症、喘息、湿疹、動物アレルギー、食物アレルギー、ラテックスアレルギー、皮膚炎、または、アレルギー減感作によって処置可能なアレルギーなどがある。 本願発明に従って処置または予防可能な自己免疫疾患の例として、乾癬、全身紅斑性狼蒼、重症筋無力症、全身硬直症候群、甲状腺炎、シデナム舞踏病、慢性関節リウマチ、糖尿病、および、多発性硬化症などがある。 炎症疾患の例として、クローン病、慢性炎症性眼疾患、慢性炎症性肺疾患、および、慢性炎症性肝疾患、自己免疫溶血性貧血、特発性白血球減少症、潰瘍性大腸炎、皮膚真菌症、強皮症、混合結合組織病、過敏性腸症候群、全身性エリテマトーデス(SLE)、多発性硬化症、重症筋無力症、ギラン・バレー症候群(抗リン脂質症候群)、原発性粘液水腫、甲状腺中毒症、悪性貧血、自己免疫萎縮性胃炎、アジソン病、インシュリン依存型糖尿病(IDDM)、グッドパスチャー症候群、ベーチェット症候群、シェーグレン症候群、慢性関節リウマチ、交感性眼炎、ハシモト病/慢性甲状腺炎、セリアック病/疱疹状皮膚炎、および、脱髄疾患、原発性胆汁閉塞性肝硬変、混合結合組織病、慢性活動性肝炎、グレーブズ病/亢進甲状腺炎、強皮症、慢性特発性血小板減少症紫斑病、糖尿病性ニューロパチー、および、敗血症性ショックなどがある。 本願発明でも処置または予防可能なその他の不必要な免疫反応の例として、血友病における抗第VIII因子抗体、または、糖尿病での抗インシュリン抗体などの組換療法剤に対する抗体がある。

したがって、上記した組成物は、ＮＦ-κＢ経路の阻害剤と標的抗原に対応する抗原とを含む薬学的組成物、すなわち、標的抗原に対する免疫応答を低減または抑制する有効量の粒子形態の薬学的組成物を患者に投与する工程を踏んで、患者の不必要な免疫応答、または、有害な免疫応答を処置または予防する上で有用である。 この薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体または希釈剤を含むことができる。 ある実施態様によれば、この組成物は、不必要な免疫応答、または、有害な免疫応答を示す個体に投与される。 その他の実施態様によれば、例えば、少なくとも一つ、および、望ましくは、二つまたはそれ以上の自己抗体ポジティブを有する一等親のI型糖尿病の病歴で同定されうる自己抗体ポジティブ、および／または、HLAハプロタイプを有する個体(例えば、Scofield, R.H., 2004. Lancet 363, 1544; Berglin et al, 2004, Arthritis Res Ther 6, R30336; Harrison et al., 2004, Diabetes Care 27, 2348を参照されたい)、または、一つまたは二つのHLA感受性遺伝子、および、ポジティブ抗CCP抗体を有する慢性関節リウマチのリスクのある個体(Klarskog et al. 2006, Arthritis Rheum. 54:38)(Rantapaa-Dahlqvist S et al. 2003, Arthritis Rheum. 48:2741)に対して、これら組成物は投与される。

本願発明において好適な薬学的組成物として、所定の目的を達成する上で有効量の生体作用性薬剤(すなわち、ＮＦ-κＢ経路の阻害剤、および、抗原)を含んでなる組成物がある。 患者に投与される活性成分の用量は、アレルギー、自己免疫疾患、および、移植物拒絶から選択される病態に好適に関与する不必要な免疫応答、または、有害な免疫応答に関連する少なくとも一つの症状を持続的に緩和するに十分な量とする。 投与する薬学的に活性な化合物の投与量または投与頻度は、処置する被験者の年齢、性別、体重、それに通常は健康状態を含めた要素を勘案して決められる。 この点に関して、投与する活性化合物の正確な量は、医師の判断によって決められる。 不必要な免疫応答、または、有害な免疫応答の処置または予防において、投与する活性化合物の有効量を決定するに際して、医師は、炎症、前炎症性サイトカインレベル、リンパ球増殖、細胞融解性Tリンパ球活性、および、調節Tリンパ球機能を評価することができる。 少なくとも、当業者であれば、アンタゴニストと抗原の好適な用量を容易に決定できる。

したがって、粒子は、投薬製剤に対して融和性を示し、かつ、予防および／または治療効果が期待できる用量でもってして、処置を受ける被験者に対して投与される。 送達される化合物の量は、一般的には、用量当たり0.01μg/kg〜100μg/kgの生体作用分子(例えば、抗原または阻害剤)であるが、処置を受ける被験者によって変化する。 ある実施態様によれば、意図した投与方法にもよるが、ＮＦ-κＢ経路の阻害剤を含む組成物は、一般的に、約0.1重量％〜90重量％、約0.5重量％〜50重量％、または、約１重量％〜約25重量％の阻害剤を含み、その残余部分は、好適な薬学的担体および／または希釈剤などの他に、抗原なども含む。 阻害剤の用量は、投与方法、患者の種類、年齢および／または病態などの多様な要素に応じて変化する。 その他の実施態様によれば、意図した投与方法にもよるが、抗原を含む組成物は、一般的に、約0.1重量％〜90重量％、約0.5重量％〜50重量％、または、約１重量％〜約25重量％の抗原を含み、その残余部分は、好適な薬学的担体および／または希釈剤などの他に、ＮＦ-κＢ経路の阻害剤なども含む。

処置する病態に応じて、粒子の製剤化を行い、そして、全身的、居所的、または、局部的にそれらを投与することができる。 製剤化ならびに投与に関する技術は、「Remington's Pharmaceutical Sciences」Mack Publishing Co., Easton, Pa., 最新版に開示されている。 好適な経路として、例えば、経口、経腸、経粘膜、または、腸内投与；筋内、皮下、経皮、皮内、脊髄内デリバリー(例えば、注射)、ならびに、髄膜内、直接心室内、静脈、腹膜内、鼻腔内、または、眼内デリバリー(例えば、注射)などの非経口デリバリーがある。 注射に関して、本願発明の粒子は、水性溶液、好ましくは、ハンクス溶液、リンガー溶液、または、生理食塩緩衝液などの生理学的に適合可能な緩衝液にて調製することができる。 経粘膜投与に関して、透過対象のバリアに対して好適な浸透剤を製剤のために用いる。 かような浸透剤は、当該技術分野で周知である。

本願発明の組成物は、許容可能な希釈剤(生理食塩水や滅菌水など)を含有する液体、あるいは、所望の触感、密度、粘度および美観を付与する許容可能な希釈剤または担体を含有するローション、クリーム、または、ゲルの形態の投与製剤とすることができる。 許容可能な希釈剤および担体は、当業者に周知のものであり、例えば、エトキシル化および非エトキシル化界面活性剤、脂肪アルコール、脂肪酸、炭化水素油脂(パーム油、ココヤシ油、および、鉱油など)、カカオバターワックス、シリコン油、pH調整剤、セルロース誘導体、非イオン性有機塩基および非イオン性無機塩基などの乳化剤、保存料、ワックスエステル、ステロイドアルコール、トリグリセリドエステル、レシチンやセファリンなどのリン脂質、多価アルコールエステル、脂肪アルコールエステル、親水性ラノリン誘導体、および、親水性蜜蝋誘導体などがあるが、これらに限定されない。

あるいは、本願発明の粒子は、本願発明を実施する上でも好適な経口投与に適した製剤に対して、当該技術分野で周知の薬学的に許容可能な担体を用いて容易に取り込むことができる。 このような担体は、本願発明の化合物を、処置が施される患者の経口摂取に供するための、錠剤、丸剤、カプセル、液剤、ゲル、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などの形態で製剤することを可能にする。 これら担体は、糖類、澱粉類、セルロース、および、その誘導体、麦芽、ゼラチン、タルク、硫酸カルシウム、植物油、合成油、ポリオール、アルギン酸、リン酸緩衝化溶液、乳化剤、等張性生理食塩水、および、発熱物質を含まない水から選択することができる。

非経口投与のための薬学的製剤は、水溶性粒子の水性溶液を含む。 さらに、粒子の懸濁液を、適切な注射用油状懸濁液として調製することができる。 好適な親油性溶媒または賦形剤として、ゴマ油のような脂肪油、あるいは、オレイン酸エチルやトリグリセリドのような合成脂肪酸エステルなどがある。 注射用水性懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、または、デキストランなどの懸濁液の粘度を増大させる物質を含有することができる。 任意に、好適な安定剤や、化合物の溶解性を高めて濃縮液の調製を可能にする薬剤などをも懸濁液に加えることができる。

経口投与用の薬学的調製物は、粒子と固形賦形剤とを混合し、次いで、錠剤または糖衣核を所望する場合には、好適な助剤を加えた後に、顆粒の混合物を加工処理することによって得ることができる。 好適な賦形剤として、具体的には、ラクトース、スクロース、マンニトール、または、ソルビトールなどの糖類の増量剤、それに、例えば、トウモロコシ澱粉、小麦澱粉、米澱粉、ジャガイモ澱粉、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／または、ポリビニルピロリドン(PVP)などのセルロース調製物がある。 必要に応じて、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、または、アルギン酸、あるいは、アルギン酸ナトリウムのようなその塩などの崩壊剤を加えることができる。 これら組成物は、どのような調剤法によっても調製することができるが、すべての方法は、一つまたはそれ以上の前述した治療剤と、一つまたはそれ以上の必須成分から構成された担体とを会合状態にせしめる工程を含んでいる。 一般的に、本願発明の薬学的組成物は、それ自体が公知の方法、例えば、混合、溶解、造粒、糖衣形成、選別、乳化、カプセル化、閉じ込め、または、凍結乾燥のための従来の方法によって製造することができる。

糖衣核は、好適なコーティング技術によって提供される。 この目的のために、濃縮糖溶液、すなわち、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル、ポリエチレングリコール、および／または、二酸化チタン、ラッカー溶液、および、好適な有機溶媒、または、溶媒混合物などを任意に含む溶液を用いることができる。 粒子の用量の多様な組み合わせを同定または特徴付けるために、錠剤または糖衣層に対して、色素または顔料を加えることもできる。

経口利用可能な医薬として、ゼラチンから形成された押し嵌め式カプセルや、グリセロールまたはソルビトールのような可塑剤とゼラチンとから形成された柔軟な密閉式カプセルがある。 押し嵌め式カプセルは、活性成分の他に、ラクトースのような増量剤、澱粉のようなバインダー、および／または、タルクやステアリン酸マグネシウムのような滑剤、そして、任意に、安定剤を含むことができる。 柔軟カプセルにあっては、活性化合物を、脂肪油、液体パラフィン、または、液体ポリエチレングリコールなどの好適な液体に溶解または懸濁させることができる。 それに加えて、安定剤を添加することもできる。

本願発明の粒子は、病態の再発をも考慮しながら、処置しようとする神経障害の重篤度などの幾つかの要素に基づいて、所定の時間、日数、週数、または、月数にわたって投与することができる。 また、例えば、所定の時間、日数、週数、月数などにわたって、絶えず注入をするなどして、継続的に投与することもできる。 あるいは、例えば、所定の日数の間に毎日１回の投与、所定の時間数にわたって毎時間に１回の投与、あるいは、適当と考えられるその他の投与スケジュールに沿って、投与を断続的に行うこともできる。

本願発明の組成物は、それ単独で、あるいは、ラクトースなどの不活性成分やその他の薬学的に許容可能な賦形剤と共に、鼻腔用または肺吸入用エアゾール、または、ネブライザー用溶液として、あるいは、吸入用微粉末としても投与することができる。 このような場合、製剤の粒子は、その直径を50μm以下、好ましくは、10μm以下の大きさとするのが望ましい。

ある実施態様によれば、例えば、米国特許第5,783,567号(Pangaea)に記載されているような、細胞、例えば、食細胞による活発な取り込み作用に着目して、粒子は投与される。

これら細胞による食作用は、粒子サイズを、通常は、約20μm以下、好ましくは、約11μm以下に維持することで改善される。

ある特定の実施態様によれば、肝臓や脾臓などの網内皮系(RES)の食細胞による取り込みが好適な場合には、粒子を、血流に直接に(すなわち、静脈または動脈内注射または注入によって)送達することができる。 あるいは、排出したリンパ節に対する食細胞が取り込みを、皮下注射の標的とすることもできる。 また、例えば、バリスティックまたはマイクロニードルデリバリーを用いて、粒子を皮内に(すなわち、樹状細胞やランゲルハンス細胞などの皮膚のAPCに)導入することもできる。 粒子が媒介するデリバリー技術の例として、例えば、米国特許第4,945,050号、第5,120,657号、第5,149,655号、および、第5,630,796号に記載されているような、好適な担体粒子を標的Ｔ細胞に送達するための起爆方式、電気方式、または、ガス放出タイプの技術がある。 マイクロニードルデリバリーが、国際公開公報第WO 2005/069736号、および、第WO 2005/072630号、および、米国特許第6,503,231号、および、第5,457,041号に例示されている。

その他の有用な(特に、寛容誘発性ポリペプチドをコードするDNAのための)送達経路は、胃腸管を介する経路、例えば、経口経路である。 あるいは、粒子が、肺胞マクロファージによって取り込まれたり、または、鼻腔内や口内からも投与できる肺のような臓器に粒子を(例えば、粉体微粒子の吸引、または、微粒子を含有する噴霧溶液または煙霧溶液の吸引によって)導入することができる。 食細胞が、一旦、粒子を貪食し始めると、ＮＦ-κＢ経路の阻害剤と抗原は、細胞内部に放出される。

したがって、本願発明は、例えば、自己免疫疾患、アレルギー、および、移植関連疾患などの不必要な免疫応答、または、有害な免疫応答に関係する抗原に対する寛容またはアネルギーの誘発を招く。 それ故に、ある実施態様によれば、本願発明は、寛容が望まれている個体に対して、共に粒子形態であるNF-κB阻害剤と抗原を投与することで、自己免疫疾患の処置のための自己抗原に対する寛容を招く。 このタイプの事例として、重症筋無力症の患者にあっては、アセチルコリン受容体(AChR)に対する自己抗体が認められるので、重症筋無力症を処置および／または予防するために、本願発明において粒子形態のNF-κB阻害剤と共に送達される粒子形態のAchR抗原または抗原発現ベクターを用いることができる。

さらに他の実施態様によれば、二卵性双生児から移植を受ける候補となる個体は、被移植者にとって移植された抗原は異物であるため、移植した細胞、組織、または、臓器に対して拒絶反応を示す。 移植前に被移植者に寛容性を付与することで、拒絶反応は、回避または軽減される。 一つまたはそれ以上の粒子形態の移植抗原と粒子形態のNF-κB阻害剤を被移植者に同時に投与することによって、慢性的な抗拒絶療法を軽減または解消することができる。 さらに他の実施態様によれば、実作業を通じて遭遇しうる汚染物質や化学物質に対する個体の感作は、免疫応答に対しては好ましくない。 化学物質に対して予め個体の免疫系に寛容性を付与することは、職業から生じる以後の免疫応答の進展を予防する上で望ましい。 これらの事例において、一般的に、個体の内因性タンパク質と反応した粒子形態の化学物質を、粒子形態のNF-κB阻害剤と共に、個体に対して同時に投与するのが望ましい。

特に、病原体自己抗原が不明である疾患については、粒子形態のNF-κB阻害剤と、解剖学的類似性を有する病原体に認められる粒子形態の抗原とを用いて、傍観的抑制を誘発することができる。 例えば、コラーゲンに対する自己抗体が、慢性関節リウマチに認められているので、慢性関節リウマチを処置するために、粒子形態のコラーゲンまたはコラーゲンをコードする遺伝子(例えば、Choy (2000) Curr Opin Investig Drugs 1 : 58-62を参照されたい)を、粒子形態のNF-κB阻害剤と共に用いることができる。 さらに、同様にして、β細胞自己抗原に対する寛容性も、I型糖尿病の進展を予防するために用いることができる(例えば、Bach and Chatenoud (2001) Ann Rev Immunol 19: 131-161を参照されたい)。

その他の実施例として、自己免疫脳脊髄炎、および、その他の数多くのCNS疾患、ならびに、多発性硬化症において、ミエリンオリゴデンドログリア糖タンパク質(MOG)に対する自己抗体が認められている(例えば、Iglesias et al. (2001) Glia 36: 22-34を参照されたい)。 したがって、粒子形態のMOG抗原、または、MOG抗原を発現する構築物を、粒子形態のNF-κB阻害剤と共に送達することで、多発性硬化症ならびに関連する中枢神経系での自己免疫疾患の処置または予防が可能となる。

本願発明の理解を容易ならしめ、かつ、効率的に実施に移すことを可能ならしめるために、特に好ましい実施態様を、本願発明の例示目的の実施例として以下に示した。

実施例１
リポソームによる関節炎の抗原特異的抑制
物質および方法
試薬
イソチオシアン酸フルオレセイン(FITC)、オボアルブミン(OVA)、メチル化ウシ血清アルブミン(mBSA)は、Sigma-Aldrich社(米国、ミズーリ州)から購入した。 ペニシリン、ストレプトマイシン、Ｌ-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、および、２-メルカプトエタノールは、Gibco⁽登録商標⁾Invitrogen社(米国、カリフォルニア州)から購入した。 完全フロイントアジュバント (CFA)は、Sigma-Aldrich社(米国、ミズーリ州)から入手した。 二酢酸カルボキシフルオレセインスクシニミジルエステル(CFSE)は、Molecular Probes社(米国、オレゴン州)から入手した。 フィコエリトリン(PE)で標識付けしたKJl-26抗体は、BD Pharmingen社(米国、カリフォルニア州)から購入した。 抗-マウス-MHC II-FITCは、Biolegend社(米国、カリフォルニア州)から購入した。 OVAのCD4エピトープ(配列 323-339)は、Auspep社(オーストラリア、ビクトリア州)から入手した。 その他のすべての試薬は、少なくとも分析用試薬の等級のものであった。

マウス
オスのC57/B16マウスおよびBALB/cマウスをARC社から入手し、また、OVA特異的TCRトランスジェニック種であり、かつ、BALB/cのバックグラウンドに関するDOl 1.10マウスをクイーンズランド大学で繁殖した。 CFSEは、Molecular Probes社(Eugene、オレゴン州)のものであった。

オボアルブミンへのイソチオシアン酸フルオレセインの結合
50mgのFITCを、500mgのOVAを含む50mLの炭酸塩緩衝液(pH 9.5、0.22mol/L)に溶解した。 得られた混合物をゆっくり撹拌し、そして、１時間、暗黒下、室温で反応を進行せしめ、その後、一晩、４℃で放置した。 水を用いた反復希釈と、窒素ガスで200kPaにまで加圧した400mLの限外濾過室(Millipore社、米国、マサチューセッツ州)を用いた分子量10,000の分子篩膜(Millipore社、米国、マサチューセッツ州)とを利用して、緩衝液の塩成分と未結合のFITCを、結合タンパク質から除去した。 得られたFITC-オボアルブミン(FITC-OVA)溶液を、アセトン-ドライアイス浴で凍結し、そして、凍結乾燥した(アルファ 2-4 LD フリーズドライヤー、Martin Christ、ドイツ)。 凍結乾燥したタンパク質溶液を、10,000gで、20分間、遠心分離して(EBA 12R 遠心分離器、Hettich Zentrifugen、ドイツ)、次いで、分子量10,000の分子篩濾過膜(Millipore社、米国、マサチューセッツ州)に通して、結合の度合を確認した。 いずれの事例でも、未結合のFITCは、蛍光分光分析値全体の１％にも満たなかった。 次いで、結合したタンパク質を貯蔵し、そして、使用時まで、４度で、遮光して保存した。

リポソーム調製物および組成物
リポソームは、従来の薄膜法によって調製した。 すなわち、250mL容の丸底フラスコに、100mgの卵フォスファチジルコリン(EPC)、0.35、1.42、および、1.75mgのBay 11-7082、クエルセチン、または、クルクミンの各々(または、必要に応じて、その他の量の阻害剤)を、10mLのクロロホルム/エタノール溶媒混合物(9:1 v/v)と共に入れた。 脂質溶液を、回転式エバポレーターで、真空下、40℃で、30分間かけて乾燥させて、薄層脂質膜を得た。 そして、残留溶媒を除去するために、脂質膜を、真空下、さらに30分間保存した(アルファ 2-4 LD フリーズドライヤー、Martin Christ、ドイツ)。 次いで、２mLのオボアルブミン、または、10mg/mlの濃度のmBSAを含むpH 7.4のHEPES緩衝液を加え、そして、室温下で、手で揺さぶって、多薄層気胞を形成した。 リポソーム分散液を、さらに２時間、室温下で静置させて、膨潤プロセスを完了した。 次いで、粗製のリポソーム懸濁液を、アセトン-ドライアイス浴で凍結し、そして、40℃の水浴で解凍した。 この凍結解凍サイクルを、５回繰り返して、タンパク質の捕捉性能を高めた。

オボアルブミンを含むリポソームについては、窒素ガスで加圧した10mLの押し出し成形機(Lipex Extruder、Northern Lipids社、バンクーバー、カナダ)を用いて、800nmのポリカーボネート膜(Nucleopore社、米国、カリフォルニア州)での高圧押し出しを５サイクル、それに、400nmのポリカーボネート膜(Nucleopore社、米国、カリフォルニア州)での高圧押し出しを５サイクル行うことで、そのサイズを層状的に小さくした。 mBSAを含むリポソームについては、400nmの膜を用いた押し出しを１０サイクル行った。 再使用に先駆けてアニーリンクプロセスを終了させるために、少なくとも２時間、室温下で、リポソームを放置した。 必要に応じて、最終リポソーム調製物に対して10mg/mlの濃度の15μLのDilのエタノール溶液を加えることで、リポソームに蛍光ラベルを付けた。

リポソームをHEPES緩衝液で希釈し、次いで、Optima⁽登録商標⁾ TLX卓上型超遠心分離機(Beckman Coulter、米国)を用いて、100,000ｇ(４℃、45分間)で遠心分離を行うことで、捕捉できなかったNF-κB阻害剤と抗原を効率的に除去した。 使用に先駆けて、リポソームのペレットをHEPES緩衝液に改めて分散させた。 このプロセスによるタンパク質の捕捉率は、少なくとも20％、Bayに関しては約60％、そして、クエルセチンとクルクミンの双方に関しては、80％を超える。 NF-κB阻害剤だけを含むリポソーム、タンパク質だけを含むリポソーム、それに、そのいずれも含まないリポソームを、関連する生体作用性成分を削除して、上述したようにして調製した。

上記したタンパク質抗原は、抗原タンパク質のペプチドエピトープで置換することができ、そして、これらは、Liang et al. (2005, Int. J. Pharm. 301: 247-254)に記載された脂質修飾および凍結乾燥単相システムの水和によって、リポソームの内部に効率的にカプセル封入することができる。

フローサイトメトリーおよび免疫蛍光分光分析顕微鏡検査によるリポソームの検出
Dilで標識付けしたリポソームを皮下(s.c)、静脈(i.v.)、または、腹膜内(i.p.)注射してから24時間後の被験者、あるいは、注射を受けていない被験者から、脾臓と排液リンパ節を除去した。 その一部をOCTで凍結し、そして、免疫蛍光分光分析顕微鏡検査に供した。 その他の試料から細胞を精製し、次いで、FITC接合抗-I-Aモノクローナル抗体で染色し、そして、フローサイトメトリーで分析した。

骨髄由来DCの調製および投与
マウスの長骨から骨髄細胞を回収して懸濁し、そして、ナイロンメッシュで濾過してから単核細胞をフィコール勾配遠心分離法で分離した。 マクロファージ、クラスII+細胞、および、リンパ球を、好適なモノクローナル抗体と磁性ビーズ(MACS、Miltenyi Biotec社、カリフォルニア州)を用いて、免疫学的に除去した。 BM細胞は、10ng/mlのGM-CSFと10ng/mlのIL-4(Peprotech、ロッキーヒル、ニュージャージー州)を補充したXCell620(CSL)培地で、一日おきに、新鮮な培地と交換しながら、６〜８日間かけてインキュベーションした。 DC調製物は、通常、80〜90％のCDllc+細胞を含んでいた。 Bayで処理したDCは、約５μMのBAY 11-7082(Bay、BioMol、プリマスミーティング、ペンシルバニア州)の存在下で継続的に培養を行い、そして、通常の生理食塩水で洗浄と懸濁を行う24時間前に、 100μMのmBSA(Sigma社)に曝した。 ５×10⁵個のBayで処理したDCは、関節炎を誘発して６日後に、尻尾の根もとに皮下(s.c)投与した。 リポソームを、10mg/mLの濃度で懸濁し、そして、関節炎を誘発して６日後に、その100μLを、皮下(s.c)または静脈(i.v.)のいずれかに投与した。 ある実験では、50μgの可溶性mBSAまたは10μgのBay溶液のいずれかを、尻尾の根もとのリポソームの注射部位に近接する箇所に皮下(s.c)投与した。

NF-κB阻害剤とモデル抗原を捕捉するリポソーム製剤の特徴
リポソームに含まれるNF-κB阻害剤と抗原による捕捉率(％EE)
捕捉されなかったNF-κB阻害剤と抗原を除去した後のリポソームに捕捉されたNF-κB阻害剤と抗原の量は、分析法によって定量することができた。 捕捉率は、以下の通りに表すことができる。

NF-κB阻害剤の分析
Bay 11-7082については、タンパク質沈殿のために用いたエタノールの20倍希釈液を加えて、リポソームを溶解した。 そして、得られた溶液を、−20℃で保存した。 30分後に、沈殿したタンパク質を除去するために、試料を、４℃で、10分間、最高速度で遠心分離した(EBA 12R遠心分離機、Hettich Zentrifugen、ドイツ)。 次いで、得られた上清でのBay 11-7082の濃度を分析し、そして、(用いた希釈度をも勘案して)得られた検量線に基づいて算出した(データ示さず)。 クエルセチンとクルクミンについては、５％w/vのトリトンＸ-100を含むPBS pH 6.5を加えて、リポソームを溶解した。 そして、得られた溶液でのクエルセチンまたはクルクミンの濃度を分析し、そして、(用いた希釈度をも勘案して)得られた検量線に基づいて算出した(データ示さず)。 分析の検証を行ったところ、改良された各NF-κB阻害剤の定量分析に関して、抗原が顕著な影響を及ぼさないことが示された。

モデル抗原の分析
若干の修正を加えた標準的なジシンコニン酸(BCA)タンパク質分析法によって、リポソームに捕捉されたモデル抗原の定量を行った。 すなわち、OVAまたはmBSAを含有しているリポソームを、20倍希釈したエタノールまたはイソプロパノールの各々を用いて溶解し、そして、−20℃で保存した。 30分後に、 試料を、４℃で、10分間、最高速度で遠心分離した(EBA 12R遠心分離機、Hettich Zentrifugen、ドイツ)。 脂質とNF-κB阻害剤を含む上清は、廃棄した。 そして、残存している溶媒を除去するために、タンパク質ペレットを、アルファ 2-4 LD フリーズドライヤー (アルファ 2-4 LD フリーズドライヤー、Martin Christ、ドイツ)に供した。 タンパク質ペレットを再溶解するために、100μLの2.5％ w/v ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)溶液(OVAへの添加用)、または、水(mBSAへの添加用)を加えた。 SDSは、OVAペレットの再溶解を補助するためのものである。 得られたタンパク質溶液を、２mLのBCA溶液(Pierce Biotechnology社、米国)と共に混合し、そして、37℃で、30分間かけてインキュベーションした。 インキュベーションを終えた後に、溶液の吸光度を、Cary 50 UV-VIS分光光度計(Varian社、米国、カリフォルニア州)を用いて、562nmの波長で計測した。 OVAおよびmBSAの濃度は、0.25mg/mL〜２mg/mLの範囲の一連の既知濃度のOVA溶液またはmBSA溶液を用いて作成した検量線に基づいて算出を行った。

粒子の大きさとゼータ(ζ)電位
押し出しと洗浄を経て調製されたリポソームの分散物のサイズ分布とゼータ電位を、光量子相関式分光器、および、顕鏡電気泳動の各々で決定した後に、HEPES緩衝液 pH 7.4で希釈した(Zetasizer 3000, Malvern、英国)。

リポソーム製剤の安定性
リポソーム試料を、(通常は、短期貯蔵のための条件である)４℃で保存し、そして、粒子サイズと多分散指数を、相関式分光器で、７日間にわたってモニターした。

様々なNF-κB阻害剤を含むリポソームに捕捉された抗原の維持
リポソームに保持された抗原を、FITC-OVAを用いて研究した。 リポソーム製剤を調製した。 HEPES pH 7.4緩衝液、または、１：20の希釈率に調整するための10％FBSを含んだHEPES pH 7.4緩衝液で、リポソーム分散液を希釈した。 希釈した分散液を撹拌し、そして、37℃で、インキュベーションした。 所定の時点で、希釈した分散液の一部を取り出し、そして、放出されたFITC-OVAをリポソームから分離するために、超遠心分離(100,000ｇ、45分間、４℃、Optima⁽登録商標⁾ TLX卓上型超遠心分離機、Beckman Coulter、米国)に供した。 0.6mLの５％ w/v トリトンＸ-100を含むPBS pH 6.5を、放出されたFITC-OVAを含んだ0.4mLの上清に添加し、そして、３mLのHEPES緩衝液 pH 7.4で希釈した。 次いで、得られた溶液に関して、492nmの励起波長と518nmの放出波長で、蛍光分光分析分光測光法(RF-1501 分光蛍光光度計、島津製作所、日本)によって蛍光強度を分析し、そして、捕捉したFITC-OVAからの放出物の分離を行わなかった以外は同条件で処理したリポソームが捕捉した全量のFITC-OVAの蛍光強度と比較を行った。

NF-κB阻害剤を含有するリポソームで処理したマウスでのNF-κB活性
NF-κB阻害剤を含んだリポソームを調製した。 C57BL/6マウス(ｎ=３)のグループに対して、Bay 11-7082、クエルセチン、および、クルクミンを、それぞれ0.5、２、および２mMの濃度で含んでいるNF-κB阻害剤を含む50μLのリポソーム製剤を、マウスの尻尾の根もとの皮下に注射した。 対照のマウスには、リポソームだけを皮下注射した。 24時間の後に、ILNを除去し、そして、70μmの細胞濾過器に通した。 細胞を洗浄した後に、100μg/mLのペニシリン、100μg/mLのストレプトマイシン、10mMのピルビン酸ナトリウム、20mM HEPES、２mMのＬ-グルタミン、および、50μMの２-メルカプトエタノールを補充した10％FCSを加えたRPMI(完全RPMI)で、２×10６細胞/mLの濃度で再懸濁した。 そして、100ng/mLのLPSの存在下または不在下で、細胞のインキュベーションを行った。 24時間のインキュベーションの後に、先に教示されている通りにして、細胞核の抽出の準備を行った(Pettit, A.R., C. Quinn, K.P. MacDonald, L.L. Cavanagh, G. Thomas, W. Townsend, M. Handel, and R. Thomas. 1997. Nuclear localization of ReIB is associated with effective antigen-presenting cell function. J Immunol 159:3681-3691)。

すなわち、細胞(２×10₆個の細胞)を、回収、および、洗浄した後に、10mM 塩化カリウム(KCl)、0.1mM エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、0.1mM エチレングリコール-ビス(-アミノエチルエーテル)-N,N,N,N-テトラ-酢酸(EGTA)、0.1mM ジチオトレイトール(DTT)、0.5mM フェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)、および、１％ v/v プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む400μLの氷冷した10mMのHEPES緩衝液 pH 7.9に再懸濁した。 細胞を、氷上で、15分間かけてインキュベーションした後に、25μLの冷やした10％のNonidet P-40(Sigma社、米国)を加え、そして、卓上型撹拌機で、10秒間、激しく撹拌を行った。 均質化物を、４℃で、10,000rpmで、30秒間かけて遠心分離し(Mikro 20、Hettich Zentrifugen社、ドイツ)、そして、細胞質画分を含む上清を廃棄した。 そして、細胞核ペレットを、0.4 M 塩化ナトリウム(NaCl)、１mM EDTA、１mM EGTA、0.1mM DTT、１mM PMSF、および、１％ v/v プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む50μLの氷冷緩衝液である20mM HEPES pH 7.9に再懸濁した。 試験管を、４℃で、15分間、揺さぶった後に、４℃で、12,000rpmで、５分間かけて遠心分離した(Mikro 20、Hettich Zentrifugen社、ドイツ)。 上清を細胞核画分として回収し、そして、必要時まで、−70℃で保存した。 プロテアーゼ阻害剤カクテルとは、アプロチニン、ロイペプチン、それに、錠剤で提供されるペプスタチン-Ａ(Complete Mini Tablet⁽登録商標⁾、 Roche Diagnostics社、スイス)の混合物であって、製造業者の指示に従って調製した。 P50/NF-κBのDNA結合は、製造業者の指示に従って、NF-κB用のBD遷移因子ファミリー比色定量キット(BD Biosciences社)を用いて、ELISAによって検出を行った。 出現した色を、マルチスキャンプレートリーダー(Labsystems社、イリノイ州、米国)で、検出した。

特異的寛容の誘発と、それに続く、NF-κB阻害剤と抗原とを同時に捕捉するリポソームのin vivo投与：OVA特異的Ｔ細胞モデル。

OVAとNF-κB阻害剤とを同時に捕捉するリポソームによるOVA特異的Ｔ細胞の刺激
脾臓とILNをナイーブDO11.10マウス(OVA特異的TCRトランスジェニックマウス)から回収し、そして、70μmの細胞濾過器に適用した。 細胞を、温めたPBSに１×10７細胞/mLの濃度で懸濁し、そして、等量の10μM CFSEと混合し、次いで、37℃で、10分間かけてインキュベーションした。 CFSE溶液に含まれる細胞を、450×ｇで、５分間、４℃で、遠心分離することによって、10％FCSを補充した氷冷RPMIで、二度の洗浄を行い、そして、2.5×10７細胞/mLの濃度で再懸濁した。 200μLの細胞懸濁液を、BALB/cマウスの尻尾の静脈に対して静脈注射した。 24時間の後に、OVAとNF-κB阻害剤を捕捉している50μLのリポソーム製剤(表１で報告された製剤)を、尻尾の根もとに皮下注射した。 リポソーム単体、OVA-リポソーム、および、OVAを含んだCFAを、対照として用いた。 注射をしてから72時間後に、ILNを除去し、そして、単一細胞懸濁液の調製に移った。 そして、フローサイトメトリー分析に供するために、細胞を、(DOl1.10細胞に特異的な)KJ1-26-PE抗体で染色した。

OVAと共にリポソームに捕捉されたNF-κB阻害剤によるOVAペプチド抗原で再刺激した後のOVA特異的Ｔ細胞活性に関する効果
脾臓とILNをナイーブDO11.10マウスから回収し、そして、70μmの細胞濾過器に適用した。 200μLの2.5×10７細胞/mLの濃度の細胞懸濁液を、BALB/cマウスの尻尾の静脈に対して静脈注射した。 移植を行って24時間の後に、マウスの尻尾の根もとに、OVAを含むCFAを皮下注射した。 ７日後に、OVAとNF-κB阻害剤を捕捉している50μLのリポソーム製剤(表４)を、マウスの尻尾の根もとに皮下注射した。 注射をしてから７日後に、ILNを除去し、そして、単一細胞懸濁液の調製に移った。 ナイロンウールカラムにＴ細胞を通して、それを蓄積し、そして、450×ｇで、５分間かけて遠心分離することで洗浄を行った。 ２×10６細胞/mLの濃度で、Ｔ細胞を、完全RPMIにて再懸濁した。 100μLのＴ細胞懸濁液を、丸底の96ウェルマイクロタイタープレート(Techno Plastic Products社、スイス)で培養し、そして、CD11cマイクロビーズとLSカラム(Miltenyi社、ドイツ)を用いたポジティブ免疫選別によってナイーブマウスの脾臓から精製しCD11c₊細胞で再刺激をした。 ０〜2000 ng/mLの範囲の濃度のOVAペプチドを、Ｔ細胞が置かれたウェルに加えて、最終ペプチド濃度を０〜1000 ng/mLとし、かつ、最終体積を200μLとした。 37℃、５％二酸化炭素の条件下で、プレートを、３日間かけてインキュベーションした。 Ｔ細胞の増殖は、培養の最後の18時間において添加された[３Ｈ]-チミジンの取り込みに基づいて測定がされた。 次いで、自動式96ウェル回収装置(Packard Instruments社、コネチカット州、米国)によって、ガラス繊維濾紙に細胞を回収した。 [３Ｈ]-チミジンの取り込みは、TopCount NXTシンチレーションカウンター(Packard Instruments社、コネチカット州、米国)を用いた液体シンチレーション算出法によって確認をした。 増殖値は、３つのウェルの平均cpm±SEMとして報告した。

特異的寛容の誘発と、それに続く、NF-κB阻害剤と抗原とを同時に捕捉するリポソームのin vivo投与：抗原誘発性関節炎(AIA)モデル。

関節炎を誘発する21日前に、C57BL/6マウスに対して、50μLのCFAで乳化した100μgのmBSAを含む50μLの生理食塩水を、各マウスの腋のしたに皮内注射して免疫処置を行った。

同時に、400ngの百日咳毒素を含む200μLの生理食塩水を腹膜内に注射した。 ７日後に、50μLのCFAで乳化した100μgのmBSAを含む50μLの生理食塩水の効果促進剤を、尻尾の根もとに皮下注射した。 21日目に、右関節に、60μgのmBSAを含む10μLの生理食塩水を関節内注射をして関節炎を誘発すると共に、左関節は、対照である10μLの生理食塩水で処置を行った。 27日目に、各グループのマウス(ｎ=10)に対して、尻尾の根もとに50μLの様々なリポソーム製剤(表５)を皮下注射した。 対照として、未処置のマウスと50μLのリポソームだけを投与したマウスを用いた。

別の実験において、マウスの集団に対して、50μLのクルクミン-OVAリポソーム(表１に記載の組成物)、50μLのクルクミン-mBSAリポソーム(表５に記載の組成物)、または、リポソームにカプセル封入された50μLのクルクミン(抗原なし)を皮下注射すると同時に、2.5mg/mLの濃度の50μLのmBSA溶液を投与した。 関節炎を誘発した日から、各マウスの膝関節の腫れ具合を、３〜４日おきに、最長で13日間にわたって、ノギス(株式会社ミツトヨ、日本)で計測を行い、そして、右膝関節の直径と左膝関節の直径との間の差異に基づいた百分率、すなわち、各マウスでの両膝での最大相違値がほぼ100％となる百分率で表現をした。 33日目に、頸部脱臼させてマウスを屠殺し、そして、膝の皮膚を剥ぎ取った。 膝関節の腫れ具合を、抗原と生理食塩水を注射した膝に対して比較を行い、その臨床スコアをまとめた。 スコアは、１〜５の等級で表現される。 １＝抗原と生理食塩水を注射した膝と比較して変化なし。 ２＝関節がわずかに変色している。 ３＝関節の変色と、外側に軽度の腫れと変色が認められる。 ４＝関節の変色と、外側に中度の腫れと変色が認められる。 ５＝靱帯が目視できないほどの重度の関節の変色と、外側に重度の腫れと変色が認められる。

統計学的分析
この章で報告したデータのグループ間の統計学的差異を、スチューデントの非対称ｔ検定(二つの比較対象物が用いられる)、または、偏差分析(複数の比較対象物が用いられる)のいずれかによって決定した。 0.05未満のｐ値は、顕著な差異を示しているものと考えられる。

結果
リポソームは、リンパ器官のMHCクラスII+食細胞によって取り込まれ、そして、特定のＴ細胞に対する抗原を供給する。

リポソームのin vivoでの分布は、投与経路、粒子サイズ、それに、脂質組成物の影響を受ける(Oussoren, C, and G. Storm. 2001. Liposomes to target the lymphatics by subcutaneous administration. Adv Drug Deliv Rev 50:143-156)。 今日までに、予防接種のためのリポソームの投与経路として、静脈(i.v.)および皮下(s.c.)への注射が広く研究されている。 i.v.注射で投与されたリポソームは、全身の様々な臓器に送達され、通常は、肝臓および脾臓で迅速に蓄積されるのに対して、皮下に注射されたリポソームは、注射部位に留まり、そして、局所の排液性リンパ節に移行する浸透性の抗原供給細胞によって捕捉されるか、あるいは、皮膚上の排液性リンパ管を介して常在するリンパ節APCに直結することができる(Oussoren, C., M. Velinova, G. Scherphof, J.J. van der Want, N. van Rooijen, and G. Storm. 1998. Lymphatic uptake and biodistribution of liposomes after subcutaneous injection. IV. Fate of liposomes in regional lymph nodes. Biochim Biophys Acta 1370:259-272; Metselaar, J.M., M.H. Wauben, J.P. Wagenaar-Hilbers, O.C.Boerman, and G. Storm. 2003. Complete remission of experimental arthritis by join targeting of glucocorticoids with long-circulating liposomes. Arthritis Rheum 48:2059-2066; Allen, T.M., C.B. Hansen, and L.S. Guo. 1993. Subcutaneous administration of liposomes: a comparison with the intravenous and intraperitoneal routes of injection. Biochim Biophys Acta 1150:9-16)。 ポリエチレングリコールのような親水性ポリマーでリポソームの表面をコーティングすることで、肝臓によるリポソームの迅速な取り込みが妨げられ、血流内でのリポソームの循環時間が長くなることがわかってきている(Torchilin, V.P. 2005. Recent advances with loposomes as pharmaceutical carriers. Nat Rev Drug Discov 4:145-160)。

寛容性の目的のために、DC前駆体の他に、脾臓やリンパ節のようなリンパ器官に常在しているか、あるいは、そこに移行するDCなどの食細胞に、リポソームの内包成分を送達する必要がある。 リンパ器官のAPCをリポソームが標的にすることができるかどうかを調べるために、マウスの尻尾の静脈への静脈注射、あるいは、尻尾の根もとでの皮下注射によって、400nm濾過膜に通して押し出した蛍光標識付けしたEPCリポソームをマウスに投与した。 的確な蛍光分光分析、低い毒性、簡便な標識付けプロセス、リポソーム膜への非常に安定な組み込み、それに、細胞膜間の移動に対する抵抗性などの多くの利点に鑑みて、Dilを蛍光標識として採用した(Claassen, E. 1992. Post-formation fluorescent labelling of liposomal membranes. In vivo detection, localisation and kinetics. J Immunol Methods 147:231-240)。 Dilで標識付けしたリポソームに関するAPCによる取り込みを評価するために、注射をして24時間後に、脾臓(i.v.注射用)と局所のリンパ節(s.c.およびi.p.注射用)を回収し、細胞懸濁液の調製を進め、そして、APCによって発現されるＢ細胞、DC、および、マクロファージなどのMHC-クラスII、あるいは、DCによって発現されるCD11cに関して染色を行った。

リンパ節または脾臓を排除するMHCクラスII+およびCD11c+細胞を取り込んだ後に、DiIリポソームは視覚化される(図１、Ａ-Ｃ)。 i.v.またはs.c.注射を行った後に、脾臓において、CD11b+およびF480+マクロファージ、および、CD11c+ DCによって、リポソームは取り込まれる(図１、Ｄ-Ｈ))。

NF-κB阻害剤を含むリポソームで処置したマウスでのNF-κB活性
リポソームに捕捉されたNF-κB阻害剤のNF-κBの活性化に関する効果を評価するために、C57BL/6マウス(ｎ=３)のグループに対して、様々なNF-κB阻害剤を捕捉しているOVA-リポソームを、scまたはivで注射した。 注射をして24時間後に、脾臓の細胞を単離し、そして、LPSの存在下または不在下で、さらに24時間かけて培養を行った。 細胞核NF-κB活性は、ELISAを利用して、コンセンサスオリゴヌクレオチドに対する細胞核抽出物に含まれるp50/NF-κBのDNA結合性に基づいて決定した(図２)。 細胞核p50はAPCによって顕著に発現されるものであり、また、MHC-II₊細胞が、排液性リンパ節から精製されたものではないものの、NF-κB活性を決定するためには感受性試験法を利用すべきであることから、この分析では、細胞核p50について試験を行った。

リポソームで処置したマウスから得た細胞は、ex vivoでのLPS処置を行わない場合にあっては、低レベルのp50 DNA結合性を示した。 予期していた通り、リポソームだけを与えたマウスから得た細胞では、LPSは、p50 DNA結合性を増大させた。 これとは対照的に、LPS処置を行った後では、クエルセチンまたはクルクミンのいずれかを捕捉したリポソームを注射したマウスから得た細胞は、LPSに応答してp50 DNA結合性が増大することはなかった。 これら結果は、クエルセチンまたはクルクミンのいずれかを捕捉したリポソームが、in vivoで送達をした後に、APCのNF-κB活性をブロックすることができることを指し示すものである。 NF-κB阻害剤と抗原を同時に捕捉するリポソームによるin vivoでの特異的寛容性の誘発：OVA特異的Ｔ細胞モデル。

OVAとNF-κB阻害剤を同時に捕捉するリポソームによるOVA特異的Ｔ細胞の刺激
リポソーム製剤に捕捉されたOVAが、APCによって、in vivoで、OVA特異的Ｔ細胞を供給できるかどうかを決定するために、CFSEで標識されたDO11.10 OVA特異的TCRトランスジェニックＴ細胞が適切に導入されたナイーブBalb/cマウスの尻尾の根もとに、OVAとNF-κB阻害剤を捕捉してはいるが、DiIを含んでいないリポソームを皮下注射した。 リポソームを注射して72時間後に、被移植者マウスから得たILN由来の細胞を、PEで標識付けされ、かつDO11.10 Ｔ細胞に特異的なKJ 126抗体で染色した。 CFSEとは、親のＴ細胞が分裂する時に、娘細胞の間に均質に行き渡る細胞質染色剤である。 したがって、T-細胞の増殖は、フローサイトメトリーを用いて、OVA特異的Ｔ細胞のCFSE蛍光分光分析で得た強度値の減少度を測定することによって決定することができる。

リポソームだけを注射したマウスに関して、親集団のCFSE希釈物を測定して得たＴ細胞の増殖は、ごくわずかでしかなかった。 これとは対照的に、OVA-CFAまたはOVA-リポソームのいずれかを注射したマウスでは、72時間にわたって、Ｔ細胞は活発に細胞分裂をした(図３)。 これら結果は、リポソームに捕捉されたOVAが、加工処理を施されてＴ細胞に供給され、そこで、抗原特異的増殖をもたらすAPCにまで、in vivoで、送達可能であることを明確に実証している。 OVAを捕捉しているリポソーム、および、OVAとNF-κB阻害剤を同時に捕捉しているリポソームのいずれをマウスに注射しても、排液性リンパ節でのＴ細胞増殖応答に関して、両者間に差異は認められなかった(図３)。

OVAとNF-κB阻害剤を捕捉しているリポソームの投与によるin vivoでのＴ細胞の増殖は、in vivoで、定常状態下でDCを標的化するためにDEC-205共役抗原を用いて行った以前の研究結果と同様であった。 DEC-205抗原を取り込んだ未発達のDCは、まず、Ｔ細胞の増殖を誘発するが、１週間以内には、大半のＴ細胞が、先に共役時に供給した抗原に対して応答不能となった(Mahnke, K., Y. Qian, J. Knop, and A.H. Enk. 2003. Induction of CD4+/CD25+ regulatory T cells by targeting of antigens to immature dendritic cells. Blood 101:4862-4869; Hawiger, D., K. Inaba, Y. Dorsett, M. Guo, K. Mahnke, M. Rivera, J.V. Rauetch, R.M. Steinman, and M.C. Nussenzweig. 2001. dendritic cells induce peripheral T cell unresponsiveness under steady state conditions in vivo. J Exp Med 194: 769-780)。 Ｔ細胞応答の遅延抑制は、アネルギーの配列に起因する抗原特異的寛容とエフェクターＴ細胞の削除を招く未発達DCによる末梢調節Ｔ細胞の誘発を原因とするものであった(Mahnke, K., Y. Qian, J. Knop, and A.H. Enk. 2003. Induction of CD4+/CD25+ regulatory T cells by targeting of antigens to immature dendritic cells. Blood 101:4862-4869; Lohr, J., B. Knoechel, E.C. Kahn, and A.K. Abbas. 2004. Role of B7 in T cell tolerance. J Immunol 173:5028-5035)。

OVA-ペプチド抗原で再刺激した後のOVA特異的Ｔ細胞に関する、リポソームにOVAと共に捕捉されたNF-κB阻害剤の効果
本願発明者らは、OVAとNF-κB阻害剤とを捕捉しているリポソームｇ、抗原特異的寛容を誘発するか否かを検証した。 この検証を行うにあたって、DO11.10 OVA特異的TCRトランスジェニックＴ細胞を、BALB/cマウスに導入した。 18時間後に、OVA特異的免疫応答を誘発するために、これらマウスにOVAとCFAを与えた。 その７日後に、OVA単独、または、OVAとNF-κB阻害剤を含んだリポソーム製剤を、マウスに皮下注射した。 その７日後に、鼠蹊部リンパ節を除去し、そして、ナイロンウールカラムを用いて、Ｔ細胞を濃縮した。 そして、異なる濃度のOVA-ペプチドが供給されたナイーブ共通遺伝子マウスから精製した脾臓のDCを用いて再刺激を与えた後に、[₃Ｈ]チミジンの取込値を計測して、Ｔ細胞のOVA特異的免疫応答を評価した(図４)。

ポジティブ対照のOVA-CFAと比較を行ったところ、OVA-リポソーム、それに、NF-κB阻害剤を捕捉しているOVA-リポソームに対するOVA特異的応答は抑制されていた。 OVA-クエルセチンまたはクルクミンのいずれかを捕捉したリポソームを投与したマウスにおいて、Ｔ細胞増殖抑制が最大であったが、OVA-リポソーム単独、または、Bay 11-7082を捕捉しているOVA-リポソームを投与したマウスでは、顕著な抑制は認められなかった。 これら結果は、高親油性の阻害剤であるクルクミンやクエルセチンなどと比較して、Bay 11-7082を保持するためのリポソームの非効率性が、標的Ｔ細胞に送達されるBay 11-7082が奏する有効性を減退しかねない、ことをさらに示唆するものである。

これらの結果は、OVAペプチドで再刺激した後のＴ細胞応答の抑制が、調節Ｔ細胞を誘発する効果によるものであろうことを示唆している。 さらに、標的APCでNF-κB活性化をブロックする能力は、この分析で認められた抗原特異的Ｔ細胞の抑制レベルと相関しており、このことは、リポソームが、関連する抗原特異的Ｔ細胞の寛容性によって、in vivoで、抗原とNF-κB阻害剤の双方をAPCに向けて送達することができ、そして、APCのNF-κB活性が抑制されることを示唆している。

リポソームによる関節炎の抗原特異的抑制は、NF-κB阻害剤で処置したDCによる抑制と同等である。

関節炎の抑制に関するリポソームの効果を評価するために、二週間に二度、mBSAを含んだ完全フロイントアジュバントの投与および増量をすることによって抗原誘発性関節炎(AIA)を誘発し、その後に、一方の膝関節にmBSAを注射した。 ６日後に、関節の腫れが臨床的に明確に確認できれば、Bay11-7082の存在下で生成し、かつmBSAが与えられたDC、あるいは、リポソームのいずれかを、関節炎を患ったマウスにs.c.注射した。 ４日後に、関節の腫れの程度をカリパスで測定し、そのスコアを決定した。 リポソームとして、リポソーム単体、mBSAだけを含んだもの、mBSAとクルクミンを含んだもの、クエルセチンとmBSAを含んだもの、Bay11-7082とmBSAを含んだもの、クルクミンだけを含み、かつ投与直後に可溶性mBSAが注射されるもの、あるいは、mBSAだけを含み、かつ投与直後に可溶性Bay11-7082が注射されるもの、を用意した(図５)。 これらデータは、粒子内に抗原とNF-κB阻害剤の双方を含んでいる二つのリポソームが、急性炎症性関節炎の抑制に関して同等の効果を奏することを示している。 しかしながら、一成分だけを含んでいるリポソームでは、その他の成分を直後に皮下組織に注射しても、関節炎を抑制する顕著効果は認められなかった。

選択したNF-κB阻害剤とモデル抗原を捕捉しているリポソームの特性
リポソームは、選択したNF-κB阻害化合物、特に、親油性の化合物を送達するための有用な担体である。 食細胞DC前駆体に向けて、in vivoで、NF-κB阻害剤を標的化することによって、特定の抗原に対する免疫寛容性を獲得するために、本願発明者らは、NF-κBを有するリポソーム内に抗原も一緒に取り込もうとした。 リポソームに取り込むために選ばれた幾つかのNF-κB阻害剤として、Bay11-7082、クルクミン、および、クエルセチンなどがある。 最後の二つは、Bay11-7082よりも 親油性に富んでいるので、リポソームの脂質二重層に対して良好な親和性を示し、また、良好に保持されるものと考えられる。

クルクミン (１,７-ビス(４-ヒドロキシ-３-メトキシフェニル)-１,６-ヘプタジエン-３,５-ジオン)は、ウコン属ショウガ科(ウコン)の根茎から単離されたフェノール天然物であり、このものは、抗炎症性および抗突然変異性を示し、また、p38 MAPキナーゼやNF-κBなどのように、多数の細胞型での幾つかの情報伝達経路の阻害に寄与する抗酸化活性をも備えている(Kim, G.Y., K.H. Kim, S.H. Lee, M.S. Yoon, H.J. Lee, D.O. Moon, C.M. Lee, S.C. Ahn, Y.C. Park, and Y.M. Park. 2005. Curcumin inhibits immunostimulatory function of dendritic cells: MAPKs and translocation of NF-kappaB as potential targets. J Immunol 174:8116-8124)。 クエルセチンは、アプリコット、マンゴーなどの果物に含まれる主要なフラボノイドであり、同様の性質を備えている(Kim, B.H., S.M. Cho, A.M. Reddy, Y.S. Kim, K.R. Min, and Y. Kim. 2005. Down-regulatory effect of quercitrin gallate on nuclear factor-kappa B-dependent inducible nitric oxide synthase expression in lipopolysaccharide-stimulated macrophages RAW 264.7. Biochem Pharmacol 69:1577-1583)。

50mg/mLの濃度のEPCから製造したリポソームを、本願明細書で報告した研究での基礎製剤として用いた。 したがって、まずは、これらリポソームに、親水性抗原(特に、OVAおよびmBSA)を、選択した親油性NF-κB阻害剤と共に同時に取り込めるかどうかについて、試験を行った。 従来の薄層法によって多層状のリポソームを調製し、そして、このものを、親水性の巨大分子の取り込み効率を改善するために、凍結解凍サイクルに供した。 次いで、得られたリポソーム試料を、その後のin vivoでの評価に供するために粒子サイズを小さくすべく、400nmフィルター膜を介して押し出した。

リポソームへのNF-κB阻害剤と抗原の捕捉効率に関する同時取り込みの効果
NF-κB阻害剤と抗原を共に捕捉しているリポソームを、捕捉効率、サイズ分布、ゼータ(ζ)電位、それに、親水性抗原の保持能力について検証を行った。 親油性化合物を顕著に捕捉しているにもかかわらず、凍結解凍サイクルを用いずに、従来の薄層法によって調製したリポソームは、親水性分子に関する捕捉効率は比較的に低かった。 例えば、FITC-OVAを捕捉するための同じ条件とEPC脂質濃度を用いた以前の実験では、捕捉効率が５％にも満たないとの報告がされている(Copland, M.J., M.A. Baird, T. Rades, J.L. McKenzie, B. Becker, F. Reck, P.C. Tyler, and N.M. Davies. 2003. Liposomal delivery of antigen to human dendritic cells. Vaccine 21:883-890)。 それに対して、本願発明において、５回の凍結解凍サイクルを組み込むことで、OVAの捕捉率が、ほぼ20％改善していた。 これら結果は、調製プロセスに凍結解凍サイクルを組み込むことで、親水性化合物の取り込み効率が実質的に改善することを実証するものである。

mBSAの捕捉効率(約25％)は、OVAの捕捉効率よりも若干高い。 このことは、その親油性を増大させうるBSAのメチル化に寄与するかもしれない。 そのようにして増大した親油性は、OVAよりも顕著にmBSAを捕捉する役割を果たすことになるかもしれない。 さらに、異なる供給源から得たアルブミンタンパク質が、様々な度合いでリポソームと相互作用することが、これまでに報告されている(Dimitrova, M.N., H. Matsumura, A. Dimitrova, and V.Z. Neitchev. 2000. Interaction of albumins from different species with phospholipid liposomes. Multiple binding sites system, Int J Biol Macromol 27:187-194)。 このことは、アミノ酸配列の違いに起因するものであって、タンパク質の表面性状、ひいては、タンパク質とリポソームとの間の相互作用性にも差異をもたらす。

NF-κBを取り込んでいるリポソームに対するOVAの捕捉率は、すべての事例において、阻害剤を含んでいないリポソームに対するOVAの捕捉率よりも、わずかに大きかったが、NF-κB阻害剤と共にOVAまたはmBSAのいずれかを捕捉させた事例では、両者の間に、統計学的に有意の差異は認められなかった(ｐ>0.05)。 さらに、同じNF-κB阻害剤を含んでいるリポソームを用いて比較したところ、リポソーム製剤をOVAまたはmBSAのいずれを用いて調製しても、NF-κB阻害剤の捕捉率に統計学的差異は認められなかった(ｐ>0.05)。 クエルセチンやクルクミンなどの親油性に富んだ化合物の捕捉率(logＰ>3)は、80％を超えるものであったが、Bay11-7082のような親油性が乏しい化合物の捕捉率(logＰ=1.63)は、60％程度であった。

リポソームの捕捉に関して、抗原とNF-κB阻害剤との間に関係がないものと考えられた。 親油性のNF-κB阻害剤は、疎水性の相互作用を介してリン脂質の脂肪鎖と相互作用する脂質二重層内に、リン脂質の極性端部と相互作用するその極性官能基で、捕捉されるものと考えられる。 これに対して、親水性抗原は、水性ドメインに取り込まれるものと考えられ、また、脂質二重層の表面に対するその相互作用は、タンパク質の表面活性作用に起因するものと思われる。 したがって、親油性NF-κB阻害剤と親水性抗原をリポソームに取り込んでも、両者の間に相互作用が生じることはほとんどなく、よって、各々の捕捉効率に関して相互作用に起因する影響は及ばなくなる。 これら結果は、親水性／親油性、および、分子サイズの双方に関して全く異なるNF-κB阻害剤と抗原とを同時に送達する上で、リポソームが好適であることを実証している。

抗原とNF-κB阻害剤を捕捉しているリポソームの粒子サイズ、多分散性、および、ゼータ(ζ)電位に関する同時捕捉の効果
クエルセチンを除いて、mBSAおよびNF-κB阻害剤の双方を捕捉するリポソームの粒子サイズは、約350nmであった。 この数値は、NF-κB阻害剤を取り込んでいるが、抗原を含んではいないリポソームのサイズと同様であり、また、統計学的な差異(ｐ>0.05)は認められない。 しかしながら、捕捉したNF-κB阻害剤にかかわらず、OVAを捕捉しているリポソームの粒子サイズは、mBSAを捕捉しているリポソームの粒子サイズ(409.9±16.9nmに対して、NF-κB阻害剤を含んでいないリポソームでは328.7±22.0nm)、それに、抗原を含んでいないリポソームの粒子サイズよりも若干に大きい。 OVAを用いて調製したリポソームは、押し出し形成が若干難しいので、400nmの膜を利用して単純に押し出す(10サイクル)プロトコールを、OVAリポソームのために、まず、800nmの膜(５サイクル)、次いで、400nmの膜(５サイクル)を利用して連続的に押し出す方式に改めた。

クエルセチンと共に抗原を捕捉しているリポソームの粒子サイズは、その他のNF-κB阻害剤と抗原とを捕捉しているリポソームの粒子サイズよりも大きかった(ｐ<0.05)。 観察された粒子サイズが大きかった理由として、二重層へのクエルセチンの挿入が考えられ、これにより、二重層脂質のパッキングパラメーター、それに、水素結合を介した脂質極性端部官能基を有するクエルセチンによる相互作用性に影響が及んだものと考えられる。

OVAまたはmBSAを捕捉しているリポソームのゼータ電位に有意の差異は認められなかった(ｐ>0.05)。 さらに、NF-κB阻害剤だけを取り込んでいるリポソームと比較しても、抗原の取り込みを行っても、これらリポソーム製剤のゼータ電位には影響が及ばなかった(ｐ>0.05)。 リポソーム内部の水性ドメインにおける抗原の位置を改めて考慮すると、抗原の取り込みによって、リポソーム表面の電位、ひいては、ゼータ電位の変化には至らないものと考えられた。 しかしながら、ゼータ電位の変化が認められなかったことは、いずれの抗原も、リポソームの外表面にその相当量が吸収されてしまい、そして、取り込まれていない抗原が、遠心分離によって除去されたことを示唆するものである。

以上をまとめると、いずれの抗原を取り込んだとしても、NF-κB阻害剤だけを捕捉しているリポソームと比較して、サイズ、サイズ分布、および、ゼータ電位などの、NF-κB阻害剤を有するリポソームの物理的性状を顕著に改変するに至らないことを、これら結果は示している。

NF-κB阻害剤と抗原を捕捉しているリポソーム製剤の安定性
抗原とNF-κB阻害剤を捕捉しているリポソームの安定性を、４℃で、７日間にわたって貯蔵して(in vivo評価に先駆けて要求され、製剤の貯蔵に関して用いられる条件)、その粒子サイズを検証した。 これら結果は、抗原とNF-κB阻害剤を捕捉しているリポソームが、これら条件下で、少なくとも７日間にわたって貯蔵した際に、物理的に安定であったことを示している。 したがって、すべてのリポソーム製剤を４℃で貯蔵し、そして、調製を終えてから７日以内に使用した。

異なるNF-κB阻害剤を含むリポソームに捕捉された抗原の維持
リポソームを、in vivoで生体作用化合物を送達するための担体として用いる場合、水性コアに捕捉されている親水性化合物、特に、小分子は、リポタンパク質のような血清成分とリポソームとの間の相互作用に起因して、投与(例えば、静脈注射)を行った後に急速に消失するであろう(Jones, M.N., and A.R. Nicholas. 1991. The effect of blood serum on the size and stability of phospholipid loposomes. Biochim Biophys Acta 1065:145-152; Harashima, H., T.M. Huong, T. Ishida, Y. Manabe, H. Matsuo, and H. Kiwada. 1996. Synergistic effect between size and cholesterol content in the enhanced hepatic uptake clearance of liposomes through complement activation in rats. Pharm Res 13:1704-1709; Maurer, N., D.B. Fenske, and P.R. Cullis. 2001. Developments in liposomal drug delivery systems. Expert Opin Biol Ther 1:923-947)。 リポソーム膜から高密度リポタンパク質(HDL)および低密度リポタンパク質(LDL)へとリン脂質を移動させて、取り込んだ薬剤を漏出させることで、リポソームが不安定になることが示されている(Allen, T.M. 1981. A study of phospholipid interactions between high-density lipoproteins and small unilamellar vesicles. Biochim Biophys Acta 640:385-397; Scherphof, G., F. Roerdink, M. Waite, and J. Parks. 1978. Disintegration of phosphatidylcholine liposomes in plasma as a result of interaction with high-density lipoproteins. Biochim Biophys Acta 542:296-307; Hunter, J.A., Z. Shahrokh, T.M. Forte, and A.V. Nichols. 1982. Aggregation of low density lipoproteins with unilamellar phosphatidylcholine vesicles. Biochem Biophys Res Commun 105:828-834)。 インキュベーション培地にわずか10％のFBSが存在するだけで、リポソーム内容物の漏出を急速に招き、また、このものを、リポソームの血清安定性の指標としても使用できることが報告されている(Allen, T. M., and L. G. Cleland. 1980. Serum-induced leakage of liposome contents. Biochim Biophys Acta 597:418-426)。

血清中での不安定性に関わるリポソームの感受性は、特に、リポソーム膜の流動性による影響を受ける。 DSPCのようなＴ_Cの高い飽和リン脂質から構成されたリポソームは、安定性に優れ、それ故に、血漿中の溶質の漏失が抑えられることが報告されている(Hao, Y.L., Y.J. Deng, Y. Chen, X.M. Wang, H.J. Zhong, and X.B. Suo. 2005. In vitro and in vivo studies of different liposome containing topotecan. Arch Pharm Res 28:626-635; Clary, L., G. Verderone, C. Santaella, and P. Vierling. 1997. Membrane permeability and 安定性 of liposomes made from highly fluorinated double-chain phosphocholines derived from diaminopropanol, serine or ethanolamine. Biochim Biophys Acta 1328:55-64; Senior, J., and G. Gregoriadis. 1982. 安定性 of small unilamellar liposomes in serum and clearance from the circulation: the effect of the phospholipid and cholesterol components. Life Sci 30:2123-2136; Gregoriadis, G., and J. Senior. 1980. The phospholipid component of small unilamellar liposomes controls the rate of clearance of entrapped solutes from the circulation. FEBS Lett 119:43-46)。 リポソーム製剤にコレステロールを取り込むことで、脂質の抱え込み密度が増大して、二重層の安定性が改善することも知られている(Allen, T.M., and L.G. Cleland. 1980. Serum-induced leakage of liposome contents. Biochim Biophys Acta 597:418- 426, Kirby, C, J. Clarke, and G. Gregoriadis. 1980. Effect of the cholesterol content of small unilamellar liposomes on their 安定性 in vivo and in vitro. Biochem J 186:591- 598)。 さらに、リポソーム構造でのコレステロールの存在が、リン脂質のHDLへの転移を阻害することが報告されている(Damen, J., J. Regts, and G. Scherphof. 1981. Transfer and exchange of phospholipid between small unilamellar liposomes and rat plasma high density lipoproteins. Dependence on cholesterol content and phospholipd composition. Biochim Biophys Acta 665:538-545)。

今回の研究において、そこで用いたモデルリポソーム製剤は、コレステロールを含んでおらず、また、EPCからなるものであった。 したがって、リポソーム製剤が、安定であるかどうか、そして、血清の存在下で、その内容物、特に、捕捉した抗原を保持できるかどうかについて、決定を行った。 10％のFBSが補充されたHEPES緩衝液 pH 7.4で懸濁されており、しかも、様々なNF-κB阻害剤を含有するリポソームに捕捉される抗原として、FITC-OVAを用いた。 FITC-OVAの放出物を、28時間、37℃で、モニターし、そして、FBS無しで同条件でインキュベーションしたリポソームからの放出物と比較を行った。

様々なNF-κB阻害剤を含有したリポソームからのFITC-OVAの放出曲線を、図６に示している。 37℃で、10％FBSの存在下で、28時間かけてインキュベーションした後のリポソームには、同時に捕捉されたNF-κB阻害剤に関係なく、90％を超えるFITC-OVAが残存していた。 さらに、FBSの存在下または不在下でインキュベーションされたリポソーム相互には、顕著な差異は認められなかった。 FBSと共にインキュベーションすることで、リポソーム内部に抗原が十分に捕捉されていたことは、抗原の大きな分子構造、すなわち、リポソーム外部への拡散を妨げる大きな分子構造が関係しているものと考えられる。

実施例２
抗原関連リポソームまたは微小球は、調節Ｔ細胞の誘発によって、抗原特異的な抑制を誘発する。

物質および方法
試薬
ポリ(d,l-乳酸-コ-グリコール酸(PLGA)微小球は、まず、オボアルブミン、クルクミン、PLGA、および、ポリビニルアルコール(PVA)を混合し、次いで、13,500rpmで均質化し、その後に、800rpmで撹拌することによって調製した。 密度遠心分離を行った後に、粒子を５％w/vスクロース溶液に分散せしめ、篩かけし、そして、凍結乾燥した。 使用に先駆けて、PBSで粒子を復元した。 OVA-クルクミンリポソームは、実施例１に記載の手順に従って調製した。

抗原特異的抑制を試験するためのin vivoモデル
DO11.10マウスに、OVAと完全フロインドアジュバント(CFA)を与え、そして、７日後に、クルクミンOVAリポソーム、または、クルクミンOVA微粒子のいずれかを注射した。 ７日後に、これらマウスから得た脾臓細胞を精製し、そして、７日前にOVAとCFAを与えたBALB/cマウスに移植した。 その５日後に、移植を受けたマウスを屠殺し、そして、様々な濃度のOVAペプチドで再刺激をした。

結果
抗原関連リポソームまたは抗原関連微小球のいずれもが、調節Ｔ細胞の誘発によって、抗原特異的な抑制を誘発する。

OVA/CFAを与えたマウス由来のOVA特異的DO11.10 Ｔ細胞が与えられ、かつOVA/CFAを与えたマウス由来の脾臓細胞は、OVAペプチドによる再刺激に対して良好に反応した(図７、赤色ライン)。 これに対して、DO11.10 Ｔ細胞のドナーにOVA/CFAを与え、そして、OVAクルクミンリポソーム(緑色ライン)または微小球(青色ライン)で処置を行った場合には、移植を受けたマウス由来の脾臓細胞の応答は抑制されていた。 OVA/CFAを与えなかったネガティブコントロールのマウスは、OVAペプチドに対してほとんど反応をしなかった(黒色ライン)。 これらデータは、OVAとNF-κB阻害剤がカプセル封入されているリポソームや微小球が、OVAに対する所定の反応の抑制に寄与できたことを示すものである。 この抑制は、ある動物から他の動物へとＴ細胞によって伝えることができ、調節Ｔ細胞が誘発されていることを指し示す指標にもなっている(Martin E, O 'Sullivan BJ, Low P and R Thomas. antigen-specific suppression of a primed immune response by dendritic cells mediated by regulatory T cells secreting interleukin-10. Immunity 2003. 18:155-67.)。

特許、特許出願、および、本願明細書で引用した文献でのそれぞれの開示は、本願明細書の一部を構成するものとして、それらの全内容を援用する。

本願明細書に記載した文献の引用は、それら文献が、本願発明に対する「先行技術」として入手可能であることを認容するものではない。

本願明細書において、本願発明の目的を、本願発明の好適な実施態様に沿って説明してきたが、これらの開示は、本願発明を、ある特定の実施態様または特定の特徴部分の組み合わせにまで限定することを意図するものではない。 したがって、当業者であれば、本願明細書の開示に基づいて、本願発明の範囲から逸脱せずとも、特定の実施態様に対して様々な修正および変更を加えることは可能である。 そのような修正および変更のすべてを、本願特許請求の範囲の欄に記載された発明に包含されることが意図されている。

リンパ器官の樹状細胞やマクロファージなどのMHCクラスIIを発現する食細胞によって取り込まれたリポソームを示すグラフと写真である。 A-C：赤色蛍光染色剤DiIで標識付けした100μLのリポソームのC57BL/6マウスへの注射、すなわち、(A) 尾静脈への静脈注射(iv)、または、(B)尾の付根への皮下注射(sc)、あるいは、(C)腹膜内(ip)に注射を行った。 注射から24時間後に、静脈注射したマウスの脾臓細胞、そして、皮下または腹膜内に注射したマウスから排除したLNを採取して、細胞懸濁液の調製のために供した。 細胞を、抗MHCクラスII-FITC(i.v.注射およびs.c.注射用)またはCD11c-APC(IP注射用)で染色し、そして、フローサイトメトリーで分析を行った。 対照のマウスには、リポソームを投与していない。 リポソームを取り込んだクラス11+またはCDllc+細胞の比率を、重複標識四分割画分に示している。 D-H：注射から24時間後に、100μLのDiIクルクミン リポソームをi.v.注射またはs.c.注射したマウスの脾臓をOCT培地に埋設し、そして、6μmの薄片に切った。 20倍の拡大率。 (D) iv注射。 単核細胞およびマクロファージを、AlexaFluor 647 CDl1b(青色)およびAlexaFluor 488 F480(緑色)の各々で染色した脾臓。 DiI+リポソームは、赤色で表示された。 (E) iv注射。 薄片に切断され、かつ骨髄樹状細胞およびマクロファージを、AlexaFluor 647 CD11c(青色)およびAlexaFluor 488 F480(緑色)の各々で染色した脾臓。 (F) sc注射。 薄片に切断され、かつAlexaFluor 647 CD11b(青色)およびAlexaFluor 488 F480(緑色)の各々で染色した脾臓。 (G) iv注射。 薄片に切断され、かつAlexaFluor 647 CD11c(青色)およびAlexaFluor 488 F480(緑色)の各々で染色した脾臓。 (H) 注射されていない対照の脾臓であって、CDllb/F480(左側のグラフ)およびCDllc/F480(右側のグラフ)で染色したが、DiI染色(赤色)は認められなかった。 NF-κB阻害剤が、リンパ節細胞を排除する際にNF-κB応答をブロックすることを示すグラフである。 C57BL/6マウスに、50μLのリポソーム製剤をi.v.注射した。 24時間後、脾臓を除去して、細胞懸濁液の調製のために供した。 100ng/mLのLPSを含む培地または100ng/mLのLPSを含まない培地で、細胞を、24時間かけてインキュベーションした。 細胞核抽出物を取得して、そして、ELISAで、p50 NF-κB DNA結合について分析を行った。 各棒グラフは、三匹のマウスのプールから得たp50/NF-κB DNAの結合レベルを示している。 試験結果は、リポソームで処理したマウスに関する三つの実験から得た平均値と誤差値としてのSDとを示している。 *p<0.05、リポソーム無しで投与を行った後の応答と、クルクミンリポソームおよびクエルセチンリポソームを投与した後のLPS応答との比較値である。 リポソームと抗原との組み合わせが、粒子内のNF-κB阻害剤の有無によって、LNを排除するにあたって特異的Ｔ細胞応答を刺激することを示すグラフである。 CSFEで標識付けしたOVA特異的Ｔ細胞の選択的導入の１日後に、50μLの差ｍざｍな様々なリポソーム製剤でBALB/cマウスを処置した。 72時間後に、鼠蹊部リンパ節を除去して、細胞懸濁液の調製のために供した。 次いで、OVA-特異的TCRを認識し、かつPEで標識付けをされたKJ1-26抗体で細胞を染色し、そして、フローサイトメトリーで分析を行った。 円弧(Rl)で示したドットプロットは、親Ｔ細胞であり、一方で、矩形(R2)で示したドットプロットは、娘細胞である。 このヒストグラムは、リポソームで処置していないマウス(フィルヒストグラム)のＴ細胞応答と比較して、様々なOVA製剤で処置したマウス(ラインヒストグラム)のＴ細胞応答を示すCFSE蛍光強度(右側から左側へ)の減少を実証している。

試験結果は、二つの別個の実験結果を示している。
抑制されたOVAが、リポソームおよびNF-κB阻害剤によって送達されたOVAに対する応答を再現することを示すグラフである。 OVA特異的DOl1.10 Ｔ細胞への選択的導入を行った後に、Balb/cマウスをOVA-CFAで処置した。 ７日後に、OVA-CFA(赤色ライン)、OVAおよびBay 11-7082の双方を取り込んだリポソーム(青色ライン)、OVAおよびクエルセチンの双方を取り込んだリポソーム(茶色ライン)、OVAおよびクルクミンの双方を取り込んだリポソーム(燈色ライン)、または、OVAおよびQuilAの双方を取り込んだリポソーム(緑色ライン)で、マウスを処置した。 処置を行って７日後に、鼠蹊部リンパ節からＴ細胞を回収し、そして、RPMI+10％ FCSにおいて培養をした。 検出のための[³H]チミジンを用いて、0-10μg/mLの濃度のナイーブDCおよびOVAペプチド(323-339)と共に、72時間のインキュベーションを行った後に、Ｔ細胞の増殖の評価を行った。 三つのウェルから得たcpm値の平均値とSEMとして示した誤差範囲を示した。 試験結果は、二つの別個の実験結果を示している。 抗原とNF-κB阻害剤の双方を含むリポソーム微粒子が、抗原特異的に関節炎を抑制することを示すグラフである。 抗原誘発性関節炎(AIA)は、２週間の期間内に２度、mBSAを含む完全フロイントアジュバントで処置して刺激を与え、その後に、一方の膝関節にmBSAを注射して誘発した。 ６日後に、十分な関節の腫れが臨床的に認められれば、リポソーム、または、Bay 11-7082の存在下で生成され、かつmBSAが加えられたDCのいずれかを、s.c.注射した。 ４日後に、関節の腫れ具合を、カリパスで計測した。 リポソームとして、リポソーム不含画分、mBSAだけを含むリポソーム、mBSAとクルクミンを含むリポソーム、クエルセチンとmBSAを含むリポソーム、Bayl1-7082とmBSAを含むリポソーム、クルクミンだけを含むリポソームと可溶性の注射用mBSAとの組み合わせ、またはmBSAだけを含むリポソームと可溶性の注射用Bayl1-7082との組み合わせ、のいずれかを用いた。

**p<0.001、***p<0.0001、処置を行わずに関節炎を患ったマウスとの比較値である。 各グループに５匹のマウスを割り当てて、試験を３回繰り返した。
様々なNF-κB阻害剤を取り込んだリポソームでのFITC-OVAの存在を示すグラフである。 FITC-OVAだけを取り込んだリポソーム(●)、FITC-OVAとBay11-7082の双方を取り込んだリポソーム(▲)、FITC-OVAおよびクエルセチンの双方を取り込んだリポソーム(Δ)、および、FITC-OVAとクルクミンの双方を取り込んだリポソーム(○)を、pH 7.4のHEPES緩衝液(A)または10％FBSを加えたpH 7.4のHEPES緩衝液(B)で、37℃で、インキュベーションした。 FITC-OVAの放出を、蛍光分光光度計で、28時間にわたってモニターした。 OVA-クルクミン-リポソームまたはOVA-クルクミン-微小球のいずれもが、調節Ｔ細胞を誘発することを示すグラフである。 DOl1.10マウスを、OVAおよび完全フロインドアジュバントで処置し、そして、７日後に、クルクミン-OVAリポソームまたはクルクミン-OVAポリマー微粒子のいずれかを注射した。 その７日後に、脾臓細胞を精製し、そして、処置を施した被移植者側のBALB/cに移された。 ５日後にマウスを屠殺し、そして、様々な濃度のOVAペプチドで脾臓細胞を再刺激した。

Claims (31)

1. 標的抗原に対する免疫応答を調節するための組成物であって、ＮＦ-κＢ経路の阻害剤と標的抗原の少なくとも一部に対応する抗原とを含み、そして、当該阻害剤および当該抗原が粒子の形態である組成物。
2. 前記阻害剤および前記抗原が、少なくとも一つの粒子に含有されている請求項１に記載の組成物。
3. 前記阻害剤および前記抗原が、同じ粒子に含有されている請求項２に記載の組成物。
4. 前記阻害剤および前記抗原が、異なる粒子に含有されている請求項２に記載の組成物。
5. 前記粒子が、マトリックス、担体または基質異を含む請求項２に記載の組成物。
6. 前記粒子が、ナノ粒子および微粒子から選択される請求項２に記載の組成物。
7. 前記粒子が、脂質マトリックスまたは担体を含む請求項２に記載の組成物。
8. 前記粒子が、リポソームである請求項７に記載の組成物。
9. 前記粒子が、金属粒子を含む請求項２に記載の組成物。
10. 前記粒子が、重合マトリックスまたは担体を含む請求項２に記載の組成物。
11. 前記粒子が、セラミックマトリックスまたは担体を含む請求項２に記載の組成物。
12. 前記抗原が、アレルゲン、自己抗原、および、アロ抗原からなるグループから選択される請求項１に記載の組成物。
13. 前記抗原が、タンパク質抗原、脂質抗原、糖脂質抗原、および、炭水化物抗原からなるグループから選択される請求項１に記載の組成物。
14. 前記自己抗原が、狼瘡自己抗原、Smith、Ro、La、Ul-RNP、フィブリリン；核抗原、ヒストン、糖タンパク質 gp70、および、リボソームタンパク質；ピルビン酸デヒドロゲナーゼデヒドロリポアミドアセチルトランスフェラーゼ(PCD-E2)；毛嚢抗原；ヒトトロポミオシンアイソフォーム５(hTM5)；プロインシュリン、インシュリン、IA2、および、GAD65：II型コラーゲン、ヒト軟骨gp39 (HCgp39)、および、gpl30-RAPS、dnaJpl、シトルリン化タンパク質およびペプチド、シトルリン化II型コラーゲン、シトルリン化ビメンチンおよびシトルリン化フィブリノーゲン；ミエリン塩基性タンパク質、プロテオリピドタンパク質(PLP)、および、ミエリンオリゴデンドログリア糖タンパク質(MOG)；甲状腺刺激因子受容体(TSH-R)；アセチルコリン受容体(AchR)；グリアジン；ヒストン、PLP、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、チログロブリン、様々なtRNAシンテターゼ、プロテイナーゼ-3、および、ミエロペルオキシダーゼ、からなるグループから選択される請求項１２に記載の組成物。
15. 前記アレルゲンが、FeI d I、Der p I、Der p II、Der fl、Der fll；牧草、樹木および(ブタクサを含む)雑草の花粉；真菌およびカビ；魚類、貝類、カニ、ロブスター、ピーナッツ、ナッツ類、小麦グルテン、卵、牛乳などの食料品；ハチ、ジガバチ、スズメバチ、ユスリカ、イエバエ、ミバエ、ヒツジバエ、ラセンウジバエ、グレインゾウムシ、カイコ、ミツバチ、非ヌカカ幼虫、ハチミツガ幼虫、ゴミムシダマシ、ゴキブリ、チャイロコメノゴミムシダマシ、カブトムシ、クモ、および、ダニの幼虫；頭垢、尿、唾液、哺乳類の血液またはその他の体液、浮遊微粒子、ラテックス；および、タンパク質洗浄用添加物に由来するアレルゲンからなるグループから選択される請求項１２に記載の組成物。
16. 前記移植抗原が、ドナー細胞、または、心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓、神経移植成分から選択される組織、あるいは、外因性抗原の不在下で自己抗原を具備するＭＨＣを有する細胞をもたらすドナー抗原に由来する請求項１２に記載の組成物。
17. 前記抗原が、非核酸の形態である請求項１に記載の組成物。
18. 前記ＮＦ-κＢ経路の阻害剤が、BTK、LYN、BCR Igα、BCR Igβ、Syk、Blnk、PLCγ2、PKCβ、DAG、CARMAl、BCLlO、MALTl、PIK3、PIP3、AKT、p38 MAPK、ERK、COT、IKKα、IKKβ、IKKγ、NIK、RelA/p65、P105/p50、c-ReI、ReIB、p52、NIK、Leul3、CD81、CD19、CD21、および、補体および凝固カスケードでのそれらのリガンド、TRAF6、ユビキチンリガーゼ、Tab2、TAKl、NEMO、NOD2、RIP2、Lck、fyn、Zap70、LAT、GRB2、SOS、CD3ゼータ、Slp-76、GADS、ITK、PLCγl、PKCθ、ICOS、CD28、SHP2、SAP、SLAM、および、2B4からなるグループから選択されるＮＦ-κＢ経路の構成要素の機能活性レベルを低下させる請求項１に記載の組成物。
19. 前記ＮＦ-κＢ経路阻害剤が、RelA/p65、P105/p50、c-Rel、RelB、または、p52の一つ以上の機能活性レベルを低下させる請求項１８に記載の組成物。
20. 前記ＮＦ-κＢ経路の阻害剤が、SHPl、SHIP、PIR-B、CD22、CD72、FcgRIIB、IκB、PlOO、CTLA4、PD-I、CbI、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR2DL、および、Cskからなるグループから選択されるＮＦ-κＢ経路の構成要素の機能活性レベルを増大させる請求項１に記載の組成物。
21. 前記ＮＦ-κＢ経路の阻害剤が、非核酸の形態である請求項１に記載の組成物。
22. 前記ＮＦ-κＢ経路の阻害剤が、クエルセチン、クルクミン、および、Bay 11-7082から選択される請求項１に記載の組成物。
23. 薬学的に許容可能な担体または希釈剤をさらに含む請求項１に記載の組成物。
24. 被験者の標的抗原に対する免疫応答を調節する方法であって、ＮＦ-κＢ経路の阻害剤と標的抗原の少なくとも一部に対応する抗原とを同時に当該被験者に投与する工程を含み、当該阻害剤と当該抗原が粒子の形態である方法。
25. 前記組成物が、標的抗原に対する免疫応答の調節を効果的な期間と用量でもってして、注射、局所投与、または、持続的放出型投与を含む経鼻経路または経口経路で、投与される請求項２４に記載の方法。
26. 前記組成物が、全身投与される請求項２４に記載の方法。
27. 前記組成物が、皮下投与される請求項２４に記載の方法。
28. 前記組成物が、皮内投与される請求項２４に記載の方法。
29. 被験者の標的抗原に対して好ましくない免疫応答または有害な免疫応答を招くおそれのある症状または病因を伴う病態を処置または予防するための方法であって、有効量のＮＦ-κＢ経路の阻害剤、または、標的抗原の少なくとも一部に対応する抗原を被験者に投与する工程を含み、当該阻害剤と当該抗原が粒子の形態である方法。
30. 標的抗原に対する免疫応答の抑制、または、当該標的抗原が関係するアレルギーまたは自己免疫疾患の処置または予防、あるいは、当該標的抗原が関係する移植物拒絶の処置または予防のための治療剤の製造のためのＮＦ-κＢ経路の阻害剤と標的抗原の少なくとも一部に対応する抗原の使用。
31. ＮＦ-κＢ経路の阻害剤と標的抗原の少なくとも一部に対応する抗原の使用であって、標的抗原に対する免疫応答の研究と調節において、当該阻害剤および当該抗原が、粒子の形態である使用。

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