WO2004073596A2 - Composition vaccinale comprenant un antigene proteique du vih incorpore dans des vesicules lipidiques multilamellaires. - Google Patents

Composition vaccinale comprenant un antigene proteique du vih incorpore dans des vesicules lipidiques multilamellaires. Download PDF

Info

Publication number
WO2004073596A2
WO2004073596A2 PCT/FR2004/050052 FR2004050052W WO2004073596A2 WO 2004073596 A2 WO2004073596 A2 WO 2004073596A2 FR 2004050052 W FR2004050052 W FR 2004050052W WO 2004073596 A2 WO2004073596 A2 WO 2004073596A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
composition according
antigen
vesicles
hiv
Prior art date
Application number
PCT/FR2004/050052
Other languages
English (en)
Other versions
WO2004073596A3 (fr
Inventor
Sophie Gaubert
Marie-Josèphe DALLOT
René LAVERSANNE
Original Assignee
Ethypharm
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ethypharm filed Critical Ethypharm
Publication of WO2004073596A2 publication Critical patent/WO2004073596A2/fr
Publication of WO2004073596A3 publication Critical patent/WO2004073596A3/fr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1274—Non-vesicle bilayer structures, e.g. liquid crystals, tubules, cubic phases, cochleates; Sponge phases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0043—Nose
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2

Definitions

  • Vaccine composition intended to induce an immune response against the virus responsible for AIDS
  • the present invention relates to a vaccine pharmaceutical composition intended to induce an immune response against the virus responsible for AIDS.
  • the invention relates to a vaccine composition intended to administer an antigen of the human immunodeficiency virus (HIV) and to amplify and orient the immune response induced against this antigen both by injection and after administration by the mucous route.
  • HIV human immunodeficiency virus
  • the immune system protects the body against pathogens and exogenous agents. It sets up a humoral immunity composed of seric antibodies distributed in different subclasses or isotypes and a cellular immunity.
  • the cellular component is characterized by the activation of TCD4 + and TCD8 + cytotoxic (CTL) lymphocytes and NK cells. It is demonstrated by lymphoproliferation, the secretion of interleukins and / or the lysis of infected or tumor cells.
  • Interleukins (IL) are soluble mediators that act autocrine or paracrine on different cell types of the immune system. TCD4 + lymphocytes can be classified into two types according to the profile of interleukins they secrete.
  • type 1 or Thl lymphocytes secrete IL-2 and Gamma Interferon whereas type 2 or Th2 lymphocytes secrete IL-4, IL-5 and IL -10.
  • the mode of presentation of the antigen to the antigen presenting cells will also early condition the type of response induced.
  • the dose, frequency, mode of presentation and route of administration influence the immune response.
  • the antigens can be administered by parenteral, systemic or mucosal immunization.
  • Mucosal means a non-invasive administration of the antigen to a mucous site, for example - nasopharyngeal area
  • MALT mucous membranes
  • the mucosal response is the response of the immune system to the mucous membranes, characterized by the production of IgA (isotype in high concentration in the mucous membranes) and of IgG and / or by a cellular response within the mucous site and the draining nodes.
  • the systemic response is the response of the generalized immune system resulting in the presence of circulating antibodies (IgG distributed in different subclasses and also IgA) and / or by a cellular response (Thelper or CTL) in the secondary lymphoid organs (spleen , lymph nodes).
  • IgG circulating antibodies
  • CTL cellular response
  • An adjuvant is a substance added to the antigen in order to amplify and direct the specific immune response directed against this antigen.
  • Vectorization by a synthetic vector consists in incorporating the antigen into and / or on the surface of a particle or vesicle, so as to protect the antigen and / or to facilitate its capture by the competent cells of the immune system and / or to facilitate the preparation of the antigen by said cells, and thus to amplify the immune response.
  • the addition of an empty vector to the free antigen generally brings little or no amplification.
  • HIV antigens are polyproteins or proteins encoded by the HIV genome. Nine genes code for HIV immunodeficiency virus (HIV) antigens are polyproteins or proteins encoded by the HIV genome. Nine genes code for HIV immunodeficiency virus (HIV) antigens.
  • polyproteins or structural proteins • proteins with enzymatic activity: proteases or proteins involved in integration, reverse transcription and replication, and
  • proteins can be glycosylated (glycoproteins).
  • protein antigen of the HIV virus within the meaning of the present invention, is meant all the antigens of the HIV virus in the form of proteins or polyproteins, glycosylated or not.
  • AIDS is a plague which affects more than 30 million humans and for which there is currently no vaccine, neither prophylactic nor therapeutic.
  • the vaccine appears to be the only effective means of control, antiviral therapies being prohibitively expensive.
  • the main adjuvants are detoxified toxins, for example the heat-sensitive endotoxin of E. Coli (cf. WO 98/32461 from The Administrators of the Tulane Educational Fund), or modifications of lipid A, for example 3D Mpl (deacylated monophosphoryl 3 of lipid A) as described in WO 92/06113.
  • detoxified toxins for example the heat-sensitive endotoxin of E. Coli (cf. WO 98/32461 from The Administrators of the Tulane Educational Fund)
  • modifications of lipid A for example 3D Mpl (deacylated monophosphoryl 3 of lipid A) as described in WO 92/06113.
  • 3D Mpl deacylated monophosphoryl 3 of lipid A
  • Many other adjuvants have been developed, such as saponin derivatives, muramyl dipeptide, detoxified tetanus or cholera toxins, but few documents describe their use in vaccines directed against AIDS.
  • DC-Chol obtained by reaction of choloroformate on N, N-dimethylethylenediamine according to WO 96/40067
  • Another recent approach is the use of oligonucleotides having a CpG sequence, known for its ability to amplify and orient the immune response. They are described for application against the AIDS virus in WO 01/00232. Their mode of action is different from more conventional adjuvants, since they can be administered before the immunization itself.
  • adjuvants are used simultaneously in order to benefit from a synergistic effect. This is the case of WO 01/00232 which couples an adjuvant to aluminum base and a CpG oligonucleotide.
  • the adjuvant and / or the antigen are formulated in the form of an emulsion, generally of the oil in water type (cf. WO 92/06113 and WO 02/28427).
  • liposomes or other lipid or amphiphilic vesicles coupled with HIV proteins in an AIDS vaccine strategy There are few documents teaching the use of liposomes or other lipid or amphiphilic vesicles coupled with HIV proteins in an AIDS vaccine strategy.
  • the use of liposomes is cited in WO 02/28427 but the reading of Example 8 teaches that only the DC-Chol adjuvant is incorporated in the liposomes.
  • WO 99/00142 teaches the use of lyophilized liposomes to orally administer a viral protein, in particular HIV.
  • WO 96/40243 of the US Department of the Army, teaches the use of liposomes comprising the protein GP120 and lipid A to induce an immune response.
  • the bibliographic part of this document demonstrates, with the help of numerous citations, that the use of liposomes to amplify an immune response against a given antigen is not obvious, and that no predictive tool exists to anticipate the result.
  • the route of vaccine administration certainly plays an important role.
  • the pathogen having a mucosal entry door, the generation of IgA antibodies, specific to the mucous tissue, and moreover, in the urogenital mucosa is a characteristic sought in a prophylactic AIDS vaccine.
  • WO 99/00142 describes and teaches only the oral route
  • WO 02/28427 proposes, in addition to the injectable route, a mucous (nasal) route.
  • a mucous (nasal) route It is known that systems based on aluminum or calcium salts cannot be used in mucosal administration, because of their local intolerance on the nasal mucous membranes and in particular on the hair function. None of the antigen or adjuvant delivery technologies have yet made it possible to get an AIDS vaccine on the market. Antigen presentation methods therefore need to be further improved and the development of new adjuvants or antigen vectors remains an urgent need in the development of an HIV vaccine.
  • WO 98/02144 WO 99/16468. They are distinguished from liposomes by:
  • the inventors of the present invention have now discovered that the subcutaneous administration of a composition comprising an HIV protein antigen incorporated in vesicles of the type of those described in application WO 99/16468, generates a directed immune response against this antigen and that, in addition, this response is oriented, with a significant change in the distribution of antibody subclasses in favor of IgG2a antibodies.
  • the administration of the same composition by the mucosal route leads to the induction of both IgG antibodies, but also of HIV-specific IgA in the systemic compartment and in different mucosal sites.
  • compositions in which the HIV antigen is incorporated in a vesicle with onion structure allow when 'They are administered via the mucosa, to generate an immune IgA delocalized mucosal response (pulmonary, intestinal and vaginal) and therefore to stimulate the common mucous lymphoid tissue.
  • IgA delocalized mucosal response pulmonary, intestinal and vaginal
  • Such capacities are particularly important when dealing with antigens with immunizing potential, in the face of invasive pathogens with a mucous tropism such as HIV, the gateway to which is precisely mucous.
  • compositions of the invention modify the isotype towards an IgG2a response suggests an orientation of the cellular response towards a type 1 profile (the polarization towards IgG2a being dependent on the secretion of Interferon- ⁇ ).
  • This orientation constitutes a particular advantage of the compositions of the invention since this profile is particularly sought after when it is a question of fighting against viruses and in particular against HIV.
  • the multilamellar vesicles used according to the invention can be prepared from biocompatible constituents known for their harmlessness.
  • the preparation process is simple to implement and uses only common chemical devices.
  • the invention relates to a pharmaceutical composition containing a dispersion or a suspension in a pharmaceutically acceptable vehicle of multilamellar vesicles with an internal crystal-liquid structure, formed of a stack of concentric bilayers based on amphiphilic agents alternating with layers of water, aqueous solution, polar liquid or solution of a polar liquid and in which is incorporated at least one protein antigen of the HIV virus.
  • the antigen (s) are an integral part of the entity formed by the vesicle. Indeed, one can find molecules of antigen (s) in any layer between the center and the periphery of said vesicle.
  • the pharmaceutical compositions according to the invention can be used as a vaccine intended to induce a systemic or mucosal response.
  • the onion-structured vesicles as defined above incorporating an HIV antigen induce, in humans or animals, the production of specific antibodies directed against HIV and this, whether by injection or by mucous administration, in particular nasal.
  • the invention relates to a process for manufacturing the compositions of the invention, comprising the preparation of vesicles with crystal-liquid structure by transformation of a crystal-liquid phase containing at least one amphiphilic agent and at minus an HIV protein antigen and the dispersion of said vesicles in a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • the vesicles used according to the invention generally have diameters between 0.1 and 25 ⁇ m, preferably between 0.2 and 15 ⁇ m.
  • the vesicles contained in the compositions of the invention consist of several layers of amphiphilic agents alternating with layers of aqueous or polar phase.
  • the thickness of each of these layers is a molecular thickness, typically of the order of 5 to 10 nanometers.
  • a diameter of between 0.1 ⁇ m and a few tens of micrometers is therefore obtained.
  • the size profile can be studied using a laser granulometer (using the static scattering of a laser beam, analyzed from several angles).
  • the vesicles in which the antigen is incorporated have, as previously explained, a multilamellar onion structure and consist, from their center to their periphery, of a succession of lamellar layers separated by a liquid medium.
  • These vesicles can be obtained by a process comprising the preparation of a crystal-liquid lamellar phase and its transformation by application of a shear. Such a process is in particular described in patent WO 93/19735 from French patent FR-2,689,418 or WO 95/18601.
  • Such vesicles have, inter alia, the advantage of being able to be prepared by a particularly simple preparation process allowing the use of a wide variety of surfactants.
  • Another advantage also linked essentially to the process used to prepare the onion-structure vesicles used according to the invention, lies in the fact that the active agents and additives are incorporated before the formation of the vesicles, which allows a excellent encapsulation yield, hence better efficiency and very significant savings for extremely expensive molecules.
  • Such structures are advantageously obtained by incorporating at least one HIV protein antigen into a crystal-liquid lamellar phase comprising at least one surfactant, then transformation of this crystal-liquid lamellar phase into a dense phase of small multilamellar vesicles.
  • the vesicles used according to the invention can be obtained according to a process according to which a lamellar liquid-crystal phase is prepared incorporating at least one antigen and the rearrangement of said crystal-liquid phase is made into multilamellar vesicles by application of a shear .
  • This shear can be a homogeneous shear, which has the advantage of leading to vesicles of perfectly homogeneous size.
  • simple mechanical stirring may prove to be sufficient to lead to the formation of the multilamellar vesicles of the invention.
  • the antigen may be any protein antigen of the HIV virus.
  • It may also be an antigen in the form of a protein or a polyprotein, glycosylated or not.
  • It may in particular be a protein or a glycoprotein, called a structural protein, originating from the envelope of the virus or its nucleocapsid or a regulatory or enzymatic protein or any protein derived from this type of protein.
  • the antigen may in particular be an envelope protein of the HIV virus, in particular a protein of the GP 160 type or a protein derived from the GP 120 or GP 41 type encoded by the env gene.
  • the antigen may also be an enzymatic protein involved in the integration, transcription, replication of the virus and its genetic material.
  • An example of such a preferred protein according to the invention is the P24 protein.
  • the multilamellar vesicles with an onion structure are prepared according to the methods described above, in particular in international application WO 99/16468.
  • the amphiphilic molecules used for their preparation will be chosen, without this being an obligation, from the molecules described in the pharmacopoeia, or already used in drugs applied to the mucous membranes or injected parenterally.
  • the bilayers of the vesicles contained in the compositions of the invention contain at least one surfactant chosen from the group consisting of:
  • esters ethoxylated or not, C 6 to C 30 fatty acids, saturated or mono- or polyunsaturated, linear or branched, and
  • - ethers ethoxylated or not, C 5 to C 30 fatty alcohols, saturated or mono- or polyunsaturated, linear or branched, ethoxylated or not and > sucrose,
  • Co-surfactants may be added to these surfactants which can be used alone or as a mixture in order to improve the rigidity and / or the tightness of the bilayers forming the vesicle.
  • these molecules there may be mentioned: - cholesterol and its derivatives, in particular charged or neutral cholesterol esters such as cholesterol sulfate
  • phytosterols sitosterol, sigmasterol, etc.
  • the formulation advantageously involves a mixture of surfactant molecules. It is generally used at least two different surfactants having different hydrophilic-lipophilic scales, which makes it possible to continuously regulate the properties of the bilayers and thus to control the appearance of the instability which governs the formation of multilamellar vesicles.
  • the first surfactant will advantageously have a hydrophilic-lipophilic balance between 1 and 6, preferably between 1 and 4, while the second surfactant will have a hydrophilic-lipophilic balance greater than 3, preferably greater than 4.
  • amphiphilic agents used for the preparation of the vesicles according to the invention will consist of a mixture of a phospholipid and a nonionic surfactant.
  • the nonionic surfactant will advantageously be a fatty acid ester, preferably a fatty acid ester of polyethylene glycol or of sorbitan or a polysorbate; the phospholipid will, for its part, advantageously be a phosphatidylcholine.
  • the amphiphiles constituting the vesicles will consist of a mixture of phosphatidylcholine and macrogol oleate (polyethylene glycol oleate) or of a mixture of phosphatidylcholine and polysorbate 80.
  • the preparation obtained after transformation of the lamellar liquid-crystal phase into multilamellar vesicles can then be diluted, in particular with an aqueous solvent such as, for example, a buffer solution, a saline solution or a physiological solution, to thereby obtain an aqueous suspension vesicles.
  • an aqueous solvent such as, for example, a buffer solution, a saline solution or a physiological solution
  • the encapsulation technique used according to the present invention makes it possible to easily achieve very high encapsulation yields, or even close to 100%. However, such yields are not always essential depending on the intended applications.
  • the encapsulation yield of the antigen (s) in the compositions of the invention is advantageously greater than 50%, preferably greater than 80%.
  • the structure of the vesicles is responsible for the particularly advantageous results obtained, and that the multilamellar vesicles of the invention allow the antigen to arrive intact up to the antigen presenting cells (APC) and to promote its capture. by these cells or their activation. It therefore seems that the function of the vesicles of the invention is to vectorize, protect and improve the capture of the antigen by the immune system.
  • Another advantage of the technology is that we can add to this formulation natural or artificial polymers such as polysaccha wrinkles (alginates, chitosan, etc.) in order to strengthen the solidity of the vesicle, and allow it to stay longer at the site of administration or in the body, thus delivering the antigen over a longer time.
  • These polymers can be incorporated into the vesicle as well as deposited around it in the form of a coating.
  • the vesicle or the particle formed from vesicles embedded in the polymer matrix has a diameter greater than that of the vesicles alone.
  • These polymers can optionally be crosslinked to further strengthen their solidity.
  • the formulation can be supplemented by the addition of immunomodulatory molecules (chitosan, interleukins 7) which will reinforce, by their intrinsic properties, amplification and / or l orientation of the immune response.
  • immunomodulatory molecules chitosan, interleukins
  • the vesicles incorporating the antigens are advantageously prepared in a process consisting in firstly preparing the lamellar phase. This is obtained by simple mixing of the ingredients, in an order determined by the experimenter according to the miscibility of each of the constituents. It may be necessary to heat certain pasty or solid constituents in order to facilitate their incorporation.
  • the antigen is added preferably at the end of mixing, after cooling in order to avoid it being subjected to an excessively high temperature. It is also possible to prepare a mixture of all the constituents except for the antigen or its aqueous solution in the form of a “stock” mixture which will be used as necessary to prepare the lamellar phase.
  • the aqueous solution can contain different constituents intended to ensure its biological compatibility and in particular buffer mixtures but also different antigens.
  • the lamellar phase thus prepared is then subjected to moderate shearing (from 0 to 1000 s "1 ) for a limited time (from 0 to 60 minutes).
  • this shearing is obtained directly by the action of the device used for mixing.
  • it can be obtained by hand by mixing the preparation, for example using a microspatula in a plastic conical tube of
  • the sheared lamellar phase is then dispersed in a final medium, generally water or a buffer, identical or different from that which was used during the preparation of the lamellar phase.
  • a final medium generally water or a buffer, identical or different from that which was used during the preparation of the lamellar phase.
  • This dispersion is advantageously carried out at room temperature (20-25 ° C) by slow addition of the medium to the lamellar phase with constant stirring.
  • a preservative and possibly other additives intended to complete the galenical formulation can be added to the product.
  • the pharmaceutical compositions described above constitute vaccine compositions formulated for both parenteral and mucosal administration, in particular by nasal route.
  • compositions described above comprising at least one HIV protein antigen incorporated within the vesicles with a lamellar structure onion have the advantage of being able to be used for administration by mucous route and very particularly by nasal route and of inducing a mucosal response. and / or systemic.
  • the invention also relates to a vaccination method intended to immunize a human being against the virus responsible for AIDS by parenteral or mucosal administration, in particular by nasal route of a pharmaceutical composition as defined above, with the advantages set out previously, in particularly with the possibility of inducing a TH1 type immune response.
  • the invention relates to the use of multilamellar vesicles incorporating at least one protein antigen of the HIV virus, as described above, for the manufacture of a vaccine composition intended for immunization against the virus responsible for AIDS.
  • the administration can be carried out both parenterally and mucosally, in particular nasally, with all the advantages set out above.
  • Example I clearly demonstrates such an effect by nasal administration of the P24 protein of HIV.
  • Example II illustrates a method of subcutaneous immunization using the P24 protein of HIV.
  • FIGS. 1 to 4 given with reference to Example I show the titles obtained after nasal administration of the free protein and of the protein incorporated in the vesicles of the invention as well as the standard deviations (denoted SD):
  • FIGS. 5 and 6 given with reference to Example II show the titers obtained after subcutaneous immunization with the free P24 protein and with the protein incorporated in the vesicles of the invention:
  • the components are sterilized by UV irradiation for 60 min.
  • Containers and accessories (spatulas, agitators, etc.) are flame sterilized just before use.
  • the constituents O and ⁇ are introduced into a 1.5 ml plastic tube, in any order, mixed with a spatula and then heated to
  • Component introduit is introduced at room temperature in one step. The whole is homogenized using a sterilized spatula and then left to stand overnight at 4 ° C. The preparation is then dispersed at 28.46% in sodium phosphate buffer at pH 8.
  • Atropine injected intraperitoneally. Three weeks after the last immunization, the animals are sacrificed, the sera are collected and the mucous secretion samples taken, with the exception of vaginal washes which are taken from the live mouse during the four days preceding the end of the experiment.
  • mice were divided into 2 groups denoted I and II, subjected to an immunization protocol as defined previously using the following products:
  • HIV-1 P24 encapsulated 15 ⁇ l per nostril of dispersion of vesicles according to the invention HIV-1 P24 which corresponds to 3 ⁇ g of HIV-1 P24 per mouse at each immunization> group II:
  • HIV-1 P24 15 ⁇ l per nostril of a solution of HIV-1 P24 corresponding to 3 ⁇ g per mouse at each immunization Secretion samples
  • mice The trachea of the mice is cannulated using a probe and 750 ⁇ l of PBS are injected slowly so as not to create hemorrhage, the lungs are thus washed 3 times with the same solution, the sample is then centrifuged in order to '' remove lung cells and separate into aliquots kept at -20 ° C until assay.
  • the intestine is removed, released from the mesentery, and rinsed in water to remove outside blood. It is then cut longitudinally and incubated on ice in 1 ml of a washing solution enriched in protease inhibitor. The whole is centrifuged and the supernatant is recovered and frozen at -20 ° C.
  • the specific antibodies for HIV-1 P24 present in the sera and secretions are assayed by ELISA technique in which the IgA and IgG specific for HIV-1 P24 are determined (biotinylated anti-IgA (Jackson laboratories) / Streptavidin peroxidase, anti-IgG peroxidase (Pasteur Diagnosis)).
  • the results are expressed as geometric mean titles per antibody compared to a reference pool (sampling mouse na 'ives).
  • the antibody titer corresponds to the reverse of the dilution greater than or equal to the reference threshold (mice Average values na 'ives + 2SD).
  • Example I demonstrates the capacity of the invention to induce antibodies specific for the HIV virus.
  • the incorporation of the viral antigen and its nasal administration make it possible to amplify the serum IgG and IgA responses compared to the free antigen (amplification by a factor of 100 and 500, respectively for IgG and IgA).
  • the P24 antigen alone does not induce mucosal responses.
  • the incorporation into the vesicles of the invention allows the induction of local immunity (IgA and IgG) both in the lungs and in the vagina.
  • EXAMPLE II PRODUCTION OF SPECIFIC ANTIBODIES TO HIV-1 P24 following subcutaneous administration. ORIENTATION OF THE ANTIBODY RESPONSE
  • the components are sterilized by UV irradiation for 60 min.
  • Containers and accessories (spatulas, agitators, etc.) are flame sterilized just before use.
  • the components ⁇ and ⁇ are introduced into a 1.5 ml plastic tube, in any order, mixed with a spatula and then heated at 37 ° C for 60 min in an oven.
  • the constituent ⁇ is introduced at room temperature in one step.
  • the whole is homogenized using a sterilized spatula and then left to stand overnight at 4 ° C.
  • the preparation is then dispersed at 5.7% in sodium phosphate buffer at pH 8.
  • mice were divided into 2 groups denoted I and II, subjected to an immunization protocol as defined previously using the following products:
  • HIV-1 P24 encapsulated 150 ⁇ l of dispersion of vesicles according to the invention HIV-1 P24 which corresponds to 3 ⁇ g of HIV-1 P24 by injection,> group II:
  • HIV-1 P24 150 ⁇ l of a solution of HIV-1 P24 corresponding to 3 ⁇ g by injection
  • Blood samples are taken from anesthetized animals. Sera are collected after blood exudate and centrifugation to remove the blood clot. They are stored at -20 ° C until analysis.
  • the specific antibodies for HIV-1 P24 present in the sera are assayed by ELISA technique using conjugates labeled with peroxidase (anti-IgG1 and IgG2a, SouthernBiotechnology Associates).
  • the antibody titers obtained are determined according to a protocol identical to that described in Example 1.
  • the incorporation into the vesicles of the invention makes it possible to induce very high titers of seric antibodies compared to the free antigen.
  • the study of the antibody subclasses reveals a modification of the ratio of IgGl and IgG2a following the incorporation of the antigen into the vesicles of the invention.
  • IgG2a The production of IgG2a is particularly increased by the administration of vesicles containing the P24 antigen.
  • the modification of the IgG1 / IgG2a ratio in favor of IgG2a by the compositions of the invention suggests that the encapsulation in the vesicles of the invention modifies the presentation, the preparation or the activation of the antigen presenting cells and / or promotes the secretion of a type 1 interleukin profile.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

L'invention concerne une composition pharmaceutique contenant une dispersion ou une suspension dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable de vésicules multilamellaires à structure interne cristal-liquide, formées d'un empilement de bicouches concentriques à base d'agents amphiphiles alternant avec des couches d'eau, de solution aqueuse, de liquide polaire ou de solution d'un liquide polaire, et au sein desquelles se trouve incorporé au moins un antigène protéique du virus VIH. L'antigène est en particulier la protéine P 24. La composition permet d'amplifier et d'orienter la réponse immunitaire induite contre cet antigène aussi bien par injection qu'après administration par voie muqueuse.

Description

Composition vaccinale destinée à induire une réponse immunitaire contre le virus responsable du sida
La présente invention concerne une composition pharmaceutique vaccinale destinée à induire une réponse immunitaire contre le virus responsable du sida.
Plus précisément, l'invention concerne une composition vaccinale destinée à administrer un antigène du virus d'immunodéficience humaine (VIH) et à amplifier et orienter la réponse immunitaire induite contre cet antigène aussi bien par injection qu'après administration par voie muqueuse.
On rappelle tout d'abord ci-après quelques notions et définitions.
Le système immunitaire assure la protection de l'organisme contre les pathogènes et les agents exogènes. Il met en place une immunité humorale composée d'anticorps seriques répartis en différentes sous-classes ou isotypes et une immunité cellulaire. La composante cellulaire est caractérisée par l'activation des lymphocytes TCD4+ et TCD8+ cytotoxiques (CTL) et des cellules NK. Elle est mise en évidence par la lymphoprolifération, la sécrétion d'interleukines et/ou la lyse des cellules infectées ou tumorales. Les interleukines (IL) sont des médiateurs solubles qui agissent de manière autocrine ou paracrine sur les différents types cellulaires du système immunitaire. Les lymphocytes TCD4+ peuvent être classé en deux types selon le profil d'interleukines qu'ils sécrètent. Ainsi, les lymphocytes de type 1 ou Thl sécrètent de l'IL-2 et de l'Interféron gamma alors que les lymphocytes de type 2 ou Th2 sécrètent de l'IL-4, de l'IL-5 et de l'IL-10. Le mode de présentation de l'antigène aux cellules présentatrices d'antigènes (cellules dendritiques et macrophages) va également conditionner précocement le type de réponse induite. Ainsi, la dose, la fréquence, le mode de présentation et la voie d'administration ont une influence sur la réponse immunitaire. Les antigènes peuvent être administrés par immunisation parentérale, systémique ou par voie muqueuse.
On entend par voie muqueuse une administration non invasive de l'antigène à un site muqueux, par exemple - aire naso-pharyngée
- aire buccale
- arbre bronchique
- intestin
- tractus uro-génital - oreille interne
- conjonctive
- glandes mammaires, salivaires et lacrymales.
Parmi ces différents constituants du tissu lymphoïde associé aux muqueuses (MALT), certaines voies d'introduction sont d'un accès et d'une acceptabilité plus aisés : nasale, buccale, gastro-intestinale, rectale et vaginale.
La réponse muqueuse est la réponse du système immunitaire au niveau des muqueuses caractérisée par une production d'IgA (isotype en concentration importante dans les muqueuses) et d'IgG et/ou par une réponse cellulaire au sein du site muqueux et des ganglions drainants.
La réponse systémique est la réponse du système immunitaire généralisée se traduisant par la présence d'anticorps circulants (IgG répartis en différentes sous-classes et aussi IgA) et/ou par une réponse cellulaire (Thelper ou CTL) dans les organes lymphoïdes secondaires (rate, ganglions).
Un adjuvant est une substance ajoutée à l'antigène de manière à amplifier et orienter la réponse immunitaire spécifique dirigée contre cet antigène.
La vectorisation par un vecteur synthétique consiste à incorporer l'antigène dans et/ou à la surface d'une particule ou vésicule, de manière à protéger l'antigène et/ou à faciliter sa capture par les cellules compétentes du système immunitaire et/ou à faciliter l'apprêtement de l'antigène par lesdites cellules, et ainsi à amplifier la réponse immunitaire. L'addition d'un vecteur vide à l'antigène libre n'apporte en général pas ou peu d'amplification.
Les antigènes du virus d'immunodeficience humain (VIH) sont des polyprotéines ou protéines codées par le génome du VIH. Neuf gènes codent pour
• des polyprotéines ou des protéines de structure, • des protéines à activité enzymatique : protéases ou protéines impliquées dans l'intégration, la reverse-transcription et la réplication, et
© des protéines de régulation de cette activité.
Ces protéines peuvent être glycosylées (glycoprotéines). Par antigène protéique du virus VIH, au sens de la présente invention, on entend tous les antigène du virus VIH sous forme de protéines ou de polyprotéines, glycosylées ou non.
Le sida est un fléau qui touche plus de 30 millions d'humains et pour lequel il n'existe aujourd'hui aucun vaccin, ni prophylactique, ni thérapeutique. Cependant, compte tenu de la très grande prévalence de cette maladie dans les pays aux revenus les plus faibles, le vaccin apparaît comme le seul moyen de lutte efficace, les thérapies antivirales étant d'un coût prohibitif.
Les difficultés de mise au point d'un vaccin dirigé contre le virus d'immunodeficience humain sont principalement liées à la rapidité de mutation du virus. Les différentes études sur les personnes résistantes à l'infection par le VIH ou infectées par ce virus, mais ne développant pas la maladie, ont suggéré que la présence simultanée d'anticorps neutralisants (anticorps systémiques IgG et anticorps muqueux IgA) et l'induction d'une réponse lymphocytaire T cytotoxique sont les effecteurs majeurs de l'immunité anti-virale. L'induction d'une réponse TCD4+ de type 1 est également un facteur favorable à la sélection ou l'expansion des populations cellulaires cytotoxiques. L'orientation de la réponse immunitaire vers ces composantes est donc une piste sérieuse pour la mise au point d'un vaccin contre le VIH. Plusieurs antigènes sont actuellement utilisés pour ces mises au point. Les plus connus sont les protéines d'enveloppe du type GP160 ou ses dérivées GP120 ou GP41 (cf. par exemple WO 92/06113 de Smithkline Beecham Biologicals), la protéine de la capside codée par le motif GAG, ainsi que ses dérivées comme P24 ou P17 ou les protéines de fusion entre ces dernières et les précédentes (cf. WO 90/03735 de Pharmacia Genetics Engineering Inc), ainsi que les protéines Nef et Tat modifiées pour perdre leur caractère régulateur et leurs dérivées ou protéines de fusion (cf. WO 01/00232 de Smithkline Beecham Biologicals). L'une des difficultés techniques pour la mise au point de ces vaccins est l'obtention d'un véhicule capable de protéger la protéine antigène, de permettre son administration, et de stimuler le système immunitaire afin d'induire une réponse immunitaire efficace. Ce véhicule doit donc présenter des propriétés adjuvantes suffisantes, et être capable d'orienter la réponse vers le profil le plus favorable.
Aujourd'hui, les seuls adjuvants acceptés en médecine humaine sont principalement l'hydroxyde ou le phosphate d'aluminium. Ces sels se présentent sous la forme d'une suspension de grains de sel d'aluminium, à la surface desquels est adsorbé l'antigène. Ils présentent plusieurs inconvénients : ils induisent des réactions locales inflammatoires et la production d'IgE, ils ne sont pas efficaces pour tous les antigènes et ils sont incapables d'engendrer des réactions à médiation cellulaire de type CTL. De plus, de récentes craintes sont apparues sur la possibilité de toxicité locale des adjuvants à base d'aluminium, ce qui a conduit à restreindre leur utilisation dans le développement de nouveaux vaccins. Enfin ils ne sont pas utilisables dans une administration nasale. Un substitut aux sels d'aluminium est constitué des phosphates de calcium, qui connaissent récemment un regain d'intérêt, compte tenu des craintes liées à l'utilisation de l'aluminium. On trouve de nombreux documents faisant état de stratégies de mise au point de vaccins contre le sida, utilisant les antigènes cités précédemment, et divers systèmes adjuvants. Outre les sels d'aluminium, utilisés dans les demandes EP 0,327,180, et WO 92/22654 de MicroGeneSys Inc, les principaux adjuvants sont les toxines détoxifiées, par exemple l'endotoxine sensible à la chaleur d'E. Coli (cf. WO 98/32461 de The Administrators of the Tulane Educational Fund), ou des modifications du lipide A, par exemple le 3D Mpl (monophosphoryl 3 déacylé du lipide A) comme décrit dans WO 92/06113. Bien d'autres adjuvants ont été développés, comme les dérivés de saponine, le muramyl dipeptide, les toxines tétaniques ou cholériques détoxifiées, mais peu de documents décrivent leur utilisation dans des vaccins dirigés contre le sida.
Plus récemment, on a vu apparaître de nouveaux adjuvants, comme le DC-Chol (obtenu par réaction du choloroformiate sur la N,N- dimethylethylenediamine selon WO 96/40067) en mélange avec l'une des protéines citées ci-dessus (cf. WO 02/28427 d'Aventis Pasteur). Une autre approche récente est l'utilisation d'oligonucléotides présentant une séquence CpG, connue pour sa capacité à amplifier et orienter la réponse immunitaire. Ils sont décrits pour une application contre le virus du sida dans WO 01/00232. Leur mode d'action est différent des adjuvants plus classiques, puisqu'ils peuvent être administrés avant l'immunisation elle- même.
Enfin on peut noter que dans certaines demandes de brevets, plusieurs adjuvants sont utilisés simultanément afin de bénéficier d'un effet de synergie. C'est le cas de WO 01/00232 qui couple un adjuvant à base d'aluminium et un oligonucléotide CpG. Dans d'autres demandes, l'adjuvant et/ou l'antigène sont formulés sous forme d'une émulsion, en général de type huile dans l'eau (cf. WO 92/06113 et WO 02/28427).
On trouve peu de documents enseignant l'utilisation de liposomes ou d'autres vésicules à base de lipides ou d'amphiphiles couplées à des protéines du VIH dans une stratégie vaccinale contre le sida. L'utilisation de liposomes est citée dans WO 02/28427 mais la lecture de l'exemple 8 enseigne que seul l'adjuvant DC-Chol est incorporé dans les liposomes. WO 99/00142 enseigne l'utilisation de liposomes lyophilisés pour administrer oralement une protéine virale, en particulier du VIH. WO 96/40243, de US Department of the Army, enseigne l'utilisation de liposomes comprenant la protéine GP120 et le lipide A pour induire une réponse immunitaire. La partie bibliographique de ce document démontre, à l'aide de nombreuses citations que l'utilisation de liposomes pour amplifier une réponse immunitaire contre un antigène donné n'est pas évidente, et qu'aucun outil prédictif n'existe pour anticiper le résultat.
Dans une infection telle que celle du VIH, la voie d'administration du vaccin joue certainement un rôle important. Le pathogène ayant une porte d'entrée muqueuse, la génération d'anticorps IgA, spécifiques du tissu muqueux, et qui plus est, au niveau de la muqueuse uro-génitale est une caractéristique recherchée dans un vaccin prophylactique contre le sida.
La plupart des travaux présentés dans les demandes citées font appel à la voie injectable, même si d'autres voies d'administration sont décrites dans le texte des demandes. WO 99/00142 décrit et enseigne uniquement la voie orale, alors que WO 02/28427 propose outre la voie injectable une voie muqueuse (nasale). Il est connu que les systèmes basés sur des sels d'aluminium ou de calcium ne sont pas utilisables dans une administration muqueuse, à cause de leur intolérance locale sur les muqueuses nasales et en particulier sur la fonction ciliée. Aucune des technologies de délivrance d'antigènes ou d'adjuvants n'a pour le moment permis d'aboutir à un vaccin contre le sida sur le marché. Les méthodes de présentation de l'antigène doivent donc encore être améliorées et le développement de nouveaux adjuvants ou vecteurs d'antigènes demeure un besoin urgent dans la mise au point d'un vaccin contre le VIH.
Parmi les vésicules, objets sphériques formés d'arrangements moléculaires de molécules amphiphiles, les vésicules multilamellaires à structure en oignon ont fait l'objet d'importantes recherches et ont donné lieu à plusieurs brevets (WO 93/19735 ; WO 95/18601 ; WO 97/00623 ;
WO 98/02144 ; WO 99/16468). Elles se distinguent des liposomes par :
^> leur mode de préparation qui part d'une phase lamellaire à l'équilibre thermodynamique
^ leur structure interne cristal-liquide formée d'un empilement régulier de bicouches concentriques d'amphiphiles alternant avec des couches d'eau, de liquide polaire, de solution aqueuse ou de solution d'un liquide polaire (glycérol, par exemple)
"*> la nature variée des molécules amphiphiles qui peuvent être utilisées pour les constituer, seules ou en mélange. La demande internationale WO 99/16468 décrit des vésicules à structure en oignon incorporant en leur sein un antigène et permettant d'amplifier la réponse immunitaire de cet antigène. Cette demande internationale qui décrit pour la première fois l'incorporation (également désignée dans ce document par encapsulation) d'antigènes au sein d'une vésicule multilamellaire à structure en oignon montre clairement dans ses exemples qu'une telle encapsulation permet très nettement d'amplifier la réponse immunitaire lors d'une administration parentérale d'un antigène encapsulé dans une vésicule multilamellaire à structure en oignon.
On a également décrit dans la demande internationale WO 01/19335 un nouveau mode d'administration par voie muqueuse d'un antigène incorporé dans le même type de vésicule multilamellaire et mis en évidence que ce type d'administration par voie muqueuse permettait d'engendrer une réponse immunitaire non seulement au sein des différents sites muqueux mais également dans le compartiment systémique.
Les inventeurs de la présente invention ont maintenant découvert que l'administration par voie sous-cutanée d'une composition comprenant un antigène protéique du VIH incorporé dans des vésicules du type de celles décrites dans la demande WO 99/16468, engendre une réponse immunitaire dirigée contre cet antigène et qu'en plus, cette réponse est orientée, avec une modification importante de la distribution des sous-classes d'anticorps en faveur des anticorps IgG2a. De plus l'administration de la même composition par voie muqueuse entraîne l'induction à la fois d'anticorps IgG, mais aussi d'IgA spécifiques du VIH dans le compartiment systémique et dans différents sites muqueux
En effet, comme cela ressort de la description et des exemples qui suivent, il s'est avéré que les compositions dans lesquelles l'antigène du VIH se trouve incorporé dans une vésicule à structure en oignon, telle que définie ci-dessus, permettent lorsqu'elles sont administrées par voie muqueuse, d'engendrer une réponse immune IgA muqueuse délocalisée (pulmonaire, intestinale et vaginale) et donc de stimuler le tissu lymphoïde muqueux commun. De telles capacités se révèlent d'une importance particulière lorsque l'on s'adresse à des antigènes à potentiel vaccinant, face à des pathogènes invasifs à tropisme muqueux tel que le VIH, dont la porte d'entrée est justement muqueuse.
La double possibilité d'induire à la fois une réponse muqueuse et une réponse systémique présente un grand intérêt en vaccination car elle simplifie l'administration tout en offrant une immunité à plusieurs niveaux : muqueux pour défendre les voies d'accès du virus et systémique pour combattre l'infection plus disséminée ou généralisée. Ceci constitue un avantage particulièrement remarquable de la présente invention.
Par ailleurs, la mise en évidence du fait que les compositions de l'invention modifient l'isotypie vers une réponse IgG2a suggère une orientation de la réponse cellulaire vers un profil de type 1 (la polarisation vers les IgG2a étant dépendante de la sécrétion d'Interféron- γ). Cette orientation constitue un avantage particulier des compositions de l'invention puisque ce profil est particulièrement recherché quand il s'agit de lutter contre les virus et en particulier contre le VIH. D'autre part, les vésicules multilamellaires utilisées selon l'invention peuvent être préparées à partir de constituants biocompatibles connus pour leur innocuité.
De plus, le procédé de préparation est de mise en œuvre simple et ne fait appel qu'à des appareils courants de la chimie. Le fait que le procédé fasse appel à une phase lamellaire initiale à l'équilibre thermodynamique lui donne une excellente reproductibilité et permet une grande stabilité des vésicules obtenues.
Ainsi, selon l'une de ses caractéristiques essentielles, l'invention concerne une composition pharmaceutique contenant une dispersion ou une suspension dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable de vésicules multilamellaires à structure interne cristal-liquide, formées d'un empilement de bicouches concentriques à base d'agents amphiphiles alternant avec des couches d'eau, de solution aqueuse, de liquide polaire ou de solution d'un liquide polaire et au sein desquelles se trouve incorporé au moins un antigène protéique du virus VIH.
Par le terme "incorporé" dont l'utilisation nous semble préférable à celle du terme "encapsulé", on entend que le ou les antigènes font partie intégrante de l'entité constituée par la vésicule. En effet, on peut trouver des molécules d'antigène(s) dans n'importe quelle couche comprise entre le centre et la périphérie de ladite vésicule. Comme cela ressort de la description détaillée qui suit ainsi que des exemples, les compositions pharmaceutiques selon l'invention sont utilisables comme vaccin destiné à induire une réponse systémique ou muqueuse. Ainsi que cela ressort clairement des exemples, les vésicules à structure en oignon telles que définies précédemment incorporant un antigène du VIH induisent, chez l'homme ou l'animal, la production d'anticorps spécifiques dirigés contre le VIH et ce, que ce soit par injection ou par administration muqueuse, en particulier nasale. Selon une autre de ses caractéristiques essentielles, l'invention concerne un procédé de fabrication des compositions de l'invention, comprenant la préparation de vésicules à structure cristal-liquide par transformation d'une phase cristal-liquide renfermant au moins un agent amphiphile et au moins un antigène protéique du VIH et la dispersion desdites vésicules dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Les vésicules utilisées selon l'invention, ont généralement des diamètres compris entre 0,1 et 25 μm, de préférence entre 0,2 et 15 μm.
Plus précisément, les vésicules contenues dans les compositions de l'invention sont constituées de plusieurs couches d'agents amphiphiles alternant avec des couches de phase aqueuse ou polaire. L'épaisseur de chacune de ces couches est une épaisseur moléculaire, typiquement de l'ordre de 5 à 10 nanomètres. Pour un empilement d'une dizaine à quelques centaines de couches, on obtient donc un diamètre compris entre 0,1 μm et quelques dizaines de micromètres. C'est ce qui est observé expérimentalement, les vésicules étant observables en microscopie optique (en lumière polarisée afin d'avoir un meilleur contraste lié à leur biréfringence), soit comme des points non résolus pour les plus petites d'entre elles, soit comme des sphères biréfringentes pour les plus grosses. Le profil de tailles peut être étudié à l'aide d'un granulometre laser (utilisant la diffusion statique d'un faisceau laser, analysée sous plusieurs angles). On obtient en général un profil gaussien centré sur une valeur variant entre 0,1 et 25 μm montrant une faible hétérogénéité de la taille pour une formulation donnée, dans des conditions opératoires de préparation données. Les vésicules dans lesquelles se trouve incorporé l'antigène ont, comme exposé précédemment, une structure multilamellaire en oignon et sont constituées, de leur centre jusqu'à leur périphérie, d'une succession de couches lamellaires séparées par un milieu liquide. Ces vésicules peuvent être obtenues par un procédé comprenant la préparation d'une phase lamellaire cristal-liquide et sa transformation par application d'un cisaillement. Un tel procédé est en particulier décrit dans le brevet WO 93/19735 issu du brevet français FR-2 689 418 ou WO 95/18601.
Selon le brevet français FR-2 689 418, cette transformation peut être faite lors d'une étape de cisaillement homogène de la phase cristal-liquide, ce qui conduit à des vésicules encore appelées microcapsules de taille contrôlée. Toutefois, en jouant sur la formulation de la phase lamellaire cristal-liquide, en particulier sur la nature des tensioactifs entrant dans sa composition, la transformation de cette phase cristal-liquide en vésicules peut être obtenue par simple sollicitation mécanique, en particulier lors du mélange des constituants.
De telles vésicules présentent, entre autres, l'avantage de pouvoir être préparées par un procédé de préparation particulièrement simple permettant d'utiliser une grande variété de tensioactifs.
Un autre avantage, lié lui aussi essentiellement au procédé utilisé pour préparer les vésicules à structure en oignon utilisées selon l'invention, réside dans le fait que l'on incorpore les actifs et les additifs préalablement à la formation des vésicules, ce qui permet un excellent rendement d'encapsulation, d'où une meilleure efficacité et une économie très importante pour des molécules extrêmement coûteuses. De telles structures sont avantageusement obtenues par incorporation d'au moins un antigène protéique du VIH dans une phase lamellaire cristal-liquide comprenant au moins un agent tensioactif puis transformation de cette phase cristal-liquide lamellaire en une phase dense de vésicules multilamellaires de petite taille.
Ainsi, les vésicules utilisées selon l'invention peuvent être obtenues selon un procédé selon lequel on prépare une phase cristal- liquide lamellaire incorporant au moins un antigène et on provoque le réarrangement de ladite phase cristal-liquide en vésicules multilamellaires par application d'un cisaillement.
Ce cisaillement pourra être un cisaillement homogène, ce qui présente l'avantage de conduire à des vésicules de taille parfaitement homogène. Toutefois, une simple agitation mécanique pourra s'avérer suffisante pour conduire à la formation des vésicules multilamellaires de l'invention.
L'antigène pourra être tout antigène protéique du virus VIH.
Il pourra s'agir aussi bien d'un antigène sous forme d'une protéine ou d'une polyprotéine, glycosylée ou non.
Il pourra s'agir en particulier d'une protéine ou d'une glycoproteine dite protéine de structure, issue de l'enveloppe du virus ou de sa nucléocapside ou d'une protéine régulatrice ou enzymatique ou toute protéine dérivée de ce type de protéines.
L'antigène pourra en particulier être une protéine d'enveloppe du virus VIH, en particulier une protéine du type GP 160 ou une protéine dérivée de type GP 120 ou GP 41codée par le gène env.
L'antigène pourra aussi être une protéine enzymatique impliquée dans l'intégration, la transcription, la réplication du virus et de son matériel génétique.
Il pourra aussi être une protéine régulatrice de la transcription ou de la réplication. Il pourra également s'agir d' une protéine de la capside du virus VIH codée par le gène gag ou une protéine dérivée d'une telle protéine telle que la protéine P 24 ou P 17 ou une protéine de fusion.
Un exemple de telle protéine préférée selon l'invention est la protéine P24.
Les vésicules multilamellaires à structure en oignon sont préparées selon les méthodes décrites précédemment, en particulier dans la demande internationale WO 99/16468. Les molécules amphiphiles utilisées pour leur préparation seront choisies, sans que cela soit une obligation, parmi les molécules faisant l'objet d'une description dans la pharmacopée, ou déjà utilisées dans des médicaments appliqués aux muqueuses ou injectés par voie parentérale.
Selon une variante avantageuse, les bicouches des vésicules contenues dans les compositions de l'invention contiennent au moins un agent tensioactif choisi dans le groupe constitué :
- des phospholipides hydrogénés ou non hydrogénés,
- des esters des acides gras en Ce à C30, saturés ou mono- ou polyinsaturés, linéaires ou ramifiés, et de macrogol (polyéthylène glycol),
- des esters, éthoxylés ou non, des acides gras en C6 à C30, saturés ou mono- ou polyinsaturés, linéaires ou ramifiés, et
> de saccharose, de sorbitan,
> de mannitol,
> de glycérol ou de polyglycérol, > de glycol,
- des éthers des alcools gras en C6 à C30, saturés ou mono- ou polyinsaturés, linéaires ou ramifiés, et de macrogol (polyéthylène glycol)
- des éthers, éthoxylés ou non, des alcools gras en C5 à C30, saturés ou mono- ou polyinsaturés, linéaires ou ramifiés, éthoxylés ou non et > de saccharose,
> de sorbitan,
> de mannitol,
> de glycérol ou de polyglycérol, > de glycol,
A ces tensioactifs qui peuvent être utilisés seuls ou en mélange, on peut éventuellement ajouter des co-tensioactifs afin d'améliorer la rigidité et/ou l'étanchéité des bicouches formant la vésicule. Parmi ces molécules, on peut citer : - le cholestérol et ses dérivés, en particulier les esters de cholestérol chargés ou neutres comme le sulfate de cholestérol
- les autres dérivés à squelette stérol, en particulier ceux d'origine végétale communément appelés phytostérols (sitostérol, sigmastérol...) - les céramides.
La formulation fait avantageusement intervenir un mélange de molécules tensioactives. Il est généralement utilisé au moins deux tensioactifs différents ayant des balances hydrophile-lipophile différentes, ce qui permet de régler en continu les propriétés des bicouches et ainsi de contrôler l'apparition de l'instabilité qui gouverne la formation des vésicules multilamellaires.
Ainsi, on choisira avantageusement parmi les tensioactifs ci- dessus, deux tensioactifs présentant des propriétés relativement différentes, en particulier une balance hydrophile-lipophile (HLB) différente. Le premier tensioactif présentera avantageusement une balance hydrophile-lipophile comprise entre 1 et 6, de préférence entre 1 et 4, alors que le deuxième tensioactif aura une balance hydrophile- lipophile supérieure à 3, de préférence supérieure à 4.
Selon une variante particulièrement avantageuse de l'invention, les agents amphiphiles utilisés pour la préparation des vésicules selon l'invention seront constitués d'un mélange d'un phospholipide et d'un tensioactif non ionique.
Le tensioactif non ionique sera avantageusement un ester d'acide gras, de préférence un ester d'acide gras et de polyéthylène glycol ou de sorbitan ou un polysorbate ; le phospholipide sera, quant à lui, avantageusement une phosphatidylcholine.
Selon une variante particulièrement préférée de l'invention les amphiphiles constitutifs des vésicules seront constitués d'un mélange de phosphatidylcholine et d'oléate de macrogol (oléate de polyéthylène glycol) ou d'un mélange de phosphatidylcholine et de polysorbate 80.
La préparation obtenue après transformation de la phase cristal-liquide lamellaire en vésicules multilamellaires peut ensuite être diluée, en particulier avec un solvant aqueux tel que, par exemple, une solution tampon, une solution saline ou une solution physiologique, pour obtenir ainsi une suspension aqueuse de vésicules.
La technique d'encapsulation utilisée selon la présente invention permet d'atteindre aisément des rendements d'encapsulation très élevés, voire voisins de 100 %. Toutefois, de tels rendements ne sont pas toujours indispensables en fonction des applications visées. Ainsi, le rendement d'encapsulation du (ou des) antigène(s) dans les compositions de l'invention est avantageusement supérieur à 50 %, de préférence supérieur à 80 %.
Il semble que la structure des vésicules soit responsable des résultats particulièrement avantageux obtenus, et que les vésicules multilamellaires de l'invention permettent à l'antigène d'arriver intact jusqu'aux cellules présentatrices de l'antigène (CPA) et de favoriser sa capture par ces cellules ou leur activation. Il semble donc bien que la fonction des vésicules de l'invention est de vectoriser, de protéger et d'améliorer la capture de l'antigène par le système immunitaire. Un autre avantage de la technologie est que l'on peut rajouter à cette formulation des polymères naturels ou artificiels tels que les polysaccha rides (alginates, chitosan, etc.) afin de renforcer la solidité de la vésicule, et lui permettre de rester plus longtemps sur le site d'administration ou dans l'organisme, délivrant ainsi l'antigène sur un temps plus long. Ces polymères peuvent être aussi bien incorporés dans la vésicule, que déposés autour sous la forme d'un enrobage. Dans ce cas la vésicule ou la particule formée des vésicules enrobées dans la matrice polymère a un diamètre supérieur à celui des vésicules seules. Ces polymères peuvent éventuellement être réticulés pour renforcer encore leur solidité.
De plus, et c'est un des autres avantages de la technologie, la formulation peut être complétée par l'addition de molécules immuno- modulatrices (chitosan, interleukines...) qui renforceront par leurs propriétés intrinsèques l'amplification et/ou l'orientation de la réponse immunitaire.
Les vésicules incorporant les antigènes sont avantageusement préparées dans un procédé consistant à préparer, dans un premier temps, la phase lamellaire. Celle-ci s'obtient par simple mélange des ingrédients, dans un ordre déterminé par l'expérimentateur d'après les miscibilites de chacun des constituants. Il peut être nécessaire de chauffer certains constituants pâteux ou solides afin de faciliter leur incorporation. Dans ce cas on additionne l'antigène de préférence en fin de mélange, après refroidissement afin de lui éviter de subir une température trop élevée. On peut aussi préparer un mélange de tous les constituants sauf de l'antigène ou sa solution aqueuse sous forme d'un mélange « stock » qu'on utilisera selon les besoins pour préparer la phase lamellaire. La solution aqueuse peut contenir différents constituants destinés à assurer sa compatibilité biologique et en particulier des mélanges tampons mais également différents antigènes. La phase lamellaire ainsi préparée est ensuite soumise à un cisaillement modéré (de 0 à 1000 s"1) pendant un temps limité (de 0 à 60 minutes).
Dans la plupart des cas, ce cisaillement est obtenu directement par l'action du dispositif ayant servi au mélange. Pour les très petites quantités, il peut être obtenu à la main par mélange de la préparation par exemple à l'aide d'une microspatule dans un tube conique plastique de
1,5 mL
La phase lamellaire cisaillée est ensuite dispersée dans un milieu final, en général de l'eau ou un tampon, identique ou différent de celui ayant servi lors de la préparation de la phase lamellaire. Cette dispersion se fait avantageusement à température ambiante (20-25°C) par addition lente du milieu sur la phase lamellaire sous agitation constante.
Un conservateur et éventuellement d'autres additifs destinés à compléter la formulation galénique peuvent être ajoutés au produit. Les compositions pharmaceutiques décrites précédemment constituent des compositions vaccinales formulées aussi bien pour une administration par voie parentérale que par voie muqueuse, en particulier par voie nasale.
Toutes les compositions décrites précédemment comprenant au moins un antigène protéique de VIH incorporé au sein des vésicules à structure lamellaire en oignon présentent l'avantage de pouvoir être utilisées pour une administration par voie muqueuse et tout particulièrement par voie nasale et d'induire une réponse muqueuse et/ou systémique. L'invention concerne également un procédé de vaccination destiné à immuniser un être humain contre le virus responsable du sida par administration par voie parentérale ou par voie muqueuse, en particulier par voie nasale d'une composition pharmaceutique telle que définie précédemment, avec les avantages exposés précédemment, en particulier avec la possibilité d'induire une réponse immunitaire de type TH1.
Selon un dernier aspect, l'invention concerne l'utilisation de vésicules multilamellaires incorporant au moins un antigène protéique du virus VIH, telle que décrite précédemment, pour la fabrication d'une composition vaccinale destinée à l'immunisation contre le virus responsable du sida.
Dans une telle utilisation, l'administration peut être réalisée aussi bien par voie parentérale que par voie muqueuse, en particulier par voie nasale, avec tous les avantages exposés précédemment.
Les exemples ci-après illustrent de façon non-limitative l'invention.
Plus précisément, l'exemple I donné ci-après met clairement en évidence un tel effet par administration nasale de la protéine P24 de VIH. L'exemple II illustre un procédé d'immunisation par voie sous- cutanée utilisant la protéine P24 du VIH.
Les figures 1 à 4 données en référence à l'exemple I montrent les titres obtenus après administration nasale de la protéine libre et de la protéine incorporée dans les vésicules de l'invention ainsi que les écart- types (notés SD) :
> Figure 1, les titres en anticorps IgG spécifiques de P24, circulant dans le sérum, après administration nasale
> Figure 2, les titres en anticorps IgA spécifiques de P24, circulant dans le sérum, après administration nasale > Figure 3, les titres en anticorps IgG spécifiques de P24, présents dans les lavages broncho-alvéolaires (LBA), dans les lavages vaginaux (LV) et dans les lavages intestinaux (LI), après immunisation nasale
> Figure 4, les titres en anticorps IgA spécifiques de P24, présents dans les lavages broncho-alvéolaires (LBA), dans les lavages vaginaux (LV) et dans les lavages intestinaux (LI), après administration nasale
Les figures 5 et 6 données en référence à l'exemple II montrent les titres obtenus après immunisation sous-cutanée avec la protéine P24 libre et avec la protéine incorporée dans les vésicules de l'invention :
> Figure 5, les titres en anticorps IgGl spécifiques de P24, ainsi que les écart-type dans les sérums après immunisations sous- cutanées.
> Figure 6, les titres en anticorps IgG2a spécifiques de P24, ainsi que les écart-type dans les sérums après immunisations sous- cutanées.
EXEMPLES
EXEMPLE I : PRODUCTION D'ANTICORPS SPECIFIQUES DE HI¥-1 P24 SUITE A UNE ADMINISTRATION MUQUEUSE I - Préparation de vésicules contenant l'antigène P24 de
HIV-1
Formulation (en pourcentage en masse) Φ Oléate de macrogol (Simulsol 2599, SEPPIC) : 8,0 % ® Lécithine de soja Phospholipon 90G (NATTERMANN) :57,0 % θ HIV-1 P24 (TEBU) à 1 mg/ml dans du tampon phosphate de sodium pH8 :35,0 %
Mode opératoire
Les composants sont stérilisés par irradiation UV pendant 60 min. Les contenants et accessoires (spatules, agitateurs...) sont stérilisés à la flamme juste avant utilisation.
Les constituants O et θ sont introduits dans un tube plastique de 1,5ml, dans un ordre indifférent, mélangés à la spatule puis chauffés à
37°C pendant 60 min à l'étuve. On introduit à température ambiante en une étape le constituant θ. L'ensemble est homogénéisé à l'aide d'une spatule stérilisée puis laissé au repos une nuit à 4°C. La préparation est ensuite dispersée à 28.46 % dans du tampon phosphate de sodium à pH 8.
II - Protocole d'immunisation
Voie nasale
Afin de tester l'effet des vésicules selon l'invention lors d'une administration muqueuse, des souris BALB/c femelles (n=7) de 7 semaines ont reçu, par voie nasale, deux fois (à J0 et J21), différentes préparations décrites ci-dessous. L'administration par voie nasale a été réalisée après anesthésie des animaux par une solution, mélange de Kétamine, Valium et
Atropine, injectée par voie intra-péritonéale. Trois semaines après la dernière immunisation, les animaux sont sacrifiés, les sérums sont collectés et les prélèvements des sécrétions muqueuses effectués, à l'exception des lavages vaginaux qui sont prélevés sur la souris vivante pendant les quatre jours précédents la fin de l'expérimentation.
Groupes d'immunisation
Les souris ont été réparties en 2 groupes notés I et II, soumis à un protocole d'immunisation tel que défini précédemment au moyen des produits suivants :
> groupe I :
HIV-1 P24 encapsulée : 15 μl par narine de dispersion de vésicules selon l'invention HIV-1 P24 ce qui correspond à 3 μg de HIV-1 P24 par souris à chaque immunisation > groupe II :
HIV-1 P24 : 15 μl par narine d'une solution de HIV-1 P24 correspondant à 3 μg par souris à chaque immunisation Prélèvements des sécrétions
Tous les prélèvements sont effectués avec des solutions froides (4°C) et sont entreposés sur glace au fur et à mesure afin de limiter les dégradations par les enzymes protéolytiques. Lavages broncho-alvéolaires :
La trachée des souris est canulée à l'aide d'une sonde et 750 μl de PBS sont injectés lentement afin de ne pas créer d'hémorragie, les poumons sont lavés ainsi 3 fois avec la même solution, le prélèvement est ensuite centrifugé afin d'éliminer les cellules pulmonaires et séparé en fractions aliquotes conservées à -20°C jusqu'au dosage.
Lavages vaginaux
Ces prélèvements sont réalisés sur la souris vigile, par injection de 50μl de PBS dans l'orifice du vagin, le vagin est lavé 3 fois avec la même solution. Ce type de prélèvement est renouvelé durant 4 jours consécutifs afin de couvrir les variations dues au cycle hormonal de la souris. Les sécrétions sont groupées et conservées à -20°C.
Lavages intestinaux
L'intestin est prélevé, libéré du mésentère et rincé dans l'eau afin d'éliminer le sang extérieur. Il est ensuite découpé longitudinalement et incubé sur glace dans 1 ml d'une solution de lavage enrichie en inhibiteur de protéases. L'ensemble est centrifugé et le surnageant est récupéré et congelé à -20°C.
Dosage des anticorps
Les anticorps spécifiques de HIV-1 P24 présents dans les sérums et sécrétions sont dosés par technique ELISA où l'on détermine les IgA et IgG spécifiques de HIV-1 P24 (anti-IgA biotinylé (Jackson laboratories)/Streptavidine peroxydase, anti-IgG peroxydase (Diagnostic Pasteur)). Les résultats sont exprimés en moyenne géométrique des titres d'anticorps par rapport à un pool de référence (prélèvement de souris na'ives). Le titre en anticorps correspond à l'inverse de la dilution supérieure ou égale au seuil de référence (Moyenne des valeurs des souris na'ives +2SD).
III - Résultats
Les résultats du dosage des anticorps spécifiques sont présentés dans les 4 figures (figures 1 à 4) illustrant respectivement :
> Figure 1, les titres en anticorps IgG spécifiques de P24, circulant dans le sérum, après administration nasale Figure 2, les titres en anticorps IgA spécifiques de P24, circulant dans le sérum, après administration nasale
> Figure 3, les titres en anticorps IgG spécifiques de P24, présents dans les lavages broncho-alvéolaires (LBA), dans les lavages vaginaux (LV) et dans les lavages intestinaux (LI), après administration nasale
> Figure 4, les titres en anticorps IgA spécifiques de P24, présents dans les lavages broncho-alvéolaires (LBA), dans les lavages vaginaux (LV) et dans les lavages intestinaux (LI), après administration nasale L'exemple I démontre la capacité de l'invention à induire des anticorps spécifiques du virus VIH. L'incorporation de l'antigène viral et son administration nasale permettent d'amplifier les réponses IgG et IgA seriques par rapport à l'antigène libre (amplification d'un facteur 100 et 500, respectivement pour les IgG et IgA). Seul, l'antigène P24 ne permet pas d'induire des réponses muqueuses. L'incorporation dans les vésicules de l'invention permet l'induction d'une immunité locale (IgA et IgG) aussi bien dans les poumons que dans le vagin. EXEMPLE II : PRODUCTION D'ANTICORPS SPECIFIQUES DE HIV-1 P24 suite à une administration sous- cutanée. ORIENTATION DE LA REPONSE ANTICORPS
I - Préparation de vésicules contenant l'antigène P24 de HIV-1
Formulation (en pourcentage en masse) O Oléate de macrogol (Simulsol 2599, SEPPIC) : 8,0 % θ Lécithine de soja Phospholipon 90G (NATTERMANN) :57,0 % θ HIV-1 P24 (TEBU) à 1 mg/ml dans du tampon phosphate de sodium à pH 8 :35,0 %
Mode opératoire
Les composants sont stérilisés par irradiation UV pendant 60 min. Les contenants et accessoires (spatules, agitateurs...) sont stérilisés à la flamme juste avant utilisation. Les constituants Φ et © sont introduits dans un tube plastique de 1,5ml, dans un ordre indifférent mélangés à la spatule puis chauffés à 37°C pendant 60 min à l'étuve. On introduit à température ambiante en une étape le constituant ©. L'ensemble est homogénéisé à l'aide d'une spatule stérilisée puis laissé au repos une nuit à 4°C. La préparation est ensuite dispersée à 5,7 % dans du tampon phosphate de sodium à pH 8.
II - Protocole d'immunisation
Voie sous-cutanée
Afin de tester l'effet des vésicules selon l'invention lors d'une administration parentérale, des souris BALB/c femelles (n=7) de 7 semaines ont reçu, par voie sous-cutanée à la base de la queue, deux fois (à JO et J21), différentes préparations décrites ci-dessous. Trois semaines après la dernière immunisation, les sérums sont collectés.
Groupes d'immunisation
Les souris ont été réparties en 2 groupes notés I et II, soumis à un protocole d'immunisation tel que défini précédemment au moyen des produits suivants :
> groupe I :
HIV-1 P24 encapsulée : 150 μl de dispersion de vésicules selon l'invention HIV-1 P24 ce qui correspond à 3 μg de HIV-1 P24 par injection, > groupe II :
HIV-1 P24 : 150 μl d'une solution de HIV-1 P24 correspondant à 3 μg par injection
Préparation des sérums
Les prélèvements sanguins sont effectués sur animal anesthésié. Les sérums sont collectés après exsudât du sang et centrifugation afin d'éliminer le caillot sanguin. Ils sont conservés à -20°C jusqu'à l'analyse.
Dosage des anticorps
Les anticorps spécifiques de HIV-1 P24 présents dans les sérums sont dosés par technique ELISA à l'aide de conjugués marqués à la peroxydase (anti-IgGl et IgG2a, SouthernBiotechnology Associates).
Les titres d'anticorps obtenus sont déterminés selon un protocole identique à celui décrit dans l'exemple 1.
III - Résultats
Les résultats du dosage des anticorps spécifiques sont présentés dans les figures 5 et 6 et le tableau I ci-dessous illustrant > Figure 5, les titres en anticorps IgGl spécifiques de P24, ainsi que les écart-type (SD) dans les sérums après immunisations sous- cutanées.
> Figure 6, les titres en anticorps Ig2a spécifiques de P24, ainsi que les écart-type (SD) dans les sérums après immunisations sous- cutanées.
> Tableau I : les rapports des titres en sous-classes IgGl sur IgG2a des anticorps spécifiques de P24,après injection sous-cutanée de l'antigène P24, en vésicules selon l'invention ou libre ; (n = 7).
TABLEAU I
Rapports des titres en sous-classes IgGl sur IgG 2a des anticorps spécifiques de P24, après injection sous-cutanée de l'antigène P24, en vésicules selon l'invention ou libre ; (n = 7)
Figure imgf000026_0001
L'incorporation dans les vésicules de l'invention permet d'induire des titres très élevés d'anticorps seriques comparativement à l'antigène libre. L'étude des sous-classes d'anticorps révèle une modification du rapport des IgGl et IgG2a suite à l'incorporation de l'antigène dans les vésicules de l'invention.
La production d'IgG2a est particulièrement augmentée par l'administration des vésicules contenant l'antigène P24.
La modification du rapport IgGl/ IgG2a en faveur des IgG2a par les compositions de l'invention, suggère que l'encapsulation dans les vésicules de l'invention modifie la présentation, l'apprêtement ou l'activation des cellules présentatrices de l'antigène et/ou favorise la sécrétion d'un profil d'interleukines de type 1.

Claims

REVENDICATIONS
1. Composition pharmaceutique contenant une dispersion ou une suspension dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable de vésicules multilamellaires à structure interne cristal-liquide, formées d'un empilement de bicouches concentriques à base d'agents amphiphiles alternant avec des couches d'eau, de solution aqueuse, de liquide polaire ou de solution d'un liquide polaire, et au sein desquelles se trouve incorporé au moins un antigène protéique du virus VIH. 2. Composition pharmaceutique selon la revendication 1 caractérisée en ce que ledit antigène protéique est une protéine ou une glycoproteine d'enveloppe dudit virus VIH, en particulier une protéine du type GP 160 ou une protéine dérivée de type GP 120 ou GP 41.
3. Composition pharmaceutique selon la revendication 1 caractérisée en ce que ledit antigène est une protéine enzymatique impliquée dans l'intégration, la transcription, la réplication du virus et de son matériel génétique.
4. Composition pharmaceutique selon la revendication 1 caractérisée en ce que ledit antigène est une protéine régulatrice de la transcription ou de la réplication.
5. Composition pharmaceutique selon la revendication 1 caractérisée en ce que ledit antigène est une protéine de la capside dudit virus VIH codée par le gène gag ou une protéine dérivée d'une telle protéine telle que la protéine P 24 ou P 17 ou une protéine de fusion. 6. Composition pharmaceutique selon la revendication 5 caractérisée en ce que ledit antigène protéique est la protéine P 24.
7.Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisée en ce que lesdites vésicules ont des diamètres compris entre 0,1 et 25 μm, de préférence entre 0,2 et 15 μm. δ.Composition selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisée en ce que les bicouches desdites vésicules contiennent au moins un agent tensioactif choisi dans le groupe constitué :
- des phospholipides hydrogénés ou non hydrogénés, - des esters des acides gras en C6 à C3o, saturés ou mono- ou polyinsaturés, linéaires ou ramifiés, et de macrogol (polyéthylène glycol),
- des esters, éthoxylés ou non, des acides gras en C6 à C3o, saturés ou mono- ou polyinsaturés, linéaires ou ramifiés, et de saccharose, de sorbitan,
> de mannitol,
> de glycérol ou de polyglycérol, de glycol,
- des éthers des alcools gras en C6 à C30, saturés ou mono- ou polyinsaturés, linéaires ou ramifiés, et de macrogol (polyéthylène glycol)
- des éthers, éthoxylés ou non, des alcools gras en C6 à C30, saturés ou mono- ou polyinsaturés, linéaires ou ramifiés, et
> de saccharose,
> de sorbitan, > de mannitol,
> de glycérol ou de polyglycérol,
> de glycol.
9. Composition selon l'une des revendications 1 à 8 caractérisée en ce que lesdites bicouches contiennent, en outre, au moins un agent destiné à améliorer la rigidité et/ou l'étanchéité desdites bicouches.
10. Composition selon la revendication 9 caractérisée en ce que ledit agent est choisi dans le groupe constitué du cholestérol et de ses dérivés, en particulier des esters de cholestérol chargés ou neutres tels que le sulfate de cholestérol, des autres dérivés à squelette stérol, en particulier ceux d'origine végétale communément appelés phytostérols tels que le sitostérol ou le sigmastérol, des céramides.
11 Composition selon l'une des revendications 1 à 10 caractérisée en ce que lesdites bicouches contiennent à titre d'agents amphiphiles un phospholipide en association avec un tensioactif non ionique.
12. Composition selon la revendication 11 caractérisée en ce que ledit tensioactif non ionique est un ester d'acide gras.
13. Composition selon la revendication 12 caractérisée en ce que ledit ester d'acide gras est un ester de polyéthylène glycol ou de sorbitan ou un polysorbate.
14.Composition selon l'une des revendications 11 à 13 caractérisée en ce que ledit phospholipide est une phosphatidylcholine.
15. Composition selon l'une des revendications 11 à 14 caractérisée en ce que les agents amphiphiles sont constitués d'un mélange de phosphatidylcholine et d'oléate de polyéthylène glycol ou de polysorbate 80.
16. Composition selon l'une des revendications 1 à 15 caractérisée en ce que lesdites vésicules comprennent en outre un polymère naturel ou artificiel destiné à renforcer leur solidité.
17.Composition selon l'une des revendications 1 à 16 caractérisée en ce qu'elle contient en outre des molécules immuno- modulatrices renforçant l'amplification et/ou l'orientation de la réponse immunitaire. 18. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications
1 à 17, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une composition vaccinale formulée pour une administration par voie parentérale.
19. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications
1 à 17 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une composition vaccinale formulée pour une administration par voie muqueuse, en particulier par voie nasale.
20. Procédé de fabrication d'une composition selon l'une des revendications 1 à 19 caractérisé en ce qu'il comprend la préparation de vésicules à structure cristal-liquide par transformation d'une phase cristal- liquide lamellaire renfermant au moins un agent amphiphile et au moins un antigène protéique du VIH et la dispersion desdites vésicules dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
21. Utilisation de vésicules multilamellaires incorporant au moins un antigène protéique du virus VIH, telles que définies dans l'une des revendications 1 à 17 pour la fabrication d'une composition vaccinale destinée à l'immunisation contre le virus responsable du sida.
22. Utilisation selon la revendication 21 caractérisée en ce que ladite composition vaccinale est destinée à une administration par voie parentérale.
23. Utilisation selon la revendication 21 caractérisée en ce que ladite composition vaccinale est destinée à une administration par voie muqueuse, en particulier par voie nasale.
24.Utilisation selon l'une des revendications 21 à 23 caractérisée en ce que ladite composition vaccinale est destinée à induire une réponse immunitaire de type TH1.
PCT/FR2004/050052 2003-02-12 2004-02-06 Composition vaccinale comprenant un antigene proteique du vih incorpore dans des vesicules lipidiques multilamellaires. WO2004073596A2 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0301658A FR2850872A1 (fr) 2003-02-12 2003-02-12 Composition vaccinale destinee a induire une reponse immunitaire contre le virus responsable du sida
FR03/01658 2003-02-12

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2004073596A2 true WO2004073596A2 (fr) 2004-09-02
WO2004073596A3 WO2004073596A3 (fr) 2004-10-28

Family

ID=32731973

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2004/050052 WO2004073596A2 (fr) 2003-02-12 2004-02-06 Composition vaccinale comprenant un antigene proteique du vih incorpore dans des vesicules lipidiques multilamellaires.

Country Status (2)

Country Link
FR (1) FR2850872A1 (fr)
WO (1) WO2004073596A2 (fr)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995022961A1 (fr) * 1994-02-23 1995-08-31 Institut Pasteur Liposomes, et leur utilisation notamment pour l'obtention de compositions immunomodulatrices
US5679355A (en) * 1992-04-07 1997-10-21 Proteus Molecular Design Limited Vaccines containing non-ionic surfactant vesicles
WO1999000142A1 (fr) * 1997-06-26 1999-01-07 Bio-Sphere Technology, Inc. Methode pour provoquer une reponse immunitaire systemique a un antigene de l'hepatite ou du vih
WO1999004412A2 (fr) * 1997-07-18 1999-01-28 Von Ardenne Anlagentechnik Gmbh Ensemble cathode cible
WO1999016468A1 (fr) * 1997-09-29 1999-04-08 Capsulis Vecteurs d'antigenes sous forme de vesicules multilamellaires
WO2001019335A2 (fr) * 1999-09-14 2001-03-22 Capsulis Compositions destinees a une administration par voie muqueuse
US20020142030A1 (en) * 1996-03-22 2002-10-03 Oral Vaccine Technologies, Inc. Method for inducing a systemic immune response to an HIV antigen

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5679355A (en) * 1992-04-07 1997-10-21 Proteus Molecular Design Limited Vaccines containing non-ionic surfactant vesicles
WO1995022961A1 (fr) * 1994-02-23 1995-08-31 Institut Pasteur Liposomes, et leur utilisation notamment pour l'obtention de compositions immunomodulatrices
US20020142030A1 (en) * 1996-03-22 2002-10-03 Oral Vaccine Technologies, Inc. Method for inducing a systemic immune response to an HIV antigen
WO1999000142A1 (fr) * 1997-06-26 1999-01-07 Bio-Sphere Technology, Inc. Methode pour provoquer une reponse immunitaire systemique a un antigene de l'hepatite ou du vih
WO1999004412A2 (fr) * 1997-07-18 1999-01-28 Von Ardenne Anlagentechnik Gmbh Ensemble cathode cible
WO1999016468A1 (fr) * 1997-09-29 1999-04-08 Capsulis Vecteurs d'antigenes sous forme de vesicules multilamellaires
WO2001019335A2 (fr) * 1999-09-14 2001-03-22 Capsulis Compositions destinees a une administration par voie muqueuse

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GENTY M ET AL: "Complex dispersions of multilamellar vesicles: a promising new carrier for controlled release and protection of encapsulated molecules" JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE, ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS B.V. AMSTERDAM, NL, vol. 90, no. 1, 5 juin 2003 (2003-06-05), pages 119-133, XP004427411 ISSN: 0168-3659 *
VANCOTT T C ET AL: "HIV-1 neutralizing antibodies in the genital and respiratory tracts of mice intranasally immunized with oligomeric gp160." JOURNAL OF IMMUNOLOGY (BALTIMORE, MD.: 1950) UNITED STATES 15 FEB 1998, vol. 160, no. 4, 15 février 1998 (1998-02-15), pages 2000-2012, XP002254827 ISSN: 0022-1767 *
WASSEF N M ET AL: "LIPOSOMES AS CARRIERS FOR VACCINES" IMMUNOMETHODS, vol. 4, 1 juin 1994 (1994-06-01), pages 217-222, XP000601673 ISSN: 1058-6687 *

Also Published As

Publication number Publication date
FR2850872A1 (fr) 2004-08-13
WO2004073596A3 (fr) 2004-10-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5994318A (en) Cochleate delivery vehicles
US5840707A (en) Stabilizing and delivery means of biological molecules
US11806318B2 (en) Nanoemulsion compositions for preventing, suppressing or eliminating allergic and inflammatory disease
US20090291095A1 (en) Nanoemulsion adjuvants
Jain et al. Mannosylated niosomes as adjuvant-carrier system for oral mucosal immunization
US5643574A (en) Protein- or peptide-cochleate vaccines and methods of immunizing using the same
Patel et al. Mucosal and systemic immune responses by intranasal immunization using archaeal lipid-adjuvanted vaccines
US6117449A (en) Method for inducing a systemic immune response to a hepatitis antigen
JP4297515B2 (ja) 免疫原性組成物
US20140093537A1 (en) Immunogenic compositions comprising nanoemulsion and methods of administering the same
EP1696954B1 (fr) Composition vaccinale adjuvantée par une alkylphosphatidylcholine
WO1997030725A1 (fr) Vecteurs d'apport de structures cochleaires
EP1024830B1 (fr) Vecteurs d'antigenes sous forme de vesicules multilamellaires
WO2004073596A2 (fr) Composition vaccinale comprenant un antigene proteique du vih incorpore dans des vesicules lipidiques multilamellaires.
FR2798288A1 (fr) Compositions vaccinales destinees a une administration par voie muqueuse
EP0748214B1 (fr) Liposomes, et leur utilisation notamment pour l'obtention de compositions immunomodulatrices
CA2630530C (fr) Composition comprenant un vecteur synthetique colloidal bioresorbable et un vecteur viral
AU753008B2 (en) Cochleate delivery vehicles
AU2006236007A1 (en) Cochleate Delivery Vehicles
FR2808194A1 (fr) Utilisation de particules hydrophiles portant ou non des ligands ioniques pour ameliorer les proprietes immunomodulatrices d'une substance autre qu'un antigene, et les compositions pharmaceutiques ainsi obtenues

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
122 Ep: pct application non-entry in european phase