JP2002335945A

JP2002335945A - 神経刺激電極とこれを用いた細胞培養装置

Info

Publication number: JP2002335945A
Application number: JP2001142583A
Authority: JP
Inventors: Toru Yagi; 透八木; Kazuhisa Kiuchi; 一壽木内; Yasushi Onishi; 保志大西; Yuichiro Ito; 雄一郎伊藤; Yoshiki Uchikawa; 嘉樹内川
Original assignee: RIKEN
Current assignee: RIKEN
Priority date: 2001-05-14
Filing date: 2001-05-14
Publication date: 2002-11-26

Abstract

(57)【要約】【課題】特定の生体細胞を刺激するのに適した微細な
線幅が作製可能であり、培養液中で基板から長期間剥離
せず、生体細胞を長期間培養可能であり、培養した特定
の細胞に個別に刺激でき、特定の細胞の電気的信号を記
録できる神経刺激電極とこれを用いた細胞培養装置を提
供する。【解決手段】生体細胞１を載せ下面から培養液を供給
可能な多孔質ポリマーフィルム２と、多孔質ポリマーフ
ィルムに密着して形成された導電性高分子パターン４
と、導電性高分子パターンに一端が電気的に接続され他
端が外部まで延びる電気信号ライン６とを有する試料培
養皿１０を備え、電気信号ラインと導電性高分子パター
ンを介して生体細胞に電気刺激を与え、かつ電気的な活
動を記録する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、生体細胞に刺激を
与えるための神経刺激電極とこれを用いた細胞培養装置
に関する。

【０００２】

【従来の技術】生体内に埋込み生体の神経系へ刺激を与
えたり、生体の細胞を培養しながら細胞に刺激を与える
ために神経刺激電極が用いられる。しかし、従来かかる
神経刺激電極には、金や白金などの金属材料が用いられ
ていたため、生体組織との親和性が低く、生体にグリア
細胞が形成され、細胞を傷めたり細胞寿命が短縮する等
の悪影響が生じる問題があった。そのため従来は細胞外
マトリクスであるコラーゲンや細胞接着因子であるポリ
リジンで電極表面をコーティングしていたが、これによ
りインピーダンスが増加し、電気刺激が効率的にできな
い問題があった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】上述した問題点を解決
するために、本発明の発明者等は先に「導電性高分子パ
ターンの作製方法」を創案し出願した（特開平６−２３
６７１２号）。しかしこの方法により作製可能な導電性
高分子パターンの線幅は約１５０μｍが限度であった。
そのため、特定の生体細胞を刺激するには線幅が大きす
ぎる問題点があった。

【０００４】また、この方法により作製した導電性高分
子パターン上で細胞を培養すると、培養液中で導電性高
分子パターンが基板から短時間に剥離してしまう問題点
があった。そのため、従来の導電性高分子パターンでは
細胞自体が健全であるにも関わらず長期に細胞培養し試
験することができなかった。

【０００５】本発明は上述した問題点を解決するために
創案されたものである。すなわち、本発明の第１の目的
は、（１）特定の生体細胞を刺激するのに適した微細な
線幅が作製可能であり、かつ（２）培養液中で基板から
長期間剥離しない神経刺激電極を提供することにある。
また本発明の第２の目的はこの神経刺激電極を用い、
（３）生体細胞を長期間培養可能であり、かつ（４）培
養した特定の細胞に個別に刺激でき、（５）さらに特定
の細胞の電気的信号を記録できる細胞培養装置を提供す
ることにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、生体適
合性の高い基板（２）と該基板に密着して形成された導
電性高分子パターン（４）とからなり、該導電性高分子
パターンは、酸化剤を非水性溶媒に溶かしかつ界面活性
剤を添加した酸化重合剤を、前記基板上に塗布し、該基
板表面に所望のパターンの光を照射して照射部分の酸化
重合能力を低減し、次いで基板表面にモノマーを気相重
合させて光の非照射部分に形成したものである、ことを
特徴とする神経刺激電極が提供される。

【０００７】本発明の好ましい実施形態によれば、前記
酸化剤は塩化鉄であり、前記モノマーはピロールモノマ
ーであり、前記光照射は出力３０Ｗ、照射時間２０分以
上、６０分以下のエネルギーに相当する紫外線を照射す
る。また、前記基板は多孔質ポリマーフィルムである。

【０００８】上記本発明の構成によれば、神経刺激電極
が生体適合性の高い基板（２）（例えば多孔質ポリマー
フィルム）と導電性高分子パターン（４）とからなるの
で、いずれも金属材料と比較して生体適合性が高く、細
胞培養を長期に試験するのに適している。また、酸化剤
を非水性溶媒に溶かした酸化重合剤を用いることによ
り、培養液中で導電性高分子パターン（４）が基板から
剥離するのを防止できることが後述する実施例で確認さ
れた。更にこの際、界面活性剤を添加することにより均
一な分散が可能となった。更に、光照射を、出力３０
Ｗ、照射時間２０分以上、６０分以下のエネルギーに相
当する従来より十分な紫外線照射を行うことにより、特
定の生体細胞を刺激するのに適する線幅３μｍ〜１０μ
ｍの微細な線幅が作製できることが、後述する実施例で
確認された。

【０００９】また本発明によれば、生体細胞（１）を載
せ下面から培養液を供給可能な多孔質ポリマーフィルム
（２）と、該多孔質ポリマーフィルムに密着して形成さ
れた導電性高分子パターン（４）と、該導電性高分子パ
ターンに一端が電気的に接続され他端が外部まで延びる
電気信号ライン（６）とを有する試料培養皿（１０）を
備え、前記電気信号ラインと導電性高分子パターンを介
して生体細胞に電気刺激を与え、かつ電気的な活動を記
録する、ことを特徴とする細胞培養装置が提供される。

【００１０】上記本発明の構成によれば、下面から培養
液を供給可能な多孔質ポリマーフィルム（２）を用いる
ので、刺激／計測の対象となるポリマーフィルム（２）
に接した生体細胞（１）に効率的に培養液を供給し、こ
の生体細胞の長期培養が可能となる。また、この多孔質
ポリマーフィルム（２）として、光硬化性多孔質フィル
ムや熱可塑性樹脂フィルムを用いることにより、フォト
リソグラフィーや孔版印刷によりマイクロサイズで絶縁
膜を簡単に作成することができる。更に、導電性高分子
パターン（４）が多孔質ポリマーフィルムに密着して形
成されているので、金属よりも生体適合性が高く、生体
に悪影響を与えることなく生体細胞を長期間培養可能と
なる。また、電気信号ライン（６）と導電性高分子パタ
ーン（４）を介して外部から培養した特定の細胞に個別
に刺激でき、同様に特定の細胞の電気的な活動を記録す
ることができる。

【００１１】本発明の好ましい実施形態によれば、前記
試料培養皿（１０）を密閉する透明な培養チャンバー
（１２）と、生体細胞に与える電気刺激を発生する電気
刺激発生装置（１４）と、生体細胞が発する電気信号を
増幅する増幅装置（１６）と、電気刺激発生装置と増幅
装置を制御し前記電気信号を記録、解析する制御／解析
装置（１８）とを備える。

【００１２】この構成により、透明な培養チャンバー
（１２）で試料培養皿（１０）を密閉するので、試料培
養皿（１０）を無菌状態に保ちながら顕微鏡等で生体細
胞（１）を観察することができる。また、電気刺激発生
装置（１４）により例えば電気パルスを生成し、これを
雑音が乗らないようにアイソレータを通して電気信号ラ
イン（６）に電気信号を送り、生体細胞（１）を電気刺
激することができる。更に、増幅装置（１６）で生体細
胞が発する電気信号を増幅し、これを制御／解析装置
（１８）で記録、解析することにより、特定の細胞に個
別に刺激し、かつその特定の細胞の電気的活動を長期間
継続して記録することができる。

【００１３】更に、前記培養チャンバー（１２）内を無
菌状態に保ち、かつ二酸化炭素濃度を一定に保つガス交
換制御装置（２０）と、培養チャンバー（１２）内の温
度を一定に保つ温度制御装置（２２）とを備える、こと
が好ましい。

【００１４】ガス交換制御装置（２０）で二酸化炭素濃
度をモニタしながら、二酸化炭素供給源から二酸化炭素
を補給して二酸化炭素濃度を培養に適した一定濃度に保
つことができる。また、ガス供給口と排出口に除菌フィ
ルタを設けてチャンバー内を無菌状態に保つことができ
る。更に、温度制御装置（２２）で培養チャンバー（１
２）内の温度をモニタしながら、ヒータ及び／又は冷却
装置で培養チャンバー内の温度を培養に適した一定に保
つことができる。

【００１５】

【発明の実施の形態】以下、本発明の好ましい実施形態
を図面を参照して説明する。なお、各図において、共通
する部分には同一の符号を付し、重複した説明を省略す
る。

【００１６】図１は、本発明による細胞培養装置の全体
構成図であり、図２は、図１の細胞培養装置を構成する
培養チャンバーの斜視図であり、図３は、図１の細胞培
養装置を構成する試料培養皿の構成図である。また図３
において、（Ａ）は横断面図、（Ｂ）は平面図である。

【００１７】図１に示すように、本発明の細胞培養装置
は、試料培養皿１０、培養チャンバー１２、電気刺激発
生装置１４、増幅装置１６、制御／解析装置１８、ガス
交換制御装置２０及び温度制御装置２２を備える。

【００１８】試料培養皿１０は、図３に示すように、生
体細胞１を載せ下面から培養液を供給可能な多孔質ポリ
マーフィルム２と、多孔質ポリマーフィルム２に密着し
て形成された導電性高分子パターン４と、導電性高分子
パターン４に一端が電気的に接続され他端が外部まで延
びる電気信号ライン６とを有する。

【００１９】図３において、多孔質ポリマーフィルム２
は、光硬化性多孔質フィルム又は熱可塑性樹脂フィルム
であり、フォトリソグラフィーや孔版印刷により、導電
性高分子パターン４のまわりにマイクロサイズで絶縁膜
５が作成されている。また、導電性高分子パターン４は
この例では多孔質ポリマーフィルム２の表面（上面）か
ら裏面（下面）まで貫通して形成されている。なお、導
電性高分子パターン４はこのような形状の他に、集積回
路の回路パターンのように、同一平面又は複数平面に形
成してもよい。

【００２０】更に図３において、７は絶縁膜、８は基
板、９はコネクタ、１０ａは培養皿壁面である。この例
では絶縁膜７の導電性高分子パターン４と対応する位置
に電極６ａは埋め込まれており、更に電気信号ライン６
により、電極６ａとコネクタ９が電気的に接続されてい
る。電極６ａ及び電気信号ライン６は、図３（Ｂ）に示
すように、集積回路の回路パターンのように、同一平面
に形成されている。また電極６ａ及び電気信号ライン６
は、、導電性高分子パターン４と同一材料でも、或いは
生体細胞１に直接接触しない限り、金、白金等の金属材
料であってもよい。

【００２１】培養チャンバー１２は、図２に示すよう
に、試料培養皿１０を無菌状態に保つように密閉し、か
つ顕微鏡等で生体細胞１を観察することができるよう
に、透明に形成されている。また培養チャンバー１２に
は、内部にガスを吸入するガス吸入口１２ａ、ガスを排
出するガス排出口１２ｂ、温度センサ２２ａ及びヒータ
ー２２ｂが設けられている。ガス交換制御装置２０は、
ＣＯ₂供給源２０ａと排気ファン２０ｂを有し、培養チ
ャンバー１２内を無菌状態に保ちながら、かつ二酸化炭
素濃度を一定に保つようになっている。また温度制御装
置２２は、温度センサ２２ａとヒーター２２ｂを有し、
培養チャンバー１２内の温度を一定に保つようになって
いる。

【００２２】更に図１に示すように、電気刺激発生装置
１４は、生体細胞に与える電気刺激を発生するパルス発
生装置１４ａとアイソレータ１４ｂとからなり、アイソ
レータ１４ｂ、電気信号ライン６及び導電性高分子パタ
ーン４を介して生体細胞１に電気刺激を与えるようにな
っている。また、増幅装置１６は、生体細胞が発する電
気信号を増幅する。更に、制御／解析装置１８は、電気
刺激発生装置１４と増幅装置１６を制御し、生体細胞１
が発する電気信号を記録、解析する。

【００２３】上述したように、図１に示した本発明の細
胞培養装置では、神経細胞などの生体組織（生体細胞
１）に電気刺激を与えたリ、あるいは電気的な活動を記
録したりすることが可能である。電気刺激時には、制御
／解析装置１８（例えば制御／解析用コンピュータ）か
らの指示で、パルス発生装置１４が電気パルスを生成す
る。次に、電気信号に雑音が乗らないようにアイソレー
タ１４ｂを通じて、導電性高分子パターン４に信号を送
る。試料培養皿１０に置かれた生体細胞１は、導電性高
分子パターン４からの電気信号で電気刺激される。一
方、電気記録時には、生体細胞１が発する微小な電気信
号を増幅器１６で増幅し、制御／解析装置１８で信号を
記録、解析する。

【００２４】神経組織片、神経細胞や心筋組胞などの生
体細胞１を長期間にわたって生育させるため、培養チャ
ンバー１２の周辺には「二酸化炭素濃度」「温度」を一
定に保つための様々な装置が取り付けられている。ガス
交換制御装置２０によって二酸化炭素濃度をモニタしな
がら、ボンベなどの二酸化炭素供給源２０ａから培養チ
ャンバーへと二酸化炭素が供給される。そして排気ファ
ン２０ｂを使って、チャンバー１２内の空気を排出す
る。なおチャンバー内を無菌状態に保つため、ガス供給
口１２ａと排出口１２ｂにはＨＥＰＡフィルタなどの除
菌フィルタを設置する。温度は温度制御装置２２を使っ
て一定に保たれる。温度センサ２２ａでチャンバー内の
温度をモニタリングして、必要に応じてヒーター２２ｂ
で暖めることができる。なおこの装置が稼動する室内温
度は３０度以下を想定している。それ以上の温度で使用
する時は、ヒーターでばなく「ペルチェ素子」などの冷
却装置を付加する。

【００２５】上述したように、培養チャンバー１２は透
明な密封容器である。これは顕微鏡下で試料を観察する
ことができるようにするためである。容器の中に試料培
養皿１０が置かれていて、容器周辺には温度とガス濃度
を一定に保つためのセンサ２２ａや装置類が取リ付けら
れている。試料培養皿内の試料（生体細胞１）への電気
刺激あるいは電気信号記録は、電極（導電性高分子パタ
ーン４）を通じて行われる。電極にはケーブル６が接続
されていてコネクタ９を通じて、外部機器と接続するこ
とができる。

【００２６】試料培養皿１０には生体試料を長期にわた
って保育するために、いくつかの工夫がされている。最
も特徴的な点は、試料に接する材料として、多孔質ポリ
マーフィルム２を用い、電気信号を伝える電極部分の
み、導電性高分子４が配してある。多孔質のフィルムを
用いることにより、試料の下面からも培養液を供給する
ことができる。また導電性高分子はポリマー素材上に作
ることが可能であり、かつ金属よりも生体適合性が高
い。そのため、この試料培養皿１０を用いると長期保育
が可能となる。多孔質ポリマーフィルム２には様々なも
のが考えられるが、光硬化性多孔質フィルムや熱可塑性
樹脂フィルムを用いると、フォトリソグラフィーや孔版
印刷の技術を用いてマイクロサイズで絶縁膜（絶縁膜は
多孔質構造になっていない）を簡単に作成することがで
きる。

【００２７】

【実施例】以下、本発明の実施例を説明する。本発明の
目的の１つは、体内埋め込み型医療器具への応用を目指
して、生体との親和性が高い神経刺激電極を作製するこ
とである。現在、神経系への刺激電極はＩＴＯ（ｉｎｄ
ｉｕｍｔｉｎｏｘｉｄｅ）や白金などの金属材料で
作製されているが、電極と生体組織との間の親和性が問
題となっている。このため従来は、細胞外マトリクスの
ひとつであるコラーゲンや、細胞接着因子であるポリリ
ジンで電極表面をコーティングし、この問題を解決して
きた。しかし、コーティングはインピーダンスを増加さ
せるため、導電率が低下する原因となっている。従って
生体組織との親和性および導電率の低下を同時に解決す
ることが求められている。

【００２８】ポリピロール、ポリチオフェン、ポリアニ
リンなどを代表とする導電性高分子は、金属と比較して
高い生体適合性を有する。さらに導電性を持つことか
ら、人工網膜や人工内耳に用いられる体内埋め込み型刺
激電極への応用も考えられる。その場合、電極を体内の
局所に埋め込み、特定の神経を刺激するのだが、電極サ
イズを十分に微小化しなければならない。従来開発され
てきた金属製の刺激電極サイズは数〜数十μｍであり、
ポリピロールを埋め込み電極へ応用するには、同様のサ
イズまで微小化する必要がある。

【００２９】そこで本発明では、ポリピロールを用いた
体内埋め込み型刺激電極の作製を目指して、ポリピロー
ルのマイクロパターン化と生体との親和性について実験
・評価を行った。ポリピロールのパターン化の手段とし
て、酸化重合剤の光反応性を利用した方法が報告されて
おり、本発明ではこの方法を用いてポリピロールのマイ
クロパターン化を試みた。一方、ポリピロールの生体親
和性については、神経細胞培養実験を行い、評価した。
作製したポリピロール上にＰＣ１２細胞およびラットか
ら摘出した後根神経節細胞を培養し、その生存・成長を
観察した。

【００３０】（ポリピロールの作製とマイクロパターン
化）本発明では、ポリピロールの作製方法として、化学
的酸化重合法のひとつである「気相重合」を利用した。
この方法では、まず適当な有機溶媒もしくはポリマー溶
液に酸化重合剤を溶かし、酸化重合剤混合溶液を調製す
る。次に基板上に混合溶液を塗布し、乾燥させて酸化重
合剤含有膜を形成させる。そして同膜をピロール蒸気と
接触させて重合を行い、ポリピロールを作製する。ピロ
ールの酸化剤として、塩化鉄（ＩＩＩ）などの金属塩が
有効であり、例えば、塩化鉄（ＩＩＩ）含有膜にピロー
ルの蒸気を接触させると速やかに酸化重合が起こり、ポ
リピロール膜を作製することができる。そして酸化重合
剤のうち光反応性を持つものは、紫外線照射により酸化
重合能力を消失する。この性質を利用して、光反応性酸
化重合剤含有膜の表面にポジマスクパターンを重ねて紫
外線を照射し、マスクを外してから膜をピロールモノマ
ー蒸気と接触させれば、マスクされた部分のみにポリピ
ロールが重合され、パターンを作製することができる。

【００３１】以下に本発明で行った実験方法を示す。（実験方法）本実験では、ピロールモノマー、酸化剤な
どの試薬類は市販試薬をそのまま使用した。酸化重合剤
として、高い酸化能力・光反応性を有する塩化鉄（ＩＩ
Ｉ）を用いた。また、疎水性基板上への酸化重合剤塗布
を容易にするため、１０％ポリビニルアルコール（ＰＶ
Ａ）（重合度約５００）水溶液に、無水の塩化鉄（ＩＩ
Ｉ）を加え、酸化重合剤混合溶液として用いた。塩化鉄
（ＩＩＩ）とＰＶＡの混合比は、作製されたパターンの
均一性に多大な影響を及ぼす。今回は塩化鉄（ＩＩＩ）
とＰＶＡとの重量比を４：６に調製し、混合溶液として
用いた。この混合溶液をバーコーターによりポリエステ
ルフィルム上に塗布し、８０℃で１０分間乾燥させてＰ
ＶＡ−塩化鉄（ＩＩＩ）の複合膜を作製した。次に縦横
それぞれ５本の格子状パターンを持つポジマスクを複合
膜上に重ねて固定し、１０、２０、３０、６０分間の紫
外線照射をそれぞれ行った。紫外線照射装置には、３０
Ｗの光源を持つプリント基板用露光装置を使用した。照
射終了後にマスクを取り外し、密閉したデシケータ内で
複合膜とピロール蒸気を６０分間接触させ、重合を行っ
た。その後、複合膜をメタノールとエタノールで洗浄し
て、残存する酸化剤を除去し、８０℃で乾燥させてポリ
ピロールパターンを得た。

【００３２】（実験結果）本実験では、紫外線照射時間
と作製可能なポリピロール線幅の関係を調べた。従来、
線幅が１５０μｍ以上であれば、ポリピロールパターン
を明確に作製できることが報告されている。本発明で
は、マスクの線幅を最小１μｍまで変化させ、ポリピロ
ールをどこまで微細化可能かを検討した。明確なパター
ンを作製するためには、十分な紫外線照射を行い、重合
部と非重合部を明確に分別させる必要がある。紫外線照
射時間が短いと、光照射による酸化重合剤の反応が不十
分となり、照射部分にもポリピロールが生成してしま
う。そこで照射時間を変化させた際の作製可能な最小線
幅の関係を調べたところ、表１のような結果を得た。

【００３３】

【表１】

【００３４】この表より、紫外線照射時間を増加させる
ことで、作製可能な最小線幅を小さくできることが示さ
れた。本実験における条件下では、紫外線照射時間を延
長することにより線幅３μｍのパターンまで作製可能で
あった。照射時間が６０分間の場合、線幅３μｍのパタ
ーンまでほぼ明確に作製できた。しかし照射時間が２０
分間では、線幅３μｍ以下のパターンを作製できなかっ
た。また、照射時間が６０分間以内では線幅１μｍのパ
ターンを作製できなかった。これはおそらくマスクと試
料が十分に密着できておらず、マスクで遮蔽された箇所
にも紫外線がまわり込んだことが原因と考えられる。従
って、１μｍ以下のパターンを作製するためには、より
高性能な露光装置を用いるなどしてマスクと試料を十分
に密着させ、紫外線を照射する必要があると思われる。

【００３５】このように本実験では最小３μｍまでポリ
ピロールを微小化することができたが、この大きさは通
常の神経細胞に比べて十分小さい。一方、従来から開発
されてきた神経刺激用の金属電極サイズは数〜数十μｍ
である。以上から本方法を用いれば、神経刺激電極への
応用に必要な大きさまでポリピロールを微小化できるこ
とが確認された。

【００３６】（神経細胞培養実験）気相重合で作製した
ポリピロール上に神経細胞を培養し、その生存・成長の
観察により、ポリピロールと神経細胞との親和性を評価
した。ところで前述した方法で作製したポリピロール上
に神経細胞を培養しようとすると、培養液中でポリピロ
ールが基板から容易に剥離してしまう。これはおそらく
水溶性のＰＶＡをマトリクスポリマーとして用いている
ためと思われ、培養状態に悪影響を及ぼすと考えられ
る。そのため酸化重合剤には、塩化鉄（ＩＩＩ）をエタ
ノールに溶かした溶液に適量の界面活性剤（片山化学工
業ツイーン２０）を添加したものを用いた。このように
マトリクスポリマーを酸化重合剤と混合しない場合、塩
化鉄（ＩＩＩ）とピロールの酸化反応がより速やかに行
われ、短時間でピロールが重合される。そこで、この酸
化重合剤をプラスチック製培養皿底部に塗布し８０度で
１０分間乾燥させ、その後１分間密閉容器中にて酸化重
合剤含有膜とピロール蒸気を接触させて重合を行った。
重合後はメタノールとエタノールで洗浄し、乾燥させて
ポリピロールを得た。ポリピロールでコーティングされ
た培養皿は、７０％エタノールに１０分間浸して滅菌し
た後、無菌状態に保たれたクリーンベンチ内で乾燥させ
てから培養に用いた。

【００３７】培養細胞には、ＰＣ１２細胞および後根神
経節（ＤＲＧ）細胞を用いた。ＰＣ１２細胞は、ラット
副腎髄質クロム親和性細胞種より単離された神経系クロ
ーン細胞である。ＰＣ１２細胞は、神経成長因子（ＮＧ
Ｆ）非存在下では副腎髄質クロム親和性細胞の形質を示
すが、ＮＧＦ存在下では神経突起を伸展させ、交換神経
細胞様に分化することが知られている。本実験ではＮＧ
Ｆを添加して神経細胞様に分化させてからその生存と成
長を評価した。ポリピロールと神経細胞との親和性を正
確に評価するには、神経系クローン細胞だけでなく、神
経細胞の初代培養も行なう必要がある。そのためラット
ＤＲＧ神経細胞の初代培養も行なった。本実験では、Ｄ
ＲＧを直接培養するのではなく、ＤＲＧを単離して得た
神経細胞を培養し、その生存と成長を評価した。

【００３８】（ＰＣ１２細胞の培養）（培養方法）ＰＣ
１２細胞は、凍結保存されていたものを融解し、培養実
験に用いた。培養液には、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃ
ｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅＭｅｄｉｕ
ｍ）を用いた。また、培養中のｐＨ値変動を防ぐため、
ＨＥＰＥＳ緩衝液を含むＤＭＥＭを使用した。さらに細
胞の成長・接着を促進するため、培養液量に対して胎児
ウシ血清（ＦＢＳ）を４％、ウマ血清（ＨＳ）を７％添
加した。また、３日ごとに培養液を新鮮なものに交換し
た。

【００３９】対照実験として、ポリピロールによるコー
ティングなし（培養皿上への直接培養）および、ポリリ
ジンコーティング上での培養についても行った。培養皿
はポリスチレンで作製されており、ＩＴＯなどの金属に
比べて、細胞と高い親和性を持つことが知られている。
ポリリジンは細胞接着を促進する細胞接着因子のひとつ
で、培養実験では広く用いられている化学物質である。
これらとポリピロールを比較し、ポリピロールがどの程
度の親和性を持っているかを評価した。

【００４０】（実験結果）培養開始６日後において、い
ずれの場合も、細胞は突起を伸長し、他の細胞と接続を
していることが観察された。突起の長さについて比較し
た結果、ポリリジン上の細胞が最も突起を長く伸長し
た。また、ポリピロール上の培養細胞は、コーティング
なしの場合と同程度に突起を伸長した。なお、細胞はど
の基板上においても４週間にわたって生存した。コーテ
ィングなしの場合と同程度に、ポリピロール上の培養細
胞が成長し、生存した。ポリピロールが金属物質に比べ
て高い親和性を持つことが明らかになった。また、ポリ
ピロールとポリリジンの培養結果にも大きな差異がない
ことから、ポリピロール自身が高い親和性を持つことが
わかった。

【００４１】（ラットＤＲＧ神経細胞の培養）（培養方法）本実験では、３週齢の雌ラットからＤＲＧ
神経細胞を採取し、培養液を重層し、ＣＯ₂５％、温度
３７℃に保った保温庫の中に入れて培養を開始した。培
養液はＨＥＰＥＳを含むＤＭＥＭを用い、培養液量に対
して５％のＦＢＳを添加した。また、培養液は３日毎に
交換し、最初の培養液交換の際にはＤＮＡ合成阻害剤で
ある。ｃｙｔｏｓｉｎｅａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅを培
養液に加え、混入した線維芽細胞とシュワン細胞の増殖
を抑えた。対照実験として、ＰＣ１２細胞培養と同じ
く、コーティングなしの培養とポリリジンコーティング
上での培養を行なった。

【００４２】（実験結果）培養６日後において、コーテ
ィングなしの結果に比べ、ポリリジン上とポリピロール
上の培養細胞は、長い突起を伸長した。培養２０日後に
おいて、ポリピロール上に培養された神経細胞は増殖し
た線維芽細胞に取り囲まれているが、突起を大きく伸長
していることが観察できた。神経細胞はどの基板上に培
養されても、４週間にわたって生存した。これらの結果
から、初代培養の神経細胞に対しても、ポリピロールは
高い親和性を持つことが示された。ポリリジンは金属電
極表面をコーティングする物質としても用いられるが、
インピーダンス増加の原因ともなっている。そのため、
ポリリジンよりも高い導電性を持つポリピロールを電極
材料として利用すれば、細胞との親和性が高く、さらに
効率良く刺激可能な電極の作製が期待できる。

【００４３】本発明では、生体と高い親和性を持つ神経
刺激電極として、ポリピロールを用いた電極作製を提案
した。そして、ポリピロールのマイクロパターニングを
行なった。酸化重合剤の光反応性を利用したポリピロー
ルのパターニングを試みた結果、３μｍの線幅までパタ
ーン化できた。この結果より、体内埋め込み型の刺激電
極に必要な微小サイズまで、ポリピロールのパターン化
が可能であることが示された。そしてＰＣ１２細部とＤ
ＲＧ神経細胞をポリピロール上に培養した結果、細胞は
４週間にわたって生存・成長することがわかった。また
ポリピロールがポリリジンと同程度の親和性を持つこと
も確認できた。従ってポリピロールを用いれば、金属電
極に比べて、より生体親和性の高い電極が作製できると
考えられる。

【００４４】なお、本発明は、上述した実施例に限定さ
れず、本発明の要旨を逸脱しない範囲で種々に変更でき
ることは勿論である。

【００４５】

【発明の効果】上述したように、本発明の神経刺激電極
の構成によれば、神経刺激電極が生体適合性の高い基板
２（例えば多孔質ポリマーフィルム）と導電性高分子パ
ターン４とからなるので、いずれも金属材料と比較して
生体適合性が高く、細胞培養を長期に試験するのに適し
ている。また、酸化剤を非水性溶媒に溶かした酸化重合
剤を用いることにより、培養液中で導電性高分子パター
ン４が基板から剥離するのを防止できることが実施例で
確認された。更にこの際、界面活性剤を添加することに
より均一な分散が可能となった。更に、光照射を、出力
３０Ｗ、照射時間２０分以上、６０分以下のエネルギー
に相当する従来より十分な紫外線照射を行うことによ
り、特定の生体細胞を刺激するのに適する線幅３μｍ〜
１０μｍの微細な線幅が作製できることが、実施例で確
認された。

【００４６】また本発明の細胞培養装置の構成によれ
ば、下面から培養液を供給可能な多孔質ポリマーフィル
ム２を用いるので、刺激／計測の対象となるポリマーフ
ィルム２に接した生体細胞１に効率的に培養液を供給
し、この生体細胞の長期培養が可能となる。また、この
多孔質ポリマーフィルム２として、光硬化性多孔質フィ
ルムや熱可塑性樹脂フィルムを用いることにより、フォ
トリソグラフィーや孔版印刷によりマイクロサイズで絶
縁膜を簡単に作成することができる。更に、導電性高分
子パターン４が多孔質ポリマーフィルムに密着して形成
されているので、金属よりも生体適合性が高く、生体に
悪影響を与えることなく生体細胞を長期間培養可能とな
る。また、電気信号ライン６と導電性高分子パターン４
を介して外部から培養した特定の細胞に個別に刺激で
き、同様に特定の細胞の電気的な活動を記録することが
できる。

【００４７】従って、本発明の神経刺激電極とこれを用
いた細胞培養装置は、（１）特定の生体細胞を刺激する
のに適した微細な線幅が作製可能であり、かつ（２）培
養液中で基板から長期間剥離せず、（３）生体細胞を長
期間培養可能であり、かつ（４）培養した特定の細胞に
個別に刺激でき、（５）さらに特定の細胞の電気的信号
を記録できる等の優れた効果を有する。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明による細胞培養装置の全体構成図であ
る。

【図２】図１の細胞培養装置を構成する培養チャンバー
の斜視図である。

【図３】図１の細胞培養装置を構成する試料培養皿の構
成図である。

【符号の説明】

１生体細胞、２基板（多孔質ポリマーフィルム）、
４導電性高分子パターン、５絶縁膜、６電気信号
ライン、６ａ電極、７絶縁膜、８基板、９コネ
クタ、１０試料培養皿、１０ａ培養皿壁面、１２
培養チャンバー、１２ａガス吸入口、１２ｂガス排
出口、１４電気刺激発生装置、１４ａパルス発生装
置、１４ｂアイソレータ、１６増幅装置、１８制
御／解析装置、２０ガス交換制御装置、２０ａＣＯ
₂供給源、２０ｂ排気ファン、２２温度制御装置、
２２ａ温度センサ、２２ｂヒーター

フロントページの続き (72)発明者木内一壽愛知県名古屋市守山区大字下志段味字穴ケ洞2271−130 サイエンスパーク研究開発センター内理化学研究所バイオ・ミメティックコントロール研究センター内 (72)発明者大西保志愛知県刈谷市一ツ木町西新割愛知県工業技術センター内 (72)発明者伊藤雄一郎愛知県名古屋市守山区大字下志段味字穴ケ洞2271−130 サイエンスパーク研究開発センター内理化学研究所バイオ・ミメティックコントロール研究センター内 (72)発明者内川嘉樹愛知県名古屋市昭和区広路町雲雀ケ丘１番地イトーピア八事雲雀ケ丘1201号Ｆターム(参考） 4B029 AA02 AA08 AA13 AA17 AA24 BB11 CC02 CC08 DB19 DF01 DF04 GA02 GA06 GB01 GB08 GB10

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】生体適合性の高い基板（２）と該基板に
密着して形成された導電性高分子パターン（４）とから
なり、該導電性高分子パターンは、酸化剤を非水性溶媒
に溶かしかつ界面活性剤を添加した酸化重合剤を、前記
基板上に塗布し、該基板表面に所望のパターンの光を照
射して照射部分の酸化重合能力を低減し、次いで基板表
面にモノマーを気相重合させて光の非照射部分に形成し
たものである、ことを特徴とする神経刺激電極。
【請求項２】前記酸化剤は塩化鉄であり、前記モノマ
ーはピロールモノマーであり、前記光照射は出力３０
Ｗ、照射時間２０分以上、６０分以下のエネルギーに相
当する紫外線を照射する、ことを特徴とする請求項１に
記載の神経刺激電極。
【請求項３】前記基板は多孔質ポリマーフィルムであ
る、ことを特徴とする請求項１に記載の神経刺激電極。
【請求項４】生体細胞（１）を載せ下面から培養液を
供給可能な多孔質ポリマーフィルム（２）と、該多孔質
ポリマーフィルムに密着して形成された導電性高分子パ
ターン（４）と、該導電性高分子パターンに一端が電気
的に接続され他端が外部まで延びる電気信号ライン
（６）とを有する試料培養皿（１０）を備え、前記電気
信号ラインと導電性高分子パターンを介して生体細胞に
電気刺激を与え、かつ電気的な活動を記録する、ことを
特徴とする細胞培養装置。
【請求項５】前記試料培養皿（１０）を密閉する透明
な培養チャンバー（１２）と、生体細胞に与える電気刺
激を発生する電気刺激発生装置（１４）と、生体細胞が
発する電気信号を増幅する増幅装置（１６）と、電気刺
激発生装置と増幅装置を制御し前記電気信号を記録、解
析する制御／解析装置（１８）とを備える、ことを特徴
とする請求項４に記載の細胞培養装置。
【請求項６】前記培養チャンバー（１２）内を無菌状
態に保ち、かつ二酸化炭素濃度を一定に保つガス交換制
御装置（２０）と、培養チャンバー（１２）内の温度を
一定に保つ温度制御装置（２２）とを備える、ことを特
徴とする請求項５に記載の細胞培養装置。